BG107177A - Устойчиви към сулфонилурея слънчогледови растения - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до слънчогледови линии и хибриди, устойчиви към сулфонилурейни хербициди. Белегът за устойчивост е получен чрез използване наиндуцирана мутагенеза и изкуствена селекция. Изобретението се отнася и до метод за селективно контролиране на нежелан растеж, включително на паразитни плевели, чрез прилагане на сулфонилурейни хербициди към устойчиви на сулфонилурея слънчогледови култури.

Description

1. ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Изобретението се отнася до слънчогледови растения, поспециално до слънчогледови семена, които са развили устойчивост към сулфонилурейни хербициди чрез мутагенеза.

2. ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Култивираният слънчоглед (Helianthus annuus L.) е диплоиден вид (2п=34), който се отглежда в много умерен климат, в полусухи региони на света като източник на растително масло и сладкарски семена. Видовете слънчоглед за получаване на масло, съдържат от 40 до 48 процента масло в семената. Слънчогледовото масло е ценно като хранително масло, поради високото съдържание на ненаситени мазнини и светъл цвят. То се използува за салати, за готвене и производство на маргарин. Протеиновото съдържание на слънчогледовото брашно, приготвено от семената след маслената екстракция, е полезно за храненето на животни. Семената и на двата сорта култивиран слънчоглед се използуват като храна за птици.

Само няколко хербицида са създадени и разработени за селективен контрол върху плевели при култивирания слънчоглед. Тези хербициди включват алахлор, S-етилдипропилкарбамотиоат (ЕРТС), еталфлуралин, трифлуралин, пендиме талин, хлорамбин, имизаме табенз-ме тил, се токсидим и сулфен тразон. Необходими са допълнителни мероприятия за контрол върху плевелите, за да се осигури един по-добър спектър на борба с тях и за да се редуцира развитието на резистентност към хербицидите.

Представителите на семейство Orobanchaceae са плевели, които недоста тъчно са контролирани чрез понастоящем използуваните хербициди при култивирания слънчоглед. Тези плевели са облигатни коренови холопаразити при много от широколистните растения, включително и при слънчогледа. Конкретните Orobanche видове, които засяга та слънчогледа включва т Orobanche aegyptiaca Pers., О. ramosa L., O. minor Sm., O. cumana Wallr. и O. cernua Loefl. O. cumana Wallr. и O. cernua Loefl. (алтернативни имена за едни и същи видове) е сериозен проблем в Източна Европа, който се разпространява и в Южна Европа. Orobanche представлява сериозен риск и някои видове, като О. minor, са се появили като екзотични в Съединените щати. Orobanche видовете са много трудни за унищожаване, освен заради листните им части, а също така, че се развиват в почвата и семената им са много дребни , произвеждат се в изобилие, лесно се разпространяват и живеят продължително. Хербицидите, които се използуват понастоящем при слънчогледа, не осигуряват адекватен контрол.

От откриването на сулфонилурейните хербициди преди повече от двадесет години, са разработени редица препарати за селективен контрол върху плевелите при различни култури. (The Pesticide Manual, Eleventh Edition, C. D. S. Tomlin, ed., British Crop Protection Council, Surrey, U. K., 1997). Сулфонилурейните хербициди притежават като съществена молекулна структурна характеристика една сулфонилурейна половина (-S (O)₂NHC (О) NH (R)-). Сулфонилния край на половината е свързана или директно, или посред твом кислороден атом или незадължително заместена амино или метиленова група към циклична или ациклична група. На противоположния край на сулфонилурейния мост, аминогрупата, която може да има един заместител като метил (R да бъде СН₃), вместо водород, е свързана към хетероциклична група, обикновено симетричен пиримидинов или триазинов пръстен, притежаващ един или два заместителя като метил, етил, метокси, етокси, метиламино, диметиламино, етиламино и халогени. Механизмът на действие на сулфонилурейните хербициди е инхибиране на ензима асетолакта т син таза (ALS), открит при растенията, но не и при животните. Сулфонилурейните хербициди осигуряват една ценна комбинация с отлична ефективност срещу плевели, а същевременно и ниска токсичност за животните.

Тъй като сулфонилуреите са разработени за селективен контрол върху плевелите при различни култури, обикновените сор тове кул тивиран слънчоглед са недоста тъчно ус тойчиви към тези препарати и те не могат да бъдат полезни за селективен контрол при слънчогледови култури.

Докладвано е обаче, че прилагането на една ниска доза (2 до 6 g/ha) от хлорсулфурон преди поникването, води до 75-85% контрол върху О. cernua с устойчивост при слънчоглед (L. GarciaTorres et al.,Weed Research 1994, 34, 395-402). Въпреки че, сулфонилурейните хербициди са показали, че притежават ефект върху видовете Orobanche, чувствителността на обикновените сортове слънчоглед към сулфонилурея, възпрепятства използуването на по-високи апликационни количества, за да може да се осъществи един по-добър контрол върху Orobanche.

По-големи апликационни количества сулфонилурейни хербициди биха могли да бъдат използувани за контрол върху Orobanche, а също така и върху други видове, ако могат да се развият сортове слънчоглед, които са по-устойчиви към сулфонилурея. За да могат лесно да се включат в програми за създаване на нови видове, комбиниращи желани белези, белегът за сулфонилурейна устойчивост следва да бъде високо наследствен ( т.е. доминантен или полудоминантен). Индуцирани мутагенези са използувани за получаване на сулфонилурейна резистентност при соя, както е дискутирано в патент US 5,084,082, но този подход не е докладван за слънчогледа, който притежава различна морфология на семената в сравнение с тази на соята. Тъй като 99% от индуцираните мутации са рецесивни (W. Gottschalk & G. Wolf Induced Mutations in Plant Breeding, Springer-Verlag, New York, 1983, particularly p. 12), доминантните мутации са изключително рядки. За да бъдат открити доминантни хербицидни резистентни мутациии, обикновено е необходим скрининг на хиляди мутирали семена.

Следователно, съществува необходимост да може да се осъществи селективен контрол върху Orobanche и други плевели при използуването на сулфонилурейни хербициди. Заявителите са осъществили много проучвателни програми за откриване на доминантни или полудоминантни мутантни белези, осигуряващи сулфонилурейна устойчивост при култивирания слънчоглед.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Настящето изобретение се отнася до метод за получаване на слънчогледова линия, съдържаща високонаследствен белег, осигуряващ устойчивост към сулфонилурейни хербициди, който метод включва: (а) третиране на слънчогледови семена с мутагенен агент; (Ь) отглеждане на третираните семена до напълно развито растение за получаване на второ поколение семена; (с) събиране на второто поколение семена; (d) покълване на второто поколение семена в присъствието на селективно ефективно количество сулфонилуреен хербицид и селектиране и подбор само на покълналите семена, съдържащи белег, който осигурява устойчивост към сулфонилурейния хербицид; (е) отглеждане на подбраните покълнали семена до развитие на растение за получаване на семена чрез самоопрашване на слънчогледовите линии, съдържащи наследствения белег.

Изобретението също така се отнася до слънчогледово семе, съдържащо високо наследствен белег, осигуряващ устойчивост към сулфонилурейни хербициди, къдет о белегъ т е получен чрез мутагенеза. Друго изпълнение на това изобретение е устойчиво към сулфонилурея слънчогледово растение, части от което, като цветен прашец, или семепъпка, или тъканна култура от регенериращи се клетки, отгледани от гореспоменатите устойчиви към сулфонилурея семена. Гореспоменатите семена и растения могат дъпълнително да съдържат други желателни белези, като устойчивост към Orobanche паразитизъм.

Друг аспект на изобретението е метод за получаване на инбредни слънчогледови семена, притежаващи устойчивост към сулфонилурейни хербициди, включващ кръстосване на първо родителско слънчогледово растение с второ родителско слънчогледово растение и събиране на получените инбредни семена, където първото и второто родителско семе, притежава т високо наследствен белег, осигуряващ устойчивост към сулфонилурейни хербициди, и където белегът е получен чрез мутагенеза. Съответните изпълнения включват инбредно слънчогледово семе, получено по този метод и инбредно слънчогледово растение, или част от него, като семе, получено чрез отглеждане на инбредното семе. Още един друг аспект на изобретението е метод за получаване на хибридно слънчогледово семе, притежаващо устойчивост към сулфонилурейни хербициди, включващ кръстосване на първо родителско слънчогледово растение с второ родителско слънчогледово растение и събиране на полученото хибридно слънчогледово семе, където първото или второто родителско слънчогледово растение притежава високонаследствен белег, осигуряващ устойчивост към сулфонилурейни хербициди, и където белегът е получен чрез мутагенеза. Съответните изпълнения включват хибридно слънчогледово семе, получено по този метод и хибридно слънчогледово растение, или част от него, като семе, получено чрез отглеждане на хибридното семе.

Друг аспект на изобретението се отнася до метод за контролиране на нежелания растеж в култури от гореспоменатите устойчиви към сулфонилурея слънчогледови растения, като методът включва прилагане в мястото на растеж на ефективно количество сулфонилуреен хербицид. Изпълненията от този аспект на изобретението включват метод за контролиране на видове Orobanche паразити по слънчогледа.

Допълнителни аспекти на изобретението включват методи за контролиране на саморасли слънчогледови растения в зърнени култури чрез прилагане на ефективно количество от 2,4дихлорофеноксиоцетна киселина (2,4-D) и при култури със захарно цвекло, чрез прилагане на ефективно количество смес от трифлусулфурон-метил и фенмедифам на мястото на растежа.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

В описанието и примерите са използувани различни термини. За да се осигури яснота и последователно разбиране на описанието и патентните претенции, включително обхвата на термините, са представени следните дефиниции:

„Растение“: включва растителни клетки, растителни протопласти, растителни клетъчни тъканни култури, от които могат да бъдат регенерирани слънчогледови растения, растителен калус, растителни туфи и растителни клетки, които са интактни в растенията или частите на растенията, като зародиши, цветен прашец, семепъпки, прашникови торбички, венчелистчета и други части на цвета или семето, листата, стеблата и корените, включително кореновите краища и други.

„Сорт или културен вид“: отнася се до група растения вътре във вида (например Helianthus annuus), които притежават същите постоянни характеристики, които ги различават от типичните форми и от други възможни сортове във вида. Притежавайки поне един отличителен белег, „сортът“ също се характеризира със съществени и значителни вариации между индивидите в него, основани главно на Менделеевото разделяне на белезите в потомството на успешните поколения.

„Линия“: означава група растения, които показват по-малко вариации между отделните индивиди, обикновено като резултат от няколко поколения, получени чрез самоопрашване. Също така, една линия може да включва група растения, размножаващи се вегетативно от едно родителско растение, при използуването на клетъчно тъканни техники.

„Слънчогледово семе“: ботанически се отнася като „achene“ и означава комбинирани компоненти на околоплодник и зародиш.

„Поддържаща линия“: отнася се до изогенна фертилна мъжка наследствена линия, която съответствува на CMS линията. Една поддържаща линия притежава нормална цитоплазма, която позволява размножаване с CMS линия за получаване на CMS потомство.

„Цитоплазмено мъжко стерилно (CMS) растение или инбредна линия“: означава слънчогледова линия, която произвежда нежизнеспособен цветен прашец, т.е. мъжко стерилно растение. Мъжкият стерилитет се унаследява по майчина линия, т.е. мъжкото стерилно растение се използува като женски родител при кръстосване с цветен прашец от друг слънчоглед. CMS линиите се получават чрез кръстосване на рекурентна родителска инбредна линия (като мъжка) с нерекурентна линия, притежаваща цитоплазмен белег за мъжка стерилност и след това обратно кръстосване до рекурентна линия, докато се получи една мъжка стерилна линия, която е хомоложна на рекурентната линия във всички останали аспекти. Тогава рекурентната линия се счита за поддържаща. CMS линиите също се отнасят като женски линии.

„Възстановяваща линия“: означава линия, която притежава ген или гени да възстанови мъжката фертилност или жизнеспособен цветен прашец до слънчогледов хибрид или инбредна линия и потомство, което има цитоплазма от майчина страна, която предизвиква мъжки стерилитет. Този термин, заедно с описание на мъжка цитоплазмена стерилност е дискутиран от Fick,Breeding and Genetics,in Sunflower Science and Technology, J. F.Carter ed., 1978, pp. 279-338.

Настоящето изобретение се отнася до слънчогледови линии, притежаващи високо наследствени белези на сулфинилурейна хербицидна устойчивост, получени чрез химически или физически индуцирани мутационни процеси и изкуствена селекция. Тези линии са полезни при разработването на сортове слънчогледови култури, които притежават устойчивост към сулфонилурея, като по този начин е възможно използуването на тези ефективни и благоприятни хербициди за осъществяване на селективен контрол върху нежелана растителност. Нежеланият растеж, който може да бъде контролиран чрез сулфонилурейни хербициди при устойчиви слънчогледови сортове, включва паразитни плевели като видовете Orobanche.

Мутационните процеси при слънчогледа могат за бъдат индуцирани чрез третиране с различни мутагенни агенти, извести от нивото на техниката, включително физически мутагени, като рентгенови лъчи, гама лъчи, бързи или термални неутрони, протони и химически мутагени като етил метанесулфонат (EMS), дие тил сулфат (DES), етиленимин (EI), пропан султон, N-метилN-нитрозоуретан (MNY), ЬЕнитрозо-ЬЕметилурея (NMU), Nетил-1Ч-нитрозоурея (ENU) и натриев азид.

Устойчивите към сулфонилурея мутант ни слънчогледи, след това се селектират чрез третиране с определено ефективно количество от един или повече сулфонилурейни хербициди. Много сулфонилурейни хербициди мога т да бъда т използувани за селекционни третирания, включително търговски използуваните такива като амидосулфурон, азимсулфурон, бензулфурон-метил, хлоримурон-етил, хлорсулфурон, циносулфурон, циклосулфамурон, етаметсулфурон-метил, етоксисулфурон, флупирсулфурон-метил, флазасулфурон, форамсулфурон, халосулфурон-метил, имазосулфурон, йодосулфурон-метил, мезосулфурон, метсулфуронметил, никосулфурон, оксасулфурон, примисулфурон-метил, просулфурон, пиразосулфурон-етил, римсулфурон, сулфометуронметил, трифенсулфурон-метил, триасулфурон, трибенуронметил, трифлоксисулфурон и трифлусулфурон-метил. Определено ефективно количество е количеството сулфонилуреен хербицид, което предотвратява растежа на слънчогледови растения с липсваща доминантна или полудоминантна мутация, отнасяща се до устойчивост към сулфонилурейни хербициди. Определеното ефективно количество зависи от сулфонилурейните хербициди, използувани като селекционен агент и може лесно да бъде установено чрез тестване при използуване на нарастващи концентрации сулфонилурейни хербициди. Изборът на определен хербицид, ще окаже влияние върху спектъра на сулфонилурейна хербицидна устойчивост на селектираните мутанти, въпреки че кръстосаната устойчивост е типична и някои селектирани мутанти могат да бъдат по-устойчиви към други сулфонилурейни хербициди, отколко то към тези, използувани като селекционен агент. За ефикасна селекция, са желателни сулфонилуреи със силна активност срещу обикновените слънчогледови сортове. Тифенсулфурон-ме тил и метсулфурон-метил са подходящи за селектиране на устойчиви към сулфонилурея мутанти. Установяването на доминантни, устойчиви към хербициди мутанти, обикновено изисква проверяването на десетки и сто тици хиляди мутирали семена. Въпреки че такова сортиране може да се извърши при използуванет о на различни съоръжения и способи, известни от нивото на техниката, Large-Scale Hydroponic Screening System, описан в патент US 5,084,082 е особено подходящ за възстановяване на слънчогледови мутанти, устойчиви към сулфонилурейни хербициди.

Много от следващите примери и изследвания се отнасят до слънчогледови инбредни линии ΉΑ89Α' и ΉΑ89Β', общо обхващащи ΉΑ89', алтернативно идентифицирани като Ή89'. (ΉΑ89Α' е алтернативно идентифициран като Ή89Α', и ΉΑ89Β' е алтернативно идентифициран като Ή89Β'.) ΉΑ89' беше създаден в U. S. Department of Agriculture's North Dakota AgriculturalExperiment Station at Fargo и беше предоставен през Октомври 1971 година. ΉΑ89Α' се състои от цитоплазмена мъжка стерилна инбредна линия на ΉΑ89'; ΉΑ89Β' е инбредна поддържаща линия на ΉΑ89Α'. ΉΑ89Α' (също отнесена като 'CMS Н89А, 'CMS НА89А' и 'CMS НА89') е цитоплазмена мъжка стерилна линия, основана на материал от Р. Leclercq, Une St rilit Male Cytoplasmique Chez le Tournesol, Ann. Am lior. Plantes 1969, 19 (2), 99-106. За репродуцирането на ΉΑ89Α' се изисква поддържаща линия ΉΑ89Β'.

Следващият Пример 1 илюстрира получаването на слънчогледови линии, устойчиви към сулфонилуреи чрез индуцирана мутагенеза и изкуствена селекция. В този пример, използуваната родителска слънчогледова линия е „НА89В“

Пример 1

Получаване на слънчогледови линии, устойчиви към сулфонилурейни хербициди.

Част А - определяне на оптималната мутагенна концентрация.

Бяха проведени няколко експеримент а за определяне концентрацията на етилметансулфонат (EMS), необходима за индуциране на значителен брой мутации при слънчогледовите растения, без значително редуциране на растителната фертилност. Всяка порция, състояща се от 6000 семена от „НА89В“ бяха инкубирани в 0.1 М калиево фосфатен буфер (pH 5.6), добавен към концентрации EMS в диапазона между 0 и 80 тМ за 18 часа при стайна температура, причиняващо набъбване на семената. Семената бяха промити с натриев тиосулфат за 1 минута за декомпозиране на EMS, след това в 5 последователни водни промивки за елиминиране на следите от EMS. Цялата промиваща процедура продължи 5 часа. Семената бяха изсушени за 2 часа при 25°С във въздушни сушилни и след това бяха разделени на порции, всяка по 200 семена. За определяне на ефекта на EMS върху развитието и растежа на растенията, порциите от 200 семена бяха засети веднага след изсушаването и следващите 2, 4 и 6 дни съхранени при 4°С след изсушаването. Развитието на растенията беше използувано като визуална мярка за мутационната честота. Порциите от всяка EMS концентрация бяха също зася ти веднага след изсушаването и отгледани до узряване за определяне ефекта на EMS.

На основата на тези изследвания, бяха установени концентрации EMS, в диапазона от 20 до 40 тМ, които осигуряват оптимални резултати е „НА89В“ семена. Растежната ефективност на семената, третирани с тези EMS концентрации, остана по-голяма от 75% спрямо нетретираните семена. Тези концентрации изглежда дават значителни мутационни честоти, тъй като повече от половината семена се бяха развили, в сравнение с около 12% от растенията от не третирани те семена.

Също така, от повече от половината растения се получиха жизнеспособни семена.

Част В - Мащабни слънчогледови мутационни процеси и селекция

Порции, съдържащи 45,000 семена от „НА89В“ слънчогледова линия бяха инкубирани в 0,1 М калиево фосфатен буфер (pH 5.6) добавен към 20, 25, 30 или 35 mM EMS за 18 часа при стайна температура при непрекъснато разбъркване, причиняващо набъбване на семената. Както е отбелязано по-нататък, първото поколение от мутирали семена се идентифицира като „М/. Семената бяха промити в натриев тиосулфат за 1 минута за декомпозиране на EMS, и след това в 5 последователни водни промивки за елиминиране на EMS следите. Цялата промиваща процедура продължи 5 часа. Семенат а бяха изсушени за 2 часа при 25°С във въздушни сушилни. Семената, включително тези с поникнали коренови краища, бяха зася ти приблизително 48 часа след след началото на мутагенезата в четири отделни полеви участъка, при използуването на пневматично засаждане, за да се избегне повреждането на набъбналите и поникнали семена. Полевите участъци бяха разположени на няколко километра от другите слънчогледови полета, за да се избегне кръстосаното опрашване е култивираните хибриди или инбредни линии. Приблизително 120,000 разсада поникнаха от 180,000 зася ти семена и около 100,000 растения достигнаха до зрялост. Слънчогледовите пити от всеки отделен полеви участък бяха събрани след узряване, и смесени напълно. Семената са идентифицирани по-нататък като „Мг“ е четирите партиди, определени като „М₂-1“, „М₂-2“, „М₂-3“ и „М₂-4“, съответствуващи на техните „МС родители, които бяха третирани съответно е 35, 30, 25 и 20 mM EMS. Добивът от М₂ семена, събран от всеки Μι подучастък, е обобщен в Таблица 1.

ТАБЛИЦА 1

Добиви на М₂ Семена

М2 партида	EMS конц. за третиране	Добив/Брой семена/
М2-1	35 шМ	182,600
М2-2	30 шМ	482,400
М2-3	25 тМ	184,000*
М2-4	20 тМ	4,017,100

* Добивът е редуциран, поради сериозните увреждания от п тици.

„М₂“семената бяха засети в индивидуални хидропонни легла, описани като Large-Scale Hydroponic Screening System в патент U.S. 5, 084, 082 и тре тирани със сулфонилурейни хербициди. За всяко третиране, бяха добавяни 10,000 семена за легло. Беше установено, че трифлусулфурон-метил е недостатъчно активен по отношение на слъвчогледа, за да може да бъде един ефективен селекционен агент. При повечето третирания се използуваше трифенсулфурон-метил 20, 40 или 50 pg/L или римсулфурон, съответно 40 или 80 pg/L. Пет растения, показващи устойчивост към сулфонилурейни хербициди, бяха установени по време на селекционните експерименти; те са идентифицирани в Таблица 2

ТАБЛИЦА 2

Име, произход, сел. хербицид и честота на потв, на устойчиви към сулфонилурея растения

Име	От партида семена	Селектирани с	Честота на селекция
М7	М2-2	Тис	>енсулс	>урон-метил	4.2 х10’6
Mil	М2-1	Тис	>енсулс	>урон-метил	5.5 х10'6
М12	М2-2	Тис	>енсулс	>урон-метил	4.2 х10'6
М14	М2-2	Тис	>енсулс	>урон-метил	2.1 до 4.2 х10'6
Е24	М2-1	Римсулфурон	5.5 хЮ’6

* Селекционна та честота е изчислена като съотношение на преживелите мутант ни растения спрямо общия брой семена, които са зася ти и третирани със сулфонилурейния селекционен хербицид. Предполага се, че М7 и М12 притежават еднакъв мутационен произход. Приема се, че МИ и Е24 са различни мутанти. Мутационното отнасяне на М14 е неизвестно, така че, то не беше характеризирано по-нататък „МИ“ и „Е24“ бяха подбрани от същата Mj порция мутирали семена, но с различни сулфонилурейни хирбициди. Беше установено по-късно, че „МИ“ не е устойчива към римсулфурон, „МИ“ и „Е24“ вероятно се дължаха на различни мутационни процеси. „Е24“ беше стерилна и впоследствие не даде резвитие. „М14“ също беше стерилна. От общо пет растения, само „М7“, „МИ“ и „М12“ бяха фертилни и можеха да се развият чрез размножаване. „М7“ и „М12“ могат да произлизат от същия мутационен процес.

Част С - Изследване на устойчивост та на ацетолактат син таза към инхибиране чрез сулфонилурейни хербициди.

Устойчивостта на ацетолактат синтазната (ALS) ензимна активност към инхибиране чрез сулфонилурейни хербициди, беше изследвана и за двете мутантни линии, подбрани чрез изкуствена селекция, при използуването на сулфонилурейни хербициди и тяхния сулфонилурея-чувствителен родител („Н89В“). Тъканни фрагменти от листа на слънчогледови растения бяха събрани, след израстването им върху градинска почва без хербициди. Листинте тъкани след това бяха поставени в течен азот и суспендирани в екстрахиращ буфер (100 mM калиев фосфат, 1 mM натриев пируват, 0.5 mM магнезиев хлорид, 0.5 тМ EDTA, 10% (v/v) глицерол, 0.1 mM FAD, 10 тМ цистеин, 1 тМ левцин, 1 тМ валин, pH 7.5). Супернатанта беше събран след центрофугиране (15 мин при 4°С) на тъканните късове и след това третиран с равен обем наситен воден разтвор на амониев сулфат за 1 час. Преципитиралите протеини бяха събрани след центрофугирането и ресуспендирани в буфер (50 тМ калиев фосфат, 100 тМ натриев пируват, 10 тМ магнезиев хлорид, pH 7. 25), и след това опреснени с ресуспендиран буфер чрез Sephadex® (Pharmacia) колона. Обезсолените екстракти бяха инкубирани за 1 час при 37° С с 100 или 1000 ppb тифенсулфурон-метил или римсулфурон. (Тези два хербицида бяха избрани, поради тяхното използуване като изкуствени селекционни агенти в хидропонните експерименти. Оставащата ALS активност след това беше изследвана.

Изпитванията започнаха чрез добавяне на ензимен разтвор (20 μΕ, включен в обема на крайната реакционна смес) и завършен чрез добавяне на воден разтвор на сярна киселина (2. 55% v/v; 50 pL). Подкиселените реакционни смеси след това бяха загря ти за 15 минути при 60°С. Беше добавен креатин (1. 445 % w/v; 30 pL), a след това ос-нафтол (6. 516 % w/v, 90 pL), прясно приготвен във воден натриев хидроксид (5 N) и съхранен на тъмно. Разтворите бяха отново загря ти за 15 минути при 60°С. Абсорбантите бяха измерени при 540 nm дължина на вълната 30 минути след приключване на изследването. Те бяха коригирани чрез изваждане на осреднената А⁵⁴⁰ на началното време на контролите (съдържащи 25% воден ацетонитрил на мястото на разтвора на съединението), към които беше добавена киселина преди ензима. Ензимната активност беше изчислена спрямо пълното оцветяване на контролите, съдържащи 25% воден ацетонитрил на мястото на тест разтвора на съединението.

Всяко измерване на ALS активност, беше повторено шест пъти и измерената активност беше осреднена. Резултатите, представени в Таблица 3, са изразени като проценти ALS ензимна активност, оставаща спрямо контрола без хербицид.

ТАБЛИЦА 3

ALS активност оставаща след третиране със сулфонилурея

Хербициди, използувани за ALS изсл.	Източник на растение	ALS активност с 100 ppb херб.	ALS активност с 1000 ppb херб.
Тиофенсулфурон -	Н89В	16%	4%
метил	М2М7	50%	26%
	М2М11	30%	16%
	М2М12	50%	17%
	М2М14	32%	17%
Римсулфурон	Н89В	8%	4%
	М2Е24	35%	25%

Тест резултатите показват, че ALS ензимите на мутантните линии, селектирани с тифенсулфурон-метил запазват от 2 до 6 пъти повече активност, отколко то некултивирания ALS вид от „Н89В“ в присъствието на тифенсулфурон-метил. ALS ензимите на мутантните линии, селектирани с римсулфурон запазват от 4 до 6 пъти повече активност, отколкото некултивирания ALS вид от „Н89В“ в присъствието на римсулфурон. По този начин, тестът потвърждава, че мутациите предават ALS ензимната устойчивост към инхибиране чрез сулфонилуреи, причиняващи мутантни линии, устойчиви към сулфонилурейни хербициди.

Полза

Устойчиви към сулфонилурея слънчогледови линии, получени чрез индуцирани мутационни процеси и изкуствена селекция, са полезни като източници на хербицидна устойчивост при програмите за размножаване на слънчогледа. Инбредните линии са получени чрез селектирани растения от няколко поколения да продуцират инбредни линии, които се размножават и са непроменливи. Устойчивите към сулфонилурея линии като „М7“, „МИ“ и „М12“, получени от приети поддържащи линии като „Н89В“ са особено полезни, защо то те улесняват бързо и ефективно трансфера на моногенна доминантна (високо наследствена) устойчивост чрез конвенционалните средства, без да се жертват агрономични белези и без необходимост от екстензивно повторно кръстосване.

Например, устойчивите към сулфонилурея поддържащи линии, могат да бъдат кръстосани с мъжки стерилни линии, найобикновено получени при слънчогледово размножаване през цитоплазмен мъжки стерилитет, за продуциране на мъжко стерилно потомство, притежаващо белег на устойчивост към сулфонилурея. Белегът за цитоплазмен мъжки стерилитет (CMS) е получен чрез кръстосване на култивиран Helianthus annuus L. (като мъжки) с Н. petiolaris Nutt. (Р. Leclercq,Une Sterilite Male Cytoplasmique Chez le Tournesol,Ann. Amelior. Plantes 1969, 19 (2), 99-106) или H. maximiliani Schrad. или H. giganteus L. (E. D. P. Whelan and W. Dedio,Registration of Sunflower GermplasmComposite Crosses CMG-1, CMG-2, and CMG-3, Crop Science 1980, 20, 832) и след това повторно кръстосан с култивиран Н. annuus (като мъжки). CMS е рузул та тъ т о т факт ори, които произ тича т о т цитоплазмения, ка то про тивоположен на нуклеарния геном. Различни методи за осигуряване на генетичен мъжки стерилитет са известни от нивото на техниката, например, Американски патенти 3,710,511,3,861,709,4,654,465,4,727,219 5,432,068, и Европейска патентна публикация 329,308-А и РСТ публикация WO 90/08828.

Високонаследствена устойчивост към сулфонилурейни хербициди може да бъде използувана за получаването на експериментални или търговски количества от Fj хибридни семена. В такава една заявка, устойчива към хербициди линия (която е предадена мъжка стерилна линия през генетични, химични или мануални средства) е засята (или между редовете, или в отделни редове) в същото поле е мъжка възстановяваща, но чувствителна към хербициди линия. След опрашването, мъжкият родител се отделя от полето чрез третиране със сулфонилуреен хербицид, което е селективно летално към възстановяващия родител. Цялото поле (съдържащо Fx семена, получени от женската линия, устойчива към сулфонилурея) може да бъде прибрано без контаминиране на семената от възстановяващата линия.

Хибридизацията позволява комбиниране или съчетаване на високонаследствен белег за устойчивост към сулфонилурея с други желани белези, например, по-бързо узряване, устойчивост към суша и студ, повишаване добива на семена, повишаване масленото съдържание на семената, модификация на състава на конституентите на мастните киселини в маслото, повишаване съдържанието на протеините в семената, модификация на аминокиселинното съдържание на протеините в семената, недоразвитост, устойчивост към полягане, устойчивост към инсекти и заболявания, причинени от бактерии, гъби и вируси и устойчивост към паразитни растения, като Orobanche. Желаните белези за устойчивост към заболявания, които могат да се комбинират с белег за устойчивост към сулфонилурея, включват устойчивост към ръжда (причинена от Puccinia helianthi), пероноспора (причинена от Plasmopara halstedii), въглищно плесенясване (причинено от Macrophominia phasiolina), Phoma black stem (причинено ο τ Phoma macdonaldii), клюмване на ствола или цвета (причинено от Sclerotinia sclerotiorum) и загниване на стеблото (причинено от Phomopsis helianthi). U. S. Патенти 5,276,264 и 5,461,171 описват слънчогледови растения, притежаващи белези за понижени нива на наситените мастни киселини в маслото на семената. U. S. Патенти 4,627,192, 4,743,402, 5,866,765 и 5,866,766 описват слънчогледови линии и хибриди, притежаващи белези за високо съдържание на олеинова киселина в маслото на семената. U. S. Патент 5,959,175 описва метод за модификация на масления състав на слънчогледа чрез генетична регулация. U. S. Патенти 4,378,655 и 4,527,352 описват полудребни и напълно дребни слънчогледови хибриди. Orobanche устойчивите белези са известни и унаследяването на гените, осигуряващи устойчивост към Orobanche са изследвани (виж, например, J. F. Miller & G. N. Fick,The Genetics of Sunflowerin Sunflower Technology and Production,A. A. Schneiter ed., No. 35 in Agronomy Series, American Society of Agronomy, Madison, WI, USA, 1997, по-специално стр. 476-477, и цитираните отпратки).

Отглеждането на слънчоглед се превърна във важен отрасъл (виж, например, Sunflower Science and Technology, J. F. Carter ed., No. 19 in Agronomy Series, American Society of Agronomy, Madison, WI, USA, 1978, по-специално Chapter 9 (pp. 279-338), G. N. Fick, Breeding and Genetics, Chapter 10 (pp. 339-369), E. D. P. Whelan,Cytology and Interspecific Hybridization, and Chapter 11 (pp. 371-386), D. L. Smith,Planting Seed Production, and Sunflower Technology and Production, A. A. Schneiter ed., No. 35 in Agronomy Series, American Society of Agronomy, Madison, WI, USA, 1997, поспециално Chapter 8 (pp. 395-439), G. N. Fick & J. F. Miller,Sunflower Breeding, Chapter 9 (pp. 441-495), J. F. Miller & G. N. Fick,The Genetics of Sunflower, Chapter 10 (pp. 497558), C. C. Jan,Cytology and Interspecific Hybridization, and Chapter 11 (pp. 559-593), D. L. Bidney & C. J. Scelonge, Sunflower Biotechnology). Слънчогледът може да бъде размножаван чрез самоопрашване и чрез кръстосано опрашване. Разработването на един хибриден слънчогледов сорт включва три стъпки: (1) Селекция на растенията от различни гермплазмени пулове за начално кръстосано размножаване; (2) селфинг на селектираните растения от кръстосаното размножаване за няколко поколения за получаване на една серия инбредни линии, които, въпреки че са различни една от друга, се размножават и са непроменливи; (3) кръстосване на селектираните инбредни линии с други, несвързани инбредни линии, за получаване на хибридно потомство (FJ. По време на размножителния процес, жизнеспособност та на линиите намалява. Тя се възстановява, когато две различни инбредни линии се кръстосат, за да се получи хибридното поколение (FJ. Една важна последица от хомозиготност та и хомогенност та на инбредните линии е, че хибридът, създаден чрез кръстосване на една определена двойка родители, между които съществува родство, винаги ще бъде един и същ. Щом като двойката родители, която създава по-добър хибрид е идентифицирана, може да се продуцира една постоянна доставка на хибридни семена и съответно хибридни слънчогледови растения. Широкомащабната търговска продукция на слънчогледови хибриди, така както се пректикува понастоящем, изисква използуването на някои от мъжките стерилни системи, както са описани по-горе.

Освен чрез половото размножаване, слънчогледовите растения могат да се размножават и чрез тъкани и клетъчни култури, които наследствено съхраняват генетичните характеристики на първоначалните растения. Обаче геномът може също да бъде променен, докато е в клетъчната култура чрез използуване на мутационни процеси или добре известни генни трансфериращи техники (например, Agarobacterium tumafaciens инфекция, бомбандиране с частици). По същество, всяка растителна тъкан с клетки, способни да се делят, може да бъде използувана за размножаване на растения чрез техниките на тъканни и клетъчни култури. Културите могат да бъдат създадени от зародиши, цветен прашец, семепъпки, прашникови торбички, венчелистчета и други части на цвета или семето, листа, стебла и корени, включително коренови връхчета. Тъкани, които са взети от васкуларната зона на стеблата и корените, са особено подходящи. U. S. Патенти 4,670,391, 4,670,392, 4,673,648, 4,681,849, 4,687,743 и 5,030,572 описват методи за възстановяване на слънчогледови растения от клетъчни култури, получени от слънчогледови тъкани. По този начин, от литературата и от предшествуващото състояние на техниката тези методи за получаване на слънчогледови растения от клетъчни култури и тъканни култури са добре известни. Друг аспект на това изобретение, е да осигури клетки, при нарастването и диференциацията на които да се получат слънчогледови растения, притежаващи белег на устойчивост към сулфонилурея.

Сортовете слънчоглед, устойчиви към сулфонилурея, разширяват ползата от сулфонилурейни хербициди и предоставят на фермерите повече възможности за контрол върху плевелите. С по малки ограничения за сигурността на куртурата може да се даде по голям акцент за получаване на добър контрол върху проблемните плевели. Такива плевели, включват паразитни плевели като Broomrapes (Orobanche spp.) и кукувича прежда (Cuscuta spp.). Broomrapes, засягащи слънчогледовите растения включват Orobanche aegyptiaca Pers., О. ramosa L., O. minor Sm., O. cumana Wallr. and O. cernua Loefl. Кукувича плежда, засягаща слънчогледа включва Cuscuta glomerata Choisy, C. indecora Choisy и C. pentagona Engelm. Контролът върху видовете Orobanche чрез сулфонилурея при устойчиви към сулфонилурея слънчогледови сортове, е особено ценен, тъй като е трудно контролирането на Orobanche с използуването на хербициди, които са доста тъчно сигурни по отношение на обикновените слънчогледови сортове. Също така, устойчивите към сулфонилурея слънчогледови сортове, осигуряват възможност за комбиниране на хербициди, които имат допълнителен спектър за контрол върху плевелите и различен начин на действие. Такива хербицидни смеси, дават възможност на фермерите да контролират допълнителни видове плевели, като намаляват риска от отглеждане на устойчиви към хербициди биотипове плевели, които биха могли да преобладават при пов торна та упо треба на хербициди със същия начин на действие.

Едно селективно летално сулфонилурейно третиране може също да бъде използувано за отделяне на чувствителните към хирбициди расения от устойчивите към сулфонилурея популации, които са били контаминирани при невнимателни ръчни операции със семената. Големите площи със посеви могат лесно да бъдат почистени от бурени чрез разпръскване на хербицид, който е летален за чувствителните растения върху цялото поле.

Голямо разнообразие о т сулфонилурейни хербициди може да бъде успешно използувано за контрол върху плевелите при устойчиви към сулфонилурея слънчогледи, което включва амидосулфурон, азимсулфурон, бенсулфурон-метил, хлоримуроне тил, хлорсулфурон, циносулфурон, циклосулфамурон, етаметсулфурон-метил, етоксисулфурон, флупирсулфурон, флазасулфурон, форамсулфрон, халосулфурон-метил, имазосулфурон, йодосулфурон-метил, мезосулфурон, метсулфуронметил, никосулфурон, оксасулфурон, примисулфурон-метил, просулфурон, пиразосулфурон-етил, римсулфурон, сулфометуронметил, тифенсулфурон-метил, триасулфурон, трибенурон-метил, т рифлоксисулфурон и трифлузулфурон-метил. Въпреки че една отделна линия слънчоглед, устойчива към сулфонилурея, обикновено ще покаже значителна устойчивост спрямо различни сулфонилуреи, високите нива на устойчивост са най-гарантирани към съответната сулфонилурея, която е използувана като селекционен агент по време на изкуствената селекция, последваща индуцираната мутагенеза. Обаче, индуцираната мутагенеза и изкуствена селекция, могат също да дадат високи нива на устойчивост към сулфонилуреи, различни от тези, използувани като селекционен агент.

Обикновено, сулфонилурейните хербициди се прилагат на устойчивите към сулфонилурея слънчогледи в подобни количества, както при останалите култури. Сулфонилурейните хербициди могат да се прилагат на слънчогледовите култури преди поникване и след поникване. За контрол върху много плевели, включително паразити като Orobanche, апликацията след поникване, осигурява обикновено най-добра ефективност при определено количество. Обаче, апликациите преди поникване и покриване на семената, може да бъде полезно в комбинация с третирания след поникване при контрол на Orobanche. Също така, разделянето на апликациите на повече от едно третиране (т.е. разделни апликации) може да подобри контрола върху Orobanche, като намали риска от фито токсичност за слънчогледа. Специалист в област та може лесно да определи апликационните количества, а също така и времето, необходимо за желаните нива на контрол върху плевелите и безопасност та на културите.

Заедно със специфично разкритите устойчиви към сулфонилурея слънчогледови линии „М7“, „М11“ и „М12“ и т яхни те хибриди, трибенурон-метил, метсулфурон-метил и етаметсулфурон-метил, са особено подходящи за селективен контрол на плевели, включително Orobanche. За ефективен контрол на плевели с адекватна устойчивост на културите, трибенурон-метил се прилага обикновено в диапазона от 5 до 50 g/ha, за предпочитане от 8 до 40 g/ha и още повече за предпочитане от 15 до 30 g/ha за повече то използувания. За ефективен контрол на плевели с адекватна устойчивост на културите, метилсулфурон-метил се прилага обикновено в диапазона от 1 до 12 g/ha, за предпочитане от 2 до 10 g/ha и още повече за предпочитане от 4 до 8 g/ha за повече то използувания. За ефективен контрол на плевели с адекватна устойчивост на културите, етаметсулфурон-метил се прилага обикновено в диапазона от 5 до 50 g/ha, за предпочитане от 10 до 40 g/ha и още повече за предпочитане от 15 до 30 g/ha за повече то използувания.

Следващите тестове показват хербицидната устойчивост към сулфонилурея на слънчогледови сортове, получена при конвенционално размножаване на уст ойчиви към сулфонилурея линии „М7“, „МИ“ и „М12“ и контрола върху плевели при тези сортове, използувайки сулфонилурейни хербициди.

Тест А - Демонстрация на сулфонилурейни та хербицидна устойчивост

В малки опитни полета, слънчогледови сортове, описани в Таблица 4, бяха напръскани след поникването с различни сулфонилурейни хербициди.

ТАБЛИЦА 4

Описание на сортове слънчоглед, включително мутантни наследствени линии и хибриди

#	ИМЕ	ОПИСАНИЕ
А	Хибрид контрол :Н89 А х RHA274	USDA CMS H89A(“USDA” означава United State Department of Agriculture”; “CMS” означава цитоплазмена мъжка стерилна, кръстосана с възстановена линия USDA RHA274
В	Наследствена линия контрол: Н89А	USDA CMS Н89А /цитоплазмена мъжка стерилна наследствена линия/
С	GA-M4M12 X RHA274	Хибриден мутант с М4 поколение от мутантна линия М12 по майчина линия
D	GA-M4MII X RHA274	Хибриден мутант с М4 поколение от мутантна линия Mil по майчина линия
Е	GA-M4M7 X RHA274	Хибриден мутант с М4 поколение от мутантна линия М7 по майчина линия
F	Х89А х М4М12	USDA CMS Н89А кръстосан с М4 поколение от мутантна линия М12 по бащина линия
G	Х89А х М4М11	USDA CMS Н89А кръстосан с М4 поколение от мутантна линия Mil по бащина линия
Н	Н89А х М4М7	USDA CMS Н89А кръстосан с М4 поколение от мутантна линия М7 по бащина линия
I	BC3-M4MI2	Трето поколение обратно кръстосване на мутантна наследствена линия М12
J	ВС3-М4М11	Трето поколение обратно кръстосване на мутантна наследствена линия Mil
К	ВСз-М4М7	Трето поколение обратно кръстосване на мутантна наследствена линия М7

За получаването на хибриди С, D и Е, четвърто то поколение самоопрашващи се поддържащи мутантни линии М₄М12, М₄М11 и М₄М7 бяха химически стерилизирани чрез прилагане върху пъпката на цвета на малко количество разтвор на гиберелинова киселина за стерилизиране на цветния прашец, съгласно общия метод, описан в Sunflower Science Technology, J. F. Carter ed (Number 19 in the seriesAgronomy) pp. 339-386. Това тре тиране позволява поддържащите растения да се отнасят като CMS инбредни линии и позволява получаването на хетерозиготни устойчиви хибриди, заедно с хербициден устойчив източник, който произлиза от майчина страна. Това кръстосване позволи оценката на половия ефект на мутантния източник, когато е въведен по майчина линия при кръстосване, както е описано в кръстоски С, D и Е, обратно на бащина страна при кръстосване, както е описано в кръстоски F, G и Н. Обозначенията I, J и К идентифицират трето поколение CMS мутантни линии, кръстосани с четвърто поколение поддържащи линии за поддържане на високонаследствен мутантен белег в мъжка стерилна хомозиготна устойчива среда. Специалист в област та на размножаване на слънчоглед, разбира значението на такова кръстосване.

Бяха извършени апликации на приготвените сулфонилурейни хербициди след поникването, на етап 6-лист но развитие на растенията, използувайки четири случайно разпределени репликации. Приложените количества бяха избрани да съответствуват на обичайно използуваните количества на тези хербициди при културите, които са регистрирани в Европа. Всички хербициди, с изключение на метсулфурон-метил, бяха разпръснати в комбинация с Citowet нейонен етоксидиран алкохол при 0.25% обем от приготвения продукт за обема вода, приложен върху един хектар.

Изчисляването на максималното увреждане (т.е. пик) на слънчголедовите сортове от сулфонилурейните хербициди, беше извършено чрез визуална оценка и е представено на Таблица 5. Оценка 0% фито токсичност, означава, че няма увреждане на културите. Оценка от 15 до 20% увреждане, показва, че растенията не са значително и неблагоприятно засегнати и могат бързо и напълно да се възстановят. Това е и границата на уврежданията, която се счита, че е приемлива от фермерите. Оценка от 100% означава пълна деструкция на всички растения.

ТАБЛИЦА 5

Максимална фитотоксичност след третиране със сулфонилурея

	Сортове слънчоглед
Акт. инградиенти	Колич. /g a.i/ha/*	А	в	с	D	Е	F	G	Н	I	J	К
Примисулфуронметил	30	100	100	71	75	74	66	73	69	35	55	51
Никосулфурон	30	33	54	12	13	13	15	20	16	8	23	14
Римсулфурон	15	100	100	99	99	98	98	98	96	90	95	95
Римсулфурон	30	100	100	100	100	100	100	100	100	97	98	97
Трифлусул фуронметил	20	100	100	19	19	20	16	15	10	4	6	8
Трифлусул фуронметил	40	100	100	38	40	38	33	36	33	13	14	10
Тифенсулф урон-метил	35	100	100	75	81	83	78	81	80	34	52	36
Тифенсулф урон-метил	70	99	100	88	92	93	89	90	90	53	79	79
Метсулфур он-метил	6	100	100	8	7	0	4	6	4	7	11	8
Трибенуро н-метил	22.5	100	100	0	6	2	0	3	0	4	0	4
Триасулфу рои	20	100	100	94	99	97	98	98	98	93	95	95

*Апликационните количества при тези третирания се отнасят до количеството активен инградиент във формулираните хербициди в единици g a.i./ha.

Контролният чувствителен хибрид и инбредно растение (А и В) бяха унищожени от всички тествани сулфонилурейни хербициди, освен от никосулфурон. Хомозиготните резистентни инбредни линии ВС₃-М₄М12 (I), ВС₃-М₄М11 (J) и ВС₃-М₄М7 (К), бяха резистентни към метсулфурон-метил, трибенурон-метил и в по-малка степен към трифлусулфурон-метил при 20 g a.i./ha, недостатъчно устойчиви към никосулфурон и по-малко чувствителни, отколко то нормите за тиофенсулфурон-метил и примисулфурон-метил. Всичките три линии бяха толкова чувствителни, колкото нормите за римсулфурон и триасулфурон за прилагане на тестваните количества.

Хетерозиготните резистентни хибриди (С до Н) бяха толкова устойчиви, колкото трите хомозиготни резистентни линии към метсулфурон-метил и трибенурон-метил, но хомозиготните резистентни линии бяха по-устойчиви към примисулфурон-метил, никосулфурон и тифенсулфурон-метил. Тези резултати са показателни за високонаследствените (т.е. доминантни или полудоминантни) мутации.

Тест В Оценка на резистентността към ALS-инхибиращи хербициди.

Бяха проведени експеримен ти в оранжерии за оценка на диапазона на устойчивост на три хомозиготни резистнтни мутанта към различни хербициди, инхибиращи асетолактат син таза (ALS), като механизъм на действие. Тестваните инбредни линии бяха пето поколение самоопрашени поддържащи линии М₅М7, М₅М11 и М₅М12, а също така и четвърто поколение мъжки стерилни обратнокръстосани ВС₄-М₅М7, ВС₄-М₅М11 и ВС₄-М₅М12. Приготвените хербициди бяха приложени след поникването на 4-лис тен етап. Апликационните количества на тестваните хербициди бяха избрани да съвпадат с обикновено използуваните количества при културите, за които те са регистрирани. Апликационните количества на имазетапир бяха подбрани да съответствуват на количествата, препоръчани за контрол срещу паразитни плевели при слънчогледа от L. GarciaTorres et al., Weed Technology 1995, 9, 819-824. Дивият вид H89 инбреден слънчоглед не беше включен в този тест, защо то е известно, че много от тестваните хербициди са ефикасни при контролирането на саморасли слънчогледи като плевели. Третиранията бяха повторени два пъти. Измерването на максималното увреждане на слънчогледовите сортове от сулфонилурейни хербициди беше извършено чрез визуална оценка; средните стойности са представени в Таблица 6. Оценка 0% фи то токсичност, означава, че няма увреждане на културите. Оценка от 15 до 20% увреждане, показва, че растенията не са значително и неблагоприятно засегнати и могат бързо и напълно да се възстановят. Оценка от 100% означава пълна деструкция на всички растения.

ТАБЛИЦА 6

Максимална фитотоксичност след третиране с хирбициди

	Сортове слънчоглед /описани в Таблица 2/
Активи Инградиенти	Колич. /g a.i/ha/*	М5М7	М5М11	М5М12	вс4- М5М7	вс4М5М11	ВС4М5М12
Халосулф уронметил	45	50	60	60	60	65	65
Флупирсу лфуронметилнатрий	10	62.5	50	57.5	42.5	60	50
Амидосул фурон	30	52.5	60	45	47.5	57.5	55
Трибенуро н-метил	22.5	12.5	0	7.5	10	17.5	20
Римсулфу рои	15	52.5	65	55	45	47.5	65
Сулфосул фурон	22.5	50	60	65	47.5	57.5	50
Етаметсул фуронметил	15	10	0	0	5	10	0
Хлорсулфурон	20	47.5	50	45	45	50	45
Имазетапир /амониева сол/	25	22.5	30	22.5	20	25	30
Пиритиобакнатрий	70	37.5	50	40	35	42.5	40

*Апликационните количества при тези третирания се отнасят до количеството активен инградиент във формулираните хербициди в единици g a.i./ha.

Резултатите потвърждават добрата устойчивост на хомозиготното потомство на трите мутант ни източника към трибенурон-метил. Също бе установено, че всички мутанти са извънредно резистентни към етаметсулфурон-метил. Беше наблюдавана една недостатъчна устойчивост към използувани малки количества имазетапир. Обаче, подобна недостатъчна устойчивост към имазетапир, също е представена от несулфонилуря-резистентна слънчогледова гермплазма. Наблюдаваната недостатъчна устойчивост не може да се приеме, че се дължи на сулфонилурея-ризистентни мутации. Установено бе, че мутантите са чувствителни към римсулфурон, халосулфурон-метил, флупирсулфурон-метил (натриева сол), амидосулфурон, сулфосулфурон, хлорсулфурон и пиритиобакна трий.

Тест С - Оценка на сулфонилурейната фи то токсичност към резистентен хибриден слънчоглед

Беше проведен тест за фито токсичност на открит полеви участък при използуването на хибриди ВС₄-М₅М7 (женски родител) х РНА155 възстановяваща линия (мъжки родител) и ВС₄-М₅М12 (женски родител) х РНА155 възстановяваща линия (мъжки родител), където устойчивост та на всеки един хибрид ζ* вероятно се основава на отделни мутагенни процеси. РНА155 е възстановяваща линия, развита от Pioneer Hi-Bred International, която може да бъде използувана като мъжки родител при кръстосване с цитоплазмени мъжки стерилни (CMS) слънчогледови линии.

Тест хирбицидите бяха приложени като приготвени състави след поникването при етап 6-листен слънчоглед в три случайно разпределени репликации. За апликации след поникването, тест хербицидите бяха поставени във воден резервоар като разтвор, съдържащ 0.1% v/v Witco Trend 90® етоксилиран мастно алкохолен сърфактант. Бяха изследвани също така и две сулфонилурейни третирания (трибенурон-метил и метсулфуронметил) е покритие на семена е приготвените хирбициди и трикратна репликация. Изчисляването на увреждане на слънчегледовите сортове от сулфонилурейните хербициди, беше извършено чрез визуална оценка и е представено на Таблица 7. Оценка 0% фи то токсичност, означава, че няма увреждане на културите. Оценка от 15 до 20% увреждане, показва, че растенията не са значително и неблагоприятно засегнати и могат бързо и напълно да се възстановят. Оценка от 100% означава пълна деструкция на всички растения.

ТАБЛИЦА 7 Фитотоксичност към ВС4М5М7 х РНА155 и BC4M5MI2 х РНА155 хибриди след третиране с хербициди

	Оценяване след третирането
ВС4М5М7 х РНА155	BC4M5MI2 х РНА155
Акт.ингр.	Кол.*	7DAT|	15 DAT	30 DAT	7 DAT	15 DAT	30 DAT
След поникване
Трибенуронметил	11.25 22.5	25 37	20 38	8 22	17 22	18 18	8 13
Метсулфуронметил	3 6	28 55	28 58	15 43	23 43	23 50	22 33
Трифлусулфурон- метил	7.5 15	38 57	40 53	28 40	22 38	22 45	25 43
Хлоримурон-етил	6.25 12.5	83 85	73 83	67 83	70 80	80 90	68 88
Никосулфурон	18.75 37.5	37 57	40 55	18 50	28 42	20 52	18 50
Римсулфурон	15	87	92	93	87	90	90
Третиране на семена
Трибенуронметил	22.5	57	38	32	10	23	11
Метсулфуронметил	6	88	73	57	83	75	57

*Апликационните количества при тези третирания се отнасят до количеството активен инградиент във формулираните хербициди в единици g a.i./ha.

Хибридите, използвани в този тест бяха хетерозиготни в гена за резистентност. Както е видно от резултатите от Тест А, сортовете хомозиготи в гена за резистентност, може да се очаква че притежават по-голяма резистентност, отколкото ВС₄-М₅М7 х РНА155 и ВС₄-М₅М12 х РНА155 хибриди към хербицидите, използувани при Тест С. Данните в Таблица 7 показват, че фитотоксичността към тези два хербицида беше най-голяма скоро след хербицидната апликация и впоследствие намаля. За трибенурон-метил при 11.25 g a.i./ha бяха наблюдавани малки увреждания 30 дни след третирането. Беше установено, че трибенурон-метил е най-селективният сулфонилуреен препарат за прилагане на тези хибриди, последван от метсулфурон-метил, никосулфурон, трифлусулфурон-метил, хлоримурон-етил и римсулфурон. Третирането на тези хибриди след поникването е по-малко фитотоксично, отколкото покритието на семената.

Тест D - Използуване на сулфонилуреите за контрол на Orobanche сшпапа при резистентни слънчогледи.

Различни инбреди или хибриди, получени от М7 и М12 резистентни мутанти бяха използувани за демонстриране на контрол върху паразитните видове Orobanche cumana. Целта на този тест беше да изчисли ефикасността на трибенурон-метил за контрол на Orobanche cumana преди и след поникване на културите от почвата. Бяха оценени различни хербицидни третирания, при използуването на шест репликации за всяко третиране. Третиранията изследваха следните начини на прилагане: покритие на семена, смесване с почвата преди поникването, разпръскване преди поникване и разпръскване след поникваването. Всички хербицидни третирания използуваха формулирани хербицидни състави.

Покритие на семената

За третирания с покритие на семената 3 мг Orobanche cumana семена бяха прибавени към всеки съд, съдържащ растежна смес от 60% суха глинеста почва, 20% пясък и 20% торф. Съдържанието на органично вещество в тази растежна смес е 4.2%, a pH 8.05. Съдовете бяха поставени в синтетични корита и поливани до степен 25% от теглото на почвата. Съдовете бяха държани в оранжерия от 8 до 10 дни при около 24°С през деня и 20° С през нощта. Осем семена от ВС₄-М₅М12 слънчогледов резистентен мутант бяха зася ти ръчно в съдовете, контаминирани с Orobanche в края на инкубационния период на паразитните семена на плевела.

Преди засяването, слънчогледовите семена бяха покрити с приготвения състав, съдържащ 25% трибенурон-метил. Семената бяха покрити при използуването на лабораторно флуидно легло, снабдено с покриващо средство (Strea 1 Aerocoater произведено от Niro Aeromatic, Haupstrasse 145, CH-4416 Bubendorf, Switzerland) и покриващ разтвор, съдържащ около 23% Sepiret 8330 ® (покриващ състав продаван от Seppic, 75 quai d'Orsay Paris 75321 cedex 07 France) и 77% вода при количество от 3 L/100 Kg семена. След покритието, семената бяха изсушени във флуидно изсушаващо легло при 35 С. След това семената бяха запечатани в пластмасови торба, съдържаща воден разтвор възлизащ на 5% от теглото на семената, съдържащи трибенурон-метилов състав. Количеството трибенурон-метил беше от 0.00001, 0.1 или 10 mg a. i./g от семето. Торбата беше разтръскана за три минути за равномерно разпределение на разтвора на трибенуронме тил върху повърхността на семената. Покритите семена после бяха изсушени при стайна температура и съхранени до засяването. Беше избрана максимална концентрация, за да се използува количество, подобно на максималното количество трибенурон-метил, прилагано В Европа за контрол на плевелите при зърнените култури.

Смесване с почвата преди поникване

За третирания с използуване на смесване с почвата преди поникването, водна смес на трибенурон-метил беше впръскана в почва, съдържаща семена на Orobanche cumana. След това пръст та беше размесена ръчно и разпределена в съдовете. Количествата трибенурон-метил, използувани при тези третирания са изразени в g i.a./ha въз основа на обема почва и размерите на съдовете. Приложените количества бяха 11.25 и 22.5 g i.a./ha.

Приложение чрез разпръскване преди поникване

За приложения чрез разпръскване преди поникване,два дни след засаждането на слънчогледовите семена, съдовете бяха напръскани с водна смес на трибенурон-метил в количества от 2.25 и 11.25 g i.a./ha.

Приложение чрез разпръскване след поникване.

За приложения чрез разпръскване след поникване, съдовете със слънчоглед на етап 6 или 8 листа, бяха напръскани с водна смес на трибенурон-метил в количества от 11.25 и 22.5 g i.a./ha.

Оценка

Ефектът от различните третирания беше определен 35 дни след засаждането. Слънчогледовите корени бяха почистени чрез измиване с вода и наличието на нодули Orobanche беше определено визуално и чрез измерване на кореновата влажна маса и сравнени с контролни растения, без Orobanche инфестация. В сравнението на нодулите, наблюдавани при контролните растения, контролираните Orobanche нодули, не показаха нарастване и кафеникав цвят, както и липса на бяло нарастване на апекса на стеблото. Нодулите, причинени от Orobanche, увеличиха теглото на корените и беше установена корелация (г=0.7) между визуалните резултати и измерванията на теглото. По този начин, измерванията могат да бъдат използувани за потвърждение на визуалните отчитания. Поникването на Orobanche също беше установено, но то е по-малко ефективно за определяне на ефекта от третиранията и за отчитане на този тест. Резултатите от третиранията са представени на Таблица 8.

ТАБЛИЦА 8

Описание на третирания на Orobanche при използуване на Трибенурон-метил и резултати

Покритие на семената /mg a.i./g	Включване в почвата преди поникване /g a.i./ha/	Разпръскване преди поникване /g a.i./ha?	Разпръскване след поникване /g a.i./ha?	Контр. /%/
0.00001	0.1	10	11.25	22.5	11.25	22.5	2.25	11.25
									0
X									8
	X								37
		X							82
X							X		63
X								X	70
	X						X		85
	X							X	80
		X					X		82
		X						X	89
			X						55
				X					72
						X			40
					X			X	78
							X		63
								X	88

Покритията на семената и прилаганията след поникване, като отделни апликации, предоставят най-добър контрол върху Orobanche. Покритие на семената, с използуване на 10 mg a.i/g семена или прилагане след поникване на 11.25 g a.i./ha, осигурява над 80% контрол върху Orobanche, отчетено по ефекта върфу корените. Най-доброто пълно третиране, осигуряващо 89% контрол, беше при покритие 10 mg a.i/g семена, последвано от апликация след поникване при 11.25 g a.i./ha.

Тест Е - Използуване на сулфонилуреи за контрол на Orobanche cumana при резистентни слънчогледи.

На основата на резултатите от Тест D, беше разработен един модифициран протокол за определяне на три подходящи момента за третиране след поникване. В този тест беше използуван хибрид ВС₄-М₅М12 (женски родител) х РНА155 възстановяваща линия (мъжки родител), описан в Тест С. Бяха изследвани различните хербицидни програми при използуване на три репликации. Бяха приложени формулиран състав на трибенурон-метил при 11.5 и 22.5 g a.i./ha, и формулиран хербициден състав на метсулфурон-метил при 3 и 6 g a.i./ha. Беше приложено покритие на семена с тези формулирани хербициди на 6 кг в количество, което се счита, че се разпространява върху семената на всеки съд и бяха отбелязани апликационните количества на хербицидния активен инградиент за хектар.

Третиранията бяха осъществени подобно на методите, описани в Тест D. Апликациите преди поникване бяха само разпръснати, без смесване с почвата. За апликации преди поникване, съдовете бяха напръскани при използуване на големи количества хербициди, два дни след засаждането на семената. Третирания след поникване бяха извършени при етап 4-6 листни слънчогледи (съответствуващ на ранен етап на Orobanche прикрепване; идентифициран като „Т1“), 6-8 листен етап на слънчогледа (съответствуващ на среден етап на Orobanche прикрепване; нодули < 5мм диаметър; идентифициран като „Т2“) и 8-12 листен етап на слънчогледа (съответствуващ на късен етап на Orobanche прикрепване; идентифициран като „ТЗ“). Апликациите на средния етап включваха както големи, така и малки количества от всеки хирбицид.

За сравнение, в този тест също бяха включени други ацетолактат синтаза-инхибиращи хербициди, които са описани в литературата, че дават добър контрол върху Orobanche (L. Garcia- Torres et al., Weed Research 1994, 34, 395-402 ; L. GarciaTorres et al., Weed Technology 1995, 9, 819-824 ; J. Hershenhorn et al., Weed Technology 1998, 12, 108-114).

Резултатите бяха изчислени, както е описано в Тест D и са представени в Таблица 9.

ТАБЛИЦА 9

Третиране на Orobanche и резултати

Хербицид	Покр итие на семен ата/g a.i./g	Преди поникв ане /g a.i./g	След поникване	Контрола /%/	Уврезвд /%/
/g a.i./g	Време
Трибенуронметил		22.5			70	70
Метсулфуронметил		6			-	100
Трибенуронметил	11.25		11.25	Т2	88	50
Метсулфуронметил	3		3	Т2	-	100
Трибенуронметил			22.5	Т2	75	0
Метсулфуроиметил			6	Т2	97	25
Трибенуронметил			11.25+ 11.25	Т1+ ТЗ	90	0
Метсулфуронметил			3+ 3	Т1+ ТЗ	96	0
Трибенуронметил		11.25	11.25	Т2	78	0
Метсулфуронметил		3	3	Т2	87	0
Трибенуронметил		22.5			0	0
Метсулфуронметил		6			30	0
Хлорсулфурон		2			13	0
Хлорсулфурон		10			58	0
Имазетапир, амониева сол		40			60	0
Имазапир, изопропил амино васол			15	ТЗ	72	0
Трисулфурон- метил			18.75	Т2	75	0

Третиранията, включващи само апликации преди поникване, имаха малък ефект върху Orobanche в рамките на тестваните количества, вероятно поради ограниченото поливане на почвата, което не даде възможност на хербицидите да достигнат до корените на слънчогледите. Третиранията, включващи покритие на семена показаха значителен ефект върху Orobanche, но бяха значително фито токсични за слънчогледа при апликационни количества в този тест.

Третиранията, включващи апликации след поникване, показаха най-добри резултати. Установено бе, че метсулфуронме тил е по-ефикасен за кон трол върху Orobanche, че е по вероятно причинява фито токсичност дори и при на по-малки прилагани количества, отколкото трибенурон-мтил. Една отделна апликация на метсулфурон-метил от 3 g a.i./ha при Т1 и при ТЗ, осигури същите отлични нива на контрол върху Orobanche, както 6 g a.i./ha при Т2, като се предотвратява слънчогледовата фи то т оксичнос т.

Хлорсулфурон, имазетапир, имазапир и трифлусулфуронС метил бяха по-малко ефективни за контрол върху Orobanche.

Имазапир и трифлусулфурон-метил причиниха временни фитотоксични симптоми, но слънчогледите се възстановиха напълно.

Тест F - Последователно приложение на сулфонилуреи за контрол върху Orobanche cumana

Бяха проведени експеримен ти в оранжерия за определяне на най-добрата последователна програма, в сравнение с директното прилагане на трибенурон-метил или метсулфурон-метил за контрол върху Orobanche cumana (род F). Бяха изследвани границите на дозата за оптимална ефективност. Двата хербицида бяха използвани като формулирани състави. Двата хибрида ВС₄-М₅М7 к (женски родител) х РНА155 възстановяваща линия (мъжки * родител) и ВС₄-М₅М12 (женски родител) х РНА155 възстановяваща линия (мъжки родител), описани в Тест С бяха използувани в този тест. ВС₄-М₅М7 х РНА155 се отнася понататък като „Хибрид 7“ и ВС₄-М₅М12 х РНА155 се отнася като „Хибрид 12“.

Третирането на обвивката на семената беше осъществено, както е описано в Тест D. Третиранията след поникване бяха приложени при 2-4 листен етап на слънчогледа (съответствуващ на ранен етап на Orobanche прикрепване; идентифициран като „Т1“), 6-листен етап на слънчогледа (съответствуващ на среден етап на Orobanche прикрепване; нодули < 5мм диаметър; идентифициран като „Т2“) и 8-листен етап на слънчогледа (съответствуващ на късен етап на Orobanche прикрепване; идентифициран като „ТЗ“).

За справка беше включен имазапир, който е имидазолинон, вместо сулфонилурея, но който също инхибира ацетолактат син таза та , тъй като е докладвано че той контролира Orobanche при слънчогледа (L. Garcia-Torres et al., Weed Technology 1995, 9, 819-824).

Ефикасност та беше преценена визуално и описана, както в Тест D с тази разлика, че ефективността беше оценена десет дни покъсно, отколкото при тест D и Е. По-късното измерване позволи наблюдаването на всяко намаление на ефективност та , дължащо се на късно Orobanche поникване или на пов торно израстване на третираните нодули. Ефикасността от контролирането на Orobanche прикрепвания към корените, беше доказана от нодулите, включващи черни некротични тъкани без поява на активна меристематична зона. Тези нодули лесно могат да бъдат смачкани между пръстите.

Третиранията и резултатите са обобщени в Таблица 10.

ТАБЛИЦА 10

Последователни Orobanche третирания и резултати при хибрид 7 и хибрид 12

ХЕРБИЦИД	Покрити семена (g a.i./ha)	След поникване (g a.i./ha)	% Контрол Хибрид 7	% Контрол Хибрид 12
ΤΙ	Т2	ТЗ
Трибенуронметил	11.25		11.25		77	78
11.25			11.25	82	83
		11.25		77	73
			11.25	78	80
	22.5			72	73
		22.5		82	83
			22.5	87	87
	11.25		11.25	85	85
Метсулфуронметил		3		3	92	90
	3			65	63
			3	93	95
Имазапир Изопропиламинова сол				15	97	97

Тестъ т не показа полза при обвивката на семената, последвано от третиране след поникване, в сравнение с отделно третиране след поникване. Късното третиране след поникване даде по-добър контрол, отколкото ранното третиране след поникване, вероятно поради това, че то подхожда по-добре на фазата на удължаване на Orobanche нодулна меристемна активност. При този тест в оранжерия, единично късно третиране след поникване с 3 g a.i./ha метсулфурон-метил показа отличен контрол, сравним с 15 g a.i./ha имазапир. 22.5 g.a.i./ha трибенурон-метил беше необходим за добър контрол върху Orobanche.

Тест G - Контрол върху сулфонилурея-резистентни слънчогледи като саморасли плевели.

Слънчогледовите култури често се редуват със зърнени култури, като пшеница, или понякога с други култури като захарно цвекло. Като част от спектъра за контрол върху плевелите, сулфонилурейните хербициди често се използуват за премахване на самораслите слънчогледови растения, появяващи се С при редуващите се култури. Целта на този тест беше да оцени хирбицидите, които могат да се използуват за контрол върху сулфонилурея-резистентни слънчогледи като саморасли плевели.

Тстът включваше сулфонилурея-резистентно слънчогледово потомство ВС₂-М ₃М11 и ВС₂-М ₃М12, получено съответно от МИ и М12. За сравнение също беше включен един сулфонилуреячувствителен хибрид, Н89А х RHA274. Растенията бяха напръскани с формулираните хербициди на 4-листен етап. Ефективността от третирането на слънчогледите беше отчетена визуално 4 седмици след приложението, при използване на скала, където 0 означава липса на контрол върху слънчогледа, 85 означава достатъчно ефективно ниво, за да спре разлистването и размножаването на растенията и 100 означава пълна деструкция на му тан ти те. Данните са представени на Таблица 11.

ТАБЛИЦА 11

Ефект на различните хербициди върху обикновени и устойчиви към сулфонилурея хербициди

Третиране	Количество (g a.i./ha)	Ефикасност Н89А х RHA274	Ефикасност ВС2-М3М11	Ефикасност ВС2-М3М12
Трифенсулфу рон-метил	10	100	2	10
20	100	17	16
40	100	50	32
60	100	74	58
Трибенуронметил	10	100	0	0
20	100	0	0
40	100	3	0

	60	100	10	14
Метсулфуронметил	4	100	8	18
Трифлусулфу рон-метил	15	82	13	8
Фенмедифам	240	0	0	7
2,4-D	530	100	100	100
Тифенсулфур он-метил +Метсулфурнметил	40+4	100	83	100
Тифенсулфур он-метил -(Трибенуронметил	20+10	100	26	26
40+20	100	76	60
Метсулфуронметил + 2,4-D	4+530	100	100	100
Трисулфуронметил + Фенмедифам	15+240	100	40	63

Резултатите потвърждават отлични до много добрите нива на резистентност на мутантите, произхождащи от Mil и М12 към трибенурон-метил до 60 g a.i./ha. Данните също потвърждават устойчивостта на мутантите към метсулфурон-метил, трифлусулфурон-метил и тифенсулфурон-метил, които бяха използувани в първоначалната изкуствена селекция, но в по-малка степен, в сравнение с трибенурон-метил.

Комбинацията от тифенсулфурон-метил и метсулфурон-метил показа добра ефикасност спрямо мутантите, докато комбинацията от тифенсулфуронметил и трибенурон-метил, беше недостатъчно активна за всяко ниво на приложение, полезно за контрол на резистентен към сулфонилурея слънчоглед в редуващи се зърнени култури, при които хербицидите обикновено се прилагат еднократно по време на сезонното отглеждане. Реакцията и на двата мутанта към

2,4-D, който често е използуван за контрол върху плевели при зърнени култури, беше същата, както при чувствителен към сулфонилурея слънчоглед. Мутантите бяха напълно разрушени от 2,4-D, самостоятелно или в комбинация с метсулфурон-метил.

фенмедифам, използуван за контрол върху плевелите при захарно цвекло, беше неефективен самостоятелно за контролиране или на сулфонилурея-чувствителни, или на сулфонилурея-резистентни саморасли слънчогледи. Когато обаче се комбинира с трифлусулфурон-метил, ефективността беше синергистично подобрена, както в сравнение с прилагането на трисулфурон-метил. Контролът върху плевелите при захарното цвекло изисква 2-3 хербицидни приложение за сезон, за да може той да е ефективен при тази бавно растяща култура. Следвайки тази агрономическа практика, 2-3 приложения от смес от трифлуметил и фенмедифам върху самораслите слънчогледови мутанти ще забави достатъчно раОтежът им и ще възпрепятствува разлистването и размножаването.

Тест Η - Контрол на слънчогледовите плевели

Този тест определи ефекта на три сулфонилурейни хербицида (трибенурон-метил, метсулфурон-метил и етаметсулфурон-метил), а също така и два сравними хербицида (имазапир, изопропиламинова сол и аклонифен, за контролиране на важни селскостопански плевели при слънчогледаовите култури в количества, които са обичайно използувани при други култури.

Полски участъци (2 м х 5 м) бяха разорани за отстраняване на плевелите и след това зася ти в редове със следните плевели: Capsella bursa pastoris, Atriplexpatula, Chenopodium album, Stellaria media, Mecurialis annua, Polygonum persicaria, Amaranthus retroflexus,Polygonum convolvulus, Polygonum aviculare, Viola arvensis, Matricaria inodora, Anagallis arvensis, Sinapis arvensis, Setaria viridis, Solanum nigrum и Echinochloa crus-galli. 21 дена след засяването, за което време плевелите бяха достигнали етап на 2 до 6 листен растеж, бяха приложени хербицидни третирания, като всяко от тях беше трикратно повторено. Хербицидите бяха разпръснати чрез стандартна разпръскваща дюза движеща се перпендикулярно на зася ти те линии, използуваща спрей-обеми от около 296 L/ha. За третирания с трибенурон-метил, метсулфурон-метил, етаметсулфурон-метил и имазапир, изопропиламин сол, 0.1 % обем от Witco Trend 90 етоксидиран маслен алкохолен сърфактантен адювант беше добавен към разпраскващата смес за ускоряване на хербицидния ефект. Трибенурон-метил беше приложен при 22.5 g a.i./ha, метсулфурон-метил беше приложен при 6 g a.i./ha, етаметсулфурон-метил беше приложен при 16 g a.i./ha, имазпир, изопропиламинова сол беше приложен при 15 g a.i./ha, и алконифен беше приложен при 1200 g a.i./ha,

Оценката на контрола върху плевели беше направена чрез визуално отчитане 36 дни след хербицидното третиране. Визуална стойностна система беше използувана на базата на процентна скала от 0 до 100% сравнена със един съседен контролен не третиран участък. На тази скала, 0 изразява липса на визуални различия спрямо не третирана та контрола и 100 изразява пълен контрол върху представените видове плевели. Резултатите са показани на Таблица 12.

ТАБЛИЦА 12

Ефект на хербициди върху важни за земеделието плевели при слънчогледовите култури

ВИДОВЕ ПЛЕВЕЛИ	Трибенур он-метил	Метсулфу рон-метил	Етаметсу лфуронметил	Имазапир, изопроп ИЛ аминов а сол	Аклони феи
Capsella bursa pastoris	100	100	100	100	100
Atriplex patula	100	100	0	85	0
Chenopodium album	100	100	0	87	100
Stellaria media	100	100	79	100	100
Mercurialis annua	100	100	0	47	50
Polygonum persicaria	100	100	0	100	70
Amaranthus retroflexus	93	99	82	84	40
Polygonum convolvulus	93	92	0	94	23
Polygonum aviculare	90	100	0	0	30
Viola arvensis	100	100	0	0	57
Matricaria inodora	100	100	67	43	0
Anagallis arvensis	100	100	100	100	100
Sinapis arvensis	100	100	97	100	100
Setaria viridis	65	47	0	93	40
Solanum nigrum	100	97	70	100	20
Echinochloa crus-galli	65	47	33	27	0

Резултатите, представени в Таблица 12 показват, че и трибенурон-метил и метсулфурон-метил осигуряват отличен широкоспектърен контрол върху плевелите при прилагани количества, към които други тестове показват, че слънчогледовите линии, описани в това изобретение са устойчиви.

Депозити

Депозити те на слънчогледови линии М7, МП, М12 и РНА155 се съхранява т о т Pioneer Hi-Bred International, Inc., 800 Capital Square, 400 Locust Street, Des Moines, Iowa 50309-2340 U. S. А. от приоритетната дата на подаване на настоящата заявка. На 2 Август 2000 година заявителите депозираха слънчогледова линия

М7 в American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110 U. S. А., състояща се от поне 2500 семена от цитоплазмена мъжка стерилна форма SU7F (ATCC Deposit No. РТА-2296) и допълнителната поддържаща линия SU7G (ATCC Deposit No. РТА-2295). Заявителите също депозираха в АТСС на 2 Август 2000 година поне 2500 семена от възстановяваща слънчогледова линия РНА155 (ATCC Deposit No. РТА-2294). На 8 Декември 2000 година заявителите депозираха в АТСС слънчогледова линия МИ, състояща се поне от 250 семена от цитоплазмена мъжка стерилна форма SU1 IF (АТСС Deposit No. РТА-2767) и допълнителната поддържаща линия и SU11G (АТСС Deposit No. РТА-2768) и слънчогледова линия М12, състояща се от поне 250 семена SU12F (АТСС Deposit No. РТА-2769) и SU12G (АТСС Deposit No. РТА-2770), които включват първоначално

С възстановяващата форма на линия М12. Тези депозити на слънчогледови линии SU7F & SU7G (М7), SU1 IF & SU11G (МИ), SU12F & SU12G (М12) и РНА155 ще бъдат съхранявани в АТСС, който е обществен депозит ар за период от 30 години или за 5 години след последната молба за период, който е по-дълъг и ще бъдат заменени, ако са нежизнеспособни през този период. Също така, заявителите са удовлетворили всички изисквания на 37 С. F. R. 1. 801-1. 809, включващи осигуряване на индикация за жизнеспособността на пробите. Заявителите не налагат ограничения върху наличност та на депозираните материали от АТСС след издаването на патент по тази заявка. Обаче, заявителят няма право да не приема ограничения, наложени от закона за трансфер на биологичен материал или пренасянето му с търговска цел. Заявителят не се отказва от правата си при нарушаването на патентните права след издаване на патента или съгласно Закона за защита на сортовете (7 USC 2321 et seq.). Допълнителни депозити на слънчогледови линии Mil и М12 ще бъдат направени в АТСС необходими за осигуряване наличието на обекта при условията, описани по-горе за SU7F, SU7G и РНА155 депозити.

Въпреки че гореспоментото изобретение е описано в детайли чрез разкриване и примери с оглед яснота и разбиране, е очевидно, че съответни промени и модификации могат да се извършват в обхвата на изобретението, като се ограничават само до обхвата на приложените патентни претенции.

Claims (28)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Метод за получаване на слънчогледова линия, притежаваща високонаследствен белег, даващ устойчивост към сулфонилурейни хербициди, които включва:

   (a) третиране на слънчогледови семена с мутагенен агент;

   (b) отглеждане на третираните семена до напълно развити растения за получаване на второ поколение семена;

   (c) събиране на семената второ поколение;

   (d) покълване на второто поколение семена в присъствието на селективно ефективно количество сулфонилуреен хербицид за селекция само на покълнали семена, притежаващи белег, даващ устойчивост към сулфонилурейния хербицид; и

   W (е) отглеждане на подбраните покълнали семена до напълно развити растения за получаване чрез самоопрашване на семена от слънчогледова линия, съдържаща наследствения белег.
2. 2. Слънчогледово семе, съдържащо високонаследствен белег, даващ устойчивост към сулфонилурейни хербициди, характеризиращо се с това, че споменатият белег е получен чрез мутагенеза.
3. 3. Семе, съгласно претенция 2, означено като слънчогледова линия М7, репрезентативно семе от споменатата линия М7, което е депозирано под АТСС Депозитарен N РТА-2295 и РТА2296.
4. 4. Семе, съгласно претенция 2, означено като слънчогледова линия Mil, репрезентативно семе от споменатата линия МИ, което е депозирано под АТСС Депозитарен N РТА-2767 и РТА-

   2768.
5. 5. Семе, съгласно претенция 2, означено като слънчогледова линия М12, репрезентативно семе от споменатата линия М12, което е депозирано под АТСС Депозитарен N РТА-2769 и РТА2770.
6. 6. Слънчогледово растение или част от него, отгледани от семе, съгласно претенции 3, 4 или 5.
7. 7. Семе, съгласно претенция 2, което съдържа наследствен белег, отнасящ се до резистентност към Orobanche паразитизъм.
8. 8. Слънчогледово растение или част от него, получени чрез отглеждане на семе, съгласно претенция 2.
9. 9. Цветен прашец от растение, съгласно претенция 8.
10. 10. Семепъпка от растение, съгласно претенция 8.
11. 11. Тъканна култура от регенериращи се клетки от растение, съгласно претенция 8.
12. 12. Метод за получаване на инбредно слънчогледово семе, притежаващо устойчивост към сулфонилурейни хербициди, включващ кръстосване на първо родителско растение слънчоглед с второ родителско растение слънчоглед и събиране на полученото инбредно слънчогледово семе, характеризиращ се с това, че първото и второто родителско слънчогледово растение е слънчогледовото растение, съгласно претенция 8.
13. 13. Инбредно слънчогледово семе, получено по метода, съгласно претенция 12.
14. 14. Инбредно слънчогледово растение или част от него, получено чрез отглеждане на инбредно семе, съгласно претенция 13.
15. 15. Семе, получено от инбредно растение, съгласно претенция 14.
16. 16. Метод за получаване на хибридно слънчогледово семе, притежаващо резистентност към сулфонилурейни хербициди, включващ кръстосване на първо родителско слънчогледово растение с второ родителско слънчогледово растение и събиране на полученото хибридно слънчогледово семе, характеризиращ се с това, че първото или второто родителско слънчогледово растение е слънчогледовото растение, съгласно претенция 8.
17. 17. Хибридно слънчогледово семе, получено по метода, съгласно претенция 16.
18. 18. Хибридно слънчогледово растение или част от него, получено чрез отглеждане на хибридното семе, съгласно претенция 17.
19. 19. Семе, получено от хибридно растение, съгласно претенция 18.
20. 20. Метод за контролиране на нежелан растеж в култури от слънчогледови растения, съгласно която и да е от претенции 8, 14 или 18, включващ прилагане на мястото на растежа на ефективно количество сулфонилуреен хербицид.
21. 21. Метод, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че растежът включва паразитен плевел.
22. 22. Метод, съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че паразитният плевел е от вида Orobanche.
23. 23. Метод, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че сулфонилурейният хербицид е трибенурон-метил.
24. 24. Метод, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че сулфонилурейният хербицид е метсулфурон-метил.
25. 25. Метод, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че сулфонилурейният хербицид е етаметсулфурон-метил.
26. 26. Метод, съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че сулфонилурейният хербицид се прилага след поникването на слънчогледови растения.
27. 27. Метод за контролиране на саморасли слънчогледови растения, съгласно която и да е от претенции 8, 14 или 18 в зърнени култури, включващ прилагане на мястото на саморасли ти слънчогледови растения на ефективно количество

    2,4-D.
28. 28. Метод за контролиране на саморасли слънчогледови растения, съгласно която и да е от претенции 8, 14 или 18 в култури от захарно цвекло, включващ прилагане на мястото на самораслите слънчогледови растения на ефективно количество смес от трифлусулфурон-метил и фенмедифам.