SK281583B6 - Spôsob detekcie malígnych a premalígnych zmien - Google Patents

Abstract

Je opísaná detekcia malígnych a premalígnych zmien, ako sú malígna transformácia, premalígna transformácia, hyperplázia alebo morfologické zmeny, v humánnych bunkách, pri ktorom sa a) stanoví obsah syndekanu v bunkách, ktorý je prítomný v prvej tekutine alebo vzorke tkaniva vyšetrovaného človeka, pričom prvá vzorka sa odoberá z tekutiny alebo tkaniva, v ktorom je podozrenie na obsah malígnych buniek, premalígnych buniek, hyperplastických buniek alebo buniek, vykazujúcich morfologickú zmenu v porovnaní s ich normálnym stavom; b) obsah syndekanu stanovený v stupni a) sa porovná s obsahom syndekanu, stanoveným z druhej vzorky biologického materiálu, pričom druhá vzorka biologického materiálu predstavuje tekutinu alebo tkanivo rovnakého typu, ako je prvá vzorka biologického materiálu, pričom však táto druhá vzorka pochádza z buniek, ktoré sú normálne alebo menej transformované ako bunky v stupni a); a c) stanoví sa prítomnosť malígnych alebo premalígnych zmien na základe prítomnosti menšieho množstva syndekanu v prvej vzorke v porovnaní s druhou vzorkou biologického materiálu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu detekcie malígnych a premalígnych zmien, ako sú malígna transformácia, premalígna transformácia, hyperplázia alebo morfologické zmeny, v humánnych bunkách.

Doterajší stav techniky

Povrchové molekuly buniek, ktoré sa uplatňujú pri špecifických interakciách medzi povrchom bunky a extracelulárnou matricou (ECM), sa nazývajú matričné receptory. Rozoznať matricu týmito receptormi hrá dôležitú úlohu pri regulácii tvaru buniek, proliferácii a diferenciácii, a preto je kritickým bodom normálneho vývoja orgánov a zachovávania architektúry tkaniva. Známe matričné receptory zahrnujú napríklad skupinu transmembránových glykoproteínových receptorov, ktoré majú spoločné štrukturálne a funkčné vlastnosti a nazývajú sa integríny (Hynes R. (1987) Celí 48: 549 až 554). Jedná sa o 67-kDa glykoproteín, ktorý sa viaže k laminínovému reťazcu B! (Graf a ďalší (1987) Celí 48: 65: 989 - 996) a povrchové bunkové proteoglykany (PG), ktoré v závislosti od zloženia glykozaminoglykanu (napríklad v heparansulfáte) môžu interagovať s rôznymi molekulami matrice) Jalkanen M. (1987) Med. Biol. 65: 41 až 47).

Adhézia, šírenie, proliferácia a diferenciácia buniek sú založené na úzkom kontakte medzi povrchom buniek a obklopujúcou extracelulárnou matricou (ECM). Selektívne použitie interakcie ligand-receptor môže in vivo vytvoriť rôznorodé špecifické interakcie bunka-matrica, ktoré sú potrebné pre vývin orgánov (Ekblom a ďalší (1986) Ann. Rev. Celí. Biol 2: 27 - 47).

O transformácii je známe, že mení odpoveď buniek na ECM (Liotta L. (1986 Cancer Res. 46: 1 - 7), čím vzniká možnosť vzniku zmien v expresii matričných receptorov malígnymi bunkami (Plateniaber a Hynes (1989) Celí 56: 281 - 290; Cheresh a ďalší (1989) Celí 57: 59 - 69). Tieto zmeny sú v značnom rozsahu neznáme, ale môžu mať rozhodujúcu úlohu pri vzniku malígneho chovania rôznych typov buniek.

Proteoglykan povrchových buniek z epitelových buniek myšacej prsnej žľazy sa skladá z lipofilnej membránovej domény (Rapraeger a Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632 - 3636; (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103 - 4109) a z matricovej interagujúcej ektodomény, ktorý obsahuje heparín-sulfátové a chondroitínsulfátové reťazce (Rapraeger a ďalší (1985) J. Biol. Chem. 260: 11 046 - 11 052). Nedávne cDNA-klonovanie myšieho a humánneho syndekanu potvrdilo existenciu týchto funkčných domén v jadrovom proteíne a tento bunkový proteoglykan (PG) bol označený názvom syndekan (Saunders a ďalší (1989) J. Celí Biol. 108: 1547 - 1556; Mali a ďalší (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884 - 6889). Ektodoména syndekanu je rozoznaná mAb 281-2 (Jalkanen a ďalší (1985) J. Celí Biol. 101: 976 - 984; Jalkanen a ďalší (1987) J. Celí Biol. 105: 3087 - 3096) a s vysokou afinitou sa viaže ku kolagénovým fibrilám typu I, III a V (Koda a ďalší (1985) J. Biol. Chem. 260: 8157 až 8162) a s nižšou afinitou k doméne fibronektínu viažuce C-terminálny heparín (Saunders a Bernfield (1988) I. Celí. Biol. 106: 423 - 430), trombospondínu (Sun a ďalší (1989) J. Biol. Chem. 264: 2885 - 2889) a tenascínu (Salmivirta a ďalší (1991) J. Biol. Chem. 266: v tlači). Väzba ligandu povzbudzuje asociáciu membránovej domény k cytoskeletu, bohatému na aktin (Rapraeger s ďalší (1986) .T. Celí Biol. 103: 2683 - 2696). Bunky epitelu však tiež môžu uvoľniť ektodoménu z povrchu buniek proteolytickým roz štiepením jadrového proteínu, čím dôjde k oddeleniu ektodomény od membránovej domény (Jalkanen a ďalší (1987) J. Celí Biol. 105: 3087 - 3096 Weitzhandler a ďalší (1988) J. Biol. Chem. 263: 6949 6952). Syndekan teda môže viazať cytoskelet epitelu k matrici, ale tiež uvoľňovať asociáciu s matricou. Týmito asociáciami môže syndekan sprostredkovať organizáciu matrice do bunkovej organizácie a ovplyvňovať chovanie buniek. Pretože syndekan interaguje hlavne so stromálnymi zložkami, ako sú kolagénové fibrily a fibronektín, môže slúžiť ku komunikácii medzi epitelovým a mezenchymálnym tkanivom. Tento typ komunikácie má rozhodujúci význam pri normálnej diferenciácii epitelu a tvorby orgánov.

Expresiu syndekanu v priebehu vývoja a tvorby orgánov sleduje skôr morfogenetické a nie histologické rozhrania (Thesleff a ďalší (1988) Dev. Biol. 189: 565 - 572), čo je znak, ktorý taktiež podporuje aktívnu úlohu syndekanu ako matričného receptoru v priebehu vývoja. Syndekan bol lokalizovaný hlavne v rôznych epitelových bunkách (Hayashi a ďalší (1987) J. Histochem. Cytochem. 35: 1079 -

- 1088), ale vyskytuje sa taktiež na povrchu buniek plazmy (Saunderson a Bernfield (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9562 - 9566). Syndekan sa tiež vyskytuje v kondenzujúcom mezenchýme v susedstve pučiaceho epitelu pri tvorbe orgánov (Thesleff a ďalší (1988) Dev. Biol. 189: 565 -

- 572). Ukázalo sa, že jeho expresia v mezenchýme je regulovaná epitelovým kontaktom jednak v zube (Vaino a ďalší (1988) a jednak v metanefrickej ľadvine (Vaino a ďalší (1989)) a v oboch týchto tkanivách je možné jeho expresiu korelovať ako čo do priestoru, tak čo do času s morfogenézou týchto orgánov.

Podstata vynálezu

Úlohou tohto vynálezu je vyvinúť spôsob detekcie premalígnych a malígnych tkanív prostredníctvom detekcie straty syndekanu z týchto tkanív.

Ďalšou úlohou tohto vynálezu je vyvinúť spôsob detekcie premalígnych alebo malígnych tkanív prostredníctvom detekcie prítomnosti syndekanu v telesných tekutinách.

Ešte ďalšou úlohou tohto vynálezu je vyvinúť spôsob, ktorý by bol adaptovateľný predovšetkým pre detekciu malígnych alebo premalígnych tkanív u človeka:

Ešte ďalšou úlohou tohto vynálezu je vyvinúť biochemickú, imunohistologickú alebo molekulámo biologickú metódu stanovenia expresie syndekanu alebo obsahu syndekanu v tkanivách alebo telesných tekutinách na zistenie malígnych alebo premalígnych transformácií v bunkách.

Ešte ďalšou úlohou tohto vynálezu je vyvinúť spôsob zisťovania hyperplastických zmien v bunkách. Ešte ďalšou úlohou tohto vynálezu je vyvinúť spôsob detekcie navrhnutých morfologických zmien v bunkách.

Úlohou vynálezu je tiež vyvinúť spôsob kvantitatívneho stanovenia syndekanu v tkanivách alebo telesných tekutinách na stanovenie indikátorovej hodnoty.

Všeobecne je možné zhrnúť, že podľa najširšieho aspektu je predmetom tohto vynálezu spôsob detekcie malígnych a premalígnych zmien, ako sú malígna transformácia, premalígna transformácia, hyperplázia alebo morfologické zmeny, v humánnych bunkách, ktorého podstata spočíva v tom, že sa

a) stanoví obsah syndekanu v bunkách, ktorý je prítomný v prvej tekutine alebo vzorke tkaniva vyšetrovaného človeka, pričom prvá vzorka sa odoberá z tekutiny alebo tkaniva, v ktorej je podozrenie na obsah malígnych buniek, premalígnych buniek, hyperplastických buniek alebo buniek, vyka žujúcich morfologickú zmenu v porovnaní s ich normálnym stavom;

b) obsah syndekanu stanovený v stupni a) sa porovná s obsahom syndekanu, stanoveným z druhej vzorky biologického materiálu, pričom druhá vzorka biologického materiálu predstavuje tekutinu alebo tkanivo rovnakého typu, ako jc prvá vzorka biologického materiálu, pričom však táto druhá vzorka pochádza z buniek, ktoré sú normálne alebo menej transformované ako bunky v stupni a); a

c) Stanovi sa prítomnosť malígnych alebo premalígnych zmien na základe prítomnosti menšieho množstva syndekanu v prvej vzorke v porovnaní s druhou vzorkou biologického materiálu.

Spôsob podľa vynálezu je možné realizovať rôznymi metódami, ktoré zahrnujú biochemické, imunohistologické a molekulámo biologické typy metód. Spôsob je síce aplikovateľný na zistenie škodlivej transformácie, ako je malígny alebo premalígny stav pri mnohých druhoch organizmov, je však predovšetkým adaptovateľný pre detekciu škodlivých transformácii v bunkách, predovšetkým humánnych bunkách. Transformácie, ktoré je možné stanoviť, zahrnujú premalígne a malígne transformácie, vrátane hyperplastických a morfologických zmien.

Detekcia prítomnosti alebo neprítomnosti syndekanu sa môže realizovať v rôznych biologických materiáloch, pochádzajúcich z organizmu, ako sú bunky, tkanivá a telesné tekutiny, z ktorých je možné predovšetkým v prípade humánnych biologických materiálov menovať najmä sérum, plazmu, moč, miechový mok alebo iné tkanivové extrakty. Detekcia obsahu syndekanu v biologických materiáloch sa môže robiť za použitia rôznych prostriedkov ako napríklad syndekan-špecifických ligandov alebo biochemických determinantov, syndekan-špecifických protilátok a syndekanových antimediátorových mRNA a cDNA alebo oligonukleotidov.

Ďalšie znaky a aspekty vynálezu a výhody, ktoré vynález prináša sú zrejmé z nasledujúceho podrobnejšieho opisu, ktorý odkazuje na priložený výkres.

Prehľad obrázkov, na výkresoch

Na obr. IA je graficky znázornená závislosť obsahu syndekanu na povrchu buniek od času, ktorá ilustruje stratu syndekanu v myšacích mammamých epitelových bunkách, transformovaných expozíciou testosterónu.

Na obr. 1B je graficky znázornená závislosť expresie syndekanu mRNA od času, ktorá ilustruje stratu syndekanu v myšacích mammamých epitelových bunkách, transformovaných expozíciou testosterónu.

Na obr. 2A až 2D sú ilustratívne fotografie rezov biologického materiálu, tvoreného myšacou kožou, z ktorých je zrejmý postup expresie syndekanu po expozícii materiálu UV žiarením.

Na obr. 3A je ilustratívna fotografia, ukazujúca suspenziu myšacích mammamých epitelových buniek, pestovaných v monovrstvách, pričom jedna vrstva bola transformovaná rasonkogénom.

Na obr. 3B je graficky znázornený obsah syndekanu na povrchu buniek, v prípade monovrstiev, ktoré sú znázornené na obr. 3A.

Predložený vynález je sčasti založený na poznatku, že detekcia syndekanu je cenným diagnostickým kritériom na zistenie prípadných malignancií v biologických materiáloch, ako sú epitelové bunky. Sú uvedené príklady troch rôznych druhov experimentálne indukovaných transformáciou (hormonálna indukcia, UV-dráždenie a onkogénová indukcia) a vo všetkých týchto prípadoch je zrejmý úbytok syndekanu. Detekcia straty syndekanu je taktiež cenná pri iných mechanizmoch, ktoré vedú k transformáciám, majúcim za následok vznik nádorov a v dôsledku toho sa vynález neobmedzuje len na uvedené prípady. Tak napríklad detekcia syndekanu môže poskytnúť cenné informácie tiež pri rôznych proliferačných štádiách tkanív (napríklad kože, ľadvín mozgu, pľúc a močového mechúra), ktoré sa neskôr môžu zvrhnúť do malígnejšieho štádia. Tieto tzv. premalígne stavy, ktoré sa často prejavujú ako dysplázia, sú charakteristické rôznou úrovňou syndekanu. Táto úroveň syndekanu predstavuje informáciu, ktorá je potrebná na odhad vážnosti choroby, ktorý je potom dôležitý na určenie vhodného terapeutického postupu.

Dôležitou oblasťou detekcie syndekanu sú tiež bunky cirkulujúce v plazme. Ich analýza spôsobom podľa vynálezu, pri použití syndekan-špecifických protilátok, ako je napríklad analýza FACS (fluorescent activated celí sorter) poskytuje cenné informácie o patofyziologickom stave pacienta s lymhoma, myeloma, leukémiou alebo inými proliferatívnymi stavmi hematopoitických buniek.

Je takisto známe, že syndekan sa uvoľňuje z povrchu buniek (Jalkanen a ďalší (1987) J. Celí Biol. 105; 30873096) s v prípade určitých chorôb môže mať strata syndekanu z povrchu buniek za následok, že sa syndekan objaví v telesných tekutinách. V súlade s jedným aspektom tohto vynálezu má diagnostickú hodnotu meranie obsahu syndekanu v sére, plazme, moči, miechovom moku alebo v iných tkanivových extraktoch, s cieľom zistiť, do akej miery došla k deštrukcii tkaniva a strate normálnej morfológie buniek .v študovaných tkanivách.

Ako už bolo uvedené, syndekan predstavuje proteoglykan povrchu buniek, ktorý sa skladá z kovalentne viazaných glykozaminoglykanových (GAG) reťazcov a jadrového proteínu uloženého v membráne (Saunders s ďalší (L989) J. Celí Biol. 108: 1547 - 1556). Reťazce GAG syndekanu patria, ako je známe, ku skupine heparansulfátu .a chondroitínsulfátu (Rapraeger a ďalší (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046 - 11052) a nie sú obmedzené na syndekan. Jadrový proteín syndekanu je jedinečný a definuje túto molekulu ako člena zo súboru niekoľkých podobných povrchových bunkových proteoglykanov (Mali a ďalší (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884 - 6889). Murinný (pochádzajúci z hlodavcov) syndekan bol pôvodne izolovaný a ešte i teraz je obvykle detekovaný pomocou monoklonálnej protilátky (MnAb 281-2) proti jadrovému proteínu syndekanu (Jalkanen a ďalší (1985) J. Celí Biol. 101: 976 984).

Na ďalšie vysvetlenie vynálezu bola analyzovaná expresia syndekanu vo vzťahu k indukcii malígneho fenotypu v troch rôznych nezávislých biologických modeloch, v ktorých vždy došlo k malígnej transformácii epitelových buniek. Pri všetkých týchto modeloch bola súčasne s malígnou transformáciou pozorovaná strata expresie syndekanu. Tieto výsledky boli získané pri nasledujúcich modelových skúškach, ktorých cieľom je bližšie ilustrovať tento vynález.

Pri prvom modeli bola použitá bunková línia mammarných nádorových buniek myši Shionogi 115 (SI 15). Tieto bunky predstavujú vynikajúci model pre štúdie transformovaného fenotypu, pretože vykazujú odpoveď na androgény, ktorá sa prejavuje zvýšením rýchlosti ich rastu (King a ďalší (1976) J. Steroid Biochem. 7: 869 - 873) a zmenou z epitelovej na fibroblastickú morfológiu (Yates s King (1981) Cancer Res. 41: 258 - 262). Za prítomnosti androgénu vykazujú bunky voľnú adhéziu ku spodnej vrstve (substrátom) a získavajú schopnosť rásť v suspenzii bez zakotvenia k matrici. Za neprítomnosti androgénu bunky tesne lipnú k matrici a v suspenzii vôbec nerastú. (Yates a King (1981) Cancer Res. 41: 258 - 262). Podstata tejto morfologickej zmeny a nezávislosti od ukotvenia je do značnej miery neznáma, hoci bolo navrhnutých niekoľko mechanizmov, vrátane zmeny cytoskeletálnej organizácie (Couchman a ďalší (1981) Cancer Res. 41: 263 - 269) a paracrinných mechanizmov (Darbre a King (1988) publikácia Breast Cancer: Cellular and Molecular Biology, red. M. E. Lippman a R. B. Dickson, Academic Publishers, str. 307 až 341).

Bunky S115 ošetrené testosterónom vykazovali silne RGDS-závislú väzbu k fibronektínu (FN), ale žiadnu väzbu k doméne fibronektínu viažuci heparín, čo ukazuje, že exprimujú molekuly typu integrínu. Namiesto toho bunky S115 pestované bez testosterónu vykazovali epitelovú morfológiu a väzbu k doméne fibronektínu viažuci heparín, čo ukazuje, že došlo k zmene expresie syndekanu v bunkách Sl 15, ktoré boli ošetrené hormónom. V bunkách Sl 15, ktoré boli ošetrené hormónom, došlo ako k poklesu množstva ektodomény syndekanu viažucu matricu (kvantitatívne stanovenému rádioimunostanovením a metódou Westem blot), tak k poklesu množstva syndekanovej mRNA (2,6 kb). Prídavok antiandrogenného cyproteronacetátu ku kultivačnému médiu mal opačný účinok ako testosterón na syndekanovú mRNA. Inaktivácia syndekanového génu a v dôsledku toho potlačenie expresie syndekanu, má vzťah k zmeneným adhéznym vlastnostiam, vymiznutie epitelového fenotypu a na druhej strane objavenie sa fenotypu transformovaného typu buniek S115, ktoré boli ošetrené hormónom.

Príklad výsledkov získaných pri uvedenej skúške je znázornený na obr. IA a IB. Na obr. IA je uvedená porovnávacia grafická reprezentácia závislosti obsahu povrchového bunkového syndekanu od času. Táto závislosť ilustruje pokles obsahu syndekanu v myšacích mammárnych epitelových bunkách (S 115), ktoré boli transformované expozíciou testosterónu. Na obr. 18 je uvedená porovnávacia grafická reprezentácia závislosti obsahu syndekanovej mRNA od času. Táto závislosť ilustruje pokles obsahu syndekanu v myšacích mammárnych epitelových bunkách Sl 15), ktoré boli transformované expozíciou testosterónu. Tieto reprezentácie ukazujú malígne chovanie a stratu expresie syndekanu, ktoré sú zrejmé pri proteíne z obr. 1A a z hladiny mRNA z obr. IB, po expozícii. Z uvedeného vyplýva, že prídavok androgénu ku kultúram buniek Sl 15 má za následok potlačenie expresie syndekanu, ku ktorému dochádza inaktiváciou syndekanového génu. Toto potlačenie dobre koreluje so získaním nezávislosti buniek od ukotvenia a so stratou epitelového fenotypu a je teda jedným z dôvodov skutočnosti, že bunky Sl 15 vykazujú za prítomnosti androgénu transformované chovanie.

Pri druhej modelovej skúške bola študovaná imunoreaktivita syndekanu pri lysých (hr(hr) myšiach, ktoré boli exponované ožarovaním UV-A s UV-B. Pozitívne zafarbenie bolo pozorované na povrchu normálnych epidermálnych buniek ako i v dermálnych abortívnych vlasových folikulámych cystách, ktoré sú charakteristické pre tento kmeň myší. Tiež skorá reakcia na UV-ožarovanie, vykazujúca hyperplastickú epidermis s miernou celulámou atypickosťou, bola pozitívna, i keď došlo k zníženiu zafarbenia povrchu epidermálnych buniek. Vzorky s ostrou dyspláziou vykazovali slabé zafarbenie vo vrstve granulámych buniek, zatiaľ čo bazálna vrstva buniek bola negatívna. V papilómoch a keratoacanthomoch chodidla bola pozorovaná imunoreaktivita na syndekan ako v benígnych hyperplastických epidermálnych bunkách, tak v proliferujúcich epidermálnych bunkách rohovitých cýst. Malígna transformácia, ktorá bola vyjadrená ako tvorba karcinómov a sarkómov šupinových buniek, bola vždy spojená so stratou syndekanového zafarbenia. Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi poznatkami, že totiž pri malígnej transformácii pestovaných epitelových buniek dochádza k poklesu expresie syndekanu. Výsledky taktiež ukazujú, akú dôležitú úlohu hrá syndekan pri udržovaní normálnej architektúry tkaniva a pri diferenciačnom modeli kože.

Príklady zafarbenia pri rôznych vzorkách tohto typu sú uvedené na obr. 2A až 2D. Tieto obr. predstavujú ilustratívne fotografie rezov biologického materiálu, tvoreného myšacou kožou, z ktorých je zrejmý postup expresie syndekanu po expozícii materiálu UV žiarením. Na obr. 2A je znázornená normálna koža a na obr. 2 B a 2C sú ilustrované rôzne štádiá hyperplázie, pričom z rezu na obr. 2C je zrejmá určitá malígna histológia. Tieto obr. ukazujú, že premalígna hyperplázia, ktorá je indukovaná UV žiarením, je charakterizovaná postupnou stratou expresie syndekanu.

Z uvedeného je zrejmé, že epitelové bunky in vivo a uložené vo svojom normálnom prostredí strácajú v priebehu malígnej transformácie schopnosť exprimovať syndekan, čo opäť ukazuje, že expresia syndekanu je nutná pre normálnu morfológiu buniek a integritu tkaniva a že je možné korelovať pokles expresie syndekanu s vážnosťou dysplázie a malígnym charakterom epitelových buniek.

Pri tretej modelovej skúške bol použitý bodovo mutovaný gén c-Ha-ras transfekovanej myšacej mammámej epitelovej bunkovej línie. Pri týchto bunkách NOG-8 ras je gén c-Ha-ras kontrolovaný promótorom MMTV-LTR a jeho expresiu je možné teda regulovať dexamethasónom (Ciardiallo s ďalší (1989). Keď tieto bunky exprimovali gén c-Ha-ras, vytvárali na miske s bunkovou kultúrou ohniská a kolónie v suspenzii. Bunky NOG-8 ras pestované v miske s bunkovou kultúrou exprimovali syndekan v rovnakom množstve ako normálne bunky v subkonfluentnom stave. Expresia syndekanu však výrazne poklesla pri transformácii fenotypu týchto buniek, t. j. na miske sa vyskytovali ohniská alebo bunky rástli vo forme kolónii v suspenzii. Hladina syndekovanej mRNA však vo všetkých týchto rôznych kultúrach zostala na rovnakej úrovni. Je teda regulácia povrchového bunkového syndekanu pri týchto bunkách organizovaná posttranskripčne. Tieto výsledky ukazujú, že spoločným úkazom je, že sa v priebehu transformácie znižuje expresia syndekanu, pričom však spôsob jej regulácie sa bude pri rôznych transformovaných bunkách meniť podľa ich typu.

Príklad straty expresie syndekanu pôsobením onkogénu je znázornený na obr. 3A a 3B.

Na obr. 3A je ilustratívna fotografia ukazujúca suspenziu myšacích mammárnych epitelových buniek, pestovaných v monovrstvách, pričom jedna vrstva bola transformovaná ras-onkogenom. Na obr. 3B je graficky znázornený obsah syndekanu na povrchu buniek, v prípade monovrstiev, ktoré sú znázornené na obr. 3A. Expresia syndekanu bola kvantitatívne stanovená pri všetkých epitelových bunkách, pestovaných v monovrstvách a, b, c, f a po indukcii ras v suspenzii d. Ako je zrejmé, z transformovaných myšacích epitelových buniek sa stráca syndekan.

Z uvedenej skúšky je tiež zrejmé, že sa malígna transformácia vyvolaná onkogénom taktiež prejavila stratou syndekanu z povrchu epitelových buniek, čo ukazuje, že strata syndekanu je spoločným znakom malígnych transformácií a že detekcia tejto straty predstavuje cenný diagnostický prostriedok na stanovenie transformácií rakovinového typu a ich prudkosti.

Existujú tri prednostné postupy, ako stanoviť obsah syndekanu spôsobom podľa tohto vynálezu, t. j. postup biochemický, imunochemický a molekulámo biologický. Prvý z týchto postupov je založený na biochemickom rozo znaní syndekanu, ktorý môže byť súčasťou jadrového proteinu alebo kovalentne viazaných reťazcov GAG. Ukázalo sa, že syndekan môže vykazovať špecifické reťazce GAG, ktoré mu môžu udeľovať špecifické interakcie (Elenius a ďalší (19941 J. Biol. Chem. 265: 17837 - 17943; Salmivirta a ďalší (1991) J. Biol. Chem. 266: v tlači). Syndekan teda môže byť detegovaný pomocou špecifického ligandu pre syndekan. Pri iných vhodných metódach sa však používajú protilátky, ktoré sú špecifické pre syndekan a cDNA a ktoré sú opísané.

Klonovaním humánneho syndekanu (Mali a ďalší (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884 - 6889) alebo jeho izoláciou z humánnych zdrojov, ako napríklad humánna mammáma bunková línia HBL-100 (Elenius a ďalší (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837 - 17843) je možné vyrábať protilátky proti humánnemu syndekanu. To sa môže realizovať tak, že sa zvieratá imunizujú s cieľom tvorby polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok alebo sa bunky pestujú in vitro s izolovaným intaktným humánnym syndekanom, jeho fragmentmi, syntetickými peptidami alebo štiepnymi proteínmi, predpovedanými humánnym cDNA klonom, s cieľom tvoriť monoklonálne protilátky. Pri praktickej realizácii tohto vynálezu sa pri stanovení obsahu syndekanu môže používať konvenčná technika molekulárnej biológie mikrobiológie, rekombinantná DNA-techniky a imunologické techniky. Tieto techniky sú podrobne vysvetlené v literatúre, pozri napríklad Current Protocols in Immunology (1990), Greene Publishing Associates a John Wiley & Sons, Inc.

Pri použití humánnych syndekan-špecifických protilátok sa môže študovať klasickými imunohistologickými metódami expresia syndekanu v tkanivách, pozri napríklad model ilustrovaný na obr. 2A až 2D. Pri týchto metódach sa špecifické rozoznanie dosiahne pomocou primárnej protilátky (polyklonálna alebo monoklonálna) ale sekundárny detekčný systém môže používať fluorescenčné, enzýmové alebo iné konjugované sekundárne protilátky. Ako výsledok sa získa imunohistologické zafarbenie rezu tkaniva pre patologické vyhodnotenie. Tkanivá je možné taktiež extrahovať, napríklad močovinou alebo neutrálnym detergentom, s cieľom uvoľniť syndekan na stanovenia metódou Westem blot alebo stanovenia „dot(sloť') lalkanen a ďalší (1985) J. Celí Biol. 105: 976 - 985; Jalkanen a ďalší (1987) J. Ccll Biol. 105: 3037 - 3096). Pri tejto technike, ktorá je založená na použití katiónových pevných fáz sa môže kvantitatívne stanoviť syndekan pri použití izolovaného syndekanu ako štandardu. Táto technika sa môže tiež použiť pri telesných tekutinách. S týmito vzorkami je možné molámu koncentráciu syndekanu použiť na stanovenie štandardných hodnôt obsahu syndekanu v rôznych telesných tekutinách, ako je sérum, plazma, moč, miechový mok atď. Normálne hladiny syndekanu je možné zistiť z hodnôt nameraných u zdravých dobrovoľníkov, pričom tieto štandardné hodnoty sa potom porovnávajú s hodnotami nameranými u osôb trpiacich rôznymi chorobnými stavmi.

Zmeny expresie syndekanu je tiež možné detekovať pri použití syndekanovej cDNA, ako je humánna syndekanová cDNA. Hoci je syndekan medzi rôznymi druhmi dobre konzervovaný, štrukturálne rozdiely na úrovni nukleotidov sú dostatočne veľké, že to bráni použitiu myšacieho syndekanu pri detekcii humánnej syndekanovej mRNA. Obvykle je možné hladinu mRNA daného génového produktu detegovať na základe špecifickej interakcie negatívnej a pozitívnej formy rovnakého nukleotidového reťazca, v tomto prípade foriem syndekanu. Pritom sa môžu používať techniky in situ pre tkanivové vzorky, skúšky ochrany mRNA pre izolovanú RNA alebo polymerácie syndekan-špecifických nukleotidových reťazcov riadenej primérom. Všetky tieto techniky sú dobre vysvetlené v literatúre, ako napríklad v uvedenej publikácií Current Protocols in Molecular Biology.

Špecifické spôsoby podľa tohto vynálezu sú uvedené v nasledujúcich príkladoch. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a vynález sa neobmedzuje na konkrétne rozvedenia, ktoré sú v nich uvedené.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad I

Lokalizácia syndekanu v transformovaných epitelových bunkách

Zásobné bunky myšacieho mammámeho tumoru Shionogi SI 15 sa obvyklým spôsobom kultivujú v DMEM) Dulbecco-om modifikované Eagle-ovo médium), doplnené 5 % teplom inaktivovaného fetálneho teľacieho séra (i-FCS), pyruvátom (1 mM), glutaminom (1 mM), penicilínom (100 IU(ml), streptomycínom (100 pg/ml) a testosterónom (10 nm). Pri štúdiách zahrnujúcich spracovanie hormónom sa používa rastové médium doplnené 4 % fetálneho teľacieho séra spracovaného dextranovým aktívnym uhlím (DC-FCS) s alebo bez 10 nm testosterónu a/alebo 1 μΜ cyproteronacetátu. Pri experimentoch sa bunky nanesú na Nunc-ovu tkanivovú kultúru, umiestnenú v miskách pre tkanivové kultúry, pri hustote 10 000 buniek na cm². Pre počítanie buniek sa bunky lyžujú v lOmM Hepes, l,5mM chloride horečnatom s obsahom Zaboglobínu (Ceulter Electronics, Ltd./ a uvoľnené jadrá sa suspendujú^v Isotone (Coulter) a nakoniec spočítajú v Coulterovom počítači buniek.

Štvrtý deň sa bunky SI 15 v intaktnej kultúre farbia spôsobom opísaným v Jalkanen a ďalší (1985) J. Celí Biol. 101: 976 - 984). Povrchový bunkový proteoglykan, syndekan sa imunolokalizuje potkaňou monoklonálnou protilátkou 281-2 proti jadrovému proteínu proteoglykanu (Jalkanen a ďalší (1985) j. Celí Biol. 101: 976 - 974) a vyfarbenie sa kontroluje pomocou ďalšej IgG_2a monoklonálnej protilátky Mel-14, ktorá je špecifická pre lymfocytový receptor (lymphocyte homing receptor) (Gallatin a ďalší (1981) Náture 304: 30 - 34). Detekcia imobilizovaných protilátok sa urobí králičím protipotkaním FITC-konjugátom (Janssen Biochimica).

Príklad II

Detekcia pozmenenej expresie syndekanu pri transformácii epitelových buniek vyvolanej hormónom

Na kvantitatívne stanovenie syndekanu na povrchu buniek SI 15 sa bunkové monovrstvy niekoľkokrát premyjú chladným PBS a ektodoména molekuly sa uvoľní hovädzím pankreatickým trypsínom (Sigma, typ III 20 gg/ml) 10-minútovou inkubáciou na ľade, spôsobom opísaným v Rapraeger a Bemfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632 až 3636 (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103 - 4109). Po inaktivácii trypsínu inhibítorom trypsínu P100 pg/ml) sa bunky odstredia, oddelí sa supematant pre kvantitatívne stanovenie ektodomény a bunky sa suspendujú v Isotone, z dôvodu ich spočítania. Monoklonálna protilátka 281-2 sa jóduje rádioaktívnym jódom oxidačnou metódou pomocou chloramínu-T (Stähli a ďalší (1983) Meth. Enzymol. 92: 242 - 253) do dosiahnutia špecifickej aktivity 14,1 . 10⁶ cpm/pg. Pri skúške sa v zariadení so štrbinou (Minifold-slot Apparatus, Schleicher & Schuell) na katiónovú nylonovú membránu (Zeta-Probe, BioRad) nanesie supematant z 2 x 10⁵ buniek

SK 281583 Β6 a prečistený kontrolný syndekan z buniek NMuMG, spôsobom opísaným predtým (Jalkanen a ďalší (1987) J. Celí Biol. 105: 3087 - 3096). Membrána sa vyjme zo štrbinového zariadenia a inkubuje 1 hodinu pri teplote miestnosti v PHS, doplnenom 10 % FCS s cieľom blokovania membrány. Potom sa urobí inkubácia cez noc pri 4°C v PBS s obsahom 1251-označeného 281-2 (10 000 cpm/ml). Po päťnásobnom premytí filtra PBS sa urob! expozícia na film Kodak X-Omat, s cieľom vizualizácie viazanej látky 281-2, Na kvantitatívne stanovenie sa každá štrbina analyzuje laserovým densitometrom (LKB Ultroscan XL enhanced Zaser densitomcter/a porovná sa so známym množstvom syndekanu z buniek NMuMG.

Ektodomény, uvoľnené trypsínom z buniek S115 sa vyzrážajú etanolom a frakcionujú na gradientovom (4 až 10 %) géli SDS-PAGE (O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007 - 4021). Po elektroforéze sa vzorky transformujú na membránu Zeta-Probe pomocou elektroblotovacieho zariadenia 2005 Transphor Apparatus (LKB), spôsobom opísaným predtým (Jalkanen a ďalší (1985) J. Celí Biol. 101: 976 - 984; Rapraeger a ďalší (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046 - 11052) a membrána sa exponuje 1251-označenej látke 281-2, spôsobom uvedeným. Opäť i tuje možné použiť na porovnanie izolovanú syndekanovú ektodoménu z buniek NMuMG.

Príklad III Detekcia pozmenenej expresie syndekanového génu v transformovaných epitelových bunkách

Pri použití 4M izotiokyanátu guanidínu a peletizácie pomocou chloridu cesného (pozri Chirgwin a ďalší (1979) Biochem. 18: 5294 - 5299) sa izoluje celková RNA. Alikvóty RNA s hmotnosťou 15 gg sa frakcionujú na agarosovom géli s formaldehydom (1 %) a prenesú na membránu Gene Screen Plus. Vykoná sa hybridizácia s insertom cDNA próby PM-4 pre syndekan, označeným multiprimom (Amersham) (Saundera a ďalší (1989) J. Celí Biol. 108: 1547 - 1556), za podmienok navrhnutých výrobcom membrány (New England Nuclear). Imobilizovaná próba sa vizualizuje expozíciou membrány na film Kodak X-Omat pri 70 °C a kvantifikácia 2,6 kb mRNA sa urobí opísanou densitometrickou analýzou. Expresia syndekanovej mRNA sa koreluje s ribozomálnou RNA spôsobom opísaným v Denis a ďalší (1988 Nucl. Acid. Res. 16: 2354 až 2359. Špecifičnosť potlačenia syndekanu sa ďalej študuje na rovnakých vzorkách, pri ktorých sa zisťuje pomer glyceraldehyd 3-fosfát-dehydrogenázy (GAPDH) % Fort a ďalší (1985) Nucl. Acid. Res. 13: 1431 - 1442 a myšacieho alfa-aktínu (Minty a ďalší (1981) J. Biol. Chem. 256: 1008 až 1014).

Hybridizácia cRNA in situ pri parafínových rezoch sa robí spôsobom opísaným vo Wilkinson a ďalší (1989) Developm. 105: 131 - 136. 535bp fragment Sac I-Κηρ I z čiastočného cDNA klonu pre myšací syndekan (PM-4) (Saunders a ďalší (1989) J. Celí Biol. 108: 1547 - 1556) sa subklonuje (Vainio a ďalší (1991) Development, v tlači) do riboprobového pGEM-4Z vektora (Promega, Madison, WI). Klonovaný plazmid obsahujúci insert sa linearizuje enzýmom Eco RI alebo Hind III a vyrobia sa negatívne alebo pozitívne transkripty z komplementárnych reťazcov pomocou jednak T7- a jednak SP6-polymerázy, za prítomnosti ³⁵S-UTP (Amersham, Willshire, Veká Británia). Maximálna dĺžka transkriptov sa alkalickou hydrolýzou zníži na hodnotu pod 200 bp a frakcia s najvyššou špecifickou aktivitou sa zhromaždí, vyzráža a rozpustí v hybridizačnom pufri. Dopredu upravené preparáty sa hybridizujú cez noc pri 50 °C a nešpecifický viazaná próba sa odstráni (pomo cou dôkladného premytia a spracovania ribonukleázou A) a uvedeným postupom sa zariadi autoradiografia (Wilkinson a ďalší (1989) Development 105: 131 - 136).

Príklad IV

Detekcia pozmenenej expresie syndekanu v tkanivových rezoch odobratých z nádoru

U samcov svetlo pigmentovanej lysej myši kmeňa hr/hr C3H/Tif (Bomholdgaard, Dánsko) sa vyvolávajú nádory tým, že sa zvieratá ožiaria ultrafialovým žiarením UV-A a UV-B, spôsobom, opísaným v Talve a ďalší (1990) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 7: 109 - 115. V priebehu času pozorovania (12 mesiacov) sa vyskytne celkom 83 papilómov, 2 keratocanthomy, 4 skvamoceluláme karcinómy, 1-kombinovaný karcinómsarkóm a 11 sarkómov, pričom zvýšená tvorba nádorov je spojená s vysokou intenzitou žiarenia UV-A (582 J/cm²) plus vysokou intenzitou žiarenie UV-B (erytemálne účinná - EE) (1,0 J/cm²) plus vysokou intenzitou UV-B(EE) (0,8 J/cm²) (78/28 nádorov). Vzorky sa odoberú zo všetkých väčších pozorovateľných nádorov, rovnako tak ako z normálne vyzerajúcej kože exponovanej UV žiarením. Časť vzoriek sa fixuje v 10 % tlmenom formalíne, uloží do parafínu a vyrobia sa rezy, ktoré sa obvyklým spôsobom zafarbia hematoxylínom a eosínom. Zvyšok vzoriek sa zmrazí v kvapalnom dusíku a nareže. Lézia sa klasifikuje podľa štandardných histopatologických kritérií. Pre vizualizáciu podkladových membrán, ako i Herovicovho, Weigertovho, Massonovho trichrómu a Gomoriho škvŕn pri type kolagénu ako i u iných škvŕn sa v niektorých prípadoch použije Schiffoo farbenie kyselinou jodistou (PAS) a podľa potreby sa urobí elektrónová mikroskopická analýza.

Pre imunohistologickú lokalizáciu syndekanu sa použije potkania monoklonálna protilátka 281-2. Táto protilátka je špecifická pre jadrový proteín myšacej syndekanovej ektodomény (18). Na detekciu imobilizovanej látky 281-2 sa použije technika s avidinbiotín-imunoperoxidázou, ktorá je opísaná v Hsu a ďalší (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577 - 580). Po deparafinizácii a rehydratácii tkanivových rezov sa aktivita endogénnej peroxidázy zablokuje inkubáciou preparátov v 100 % metanole obsahujúcom 3 % peroxidu vodíka počas 30 minút. Potom sa rezy inkubujú s 2 % normálnym kozím sérom (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) v Tris-tlmenom soľnom roztoku, pH 7,4 (TBS) počas 30 minút pri teplote miestnosti, aby sa minimalizovalo nešpecifické farbenie. Rezy sa pokryjú primárnou protilátkou 281-2 pri koncentrácii proteínu 2 gg/ml v BSA-TBS v koncentrácii 10 g/1, potom sa vykoná inkubácia cez noc pri 4 °C. Potom sa preparáty inkubujú s biotinylovaným kozím protipotkaním IgG (Jackson's Pennsylvania) pri riedení 1 : 1000 v 1 % BSA-TBS počas 30 minút pri teplote miestnosti a nakoniec s avidínbiotín-peroxidázovým komplexom (súprava Vectastain, Vector Laboratories, Burlingame, CA) počas 30 minút pri teplote miestnosti. Po premytí sa aktivita peroxidázy demonštruje inkubáciou preparátov s 0,5 mg/ml 3,3'-diamino-bcnzidíntctrahydrochloridom (DAB, Polysciences, Inc., Northhampton, Veľká Británia) v TBS s obsahom 0,68 mg) ml imidazolu a 0,01 peroxidu vodíka počas 5 minút v tme. Preparáty sa slabo protiofarbia Mayer-ovým hematoxylínom a uložia do média Depex Mounting Médium (BDH Limited Pool, Veľká Británia). Medzi všetkými stupňami sa preparáty trikrát premyjú Tris-tlmeným soľným roztokom (TBS). Pri kontrolných rezoch sa používa normálny potkaní IgG (Sigma, St. Luis, MO) v koncentrácii 2 gg/ml. Taktiež sa zafarbí niekoľko zmrazených rezov z tumoru každého typu, pričom sa dosiahne rovnaká imunoreaktivity ako pri tkanivových rezoch, ktoré sú uložené v parafíne. Zmeny koncentrácie primárnej protilátky a inkubačného času významne nezmení profil farbenia.

Príklad V

Detekcia pozmenenej expresie syndekanu pri transformácii indukovanej ras-onkogénom

Bunky NOG-8 predstavujú subklon normálnej epitelovej bunkovej línie myšacej mliečnej žľazy NMuMG. Bunky NOG-8 ras sú líniou buniek NOG-8, ktorá bola transfekovaná plazmidom obsahujúcim glukokortikoidom indukovateľný promótor LTR, viazaný k miestu mutovaného génu c-Ha-ras. Bunky sa nechajú rásť v kultivačnom médiu RPMI 1640 (Gibco), doplnenom 5 % fetálneho teľacieho séra, spracovaného 5 % dextránovým uhlím (DCC-FCS), glutamínom, penicilínom (100 IU/ml) a streptomycínom (100 pg/ml). Pri týchto bunkách sa môže expresia génu c-Ha-ras maximálne indukovať prídavkom dexametasonu (1 μΚ) (Sigma) ku kultivačnému médiu. Na odstránenie prídavných steroidov zo séra sa použije spracovanie DCC, ktoré môže ovplyvniť expresiu transfekovaného génu. Pri suspenzných kultúrach sa bakteriologické misky pokryjú 1 % agarom (Sigma) v RPMI-1640, aby sa zabránilo možnej adhézii buniek k substrátu. Bunky sa naočkujú v hustote 1 x 10⁵/ml. Počet buniek sa stanoví po trypsinácii pri použití Coulterovho počítača (Coulter Electronics, Hialeah, FL). PM-4 je cDNA próba pre syndekan, pôvodne klonovaná Saundersom a ďalším. (1989) J. Celí Biol. 108: 1547 až 1556. Detekuje 2 pásy 2,6 k8 a 3,4 kB z normálnych myšacích mammámych buniek.

Pri výrobe RNA sa misky pre bunkové kultúry 2 x premyjú ľadovo chladným fosfátovým pufrom tlmeným soľným roztokom (PBS) a potom sa solubilizuje v 4M pufre GIT (4M izotiokyanát guanidínu v 5 mM citrane sodnom (pH 7,0), 0,1 M β-merkaptoetanole a 0,5 % N-laurylsarkosíne). Extrakcia celkovej RNA sa urobí denzitometrickou centrifugáciou pomocou chloridu cézneho (pozri Chirgwin a ďalší (1979) Biochem. 18: 5294 - 5299). Pre analýzu Northern Blot sa vzorky RNA separujú elektroforézou na 1% formaldehydovom agarovom géli. Tieto gély sa blotovaním prenesú na hybridizačnú membránu GeneScreen. Filtre sa predhybridizujú v IM chloride sodnom, 1 % dodecylsulfáte sodnom, 10 % dextransulfáte 5 x v Denhardt-ovom roztoku, 100 pg/ml lososej spermiovej DNA a 50 % formamidu pri 42 °C. Pre hybridizáciu sa pridá multiprimom označená PM-4 alebo BS-9 próba. Používa sa izotop P 32 (Amersham). Filtre sa premyjú pri 65 °C, v prípade PM-4 a pri 60 °C, v prípade BS-9 v 2 x SSC, 1 % dodecylsulfáte sodnom a autografujú na film Kodak X-Omat alebo Fuj i X-ray.

Na kvantifikáciu expresie syndekanu na povrchu buniek sa bunky v kultivačnej miske 3 x premyjú ľadovo chladným PBS. Potom sa misky inkubujú v 0,5 mM draselnej soli ctyléndiamíntctraoctovej kyseliny (K-EDTA) v PBS počas 10 minút pri +4 °C. Pridá sa trypsín (Sigma, T-8128) do konečnej koncentrácie 20 pg/ml a vykoná sa 10-minútová inkubácia pri +4 °C. Trypsín uvoľní syndekanovú ektodoménu do média (Rapraeger a Bemfíeld (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103 - 4109). Bunky sa zoškrabú gumovou stierkou alebo sa kolónie suspendujú a pridá sa inhibítor trypsínu (Sigma, T-9128) až do koncentrácie 100 pg/ml. Bunky sa odstredia (5 minút, 100 x g) supematant sa zhromaždí a bunky sa spočítajú v Coulterovom počítači. Bunky v suspenzii sa zhromaždia v skúmavke a kolónie sa nechajú 5 min. sedimentovať, potom sa odstráni supernatant podobne ako pri kultúrach v Petriho miskách.

Kolónie sa 3 x premyjú ľadovo chladným PBS a potom sa na ne pôsobí trypsínom.

Vhodné množstvo supematantu, ktoré zodpovedá počtu 2 x 10⁵ buniek sa biotovanim nanesie na katiónovú nylonovú membránu (Zeta, Proge, Bio-Rad). Membrána sa predinkubuje v inkubačnom pufre (10 % fetálne teľacie sérum, lmM azid sodný, PBS) 1 hodinu pri teplote miestnosti. K inkubačnému pufru sa v konečnej koncentrácii 10 000 cpm/ml rádioaktívne označená (metódou pomocou chloramínu-T) látka MnAb 281 - 2) Jalkanen a ďalší (1987) J. Celí Biol. 105: 3087 - 3096), ktorá rozoznáva ektodoménu syndekanu a zmes sa inkubuje cez noc pri 4° C. Filter sa 10 minút premýva PBS pri teplote miestnosti. Premývanie sa opakuje 10 x a potom sa filter autoradiografuje na rôntgenografický film. Autografie sa analyzujú densitometrom GelScan XL Ultroscan Densitometer (LKB) pomocou softwarc GelScan SL 2400 (LKB) a štandardizujú izolovanou ektodoménou (Jalkanen a ďalší (1987) J. Celí Biol. 105: 3087 - 3096.

Súhrnne je možné konštatovať, že sa vynález hodí na detekciu potenciálne škodlivých transformácií, ktoré sa realizujú prostredníctvom stanovení expresie syndekanu alebo jeho obsahu, napríklad jeho hladiny v tkanivách alebo rôznych telesných tekutinách. Postup je možné realizovať biochemický, imunohistochemicky a molekulárne biologicky, napríklad pri použití syndekan-špecifických ligandov, protilátok (polyklonálnych alebo monoklonálnych) a cDNA. Spôsob je špeciálne zameraný na malígne zmeny epitelových buniek, pri ktorých sa prejavuje v priebehu malígnej transformácie silný pokles expresie syndekanu. Do rozsahu postupu patri tiež analýza expresie syndekanu pri hyperplázii a v tomto prípade má význam pre odhad vážnosti tohto premalígneho stavu, Analýzy expresie syndekanu sú obzvlášť užitočné pri klasifikácii rôznych premalígnych proliferatívnych štádií dysplázií.

Claims (14)

1. PATENTOVÉNÁROKY

   1. Spôsob detekcie malígnych a premalígnych zmien, ako sú malígna transformácia, premalígna transformácia, hyperplázia alebo morfologické zmeny, v humánnych bunkách, vyznačujúci sa tým, že sa

   a) stanoví obsah syndekanu v bunkách, ktorý je prítomný v prvej tekutine alebo vzorke tkaniva vyšetrovaného človeka, pričom prvá vzorka sa odoberá z tekutiny alebo tkaniva v ktorom je podozrenie na obsah malígnych buniek, premalígnych buniek, hyperplastických buniek alebo buniek, vykazujúcich morfologickú zmenu v porovnaní s ich normálnym stavom;

   b) obsah syndekanu stanovený v stupni a) sa porovná s obsahom syndekanu, stanoveným z druhej vzorky biologického materiálu, pričom druhá vzorka biologického materiálu predstavuje tekutinu alebo tkanivo rovnakého typu, ako je prvá vzorka biologického materiálu, pričom však táto druhá vzorka pochádza z buniek, ktoré sú normálne alebo menej transformované ako bunky v stupni a); a

   c) stanoví sa prítomnosť malígnych alebo premalígnych zmien na základe prítomnosti menšieho množstva syndekanu v prvej vzorke v porovnaní s druhou vzorkou biologického materiálu.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsah syndekanu v prvej vzorke sa stanoví zistením obsahu syndekanového proteínu.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že obsah syndekanového proteínu sa stanoví pri použití protilátky, ktorá je špecifická pre syndekanový proteín.

   SK 281583 Β6
4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsah syndekanu v prvej vzorke sa stanoví zistením obsahu syndekanovej mRNA.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsah syndekanu v prvej vzorke sa stanoví postupom, ktorým sa zisťuje množstvo syndekanovej ektodomény v tejto vzorke.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že sa pred stanovením uvoľní syndekanová ektodoména prvej vzorky z povrchu buniek.
7. 7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa na stanovenie obsahu syndekanu v prvej vzorke použije humánna syndekan-špecifická protilátka.
8. 8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa na stanovenie obsahu syndekanovej mRNA v prvej vzorke použije humánna syndekanová pozitívna mRNA.
9. 9. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa na stanovenie obsahu syndekanovej mRNA v prvej vzorke použije syndekanový pozitívny oligonukleotid.
10. 10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že biologickým materiálom je telesná tekutina.
11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že telesnou tekutinou je plazma.
12. 12. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že telesnou tekutinou je sérum.
13. 13. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že telesnou tekutinou je moč.
14. 14. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že telesnou tekutinou je miechový mok.