CZ282203B6 - Způsob detekce maligních a premaligních změn v humánních buňkách - Google Patents
Způsob detekce maligních a premaligních změn v humánních buňkách Download PDFInfo
- Publication number
- CZ282203B6 CZ282203B6 CS931372A CS137293A CZ282203B6 CZ 282203 B6 CZ282203 B6 CZ 282203B6 CS 931372 A CS931372 A CS 931372A CS 137293 A CS137293 A CS 137293A CZ 282203 B6 CZ282203 B6 CZ 282203B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- syndecan
- sample
- cells
- content
- malignant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Způsob spočívá v tom, že se a/ stanoví obsah syndekanu v buňkách, který je přítomen v první tekutině nebo vzorku tkáně vyšetřovaného člověka, přičemž první vzorek se odebírá z tekutiny nebo tkáně, u níž je podezření na obsah maligních buněk, premaligních buněk, hyperplastických buněk nebo buněk, vykazujících morfologickou změnu ve srovnání s jejich normálním stavem; b/ obsah syndekanu stanovený ve stupni a/ se porovná s úrovní syndekanu, získanou z druhého vzorku biologického materiálu, přičemž druhý vzorek biologického materiálu představuje tekutinu nebo tkáň stejného typu, jakého je první vzorek biologického materiálu, přičemž však tento druhý vzorek pochází z buněk, které jsou normální nebo méně transformované než buňky ve stupni a/; a c/ stanoví se přítomnost maligních nebo premaligních změn na základě přítomnosti menšího množství syndekanu v prvním vzorku ve srovnánís druhým vzorkem biologického materiálu.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká oboru biologie, zejména biologie rakoviny, zvláště pak způsobu detekce premaligních nebo maligních tkání.·
Dosavadní stav techniky
Povrchové molekuly buněk, které se uplatňují při specifických interakcích mezi povrchem buňky a extracelulámí matricí (ECM), se nazývají matriční receptory. Rozeznání matrice těmito receptory hraje důležitou úlohu při regulaci tvaru buněk, proliferaci a diferenciaci a je proto kritickým bodem normálního vývoje orgánů a zachovávání architektury tkáně. Známé matriční receptory zahrnují například skupinu transmembránových glykoproteinových receptorů, které mají společné strukturní a funkční vlastnosti a nazývají se integriny (Hyneš R. (1987) Cell 48: 549 až 554). Jedná se o 67-kDa glykoprotein, který se váže k lamininovému řetězci Bl (Graf a další (1987) Cell 48: 65: 989-996) a povrchové buněčné proteoglykany (PG), které v závislosti na složení glykosaminoglykanu (například heparansulfátu) mohou interagovat s různými molekulami matrice (Jalkanen M. (1987) Med. Biol. 65: 41 až 47).
Adheze, šíření, proliferace a diferenciace buněk jsou založeny na těsném kontaktu mezi povrchem buněk a obklopující extracelulámí matricí (ECM). Selektivní použití interakce ligandreceptor může in vivo vytvořit různorodé specifické interakce buňka-matrice, kterých je zapotřebí pro vývin orgánů (Ekblom a další (1986) Ann. Rev. Cell Biol 2: 27-47). O transformaci je známo, že mění odpověď buněk na ECM (Liotta L. (1986) Cancer Res. 46: 1-7), čímž vzniká možnost vzniku změn v expresi matričních receptorů maligními buňkami (Plantefaber a Hyneš (1989) Cell 56: 281-290, Cheresh a další (1989) Cell 57: 59-69). Tyto změny jsou ve značném rozsahu neznámé, ale mohou mít rozhodující úlohu při vzniku maligního chování různých typů buněk.
Proteoglykan povrchových buněk z epitelových buněk myší prsní žlázy se skládá z lipofilní membránové domény (Rapraeger a Bemfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636, (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109) a z matricové interagující ektodomény, která obsahuje heparinsulfátové a chondroitinsulfátové řetězce (Rapraeger a další (1985) J. Biol. Chem 260: 11046-11052). Nedávné cDNA-klonování myšího a humánního syndekanu potvrdilo existenci těchto funkčních domén v jádrovém proteinu a tento buněčný proteoglykan (PG) byl označen názvem syndekan (Saunders a další (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556, Mali a další (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). Ektodoména syndekanu je rozeznána mAb 281-2 (Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984, Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096) a s vysokou afinitou se váže ke kolagenovým fibrilám typu I, III a V (Koda a další (1985) J. Biol. Chem. 260: 8157-8162) a s nižší afinitou k doméně fibronektinu vázající C-terminální heparin (Saunders a Bemfield (1988) J. Cell. Biol. 106: 423-430), thrombospondinu (Sun a další (1989)
J. Biol. Chem. 264: 2885-2889) atenascinu (Salmivirta a další (1991) J. Biol. Chem. 266: v tisku). Vazba ligandu povzbuzuje asociaci membránové domény k cytoskeletu, bohatému na aktin (Rapraeger a další (1986) J. Cell Biol. 103: 2683-2696). Buňky epitelu však také mohou uvolnit ektodoménu z povrchu buněk proteolytickým rozštěpením jádrového proteinu, čímž dojde k oddělení ektodomény od membránové domény (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096, Weitzhandler a další (1988) J. Biol. Chem. 263: 6949-6952). Syndekan tedy může vázat cytoskelet epitelu k matrici, ale také uvolňovat asociaci epitelu s matricí. Těmito asociacemi může syndekan zprostředkovat organizaci matrice do buněčné organizace a ovlivňovat chování buněk. Jelikož syndekan interaguje hlavně se stromálními složkami, jako jsou kolagenové fibrily a fibronektin, může sloužit ke komunikaci mezi epitelovou
- 1 CZ 282203 B6 a mesenchymální tkání. Tento typ komunikace má rozhodující význam při normální diferenciaci epitelu a tvorby orgánů.
Exprese syndekanu v průběhu vývoje a tvorby orgánů sleduje spíše morfogenetická a nikoliv histologická rozhraní (Thesleff a další (1988) Dev. Biol. 189: 565-572), což je znak, který rovněž podporuje aktivní roli syndekanu, jakožto matričního receptorů v průběhu vývoje. Syndekan byl lokalizován hlavně v různých epitelových buňkách (Hayashi a další (1987) J. Histotochem. Cytochem. 35: 1079-1088), ale vyskytuje se také na povrchu buněk plazmy (Sanderson a Bemfield (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 9562-9566). Syndekan se také vyskytuje v kondenzujícím mesenchymu v sousedství pučícího epitelu při tvorbě orgánů (Thesleff a další (1988) Dev. Biol. 189: 565-572). Ukázalo se, že jeho exprese v mesenchymu je regulována epitelovým kontaktem jednak v zubu (Vainio a další (1988)) ajednak v metanefrické ledvině (Vainio a další (1989)) a v obou těchto tkáních lze jeho expresi korelovat, jak co do prostoru, tak co do času, s morfogenezí těchto orgánů.
Podstata vynálezu
Úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob detekce premaligních a maligních tkání prostřednictvím detekce ztráty syndekanu z těchto tkání.
Dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob detekce premaligních nebo maligních tkání prostřednictvím detekce přítomnosti syndekanu v tělesných tekutinách.
Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob, který by byl adaptovatelný zejména pro detekci maligních nebo premaligních tkání u člověka.
Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout biochemickou, imunohistologickou nebo molekulárně biologickou metodu stanovení exprese syndekanu nebo obsahu syndekanu v tkáních nebo tělesných tekutinách, za účelem zjištění maligních nebo premaligních transformací v buňkách.
Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob zjišťování hyperplastických změn v buňkách.
Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob detekce předpokládaných hyperplastických změn v buňkách.
Ještě dalším úkolem vynálezu je vyvinout způsob detekce předpokládaných morfologických změn v buňkách.
Úkolem vynálezu je také vyvinout způsob kvantitativního stanovení syndekanu v tkáních nebo tělesných tekutinách za účelem stanovení jeho indikátorové hodnoty.
Obecně lze shrnout, že podle nejširšího aspektu, je předmětem tohoto vynálezu způsob detekce potenciálně škodlivých transformací buněk organismu, jehož podstata spočívá v tom, že se stanoví indikátor obsahu syndekanu ze vzorku biologického materiálu organismu a stanovený indikátor obsahu syndekanu se porovná s indikátorem obsahu syndekanu z referenčního biologického materiálu, přednostně z materiálu stejného typu.
Způsob podle vynálezu je možno provádět různými metodami, které zahrnují biochemické, imunohistologické a molekulárně biologické typy metod. Způsob je sice aplikovatelný pro zjištění škodlivé transformace, jako je maligní nebo premaligní stav u mnoha druhů organismů, je však zejména adaptovatelný pro detekci škodlivých transformací v buňkách, zejména
-2CZ 282203 B6 humánních buňkách. Transformace, které je možno stanovit, zahrnují premaligní a maligní transformace, včetně hyperplastických a morfologických změn.
Detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti syndekanu se může provádět v různých biologických materiálech pocházejících z organismu, jako jsou buňky, tkáně a tělesné tekutiny, z nichž lze, zejména v případě humánních biologických materiálů, jmenovat zvláště sérum, plazmu, moč, míšní mok nebo jiné tkáňové extrakty. Detekce obsahu syndekanu· v biologických materiálech se může provádět za použití různých prostředků, jako například syndekan-specifických ligandů nebo biochemických determinantů, syndekan-specifických protilátek a syndekanových io antimediátorových mRNA a cDNA nebo oligonukleotidů.
Další znaky a aspekty vynálezu a výhody, které vynález přináší, jsou zřejmé z následujícího podrobnějšího popisu, který se odkazuje na přiložený výkres.
Přehled obr, na výkrese
Na obr. IA je graficky znázorněna závislost obsahu syndekanu na povrchu buněk na čase, která ilustruje ztrátu syndekanu v myších mammámích epitelových buňkách, transformovaných 20 expozicí testosteronu.
Na obr. 1B je graficky znázorněna závislost exprese syndekanové mRNA na čase, která ilustruje ztrátu syndekanu v myších mammámích epitelových buňkách, transformovaných expozicí testosteronu.
Na obr. 2A až 2D jsou ilustrativní fotografie řezů biologického materiálu, tvořeného myší kůží, z nichž je zřejmý postup exprese syndekanu po expozici materiálu UV záření.
Na obr. 3A je ilustrativní fotografie ukazující suspenzi myších mammámích epitelových buněk, pěstovaných v monovrstvách, přičemž jedna vrstva byla transformována rasonkogenem.
Na obr. 3B je graficky znázorněn obsah syndekanu na povrchu buněk, v případě monovrstev, které jsou znázorněny na obr. 3 A.
Předložený vynález je zčásti založen na poznatku, že detekce syndekanu je cenným diagnostickým kriteriem pro zjištění případných malignancí v biologických materiálech, jako jsou epitelové buňky. Jsou uvedeny příklady tří různých druhů experimentálně indukovaných transformací (hormonální indukce, UV-dráždění a onkogenová indukce) a ve všech těchto případech je zřejmý úbytek syndekanu. Detekce ztráty syndekanu je také cenná při jiných mechanismech, které vedou ke transformacím majícím za následek vznik nádorů a v důsledku toho se vynález neomezuje pouze na výše uvedené případy. Tak například detekce syndekanu může poskytnout cenné informace také při různých proliferačních stadiích tkání (například kůže, ledvin, mozku, plic a močového měchýře), které se později mohou zvrhnout do malignějšího stádia. Tyto tzv. premaligní stavy, které se často projevují jako dysplasie, jsou charakteristické různou úrovní syndekanu. Tato úroveň syndekanu představuje informaci, která je potřebná pro odhad vážnosti choroby, který je pak důležitý pro určení vhodného terapeutického postupu.
Důležitou oblastí detekce syndekanu jsou také buňky cirkulující v plazmě. Jejich analýza způsobem podle vynálezu, za použití syndekan-specifických protilátek, jako je například analýza 50 FACS (fluorescent .activated cell sorter) poskytuje cenné informace o patofyziologickém stavu pacienta s lymphoma, myeloma, leukémií nebo jinými proliferativními stavy hematopoietických buněk.
- j CZ 282203 B6
Je rovněž známo, že syndekan se uvolňuje z povrchu buněk (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096) a v případě určitých chorob může mít ztráta syndekanu z povrch buněk za následek, že se syndekan objeví v tělesných tekutinách. V souladu s jedním aspektem tohoto vynálezu má diagnostickou hodnotu měření obsahu syndekanu v séru, plazmě, moči, míšním moku nebo jiných tkáňových extraktech, za účelem zjištění, do jaké míry došlo k destrukci tkáně a ztrátě normální morfologie buněk ve studovaných tkáních.
Jak již bylo uvedeno výše, syndekan představuje proteoglykan povrchu buněk, který- se skládá z kovalentně vázaných glykosaminoglykanových (GAG) řetězců a jádrového proteinu uloženého v membráně (Saunders a další (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556). Řetězce GAG syndekanu náleží, jak známo, ke skupině heparansulfátu a chondroitinsulfátu (Rapraeger a další (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052) a nejsou omezeny na syndekan. Jádrový protein syndekanu je jedinečný a definuje tuto molekulu jakožto člen ze souboru několika podobných povrchových buněčných proteoglykanů (Mali a další (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). Murinní (pocházející z hlodavců) syndekan byl původně izolován a ještě i nyní je obvykle detekován pomocí monoklonální protilátky (MnAb 281-2) proti jádrovému proteinu syndekanu (Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984).
Za účelem dalšího vysvětlení vynálezu byla analyzována exprese syndekanu, ve vztahu k indukci maligního fenotypu u tří různých nezávislých biologických modelů, u nichž vždy došlo k maligní transformaci epitelových buněk. U všech těchto modelů byla současně s maligní transformací pozorována ztráta exprese syndekanu. Tyto výsledky byly získány při následujících modelových zkouškách, jejichž účelem je blíže ilustrovat tento vynález.
Při prvním modelu bylo použito buněčné linie mammámích nádorových buněk myši Shionogi 115 (SI 15). Tyto buňky představují vynikající model pro studie transformovaného fenotypu, protože vykazují odpověď na androgeny, která se projevuje zvýšením rychlosti jejich růstu (Ring a další (1976) J. Steroid Biochem. 7: 869-873) a změnou zepitelové na fibroblastickou morfologii (Yates a Ring (1981) Cancer Res. 41: 258-262). Za přítomnosti androgenu vykazují buňky volnou adhezi ke spodní vrstvě (substrátům) a nabývají schopnosti růst v suspenzi bez zakotvení k matrici. Za nepřítomnosti androgenu buňky těsně lnou k matrici a v suspenzi vůbec nerostou (Yates a Ring (1981) Cancer Res. 41: 258-262). Podstata této morfologické změny a nezávislosti na ukotvení je do značné míry neznáma, ačkoliv bylo navrženo několik mechanizmů, včetně změny cytoskeletální organizace (Couchman a další (1981) Cancer Res. 41: 263-269) a paracrinních mechanizmů (Darbre a Ring (1988) publikace Breast Cancer: Cellular and Molecular Biology, red. Μ. E. Lippman a R. B. Dickson, Academie Publishers, str. 307 až 341).
Buňky SI 15 ošetřené testosteronem vykazovaly silně RGDS-závislou vazbu k fibronektinu (FN), ale žádnou vazbu k doméně fibronektinu vázající heparin, což ukazuje, že exprimují molekuly typu integrinu. Namísto toho, buňky SI 15 pěstované bez testosteronu vykazovaly epitelovou morfologii a vazbu k doméně fibronektinu vázající heparin, což ukazuje, že došlo ke změně exprese syndekanu v buňkách SI 15, které byly ošetřeny testosteronem. U buněk SI 15, které byly ošetřeny testosteronem, došlo jak k poklesu množství ektodomény syndekanu vázající matrici (kvantitativně stanovenému radioimunostanovením a metodou Western blot), tak k poklesu množství syndekanové mRNA (2,6 kb). Přídavek antiandrogenního cyproteronacetátu ke kultivačnímu médiu měl opačný účinek než testosteron na syndekanovou mRNA. Inaktivace syndekanového genu a v důsledku toho potlačení exprese syndekanu, má vztah ke změněným adhezním vlastnostem, vymizení epitelového fenotypu a na druhé straně, objevení se fenotypu transformovaného typu u buněk S115, které byly ošetřeny testosteronem.
Příklad výsledků získaných při výše uvedené zkoušce je znázorněn na obr. IA a IB. Na obr. IA je uvedena srovnávací grafická reprezentace závislosti obsahu povrchového buněčného syndekanu na čase. Tato závislost ilustruje pokles obsahu syndekanu v myších mammámích
-4CZ 282203 B6 epitelových buňkách (SI 15), které byly transformovány expozicí testosteronu. Na obr. IB je uvedena srovnávací grafická reprezentace závislosti obsahu syndekanové mRNA na čase. Tato závislost ilustruje pokles obsahu syndekanu v myších mammámích epitelových buňkách (SI 15). které byly transformovány expozicí testosteronu. Tyto reprezentace ukazují maligní chování a ztrátu exprese syndekanu. které jsou zřejmé u proteinu z obr. 1A a z hladiny mRNA z obr. 1B. po expozici. Z výše uvedeného vyplývá, že přídavek androgenu ke kulturám buněk SI 15 má za následek potlačení exprese syndekanu, k němuž dochází inaktivací syndekanového genu. Toto potlačení dobře koreluje se získáním nezávislosti buněk na ukotvení a se ztrátou epitelového fenotypu a je tedy jedním z důvodů skutečnosti, že buňky SI 15 vykazují za přítomnosti androgenu transformované chování.
Při druhé modelové zkoušce byla studována imunoreaktivita syndekanu u lysých (hr/hr) myší, které byly exponovány ozařování UV-A a UV-B. Pozitivní zabarvení bylo pozorováno na povrchu normálních epidermálních buněk, jakož i v dermálních abortivních vlasových folikulámích cystách, které jsou charakteristické pro tento kmen myší. Také časná reakce na UVozařování, vykazující hyperplastickou epidermis smírnou cellulámí atypičností, byla pozitivní, i když došlo ke sníženému zabarvení povrchu epidermálních buněk. Vzorky s ostrou dysplasií vykazovaly slabé zabarvení ve vrstvě granulámích buněk, zatímco bazální vrstva buněk byla negativní. V papillomech a keratoacanthomech chodidla byla pozorována imunoreaktivita na syndekan, jak v benigních hyperplastických epidermálních buňkách, tak v proliferujících epidermálních buňkách rohovitých cyst. Maligní transformace, která byla vyjádřena jako tvorba karcinomů a sarkomů šupinovitých buněk byla vždy spojena se ztrátou syndekanového zabarvení. Tyto výsledky jsou v souladu s dřívějšími poznatky, že totiž při maligní transformaci pěstovaných epitelových buněk dochází k poklesu exprese syndekanu. Výsledky rovněž ukazují, jakou důležitou úlohu hraje syndekan při udržování normální architektury tkáně a při diferenciačním modelu kůže.
Příklady zabarvení u různých vzorků tohoto typu jsou uvedeny na obr. 2A až 2D. Tyto obr. představují ilustrativní fotografie řezů biologického materiálu, tvořeného myší kůží, z nichž je zřejmý postup exprese syndekanu po expozici materiálu UV záření. Na obr. 2A je znázorněna normální kůže a na obr. 2B a 2C jsou ilustrována různá stádia hyperplasie, přičemž z řezu na obr. 2C je zřejmá určitá maligní histologie. Tyto obr. ukazují, že premaligní hyperplasie. která je indukována UV zářením, je charakterizována postupnou ztrátou exprese syndekanu.
Z výše uvedeného je zřejmé, že epitelové buňky in vivo a uložené ve svém normálním prostředí ztrácejí v průběhu maligní transformace schopnost exprimovat syndekan, což opět ukazuje, že exprese syndekanu je nutná pro normální morfologii buněk a integritu tkáně a že lze korelovat pokles exprese syndekanu s vážností dysplasie a maligním charakterem epitelových buněk.
Při třetí modelové zkoušce bylo použito bodově mutovaného genu c-Ha-ras transfekované myší mammámí epitelové buněčné linie. U těchto buněk NOG-8 ras je gen c-Ha-ras kontrolován promotorem MMTV-LTR a jeho expresi lze tedy regulovat dexamethasonem (Ciardiallo a další (1989). Když tyto buňky exprimovaly gen c-Ha-ras, vytvářely na misce s buněčnou kulturou ohniska a kolonie v suspenzi. Buňky NOG-8 ras pěstované v misce s buněčnou kulturou exprimovaly syndekan ve stejném množství jako normální buňky v subkonfluentním stavu. Exprese syndekanu však výrazně poklesla při transformaci fenotypu těchto buněk, tj. na misce se vyskytovala ohniska nebo buňky rostly ve formě kolonií v suspenzi. Hladina syndekované mRNA však ve všech těchto různých kulturách zůstala na stejné úrovni. Je tedy regulace povrchového buněčného syndekanu u těchto buněk organizována posttranskripčně. Tyto výsledky ukazují, že společným úkazem je, že se v průběhu transformace snižuje exprese syndekanu, přičemž však způsob její regulace se bude u různých transformovaných buněk měnit podle jejich typu.
-5 CZ 282203 B6
Příklad ztráty exprese syndekanu působením onkogenu je znázorněn na obr. 3 A a 3B.
Na obr. 3A je ilustrativní fotografie ukazující suspenzi myších mammámích epitelových buněk, pěstovaných v monovrstvách, přičemž jedna vrstva byla transformována ras-onkogenem. Na obr. 3B je graficky znázorněn obsah syndekanu na povrchu buněk, v případě monovrstev, které jsou znázorněny na obr. 3A. Exprese syndekanu byla kvantitativně stanovena u všech epitelových buněk pěstovaných v monovrstvách a, b, c a f a po indukci ras-onkogenem v suspenzi d. Jak je zřejmé, z transformovaných myších epitelových buněk se ztrácí syndekan.
Z výše uvedené zkoušky je také zřejmé, že se maligní transformace vyvolaná onkogenem rovněž projevila ve ztrátě syndekanu z povrchu epitelových buněk, což ukazuje, že ztráta syndekanu je společným znakem maligních transformací a že detekce této ztráty představuje cenný diagnostický prostředek pro stanovení transformací rakovinového typu ajejich závažnosti.
Existují tři přednostní postupy, jak stanovit obsah syndekanu způsobem podle tohoto vynálezu, tj. postup biochemický,· imunochemický a molekulárně biologický. První z těchto postupů je založen na biochemickém rozeznání syndekanu, který může být součástí jádrového proteinu nebo kovalentně vázaných řetězců GAG. Ukázalo se, že syndekan může vykazovat specifické řetězce GAG, které mu mohou udělovat specifické interakce (Elenius a další (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837-17943, Salmivirta a další (1991) J. Biol. Chem. 266: v tisku). Syndekan tedy může být detegován pomocí specifického ligandu pro syndekan. Při jiných vhodných metodách se však používá protilátek, které jsou specifické pro syndekan a cDNA, které jsou popsány dále.
Klonováním humáního syndekanu (Mali a další) 1990 J. Biol. Chem. 265: 6884-6889) nebo jeho izolací z humáních zdrojů, jako například humánní mammámí buněčné linie HBL-100 (Elenius a další (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837-17843) je možné vyrábět protilátky proti humánímu syndekanu. To se může provádět tak, že se zvířata imunizují, za účelem tvorby polyklonálních nebo monoklonálních protilátek nebo se buňky pěstují in vitro s izolovaným intaktním humáním syndekanem, jeho fragmenty, syntetickými peptidy nebo štěpnými proteiny zakódovanými humáním cDNA klonem, za účelem tvorby monoklonálních protilátek. Při praktickém provádění tohoto vynálezu se při stanovení obsahu syndekanu může používat konvečních technik molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantních DNA-technik a imunologických technik. Tyto techniky jsou podrobně vysvětleny v literatuře, viz například Current Protocols in Immunology (1990), Greene Publishing Associates a John Wiley & Sons, lne.
Za použití humánních syndekan-specifických protilátek se může studovat klasickými imunohistologickými metodami exprese syndekanu v tkáních, viz například model ilustrovaný na obr. 2A až 2D. Při těchto metodách se specifického rozeznání dosáhne pomocí primární protilátky (polyklonální nebo monoklonální) ale sekundární detekční systém může používat fluorescenčních, enzymových nebo jiných konjugovaných sekundárních protilátek. Jako výsledek se získá imunohistologické zabarvení řezu tkáně pro patologické vyhodnocení. Tkáně lze také extrahovat, například močovinou nebo neutrálním detergentem, za účelem uvolnění syndekanu pro stanovení metodou Western blot nebo stanovení dot/slot) Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 105: 976-985, Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). Při této technice, která je založena na použití kationtových pevných fází se může kvantitativně stanovit syndekan za použití izolovaného syndekanu, jako standardu. Této techniky lze také použít u tělesných tekutin. S těmito vzorky lze molámí koncentrace syndekanu použít pro stanovení standardních hodnot obsahu syndekanu v různých tělesných tekutinách, jak je sérum, plazma, moč, míšní mok atd. Normální hladiny syndekanu lze zjistit z hodnot naměřených u zdravých dobrovolníků, přičemž tyto standardní hodnoty se potom porovnávají s hodnotami naměřenými u osob trpících různými chorobnými stavy.
Změny exprese syndekanu je také možno detegovat za použití syndekanové cDNA, jako je humánní syndekanová cDNA. Ačkoliv je syndekan mezi různými druhy dobře zakonzervován.
-6CZ 282203 B6 strukturní rozdíly na úrovni nukleotidů jsou dostatečně velké, že to brání použití myšího syndekanu při detekci humánní syndekanové mRNA. Obvykle je možno hladinu mRNA daného genového produktu detegovat na základě specifické interakce negativní a pozitivní formy stejného nukleotidového řetězce, v tomto případě forem syndekanu. Přitom se může používat technik in šitu pro tkáňové vzorky, zkoušky ochrany mRNA pro izolovanou RNA nebo polymerace syndekan-specifických nukleotidových řetězců řízené primerem. Všechny tyto techniky jsou dobře vysvětleny v literatuře, jako například ve výše uvedené publikaci Current Protocols in Molecular Biology.
Specifické způsoby podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v následujících příkladech. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a vynález se neomezuje na konkrétní provedení, která jsou v nich uvedena.
V příkladech se používá zavedených zkratek. Tak například PBS je v tomto oboru obvyklá zkratka pro fosfátem pufrovaný fyziologický roztok chloridu sodného, FCS znamená fetální telecí sérum, BSA znamená hovězí sérový albumin a TBS znamená fyziologický roztok pufrovaný Tris pufrem.
Příklady provedení vynálezu
Příklad I
Lokalizace syndekanu v transformovaných epitelových buňkách
Zásobní buňky myšího mammámího tumoru Shionogi S115 se obvyklým způsobem kultivují v DMEM (Dulbecco em modifikované Eagle ovo médium), doplněném 5 % teplem inaktivovaného fetálního telecího séra (i-FCS), pyruvátem (1 mM), glutaminem (1 mM), penicilinem (100 IU/ml), streptomycinem (100pg/ml) a testosteronem (10 nM). Při studiích zahrnujících zpracování hormonem se používá růstového média doplněného 4 % fetálního telecího séra zpracovaného dext.ranovým aktivním uhlím (DC-FCS) s nebo bez 10 nM testosteronu a/nebo l μΜ cyproteronacetátu. Při experimentech se buňky nanesou na Nunc ovu tkáňovou kulturu, umístěnou v miskách pro tkáňové kultury, při hustotě 10 000 buněk na cm2. Pro počítání buněk se buňky lyžují v 10 mM Hepes, l,5mM chloridu hořečnatém s obsahem Zaboglobinu (Coulter Electronics, Ltd.) a uvolněná jádra se suspendují v Isotonu (Coulter) a nakonec spočítají v Coulterově počítači buněk.
Čtvrtý den se buňky S115 v intaktní kultuře obarví způsobem popsaným v Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984). Povrchový buněčný proteoglykan, syndekan, se imunolokalizuje krysí monoklonální protilátkou 281-2 proti jádrovému proteinu proteoglykanu (Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-974) a vybarvení se kontrolují pomocí další IgG2a monoklonální protilátky Mel-14, která je specifická pro lymfocytový receptor (lymphocyte homing receptor) (Gallatin a další (1981) Nátuře 304: 30-34). Detekce imobilizovaných protilátek se provede králičím protikrysím FITC-konjugátem (Janssen Biochimica).
Příklad II
Detekce pozměněné exprese syndekanu při transformaci epitelových buněk vyvolané hormonem
Pro kvantitativní stanovení syndekanu na povrchu buněk S115 se buněčné monovrstvy několikrát promyjí chladným PBS a ektodoména molekuly se uvolní hovězím pankreatickým trypsinem (Sigma, typ III, 20 pg/ml) 10-minutovou inkubací na ledu, způsobem popsaným v Rapraeger
-7CZ 282203 B6 a Bemfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636, (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109). Po inaktivaci trypsinu inhibitorem trypsinu (100 pg/ml) se buňky odstředí, oddělí se supematant pro kvantitativní stanovení ektodomény a buňky se suspendují v Isotonu. za účelem jejich spočítání. Monoklonální protilátka 281-2 se joduje radioaktivním jodem oxidační metodou pomocí chloraminu-T (Stáhli a další (1983) Meth. Enzymol. 92: 242-253) do dosažení specifické aktivity 14,1.106 cpm/pg. Při zkoušce se v zařízení se štěrbinou (Minifold-slot Apparatus, Schleicher & Schuell) na kationtovou nylonovou membránu (Zeta-Probe, BioRad) nanese supematant z 2x10’ buněk a přečištěný kontrolní syndekan z buněk NMuMG, způsobem popsaným dříve (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). Membrána se vyjme ze štěrbinového zařízení a inkubuje 1 hodinu při teplotě místnosti v PBS, doplněném 10 % FCS, za účelem blokování membrány. Potom se provede inkubace přes noc při 4 °C v PBS s obsahem 1251-značené monoklonální protilátky 281-2 (10 000 cpm/ml). Po pětinásobném promytí filtru PBS se provede expozice na film Kodak X-Omat, za účelem vizualizace vázané látky 281-2. Pro kvantitativní stanovení se každá štěrbina analyzuje laserovým densitometrem (LKB Ultroscan XL enhanced laser densitometer) a porovná se známým množstvím syndekanu z buněk NMuMG.
Ektodomény uvolněné trpysinem z buněk S115 se vysrážejí ethanolem afrakcionují na gradientovém (4 až 10 %) gelu SDS-PAGE (O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-40021. Po elektroforéze se vzorky transformují na membránu Zeta-Probe pomocí elektroblotovacího zařízení 2005 Transphor Apparatus (LKB), způsobem popsaným výše (Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984, Rapraeger a další (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052) a membrána se exponuje 1251-značenou monoklonální protilátkou 281-2, způsobem uvedeným výše. Opět i zde je možno použít pro srovnání izolované syndekanové ektodomény z buněk NMuMG.
Příklad III
Detekce pozměněné exprese syndekanového genu v transformovaných epiteových buňkách
Za použití 4M isothiokyanátu guanidinu a peletizace pomocí chloridu česného (viz Chirgwin a další (1979) Biochem. 18: 5294-5299) se izoluje celková RNA. Alikvoty RNA o hmotnosti 15 pg se frakcionují na agarosovém gelu s formaldehydem (1 %) a přenesou na membránu Gene Screen Plus. Provede se hybridizace s insertem cDNA próby PM-4 pro syndekan. značeným multi-primem (Amersham) (Saunders adalší (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556), za podmínek navržených výrobcem membrány (New England Nuclear). [mobilizovaná próba se vizualizuje expozicí membrány na film Kodak X-Omat při 70 °C a kvantifikace 2,6 kb mRNA se provede densitometrickou analýzou, popsanou výše. Exprese syndekanové mRNA se koreluje s ribosomální RNA způsobem popsaným v Denis a další (1988) Nucl. Acid Res. 16: 2354-2359. Specifičnost potlačení syndekanu se dále studuje na stejných vzorcích, u nichž se zjišťuje poměr glyceraldehyd 3-fosfát-dehydrogenasy (GAPDH) (Fořt adalší (1985) Nucl. Acid Res. 13: 14311442 a myšího alfa-aktinu (Minty a další (1981) J. Biol. Chem. 256: 1008-1014).
Hybridizace cRNA in šitu u parafinových řezů se provádí způsobem popsaným v Wilkinson adalší (1989) Developm. 105: 131-136. 535bp fragment Sac Ι-Κρη I z částečného cDNA klonu pro myší syndekan (PM-4) (Saunders a další (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556) se subkionuje (Vainio adalší (1991) Development, v tisku) do riboprobového pGEM-4Z vektoru (Promega. Madison, WI). Klonovaný plasmid obsahující insert se linearizuje enzymem Eco RI nebo Hind III a vyrobí se negativní nebo pozitivní transkripty z komplementárních řetězců pomocí jednak T7- a jednak SP6-polymerasy, za přítomnosti 3’S-UTP (Amersham, Willshire, Velká Británie). Maximální délka transkriptů se alkalickou hydrolýzou sníží na hodnotu pod 200. bp a frakce s nejvyšší specifickou aktivitou se shromáždí, vysráží a rozpustí v hybridizačním pufru. Předem upravené preparáty se hybridizují přes noc při 50 °C, nespecificky vázaná próba se odstraní (pomocí důkladného promytí a zpracování ribonukleasou A) a výše uvedeným postupem se pořídí autoradiografíe (Wilkinson a další (1989) Development 105: 131-136).
-8CZ 282203 B6
Příklad IV
Detekce pozměněné exprese syndekanu v tkáňových řezech odebraných z nádoru
U samců světle'pigmentované lysé myši kmene hr/hr C3H/Tif (Bomholdgaard, Dánsko) se vyvolají nádory tím, že se zvířata ozáří ultrafialovým zářením UV-A a UV-B, způsobem popsaným vTalve a další (1990) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed 7: 109-115. ίο V průběhu doby pozorování (12 měsíců) se vyskytne celkem 83 papilomů, 2 keratocanthomy, 4 skvamocelulámí karacinomy, 1 kombinovaný karcinosarkom a 11 sarkomů, přičemž zvýšená tvorba nádorů je spojena s vysokou intenzitou záření UV-A (582 J/cm2) plus vysokou intenzitou záření UV-B (erythemálně účinná = EE) (1,0 J/cm2) plus vysokou intenzitou UV-B (EE) (0,8 J/cm’) (78/28 nádorů). Vzorky se odeberou ze všech větších pozorovatelných nádorů, stejně tak 15 jako z normálně vyhlížející kůže exponované UV zářením. Část vzorků se fixuje v 10% tlumeném formalinu, uloží do parafínu a vyrobí se řezy, které se obvyklým způsobem obarví hematoxylinem a eosinem. Zbytek vzorků se zmrazí v kapalném dusíku a nařeže. Léze se klasifikují podle standardních histopatologických kriterií. Pro vizualizaci podkladových membrán, jakož i Herovicova, Weigertova, Massonova trichromu a Gomoriho skvrn u typu 20 kolagenu, jakož i jiných skvrn se v některých případech použije Schiffova barvení kyselinou jodistou (PAS) a podle potřeby se provede elektronová mikroskopická analýza.
Pro imunohistochemickou lokalizaci syndekanu se použije krysí monoklonální protilátky 281-2.
Tato protilátka je specifická pro jádrový protein myší syndekanové ektodoménv (18). Pro detekci 25 imobilizované monoklonální protilátky 281-2 se použije techniky s avidinbiotinimunoperoxidasou, která je popsána v Hsu a další (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577-580).
Po deparafmizaci a rehydrataci tkáňových řezů se aktivita endogenní peroxidasy zablokuje inkubací preparátů ve 100% methanolu obsahujícím 3 % peroxidu vodíku po dobu 30 minut. Potom se řezy inkubují s 2% normálním kozím sérem (Vector Laboratories lne., Burlingame, 30 CA) v Tris-tlumeném solném roztoku, pH 7,4 (TBS) po dobu 30 minut při teplotě místnosti, aby se minimalizovalo nespecifické barvení. Řezy se pokryjí primární monoklonální protilátkou 2812 při koncentraci proteinu 2 pg/ml v BSA-TBS o koncentraci 10 g/1, načež se provede inkubace přes noc při 4 °C. Potom se preparáty inkubují s biotinylovaným kozím protikrvsím IgG (Jacksoďs Immunoresearch Laboratories, lne., West Baltimore, Pennsylvania) při ředění 1:1000 35 v 1% BSA-TBS po dobu 30 minut při teplotě místnosti a nakonec s avidinbiotin-peroxidasovým komplexem (souprava Vectastain, Vector Laboratories, Burlingame, CA) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Po promytí se aktivita peroxidasy demonstruje inkubací preparátů s 0,5 mg/ml 3,3 '-diaminobenzidintetrahydrochloridem (DAB, Polysciences, lne., Northhampton, Velká Británie) v TBS s obsahem 0,68 mg/ml imidazolu a 0,01 % peroxidu vodíku po dobu 5 minut 40 v temnu. Preparáty se slabě protiobarví Mayerov hematoxylinem a uloží do média Depex
Mounting Medium (BDH Limited Pool, Velká Británie). Mezi všemi stupni se preparáty třikrát promyjí Tris-tlumeným solným roztokem (TBS). U kontrolních řezů se používá normálního krysího IgG (Sigma, St. Louis, MO) o koncentraci 2 pg/ml. Také se obarví několik zmrazených řezů z tumoru každého typu, přičemž se dosáhne stejné imunoreaktivity jako u tkáňových řezů, 45 které jsou uloženy v parafínu. Změny koncentrace primární protilátky a inkubační doby významně nezmění profil barvení.
-9CZ 282203 B6
Příklad V
Detekce pozměněné exprese syndekanu při transformaci indukované ras-onkogenem
Buňky NOG-8 představují subklon normální epitelové buněčné linie myší mléčné žlázy NMuMG. Buňky NOG-8 ras jsou linií buněk NOG-8, která byla transfekována plasmidem obsahujícím glukokortikoidem indukovatelný promotor MMTV-LTR, vázaný k místu mutovaného genu c-Ha-ras. Buňky se nechají růst v kultivačním médiu RPMI 1640 (Gibco), doplněném 5 % fetálního telecího séra, zpracovaného 5% dextranovým uhlím (DCC-FCS), glutaminem, penicilinem (100 IU/ml) a streptomycinem (100 gg/ml). U těchto buněk se může exprese genu c-Ha-ras maximálně indukovat přídavkem dexamethasonu (1 μΜ) (Sigma) ke kultivačnímu médiu. Pro odstranění přídavných steroidů ze séra se použije zpracování DCC, které může ovlivnit expresi transfekovaného genu. U suspenzních kultur se bakteriologické misky pokryjí 1% agarem (Sigma) vRPMI-1640, aby se zabránilo možné adhezi buněk k substrátu. Buňky se naočkují v hustotě 1 x 10’/ml. Počet buněk se stanoví po trypsinaci za použití Coulterova počítače (Coulter Electronics, Hialeah, FL). PM-4 je cDNA próba pro syndekan, původně klonovaná Saunders-em a dalšími (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556. Detekuje 2 pásy, 2,6 kB a 3,4 kB z normálních myších mammámích buněk.
Při výrobě RNA se misky pro buněčné kultury 2 x promyjí ledově chladným fosfátovým pufrem tlumeným solným roztokem (PBS) a potom se solubilizují v 4M pufru GIT (4M isothiokyanát guanidinu v5mM citranu sodném (pH 7,0), 0,1 M β-merkaptoethanolu a 0,5% N-laurylsarkosinu). Extrakce celkové RNA se provede densitometrickou centrifugací pomocí chloridu česného (viz Chirgwin a další (1979) Biochem. 18: 5294-5299). Pro analýzu Northem Blot se vzorky RNA separují elektroforézou na 1% formaldehydovém agarosovém gelu. Tylo gely se blotováním přenesou na hvbridizační membránu GeneScreen. Filtry se předhybridizují v IM chloridu sodném, 1% dodecylsulfátu sodném, 10% dextransuflátu, 5 x v Denhardtově roztoku, 100 μg/ml lososí spermové DNA a 50% formamidu při 42 °C. Pro hybridizaci se přidá multiprimem značená PM-4 nebo BS-9 próba. Používá se izotopu P 32 (Amersham). Filtry se promyjí při 65 °C, v případě PM-4 a při 60 °C, v případě BS-9 ve 2x SSC, 1% dodecylsulfátu sodném a autografují na film Kodak X-Omat nebo Fuj i X-ray.
Pro kvantifikaci exprese syndekanu na povrchu buněk se buňky v kultivační misce 3.x promyjí ledově chladným PBS. Potom se misky inkubují v 0,5mM draselné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny (K-EDTA) v PBS po dobu 10 minut při +4°C. Přidá se trypsin (Sigma, T-8128) do konečné koncentrace 20 pg/ml a provede se 10-timinutová inkubace při +4 °C. Trypsin uvolní syndekanovou ektodoménu do média (Rapraeger a Bemfield (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109). Buňky se seškrabou gumovou stěrkou nebo se kolonie suspendují a přidá se inhibitor trypsinu (Sigma, T-9128) až do koncentrace 100 μg/ml. Buňky se odstředí (5 minut, 100 x g) supematant se shromáždí a buňky se spočítají v Coulterově počítači. Buňky v suspenzi se shromáždí ve zkumavce a kolonie se nechají 5 minut sedimentovat, načež se odstraní supematant, podobně jako u kultur v Petriho miskách. Kolonie se 3x promyjí ledově chladným PBS a potom se na ně působí trypsinem.
Vhodné množství supematantu, které odpovídá počtu 2x10’ buněk se blotováním nanese na kationtovou nylonovou membránu (Zeta Probe, Bio-Rad). Membrána se předinkubuje v inkubačním pufru (10% fetální telecí sérum, lmM azid sodný, PBS) 1 hodinu při teplotě místnosti. K inkubačnímu pufru se v konečné koncentraci 10000 cpm/ml radioaktivně značená (metodou pomocí chloraminu-T) látka MnAb 281-2 (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096), která rozeznává ektodoménu syndekanu a směs se inkubuje přes noc při 4 °C. Filtr se 10 minut promývá PBS při teplotě místnosti. Promývání se opakuje lOx a potom se filtr autoradiografuje na rentgenografický film. Autografie se analyzují densitometrem GelScan XL Ultroscan Densitometer (LKB) pomocí software GelScan SL 2400 (LKB) a standardizují
- 10CZ 282203 B6 izolovanou ektodoménou (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096).
Souhrnně lze konstatovat, že se vynález hodí pro detekci potenciálně škodlivých transformací, která se provádí prostřednictvím stanovení exprese syndekanu nebo jeho obsahu, například jeho hladiny v tkáních nebo různých tělesných tekutinách, postup lze provádět biochemicky, imunohistochemicky a molekulárně biologicky, například za použití syndekan-specifických ligandů, protilátek (polyklonálních nebo monokionálních) a cDNA. Způsob je speciálně zaměřen na maligní změny epitelových buněk, u nichž se projevuje v průběhu maligní transformace silný pokles exprese syndekanu. Do rozsahu postupu spadá také analýza exprese syndekanu při hyperplasii a v tomto případě má význam pro odhad vážnosti tohoto premaligního stavu. Analýzy exprese syndekanu jsou obzvláště užitečné při klasifikaci různých premaligních proliferativních stadií dysplasií.
Claims (3)
1. Způsob detekce maligních a premaligních změn, jako jsou maligní nebo premaligní transformace, hyperplasie nebo morfologické změny v humánních buňkách, vyznačující se t í m , že se
a) stanoví obsah syndekanu v buňkách, který je přítomen v první tekutině nebo vzorku tkáně vyšetřovaného člověka, přičemž první vzorek se odebírá z tekutiny nebo tkáně, u níž je podezření na obsah maligních buněk, premaligních buněk, hyperplastických buněk nebo buněk, vykazujících morfologickou změnu ve srovnání s jejich normálním stavem,
b) obsah syndekanu stanovený ve stupni a) se porovná s obsahem syndekanu, stanoveném ve druhém vzorku biologického materiálu, přičemž druhý vzorek biologického materiálu představuje tekutinu nebo tkáň stejného typu, jakého je první vzorek biologického materiálu, přičemž však tento druhý vzorek pochází z buněk, které jsou normální nebo méně transformované než buňky ve stupni a); a
c) stanoví se přítomnost maligních nebo premaligních změn na základě přítomnosti menšího množství syndekanu v prvním vzorku ve srovnání s druhým vzorkem biologického materiálu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsah syndekanu v prvním vzorku se stanoví zjištěním obsahu syndekanového proteinu.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsah syndekanového proteinu se stanoví za použití protilátky specifické pro syndekanový protein.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsah syndekanu v prvním vzorku se stanoví zjištěním obsah syndekanové mRNA.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsah syndekanu v prvním vzorku se stanoví postupem, kterým se zjišťuje množství syndekanové ektodomény v tomto vzorku.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se před stanovením uvolní syndekanová ektodoména prvního vzorku z povrchu buněk.
- 11 CZ 282203 B6
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím ,žese pro stanovení obsahu syndekanu v prvním vzorku použije humánní syndekan-specifické protilátky.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se pro stanovení obsahu syndekanové mRNA v prvním vzorku použije humánní syndekanové pozitivní mRNA.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se pro stanovení obsahu syndekanové mRNA v prvním vzorku použije syndekanového pozitivního oligonukleotidu.
3 výkresy
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64120991A | 1991-01-15 | 1991-01-15 | |
| US72133091A | 1991-07-01 | 1991-07-01 | |
| PCT/FI1991/000399 WO1992013274A1 (en) | 1991-01-15 | 1991-12-19 | Detection of syndecan content in biological materials such as tissues and body fluids for indications of malignant transformations of cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ137293A3 CZ137293A3 (en) | 1994-01-19 |
| CZ282203B6 true CZ282203B6 (cs) | 1997-05-14 |
Family
ID=27093707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS931372A CZ282203B6 (cs) | 1991-01-15 | 1991-12-19 | Způsob detekce maligních a premaligních změn v humánních buňkách |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5422243A (cs) |
| EP (2) | EP0816851A3 (cs) |
| JP (1) | JP3103377B2 (cs) |
| KR (1) | KR0162670B1 (cs) |
| AT (1) | ATE166157T1 (cs) |
| AU (1) | AU650936B2 (cs) |
| BG (1) | BG61625B1 (cs) |
| CA (1) | CA2100077C (cs) |
| CZ (1) | CZ282203B6 (cs) |
| DE (1) | DE69129417T2 (cs) |
| DK (1) | DK0569367T3 (cs) |
| ES (1) | ES2116331T3 (cs) |
| FI (1) | FI104347B1 (cs) |
| HU (1) | HU215778B (cs) |
| IE (2) | IE990011A1 (cs) |
| NO (1) | NO314604B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ241273A (cs) |
| PL (1) | PL168188B1 (cs) |
| PT (1) | PT100008B (cs) |
| RU (1) | RU2139540C1 (cs) |
| SK (1) | SK281583B6 (cs) |
| WO (1) | WO1992013274A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA92271B (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ299874B6 (cs) * | 1997-08-12 | 2008-12-17 | Leadd B. V. | Zpusob urcení transformacní schopnosti cinidel, zpusob urcení predispozice bunky, zpusob zjištení genové mutace, použití nukleové kyseliny kódující apoptin a diagnostická testovací souprava |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE198271T1 (de) * | 1992-12-01 | 2001-01-15 | Biotie Therapies Oy | Syndecan-stimulierung der zellulären differenzierung |
| US5726058A (en) * | 1992-12-01 | 1998-03-10 | Jalkanen; Markku | Syndecan stimulation of cellular differentiation |
| US6017727A (en) * | 1994-03-07 | 2000-01-25 | Biotie Therapies Ltd. | Syndecan enhancer element and syndecan stimulation of cellular differentiation |
| US5851993A (en) * | 1994-06-13 | 1998-12-22 | Biotie Therapies Ltd. | Suppression of tumor cell growth by syndecan-1 ectodomain |
| GB9519490D0 (en) * | 1995-09-25 | 1995-11-29 | Melvin William T | Use of a cytochrome P450 enzyme in tumour cells as a marker and target |
| US6385546B1 (en) | 1996-11-15 | 2002-05-07 | Rutgers, The University Of New Jersey | Stabilizing and destabilizing proteins |
| CA2346264A1 (en) * | 1998-10-16 | 2000-04-27 | Regents Of The University Of California | Glypicans for the detection and treatment of human carcinoma |
| US6998232B1 (en) * | 1999-09-27 | 2006-02-14 | Quark Biotech, Inc. | Methods of diagnosing bladder cancer |
| WO2001077682A1 (fr) * | 2000-04-10 | 2001-10-18 | Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni Akademikov M.M. Shemyakina I Ju. A. Ovchinnikova Rossiisskoi Akademii Nauk | Anticorps diriges contre le facteur hldf, procedes de fabrication correspondants, peptides avec des capacites antigeniques et a hydrolyse hk et procede de diagnostic de l'etat anaplasique de cellules humaines |
| AU2002338431A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-11-05 | Quark Biotech, Inc. | Sequence characteristics of bladder cancer |
| KR100694804B1 (ko) * | 2005-05-18 | 2007-03-14 | 아주대학교산학협력단 | 작은 헤어핀 ｒｎａ 분자를 포함하는 자궁 내막암 치료또는 예방용 조성물 및 그를 이용한 자궁 내막암 치료 또는예방 방법 |
| US8347890B2 (en) * | 2006-06-19 | 2013-01-08 | Insono Therapeutics, Inc. | Automated tissue retention system |
| WO2009105624A2 (en) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Simultaneous delivery of receptors and/or co-receptors for growth factor stability and activity |
| GB0803272D0 (en) * | 2008-02-22 | 2008-04-02 | Smith & Nephew | Ultrasound and tissue repair |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3511199A1 (de) * | 1985-03-28 | 1986-10-02 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur immunologischen bestimmung von heparansulfat-proteoglykan, verfahren zur herstellung bzw. reinigung von dafuer geeignetem heparansulfat-proteoglykan aus basalmembran-haltigen geweben |
| US4859581A (en) * | 1986-03-10 | 1989-08-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Endoglycosidase assay |
| US4945086A (en) * | 1988-05-03 | 1990-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Smooth muscle cell growth inhibitor |
| JPH02156898A (ja) * | 1988-12-08 | 1990-06-15 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびこのモノクローン抗体を用いる低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法 |
| WO1990007712A1 (de) * | 1988-12-23 | 1990-07-12 | Bissendorf Peptide Gmbh | Antigen, assoziiert mit degenerativen erscheinungen des zentralen nervensystems (zns), dagegen gerichtete antikörper sowie verfahren zur diagnose von dysfunktionen des zns |
| WO1990012033A1 (en) * | 1989-03-29 | 1990-10-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Construction and use of synthetic constructs encoding syndecan |
| AU2561792A (en) * | 1991-09-06 | 1993-04-05 | Children's Medical Center Corporation | Cell-type specific heparan sulfate proteoglycans and their uses |
-
1991
- 1991-12-19 EP EP97116570A patent/EP0816851A3/en not_active Withdrawn
- 1991-12-19 KR KR1019930702128A patent/KR0162670B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 CA CA002100077A patent/CA2100077C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-19 SK SK738-93A patent/SK281583B6/sk unknown
- 1991-12-19 AU AU90713/91A patent/AU650936B2/en not_active Ceased
- 1991-12-19 PL PL91300110A patent/PL168188B1/pl unknown
- 1991-12-19 WO PCT/FI1991/000399 patent/WO1992013274A1/en active IP Right Grant
- 1991-12-19 HU HU9302030A patent/HU215778B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 EP EP92901010A patent/EP0569367B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 RU RU93051783/14A patent/RU2139540C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 CZ CS931372A patent/CZ282203B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 DK DK92901010T patent/DK0569367T3/da active
- 1991-12-19 DE DE69129417T patent/DE69129417T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-19 AT AT92901010T patent/ATE166157T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 ES ES92901010T patent/ES2116331T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-19 JP JP04501685A patent/JP3103377B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-01-10 NZ NZ241273A patent/NZ241273A/en unknown
- 1992-01-13 PT PT100008A patent/PT100008B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-01-14 IE IE19990011A patent/IE990011A1/en unknown
- 1992-01-14 IE IE010792A patent/IE920107A1/en unknown
- 1992-01-14 ZA ZA92271A patent/ZA92271B/xx unknown
-
1993
- 1993-07-14 NO NO19932552A patent/NO314604B1/no unknown
- 1993-07-15 BG BG97950A patent/BG61625B1/bg unknown
- 1993-07-15 FI FI933211A patent/FI104347B1/fi active
- 1993-11-01 US US08/144,547 patent/US5422243A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ299874B6 (cs) * | 1997-08-12 | 2008-12-17 | Leadd B. V. | Zpusob urcení transformacní schopnosti cinidel, zpusob urcení predispozice bunky, zpusob zjištení genové mutace, použití nukleové kyseliny kódující apoptin a diagnostická testovací souprava |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Castellani et al. | The fibronectin isoform containing the ED‐B oncofetal domain: a marker of angiogenesis | |
| CZ282203B6 (cs) | Způsob detekce maligních a premaligních změn v humánních buňkách | |
| US20060088532A1 (en) | Lymphatic and blood endothelial cell genes | |
| US20120034616A1 (en) | Method for Modulating Epithelial Stem Cell Lineage | |
| US20100099105A1 (en) | Antibodies having binding specificity for the extracellular domain of a breast cancer resistance protein (bcrp) | |
| Barnes et al. | Sequential expression of cellular fibronectin by platelets, macrophages, and mesangial cells in proliferative glomerulonephritis. | |
| Krishna et al. | 9-O-Acetylation of sialomucins: a novel marker of murine CD4 T cells that is regulated during maturation and activation | |
| Aziz et al. | The role of autocrine FGF-2 in the distinctive bone marrow fibrosis of hairy-cell leukemia (HCL) | |
| JP2004508031A (ja) | 細胞老化関連核酸配列及びタンパク質 | |
| CA2568806C (en) | Methods for detecting and treating cancer using podocalyxin and/or endoglycan | |
| CA2472163C (en) | Psoriasin expression by breast epithelial cells | |
| Kirjavainen et al. | Translational suppression of syndecan-1 expression in Ha-ras transformed mouse mammary epithelial cells. | |
| Yasuda et al. | Differential expression of the α1 type VIII collagen gene by smooth muscle cells from atherosclerotic plaques of apolipoprotein-E-deficient mice | |
| Tiger et al. | Absence of laminin α1 chain in the skeletal muscle of dystrophic dy/dy mice | |
| Charpin et al. | ELAM selectin expression in breast carcinomas detected by automated and quantitative immunohistochemical assays. | |
| WO2010070278A1 (en) | Use of foxp2 as a marker for abnormal lymphocytes and as a target for therapy of disorders associated with abnormal lymphocytes | |
| US20070015149A1 (en) | Prlz regulatory elements in the treatment of disease and the discovery of therapeutics | |
| WO2009080779A1 (en) | Ceacam1 as a biomarker of psoriasis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20031219 |