PT100008B

PT100008B - Processo para a deteccao de transformacoes nocivas em celulas de um organismo pelo teor em sindecano

Info

Publication number: PT100008B
Application number: PT100008A
Authority: PT
Inventors: Markku Tapani Jalkanen; Pirjo Leena Kyllikki Inki; Jarkko Kirjavainen; Sirpa Marianne Leppa; Sakari Markku Mali
Original assignee: Biotie Therapies Ltd Oy
Priority date: 1991-01-15
Filing date: 1992-01-13
Publication date: 1999-06-30
Also published as: DK0569367T3; ZA92271B; NO932552D0; BG61625B1; PT100008A; EP0569367B1; RU2139540C1; FI104347B1; BG97950A; CZ282203B6; EP0816851A2; CZ137293A3; IE990011A1; IE920107A1; HU9302030D0; HUT67587A; WO1992013274A1; CA2100077C; FI104347B; JPH06504616A

Description

PROCESSO PARA A DETECÇÃO DE TRANSFOR

MAÇÕES NOCIVAS EM CÉLULAS DE UM ORGA

NISMO PELO TEOR EM SINDECANO

Resumo: (máx. 150 palavras) @

A presente invenção diz respeito a um processo para detectar uma transformação potencialmente nociva das células de um organismo. Esse processo consiste em determinar o teor de proteína ou de ARNm do sindecano em células presentes numa primeira amostra recolhida de um fluido ou tecido que se suspeita possuir células anormais e em comparar este teor de pro teína ou ARNm do sindecano com os níveis de proteína ou de ARNm do sindecano obtidos a partir de uma segunda amostra tomada de um mesmo tipo de fluido ou tecido contendo células normais. A presença da referida alteração é determinada com base na menor quantidade de proteína ou ARNm do sindecano pre

DSP

CAMPO DAS CEBOLAS, 1100 LISBOA

TEL: 8885151/2/3TELEX: 18356 INPI

TELEFAX:87 5308

INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES

FOLHA DO RESUMO (Continuação)

Modalidade e n.° (íj)

TD

Data do pedido (22)

Classificação Internacional (51)

Resumo (continuação) (57) sente na referida primeira amostra quando comparada com a re ferida segunda amostra.

NÃO PREENCHER AS ZONAS SOMBREADAS

'DSM-5 —MOORE^i^^r—____

ORION CORPORATION FARMOS

PROCESSO PARA A DETECÇÃO DE TRANSFORMAÇÕES NOCI

VAS EM CÉLULAS DE UM ORGANISMO PELO TEOR EM SINDECANO

A presente invenção insere-se genericamente no domínio da biologia, tal como a biologia do cancro, e mais esceci ficamente refere-se aos métodos para detectar tecidos pré-malignos ou tecidos malignos, por um lado, através da detecção da perda de sindecano nos tecidos e, por outro lado, através da detecção do aparecimento de sindecano nos fluídos corporais humanos, recorrendo a procedimentos que podem utilizar os líquidos específicos de sindecano, anticorpos e sondas de ADNc para a detecção.

As moléculas da superfície celular que funcionam segundo interacçoes específicas entre a superfície celular e a matriz extra-celular (MEC) são designadas por receptores matriciais. 0 reconhecimento da matriz por esses receptores desempenha uma função importante na regulação da. configuração, proliferação e diferenciação celulares e, consequentemente, constitui um fenómeno crítico no desenvolvimento normal dos órgãos e na manutenção da arquitectura tecidual. Os recepto res matriciais conhecidos englobam, por exemplo, uma família de receptores glicoproteicos transmembranais que partilham uma estrutura comum e características funcionais e são desig. nados Integrinas Z*H^nes, R,, Cell. ^+8 . ,(1907), 5^+9-55^+-7, uma glicoproteína de 67MDa, a qual se liga à cadeia BI lami nal zTGraft et al., Cell 48 (1987), 98'9-99ó_7 e os proteoglicanos ca superfície celular (rG), os quais, dependendo de composição do glicosaminoglicano (por exemplo, o sulfato de heparano), podem interactuar com uma diversidade de moléculas da matriz Z*Jalkanen, M., Med. Eiol., 65 (1957), 41-47J7.

A adesão, dispersão, proliferação e diferenciação celulares baseiam-se em contactos íntimos entre a superfície celular e a matriz extra-celular envolvente (MEC). A utiliza ção selectiva da interseção ligando-receptor pode originar in vivo a diversidade de interaeções específicas célula-ma-triz necessárias para o desenvolvimento de órgãos /Ekblom et al., Ann. Rev. Cell Biol., 2 (1986), 27-47-7. Sabe-se que a transformação altera a resposta das células à MEC /.Liotta, L.., Câncer Res., 46 (1986), 1-7-7? sugerindo que podem ocorrer modificações na expressão dos receptores da matriz originadas por células malignas ZÍPlantefaber e Hynes, Cell, 56 (1989), 281-290; Cheresh et al., Cell, (1989), 59-69-7. Essas modificações são praticamente desconhecidas mas admite-se que possam desempenhar uma função fundamental na concretização de um comportamento maligno de diversos tipos de células.

proteoglicano da superfície celular de células epi teliais mamárias do murganho é constituído por um domínio memeranoso lipofílico /Rapraeger e Bernfield, J. Biol. Chem., 258 (1983), 3632-3636; J. Biol Chem., 26o (1985), 4103-4109_7 e por um ectodomínio interactuante matricial que contem simultaneamente as cadeias do sulfato de heparano e do sulfato de condroitina ZÍRapraeger et al., ,T. Biol. Chem'. , 2o0

3.

(Ι985), 1104-6-11052,7. . Clonagens recentes de ADXc dos sinde’ canos do murganho e dos seres humanos confirmaram estes domí nios funcionais nas proteínas nucleares e designou-se este PG por sindecano Z”saunders et al., J. Cell Biol., 108 (1989), 1547-1556j Mali et al., J. Eiol. Chem., 265 (1990), 6884-688977. O ectodomínio do sindecano é reconhecido pelo mAb 281-^ £7-Jalkanen et al., J. Cell Eiol.. 101 (1985), 976-984; Jalkanen et al., J. Cell Biol., 105 (I987), 3087-309677 θ liga-se com elevada afinidade aos fibrilõ.s docolagéneo do tipo I, III e V 7*-K-Oda et al., J. Biol. Chem., 260. (1985), 8157-8162J7 Q com uma afinidade inferior ao domínio da fibronectina que se liga à heparina C-terminal ZTsaunders e Bernfield, J. Cell Biol., 106 (1988), 423-43Ç$ trombospondina ΖΓSun et al., J. Biol. Chem., 264, (I989); 2885-288973^3 tenascina £7Salmivirta et al., J. Biol. Chem., 266, (I99I no preloT?. Quando o ligando se une promove a asso ciação do domínio membranoso ao citoesqueleto rico em actina zfRapraeger et al., J. Cell Biol., 103, (1986), 2683-2696.7. Todavia, as células epiteliais também podem separar-se da superfície celular através de uma clivagem proteólítica da proteína nuclear que separa o ectodomínio do domínio membranal, Zfjalkanen et al., J, Cell Biol., 105 (1987), 30-37-3096; Weitzhandler et al., J. Biol. Chem., 263 (1988), 6949-6952J7, Em consequência, 0 sindecano pode ligar 0 citoesqueleto epite liai à matriz mas também pode perder a associação epitelial à matriz. Através dessas associações 0 sindecano pode consti tuir um mediador da organização matricial proporcionando uma organização celular e influenciando 0 comportamento das célu

las. Uma vez que o sindecano interactua fundamentalmente com os componentes do tipo estromal, tais como os fibrilos do colagénio e a fibron.eetina, então pode esse mesmo sindecano funcionar como um comunicador entre os tecidos epiteliais e de mesanquima. Este tipo de comunicação é crítico para dife renciação epitelial normal e para a formação dos órgãos.

A expressão do sindecano durante o desenvolvimento e a formação de..órgãos rege-se por mecanismos morfogenéticos em vez de histológicos £*Thesleff et al., Dev, Biol., 189 (1988), 565-572-7, característica esta que suporta também uma função activa para 0 sindecano como receptor matricial durante o desenvolvimento. 0 sindecano foi localizado principalmente em diversas células epiteliais Z*Hayashi et al., J. Histochem. Cytochem., 35, (19θ7)? 1079^_10θθ-7 mas também é possível encon trá-lo nas superfícies das células do plasma Z^Sanderson e Bernfield, Proc. Natl. Acad, Sei, USA, 85 (1988), 9562-95667· 0 sindecano localiza-se também no mesenquima de condensação próximo do epitélio em remoção durante a formação de órgãos Z/Thesleff et al., Dev. Biol., 189, (1988), 565-572J. Demons trou-se que esta expressão de mesenquima é regulada pelo contacto epitelial tanto nos dentes ZVainio et al., (1988)_7 como no rim metanéfrico ZTVainio et al., (1989).7 e em ambos os tecidos e sua expressão pode ser correlacionada espacial e temporalmente cóm a morfogénése desses órgãos.

Sumário da Invenção

Em consequência, constitui um objectivo da presente in

vençao proporcionar um método para a detecção de tecidos pré-malignos ou de tecidos malignos -através da detecção da perd^. do sindecano nesses tecidos.

Constitui outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para a detecção de tecidos pré-malignos ou de tecidos malignos através da detecção do aparecimento do sindecano em fluídos corporais.

Constitui outro objectivo da presente invenção propor cionar um método que seja particularmente adaptável para a de tecção de tecidos malignos ou de tecidos pré-malignos em seres humanos.

Constitui ainda outro objectivo da presente invenção proporcionar um método bioquímico, imuno-histológico ou bioló gico molecular para detectar a expressão do sindecano ou o teor de sindecano nos tecidos ou nos fluídos corporais com o objectivo de detectar transformações celulares malignas ou pré-malignas.

Constitui tembém um objectivo da presente inevnção proporcionar uni método para detectar modificações hlperplási cas nas células.

Constitui um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para a detecção das modificações hiper plásicas propostas celulares.

S também objectivo da presente invenção proporcionar um método para detectar as modificações morfológicas propostas celulares.

Finalmente, constitui ainda um objectivo da presente invenção proporcionar um método para a quantificação do sinde

cano dos tecidos ou dos fluídos corporais de modo a propor cionar um indicador valioso.

Resumidamente, nos seus aspectos mais amplos a pre- \ sente invenção compreende um método para detectar uma trans formação potencialmente nociva de células de um organismo, teor de sindecano determinado com decano de referência estabelecido _de um mat_e,.riai Diolog 1 co comparando o indicador de i o indicador de_teor de sln-| ã~ partir....do .material biolól gico de referencia, de preferencia um material do mesmo tipo.

método da presente invenção pode ser concretizado de diversas formas incluindo métodos bioquímicos,

-I, I—II- ' —n— rr——— . .......

lóg ic os ou Ao^txpO^^ol.ÓLgj.CjO^moleohlaj. Embo ra o imuno-histo método seja tal como o estado maligno ou um estado pré-maligno, numa grande diversi dade de organismos, é particularmente adaptável à detecção de transformações nocivas em células, particularmente nas célu tectar englobam as transformações pré-malignas e as transfor mações malignas incluindo as modificações hiperplásicas e morfológicas.

A detecção da presença ou da ausência de sindecano po de ser realizada sobre diversos materiais biológicos do orga nismo, tais como as células, os tecidos e os fluídos corporais incluindo, particularmente no caso dos materiais biológicos dos seres humanos, o soro, o plasma, a urina, o fluído espinal

e outros extractos de tecidos. A detecção do teor de sindecano nos materiais biológicos pode ser efectuada recorrendo a uma diversidade de meios incluindo os ligandos específicos do sindecano ou os determinantes bioquímicos, os anticorpos espe cíficos do sindecano e os ARNm e os ADNc anti-sentido do sindecano ou os oligonucleotidos.

Outros aspectos, objectivos e vantagens da presente in venção tornar-se-ão ma is facilmente compreensíveis a partir da seguinte descrição pormenorizada da presente invenção conjunta mente com os desenhos anexos.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1A é uma representação gráfica do teor de sindecano da superfície celular em função do tempo, ilustrando a perda. de sindecano nas células epiteliais da mama do mur nho transformadas pela exposição à testosterona;

A Figura 1B é uma representação gráfica, da expressão do ARNm do sindecano em função do tempo, ilustrando a perda de sindecano nas células epiteliais da mama do murganho trans formadas pela exposição à. testosterona;

As Figuras 2A a 2D são reproduções de fotografias de secções de material epitelial biológico do murganho, mostrando a progressão da expressão do sindecano após a exposição desse material à luz UV .

A Figura 3Â é uma reprodução de uma fotografia onde se mostra as suspensões de células epiteliais da mama do mur ganho desenvolvidas em monocamadas tendo uma camada sido trans ff formada por ras-oncagéneos; e

A Figura 3^ θ uma representação gráfica do teor de sindecano da superfície celular para as monocamadas represen tadas na Figura 3A .

Descrição Pormenorizada dos Aspectos Preferenciais

A presente invenção baseia-se, em parte, na descober ta de que a detecção do sindecano constitui um critério de diagnóstico valioso para estimar a. malignidade em materiais biológicos tais como as células epiteliais. Apresentam-se exemplos de três tipos diferentes de modos experimentais de in duzir a transformação (indução hormonal, irritação por UV e indução oncogénica) tendo ficado demonstrado que para cada ca so a perda de sindecano e evidente. A detecção de perda de sindecano também é valiosa noutros mecanismos que conduzem a uma transformação tal como a formação de um tumor, pelo que a presente invenção não fica restringida apenas aos casos anteriormente referidos . Por exemplo, a detecção do sindecano pode proporcionar também informação valiosa em diversas fases proliferativgg dos tecidos (por exemplo, nos casos de pele, rins, cérebro, pulmões, bexiga) que posteriormente podem evoluir para uma fase mais maligna. Estas fases designadas por pré-malignas, frequentemente consideradas como displasias, ex pressam níveis variáveis de sindecano, o que constitui g informação necessária para estimar a gravidade da doença de modo a poder ser proporcionado o tratamento terapêutico adequa do. Uma área .importante para a detecção do sindecano encon2 tra-se também nas células do plasma circulante. Em consequên cia, a sua analise pelo método da presente invenção, o qual utiliza anticorpos específicos do sindecano, tal como a análi se por SCAF (separador celular activado por fluorescência) proporciona informação valiosa sobre o estado patofisiológico de um paciente com linfoma, mieloma, leucemia ou outras situa ções proliferativas das células hematopoiéticas.

Sabe-se também que o sindecano se separa da superfície das células 2?Jalkanen et al., J, Cell Biol., 105, (I987), 3087-3096_7, podendo ser esse o caso em algumas doenças, sendo a perda de sindecano a partir da superfície das células a cau sa do seu aparecimento nos fluídos corporais. Em consequência, de acordo com a presente invenção, constitui factor valioso dê diagnóstico a medição das quantidades de sindecano no soro, no plasma, na urina, no fluído espinal e noutros extractos de tecidos, com o objectivo de determinar até que ponto ocorre nos tecidos estudados a destruição desses tecidos e 0 desapareci do da superfície^-e^-ul^r^TTrr mento da morfologia celular normal.

Conforme referido antes, 0^sindecanojé um proteoglica ído-nar cadeias de glicosami noglicano (GAG) covalentemente ligadas _e por uma proteína nu clear envolvida por uma membrana /fSanders et al., j , Cell.

Biol., 108, (1989), 15^7-1556J/. As cadeias de GAG do sinde cano pertencem ao grupo do sulfato de heparano e do sulfato de condroitina ZfRapraeger et al.,, J. Biol. Chem, 260, (1985), 1104-6-11052^7 e não estão limitadas ao sindecano. A proteína nuclear do sindecano é única e define esta molécula como membro de vários proteoglicanos similares da superfície celular,

/Mãli et al., J, Biol. Chem., 265,(1990), 688h-6889-7.

sindecano dos murinos foi originalmente isolado e continua a ser frequentemente detectado com um anticorpo monoclonal (MnAb 281-2) contra a proteína nuclear do sindecano Z*Jalkanen et al., J. Cell Biol., 101, (19Ô5), 976-9oh«7.

Para melhor explicar a presente invenção salienta-se que a expressão do sindecano foi analisada relativamente à in dução do fenotipo maligno em três modelos diferentes biologicamente independentes, resultando cada um deles da transformação maligna das células epiteliais. Em todos esses modelos a perda de expressão do sindecano foi observada simultaneamente com a transformação maligna. Esses resultados encontram-se resumidos nos modelos adiante apresentados_;,para: ilustração da presente invenção.

No primeiro modelo utilizou-se uma linha de células de tumor da mama de murganhos, Shionogi 115 (S115). Essas células constituem um modelo excelente para estudos do fenótipo transformado, uma vez que respondem aos androgenos por acréscimo da taxa de crescimento Z“King et al., J. Steróid Biochem,, /.,(1976), 869-873-7 θ por modificação da morfologia epitelial para fibroblastica Z*Yates e King, Câncer Res., hl, (1981), 258-262_7. Na presença de um androgéneo as células aderem fracamente ao substrato e adquirem a capacidade de se desenvolverem em suspensão sem estarem fixas à matriz ao pas So que na ausência do androgéneo aderem bastante bem à matriz e não se desenvolvem em suspensão ^ÍYates e King, Câncer Res., hl, (1981),258-262 37. A base para a modificação morfológica e para a independência de fixação é de um modo geral’desconhe.

cida embora tenham sido sugeridos diversos mecanismos explica tivos, incluindo as modificações na organização do citoesqueleto ZTCouchman et al., Câncer Res., Hl, (1981) .263-269 _7 e nos mecanismos da paracrina Darbre e King, em Breast Câncer Cellúlar and Molecular Biology, (ed. Μ. E. Lippman e B. B. Dickson); Academic Publishers, 1981? PP» 3θ7~3^1)· As células S115 tratadas com testosterona revelaram uma forte ligação à ficronectina (FN), dependente de RGDS , mas não se ligaram ao domínio de FN de ligação ã heparina, significando:’isto que a sua expressão é idêntica a integrina. Por outro lado, as células S115 desenvolvidas sem testosterona demonstraram morfologia epitelial e ligação ao domínio de FN de ligação à heparina, significando isto uma alteração da expressão do sindecano nas células S115 tratadas com aquela hormona.

Tanto as quantidades do ectodomínio de sindecano de ligação ma tricial, quantificadas por um ensaio radioimunológico e pelo O método das manchas de Western, como as quantidades de ARNm de sindecano (2,6 kb) diminuíram nas células Sll^ tratadas com aquela hormona. A adição do anti-androgéneo acetato de ei proterona ao meio de cultura contrariou o efeito da testosterona no ARNm do sindecano. Portanto, a inactivação do gene do sindecano e a consequente supressão da expressão do sindecano encontram-se relacionadas com as propriedades de adesão alteradas, com o desaparecimento do fenómeno epitelial e, por outro lado, com o aparecimento do fenótipo idêntico transformado nas células S115 tratadas com aquela hormona.

Nas Figuras 1A e 1B en.contra-se representado um exem

I ,7

U pio ilustrativo dos resultados anteriores. A Figura IA é uma representação gráfica comparativa do teor de sindeca.no da superfície celular em função do tempo ilustrando a perda de sindecano nas células epiteliais (S115) da mama do murganho transformadas pela exposição à testosterona e a Figura 1B e uma representação gráfica comparativa da expressão do ABNm do sindecano em função do tempo ilustrando a perda de sindecano nas células epiteliais da mama do murganho transformadas pela exposição à testosterona. Essas representações demonstram o comportamento maligno e a perda da expressão do sindecano que é evidente na proteína da Figura 1A e o nível de ARNm da Figura 1B após a exposição.

Do que acabou de ser exposto, conclui-se que-aadiçào de an drogéneo ãs culturas de células SÍ15 origina a supressão da expressão dó sindecano provocada pela inactivação do gene do sindecano. Esta supressão está infimamente correlacionada com a aquisição da independência de fixação e com a perda do fendtipo epitellal, pelo que constitui uma das razões de evidenciação do comportamento do tipo transformado das células S115 na presença de androgéneo.

No segundo modelo estudou-se a imunorreactividade do sindecano em murganhos desprovidos de pêlos (hr/hr) expostos a irradiação UV-A e UV-B . Foi possível observar uma colora ção positiva à superfície das células epidérmicas normais e também nos quistos foliculares pilosos abortivos dérmicos característicos desta estirpe de murganhos. A reacção precoce à irradiação com UV demonstrando uma epiderme hiperplásica com atipia celular ligeira, foi também positiva, embora com re

duzida coloração das superfícies celulares epidérmicas. Os exemplares daquela estirpe com uma displasia severa demonstraram uma coloração fraca na camada celular granular ao pas. so que a a camada celular basal foi negativa. Nos papilomas e nc ceratoacantoma individual observou-se imunorreactivida de para o sindecano nas células epidérmicas hiperplésicas be . nignas, o mesmo sucedendo nas células epidérmicas proliferantes dos quistos córneos (hórn). A transformação maligna ex pressa pela formação de carcinomas celulares escamosos e de sarcomas foi uniformemente relacionada com a perda de colora ção do sindecano. Esses resultados são consistentes com as descobertas anteriores de uma expressão reduzida do sindeca no associada à transformação maligna das células epiteliais em cultura, mas sugerem também ums função importante para o sindecano na manutenção da arquitectura tecidual normal e no padrao de diferenciação da pele.

Nas Figuras 2A a 2D encontram-se representados exem pios dessas colorações. Essas Figuras são reproduções de fo tografias de secções de material biológico da pele do murganho demonstrando a progressão da expressão do sindecano após a exposição do material à luz UV . A Figura material de pele normal e as Figuras 2B e 2C

2A mostra o ilustram dife rentes fases de hiperplasia, indicando o corte representado na Figtira 2C alguma histologia maligna. Essas Figuras demonstram que a hiperplasia pré-maligna induzida pela irradia ção de luz UV perde gradualmente a expressão de sindecano.

Pelo que acabou de se expor é evidente que as células epiteliais in_vivo e confinadas ao seu ambiente normal perdem

14·

a expressão do sindecano durante o processo de transformação maligna, indicando novamente que a expressão do sindecano é necessária para a morfologia celular normal e para a integri dade dos tecidos, mas indicando também que a perda da expres são do sindecano deve estar correlacionada com a gravidade da displasia e com a malignidade de diluías eplteliais.

No terceiro modelo utilizou-se uma linha de células epiteliais da mama do murganho transfectada do gene c-Ha-ras mutado num ponto. 0 gene c-^a-ras está sob a acção do promo tor MMTV-LTR nessas células N0G-8-ras, pelo que a sua expressão pode ser regulada pela dexametasona Z*Ciardiallo et al., (1989)_7· Quando essas células expressaram o gene c-Ha-ras, formaram focos no prato de cultura celular e colónias em suspensão. As células N0G-8-ras cultivadas num prato de cultura celular expressaram o sindecano em quantidades iguais às das células normais em estado de subconfluência. Todavia, a expressão do sindecano foi notavelmente reduzida quando essas cé lulas apresentaram o fenótipo de transformação, isto é, houve formação de focos na placa ou houve desenvolvimento celular sob a forma de colónias em suspensão. Todavia, os níveis de

ARNm do sindecano permaneceram ao mesmo nível nas diversas culturas. Deste modo, a regulação do sindecano da superfície celular e organizada pós-transcripcionalmente nessas células. Esses resultados indicam que é um fenómeno vulgar o facto de a expressão do sindecano ser reduzida durante a transformação, mas a forma segundo a qual é regulada nas diversas células po de variar de um para outro tipo de células transformadas.

1ϊ <Γ

As Figuras βΑ e βΒ representem um exemplo de perda da expressão de sindecano induzida pelo oncogéneo.

A Figura βΑ é uma reprodução de uma fotografia repre sentando suspensões de células epiteliais da mama do murga^ nho desenvolvidas em monocamadas, tendo uma dessas camadas sido transformada pelo ras-oncogér.eo, e a Figura βΒ é uma representação gra'fica do teor de sindecano da superfície ceO lular para as monocamadas representadas na Figura βΑ . A expressão do sindecano foi quantificada nas células epiteliais desenvolvidas em monocamada utilizando-se para isso os símbo los a, b, c, f e utilizou-se o símbolo d para significar a indução pelo ras em suspensão. Como é evidente, perde-se sindecano a partir das células epiteliais de murganho transformadas pelo oncogéneo-ras.

Daquilo que foi dito conclui-se que a transformação maligna induzida pelo oncogéneo origina também a perda do sin decano da superfície das células epiteliais, indicando isto O que a perda de sindecano é uma característica comum da transformação maligna e que a detecção dessas perdas constitui um valioso instrumento de diagnóstico para a determinação das transformações do tipo cancerígeno e sua gravidade.

Existem três processos preferenciais para determinar o teor em sindecano em conformidade com o método da presente invenção, isto é, os processos bioquímico^ imunoquímico e bio lógico molecular. 0 primeiro processo baseia-se no reconhecimento bioquímico do sindecano, o qual pode fazer parte da proteína nuclear ou das cadeias GAG covalentemente ligadas. Demonstrou-se’ que o sindecano deve exibir cadeias GAG espe-

cíficas, as quais podem proporcionar interacções específicas com o sindecano Z. Elenius et al., J. Biol. Chem., 265, (19901·, 17837-179^3 ') Salmivirta et al., J. Biol. Chem., 266, (1991), no prelo 7, Em consequência, 0 sindecano pode ser detectado proporcionando um ligando específico do sindecano. Tadavia, os outros métodos exequíveis utilizam anticorpos específicos do sindecano e os ADNc adiante descritos.

Com & clonagem do sindecano de origen humana Z*Msli et al.ç J._ Biol. Chem.., -265,, (1990), 6884--6889 J. ou através do seu isolamento a partir de fontes humanas, tais como a linha de células HBL-100 da mama dos seres humanos /Helenius et al·? J» Biol. Chem., 265, (1990), 17837-1784-3 _7 e possível produzir anticorpos contra 0 sindecano de origem humana. Isto pode ser conseguido Imunizando animais para produção de anti corpos policlonais ou monoclonais ou utilizando células in vitro para a produção de anticorpos- monoclonais com sindecano intscto de origem humana isolado, seus fragmentos, péptidos de síntese ou proteínas de fusão previsíveis pelo clone ADNc humano. Na prática da presente invenção é possível aplicar técnicas convencionais da biologia molecular, da microbiologia, do ADN recombinante e da imunologia para determinar o teor de sindecano, estando essas técnicas pormenorizadamente descritas na literatura. Veja-se a título de exemplo Current Protocols in immunology, Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, Inc., 1990.

Utilizando os anticorpos específicos de sindecano humano é possível estudar a expressão do sindecano nos tecidos recorrendo a métodos imuno-histológicos clássicos, por exem* ..... 1Ζ ^z

v.

ύ pio, conforme se mostra no modelo ilustrado nas Figuras 2k a 2D . De acordo com esses métodos, o reconhecimento específico é proporcionado pelo anticorpo primário (policlonal ou monoclonal) mas o sistema de detecção secundário pode utilizar técnicas de fluorescência, enzimáticas ou outros anticorpos se cundários conjugados. Em consequência, obtém-se uma coloração imuno-histolo'gica da secção tecidual para exame patológico. Também é possível extrair os tecidos, por exemplo, com ureia e com um detergente neutro para a libertação do sindecano para o ensaio de pontos/fendas ou das manchas de Western. Em confor midade com esta técnica, a qual se baseia na utilização de fases sólidas catiónicas, consegue-se a quantificação do sindeca no utilizando como padrão sindecano isolado. Esta técnica tam bem pode ser aplicada no caso dos fluídos corporais. Com essas amostras, uma concentração molar de sindecano auxiliara a estabelecer valores do teor de sindecano para diferentes fluí dos corporais, tais como o soro, o plasma, a urina, o fluído espinal, etc. 0 aparecimento normal de quantidades de sindecano pode ser depois determinado recorrendo aos valores obtidos a partir de voluntários saudáveis e comparando esses valores com os valores obtidos em pessoas que exibem estados ou do enças diferentes.

As modificações na expressão de sindecano também podem ser detectadas utilizando o ADNc do sindecano, tal como o ADNc do sindecano de origem humana. Embora o sindecano seja bem conservado entre espécies, as diferenças estruturais ao nível do nucleótido são suficientemente grandes para impedir a utilização do sindecano do murganho para a detecção do ARNm

do sindecano de origem humana. De um modo geral, os níveis de ARNm de um determinado produto génico podem ser detectados ♦

tomando como base a interacçgo específica das formas com senti do e anti-sentido-das mesmas cadeias nucleótídicas e neste caso as que dizem respeito ao sindecano. Isso pode ser consegui do utilizando uma técnica in situ para as amostras teciduais, recorrendo ao ensaio de protecção ARNm para o ARN isolado ou a polimerização das cadeias nucleotídicas específicas do sin decano dirigidas pelo precursor. Todas essas técnicas se encon tram amplamente descritas na literatura tal como a publicação Current Protocole in Molecular Biology anteriormente referida.Os exemplos que se seguem apresentam os métodos específicos em conformidade com a presente invenção. Faz-se observar que esses exemplos têm apenas objectivos ilustrativos e não pre tendem limitar a presente invenção tal como acabou de ser descrita .

Exemplo 1

Localização do sindecano em células epiteliais transformadas

Por um processo de rotina preparou-se uma cultura de cé lulas de reserva S115 Shionogi de tumor da mama do murganho em DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco ) enriquecido com 5 % de soro de vitela fetal inactivado a quente (SVF-i), pi ruvato (1 mH), glutamina (1 mM), penicilina (100 Ul/ml), estrejs tomicina (100yug/ml) e testosterona (10 nM). -Para os estudos en volvendo o tratamento hormonal utilizou-se meio de crescimento enriquecido com soro _de vitela fetal tratado com % _de dextra li ?7

Á'

. no em carvão (SVF/DC) em presença ou na ausência de testosterona (10 nM) e/ou acetato de ciproterona (ljuM). Para as expg riências procedeu-se à preparação de lamelas contendo as células com uma densidade de 10000 por cm2 sobre placas tecidugis de cultura de tecidos Pune. Para s contagem das células pro cedeu-se à lise das células utilizando Hepes 10 mH, Zaboglobin contendo MgC^ 1,5 mM (Coulter Electronics, Ltd.) e com os núcleos libertados preparou-se uma suspensão em Isoton (Coulter) e finalmente procedeu-se à contagem utilizando um contador de células Coulter.

As células S115 foram coloradas ao quarto dia de cultura intacta conforme descrito por Jalkanen et al., J. Cell. Biol, 101, (I985), 976-984·. 0 proteoglicano da superfície celu lar, isto é, o sindecano, foi imunolocalizado com um anticorpo 281-2 monoclonal da ratazana contra a proteína nuclear de proteoglicano Z*Jalkanen et al., J. Cell Biol., 101, (1985), > 976-984-_7 e essas colorações foram controladas utilizando outro anticorpo Mel-14- monoclonal IgG^_o, específico do receptor dirigido aos linfócitos Z^Oallatin et al., Nature, 304-, (1981) 30-34-J⁷. A detecção dos Bhtlcorpss imobilizados das ratazanas foi efectuada com anti-FITC da ratazana conjugado no coelho (Janssen Biochimica).

Exemplo 2

Detecção da expressão do sindecano alterada em células epiteliais sob transformação induzida por hormonas

Para a quantificação do sindecano na superfície e/elular • das células S-115 procedeu-se à lavagem de monocamadas celu lares diversas vezes -com PBS frio e libertou-se o ectodomínid da molécula com tripsina pancreática de bovino (Sygma, Type

111, 20yUg/ml por incubação durante 10 minutos sobre gelo con forme descrito por Rapraeger e Bernfield, J, Biol, Chem., 258, (1933), 3632-3636; J. Biol. Chem., 260 (1985), 4103-4109.

Após a inactivação da tripsina pelo inibidor da tripsina

100yug/ml procedeu-se a centrifugação das células , recuperou-se 0 sobrenadante para a quantificação do ectodomínio e prepara contagem das células, 0 anticorpo monoclonal 281-2 foi radioiodado pelo mé todo, da'oxidação com cloramina T ZTstâhli et al., Meth, Enzymol,, 92, (1983), 242-253-7 de modo a obter-se uma actividade específica de 14,1 x 10^ cpm^tig. Para 0 ensaio utilizou-se c os sobrenadantes provenientes de 2 x 10^ células e um sindeca, no de controlo purificado proveniente de células NMuMG, os quais foram colocados sobre uma membrana de nylon catiónica (Zeta-Probe, BioRad) num aparelho adequado de minidobra-fenda (/Ãmihifeld-Slot) (Schleider & Schuell) conforme descrito nou tra publicação /fjalkanen et al., J, Cell, Biol., 105, (1987), 3087-3096-7. Separou-se a membrana do aparelho de fenda e efec tuou-se a incubação durante 1 hora à temperatura ambiente em PBS enriquecido com 10 % de SVF para bloquear a membrana. Depois efectuou-se a incubação durante a noite à temperatura de +4°C em PBS contendo um anticorpo 281-2 marcado com 125j (10000 cpm/ml). Após a lavagem do filtro cinco vezes com PBS efectuou-se a exposição a uma película Kodak X-Omat para visualizar a ligação de 281-2. Para efeitos de quantificação procedeu-se à análise de cada fenda utilizando um densímetro de laser aperfeiçoado LKB Ultroscan XL e efectuou-se a cqm paraçao com as quantidades conhecidas de sindecano das células MNuMG .

Os ectodomínios das células S115 libertados pela trio sina foram precipitados com etanol e fraccionados sobre gel em gradiente (4-10 f₀) de SDS-PAGE /“CFarrell, J. Biol. Chem., 250- (1.976), 4007-4021.7. Após a electroforese as amostres foram transformadas sobre uma membrana do tipo Zeta-Probe utili zando um aparelho de electromareação 2005 Transphor (LKB) conforme descrito noutra publicação zfjalkanen et al., J. Cell Biol., 101.(1985), 976-984; Rapraeger et al., J. Biol. Chem., 260,(1985), 11046-11052J e a membrana foi exposta a um anticorpo 281-2 marcado com 1^5j tal como anteriormente descrito. Também neste caso é possível utilizar para comparação 0 ectodomínio do sindecano isolado das células NMuMG .

Exemplo 3

Detecção da expressão génica do sindecano alterada em células epiteliais transformadas

Isolou-se o ABN total utilizando isotiocianato de guanidina 4m e fazendo a granulação com CsCl conforme descrito por Chirgwin et al·., Biochem,, 18, (1979)9 52'94-5299. Fraccio naram-se alíquotas ARN de 15 microgramas sobre o gel de agarq se de formaldeído (1 %} e transferiram-se para uma membrana Gene Screem Plus. A hibridação com inserções de ffiâPcações múl22

tiplas (Ameraham) de uma sonda de ADNc de PM-4 para o sindeca no zfSaunders et al., J,_ Cell Biol., 1QÔ, (1999), 15+7-15507⁷foi efectuada sob as condições recomendadas pelo fabricante da membrana (New EnglandNuclear). A sonda imobilizada foi visualizada expondo a membrana a uma película Kodak X-Oniat à tempe ratura de 7ó°C e efectuou-se a quantificação de ARMm de 2_r6:kb _ por-análise densimétriea conforme descrito entes. A expressão de ARNiii do sindecano foi correlacionada com o ARN ribossómico conforme descrito por Denis et al., Nucl. Acid Res., 16, (1938), 235+-2359· A especificidade da expressão do sindecano ainda foi estudada sondando as mesmas para determinação d? taxa do gliceraldeído 3f°sfato-desidrogenase (GAPDH) Z*Fort et al. , ffucltvAcidl-Res., 13, (1985), 1+31-1+^+2 7⁷ e da alfa-actina do . murganho áTMinty et al., J. Biol. Chem., 256,(1981), lOOÔ-lOlU/,

A hibridação in situ do ARNc para secções parafínicas foi efectuada em conformidade com o método de Wilkinscnet al.,

Ό Developm., 105,(1989), 131-136. Efectuou-se a subclonagem de um fragmento Sac-I -’Κρη I de 535põ proveniente de um clone de ADNc parcial para o sindecano do murganho (PM-4-) ZSaunders et al., J. Cell Biol·.,, 108, (1989), 15^+7-1556 J ZVainio et al., Development, (1991) submetidoJ7 para 0 interior do vector pGEM-^-Z de uma ribossonda (Promega, Medison, WI). 0 plasmídeo clonado contendo a inserção foi linealizado com as enzimas Eco RI ou Hind III, tendo sido produzidas transcrições anti-sentido segundo o sentido a partir dos cordões .complementares com as polimerases T7 ou SP6 na presença de ^'S-UTP (Amersham, Willshire, UK), respectivamente. 0 comprimento máximo das transcfimõgs foi reduzido para um valor / 200 pb

por hidrólise alcalina e procedeu-se à recolhe das fracções · com a actividade específica mais elevada, efectuando-se segui demente a sua precipitação e solubilização em tampão de hibri dação. As lameles pré-tratadas foram hibridadas durante a noite è temperatura de 5θ°£ ^e executou-se os procedimentos pa_ ra a remoção da ligação não específica da sonda (incluindo la vagens bastante cuidadosas e o tratamento com a ribonuclease

U

A) e também a autorradiografia conforme descrito antes /Wilkinson et al., Deveiopment, 105. (1989) 131-136].

Exemplo 4

Detecção da expressão do sindecano alterada em secções teciduais obtidas a partir de tumores

Foram produzidos tumores em murganhos macho desprovi— dos de pêlos ligeiramente pigmentados, da estirpe hr/hr ΟβΗ/

O /Tif (Bomholdgaard, Denmark) submetendo os animais a irradiação.-UV-A e UV-B conforme descrito por Talve et al.·, Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., 2? (1990)₃ 109-115· Durante o período de observação de 12 meses ocorreu a formação de um total de 83 papilomas, 2 c e rato a cant ornas, 4· carcinomas escamocelulares, 1 carcinossarcoma combinado e 11 sarcomas, com formação tumoral crescente associada à irradiação elevada de UV-A (5b2 J/cm2) mais a irradiação elevada de UV-B (eficaz em termos de erltema =EE) (1,0 J/cm2) mais a irradiação elevada de UV-B (EE) (0,8 J/cm2) (78 contra 28 tumores). Foram extraídas amostras de todos os grandes tumores fecilmente ob

24· servsveis e também da pele c.om o aspecto normal exposta à irra diaçao UV . Uma porção das amostras foi fixada em formalina tamponada a 10 X, embebida em parafina seccionada e normalmente clorada com hematoxilina e eosina. As amostras restantes foram congeladas em azoto e seccionadas. Procedeu-se à classi ficação das lesões em conformidade com os critérios histopatológicos normalizados. Em alguns casos recorreu-se também à co loração de Schiff com ácido periódico (SAP) para visualização das membranas fundamentais e também da tricromia de Herovic, Weigert e Masson e das manchas de Gomori para os tipos de cola géneo e ainda de outras manchas e efectuou-se a análise por microscopia electrónica sempre que necessário.

Para a localização imuno-histoquímica do sindecano uti lizou-se um anticorpo 281-2 monoclonal da ratazana. Este anticorpo é específico para a proteína nuclear do ectodomínio do sindecano do murganho (18). Recorreu-se à técnica da biotina-imunoperoxidase para detectar o anticorpo 281-2 imobilizado, conforme descrito por Hsu et al., J._ Histochem, Cytochem., 29, (1981), 577-p3O. Após a desparafinização e nova hidratação das secções teciduais a actividade da peroxidase endógena’ foi bloqueada incubando as lamelas numa solução de metanol a 100Z contendo 3% de peróxido de hidrogénio, durante 30 minutos. As secções fora depois encubad.as com uma mistura de 2 % de soro normal de cabra (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) em solução salina tamponada com Tris, a pH 7Λ (STT) durante 3 minutos à temperatura ambiente (TA) para minimizar a coloração não específica. As secções foram cobertas com um anticorpo 281-2 primário para um valor de concentrarão nr-o··-^· ^^xibxdçao proteico correspondente a

jig/ml em 1 % (p/v) de BSA/STT e depois efectuou-se a. incubação durante a noite a *+°C. Depois efectuou-se a incubação das lamelas com anti-IgG do rato conjugado na cabra e biotinilado (Jackson's Immunoresearch Laboratories, Inc. West Baltimore, Pennsylvania) para um valor de diluição de 1:1000 em 1 % de BSA-STT durante 30 minutos à temperatura ambiente e finalmente com o complexo avidinbiotina-peroxidase (estojo Vectastain, Vector Laboratories, Eurlingame, CA) durante 3θ minutos à tem peratura ambiente. Após as lavagens demonstrou-se a actividade da peroxidase incubando as lamelas com 0,5 mg/ml de tetracloridrato de 3,3¹-diamino-benzidina (DAB, Polysciences, Inc., Northampton, Inglaterra) em STT contendo 0,68 mg/ml de imidazol e peróxido de hidrogénio na concentração de 0,01 % durante 5 minutos ao abrigo da luz. As lamelas adquiriram uma ligeira coloração de contraste com a hematoxilina de Mayer e com meio suportado Depex Mounting (BDH Limited Pool, Inglaterra).

Entre os diversos passos as lamelas foram lavadas 3 vezes com . solução salina tamponada com o tampão Tris (STT). Para secções de controlo utilizou-se IgG de ratazana normal (Sigma, St. Louis, M0) na concentração de 2 ^íg/ml. Procedeu-se também à coloração de algumas secções congeladas para cada tipo, tendo como consequência uma imunorreactividade idêntica à das secções de tecido embebido em parafina.

As modificações na concentração dos anticorpos prlmé« rios nos tempos de incubação não alteraram significativamente o diagrama de coloração.

Exem26

Exemplo 5

Detecção da expressão do sindecano alterada durante a transformação induzida por oncogénio ras

As células N0ú-8 apresentam um sub-clone de uma linha de células epitelial da mama do murganho normal, as células NMuMG e NOG-3 ras são uma linha de células NOG-8, as quais foram transfectadas com um plasmídeo contendo um promotor MMTV-LTB indutível para glucocorticóide ligado a um ponto do gene c-Ha-ras mutado. 0 desenvolvimento das células efectuou -se em meio de cultura celular RPMI-169-0 (Gibco) enriquecido com soro de vitela fetal tratado com dextrano a 5 % em carvão (SVF-DCC), glutamina, penicilina (100 Ul/ml) e estreptomicina (lOOyug/ml). Nessas células a expressão do gene c-Ha-ras pode ser induzida até ao valor máximo adicionando dexametasona 1 (Sigma) ao meio da cultura celular. Recorreu-se ao tratamento com DCC para eliminar do soro os esteróides adicionais, os quais poderiam eventualmente influenciar a expressão do gene transfectado. Para as culturas bacteriológicas em suspensão efectuou-se a cobertura das placas com 1 % de gelose (Sigma) em RMPI-169-0 para evitar a-possível adesão ao substrato celular. A inoculação com as células foi efectuada de modo a obter-se uma densidade de 1 x lCr/ml. Determinou-se o número de células após tripsinação utilizando um contador Coult.er (Coulter Electronics, Hialeah, FL), 0 PM-4 é uma sonda de ADNc para o sinde cano originalmente clonado por Saunders et a.l·., J. Cell Biol., 108, (1988), 159-7-1556. Permite detectar duas bandas de 2,6 kb e 3,4 kb a partir das células da mama de murganhos normais.

'ΤΑ fi

Para a preparação de ARN lavou-se duas vezes as pia ⁶ cas de cultura celular com solução salina tamponada com fos_ fato (STF) arrefecida com gelo e depois dissolveu-se em tampão GIT 4M [isotiocianato de guanidina 4M em citrato de só dio 5mM (pH 7,0), β -mercapto-etanol (0,1 M) e 0,5 1 de N-lauril-sarcosina]. A extracção do ARN foi efectuada por centrifugação das partículas densas de CsCl conforme descrito por Chirgwin et al., Biochem., 18, (1979), 5294-5299. Para a análise das manchas de Northern procedeu-se à separação de amostras de ARN por electroforese em 1% de formaldeído/gel de agarose. As manchas desses geles foram obtidas sobre uma membrana de hibridação GeneScreen. Os filtros foram pré-hibri dados em NaCl 1M, 1% de dodecilsplfato de sódio, 10Z de sulfato de dextrano, 5 x solução dè Dénhardt, ADN de esperma de salmão na concentração de 100 microgramas/ml, e 50^ de formamida, ã temperatura de 42°G. Para a hibridação utilizou-se sondas BS-9 ou PM-4 com múltiplas marcações. Utilizou-se o isótopo p-32 (Amersham). Os filtros foram lavados ã tempera tura de 65°C para o caso de PM-4 e à temperatura de 60°C para o caso de BS-9 utilizando 2 x SSC, 1% de dodecilsulfato de sódio, obtendo-se uma imagem por exposição a películas de raios X Kodak X-Omat ou Fuji.

Para a quantificaçao da expressão do sindecano da superfície celular as células das placas de culturas foram lavadas 3 vezes com STF arrefecida com gelo. Essas placas foram incubadas em K-EDTA 0,5 mM em STF durante 10 minutos ã temperatura de +4 C. Adicionou-se tripsina ate se obter uma concentração final de 20 e efectuou-se a incubação durante 10 minutos

ã temperatura de +4°C. A tripsina liberta no meio o ectod£ ( mínio do sindecano [Rapraeger e Bernfield, J. Biol, Chem. , 260, (1985), 4103-4109]. Depois efectuou-se a raspagem das células com uma espátula de borracha ou preparou-se uma sus pensão das colónias e adicionou-se o inibidor de tripsina (Sigma, T-9128) até se obter uma concentração final de 100 Jig/ml. Procedeu-se ã centrifugação das células (5 minutos a 100 x g), recolheu-se o sobrenadante e efectuou-se a contagem das células utilizando um contador Coulter. Reco lheu-se para um tubo de ensaio as células em suspensão e de_i xou-se sedimentar as colónias durante 5 minutos, seguindo-se a remoção do sobrenadante similar ao das culturas das placas de Petri. Efectuou-se a lavagem das colónias 3 vezes com

STF arrefecido com gelo e tratou-se com tripsina.

Com a quantidade adequada de sobrenadante, que corres_ ponde a 2 x 10 células, preparou-se uma mancha sobre uma mem brana de nylon catiónica (Zeta Probe, Bio-Rad). Efectuou-se a pre incubaçao da membrana em tampão de incubação (10% de Soro de Vi . telo Fetal, azeto de sódio 1 mM; STF) durante 1 hora ã temperatura amO biente . Adicionou-se MnAb 281-2 marcado radioactivamente (método da cio ramina T) [Jalkanen et al., J. Cell Biol., 105, (1987), 3087-3096], o qual reconhece o ectodomínio do sindecano, ao tampão de incubação, até se obter uma concentração final de 10000 CMP/ml e efectuou-se a incubação durante a noite à temperatura de +4°C. Lavou-se o filtro com STF duran te 10 minutos ã temperatura ambiente. Repetiu-se a lavagem 10 vezes e depois submeteu-se a filtro a exposição para obter uma autorradiografia sobre uma película de raios X. Procedeu-se ã análise da autorradiografia utilizando um densímetro de

alta precisão GelScan XL (LKB) e recorrendo à aplicação informática oelScan SL 2^-00 ção com ectodomínio isolado

105, (19Õ7), 3Oô7-3O^6J7, (LKB), efectuando-se a normaliza. ZTjalkanen et al·., J, Cell Eiol.,

Resumindo o que foi exposto.

reafirma-se que a presen

te invenção é útil para detectar transformações potencialmente nocivas mediante determinação da expressão do sindecano e do seu teor, por exemplo, ao nível dos tecidos e em diversos fluídos corporais, 0 método pode ser concretizado por técni cas bioquímicas e, imuno-histoquímicas e por biologia molecular utilizando, por exemplo, os ligandos e os anticorpos específicos do sindecano (policlonais ou monoclonais e o ADNc. Uma das aplicações especiais do método reside nas modificações malignas das células epiteliais, as quais exibem um forte dedeclínio na expressão do sindecano durante o processo da trans formação maligna. A análise da expressão do sindecano em casos de hiperplasia também está abrar^i.do' uma vez que constitui um factor valioso na estimação da gravidade desta fase pré-ma ligna. As analises da expressão do sindecano são particularmente úteis para a classificação de diversos estádios de displasias proliferantes pré-malignas.

Claims

1. - Processo para a detecção de uma transforma- . ção potencialmente nociva das células de um organismo, caracterizado pelo facto de se determinar um indicador do teor em sindecano obtido a partir de uma amostra de um material biológico desse organismo e de se comparar o indicador do teor de sindecano determinado com um indicador do teor de sindecano de ref_e rência obtido a partir de um material biológico de referência.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca racterizado pelo facto de a transformação ser uma transformação maligna.

3,Processo de acordo com a racterizado pelo facto de a transformação reivindicação 1, caser uma transformação pré-maligna.

4.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a transformaçao nociva ser uma alteração de uma hiperplasia declarada.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a transformação nociva ser uma hiperplasia.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a transformação nociva ser uma alteração morfológica declarada.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determinado por um processo bioquímico.

8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determinado por um método imuno-histológico.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determinado por um método molecular biológico.

10,- Processo de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo facto de o organismo ser humano.

11,- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determinado por um método que utiliza um determinante bioquímico específico do sindecano humano.

12.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determinado por um método que utiliza um ligando específico do sindecano humano.

13.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determinado por um método que utiliza um anticorpo específico do sindecano humano.

14.- Processo de acordo com a reivindicação 10, cara£ terizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determina do por um método que utiliza um ARNm anti-sentido do sindecano humano.

15.- Processo de acordo com a reivindicação 10, ca racterizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determinado por um método que utiliza um ADNc anti-sentido do sindecano humano.

16.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o teor em sindecano da amostra ser determinado por um método que utiliza um oligonucleotido anti-sentido do sindecano humano.

17.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o material biológico ser um fluido corporal.

18. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o fluido corporal ser o plasma.

19. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o fluido corporal ser o soro.

20. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o fluido corporal ser a urina.

21. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o fluido corporal ser o fluido espinal.

22.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o indicador do teor em sindecano determinado ser um valor quantitativo do teór em sindecano.

23.- Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o indicador do teor em sindecano de referência ser um valor quantitativo do teor em sindecano.