AT398975B - Verfahren zur herstellung von wasserlöslichem primycin und seinen komponenten sowie von diese enthaltenden pharmazeutischen präparaten - Google Patents

Description

AT 398 975 B

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichem Primycin, und auf die Trennung dessen einzelner Komponenten. Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische und veterinäre Präparate, die wasserlösliches Primycin oder dessen Komponenten als aktiven Bestandteil enthalten. 5 Primycin ist ein Antibiotikum mit starker antimikrobialer Aktivität, das in grossem Umfang angewendet wird. Seine empirische Formel wurde von I. Aberhart et al. [J. Am. Chem. Soc. 92, 5816 (1970)] bekanntgemacht; die Verfasser haben auch die vorausgesetzte Strukturformel von Primycin angegeben. Weitere Forschungen haben aber enthüllt, dass das Antibiotikum Primycin ein Gemisch ist, das aus drei Hauptkomponenten und mindestens zehn Nebenkomponenten besteht [J. Chromatogr. 295,141-151 (1984)-io ]. Die Benennung "Primycin" in dieser Beschreibung und in den Patentansprüchen angewendet bezieht sich auf dieses, aus mehreren Komponenten bestehende Gemisch; die einzelnen Komponenten des Gemisches werden mit bestimmten Buchstaben bezeichnet.

Viele Abhandlungen befassen sich mit der Herstellung von Primycin und seinen Komponenten; von diesen werden hier, ausser den obengenannten Literaturstellen, die ungarischen Patentschriften Nr. 146 75 332,153 593,158 241,177 299,194 493 und 195 517 erwähnt. Primycin und seine Komponenten, die nach den bisher bekannten Methoden hergestellt wurden, lösen sich schwer im Wasser, was verschiedene Schwierigkeiten bei der Verwendung in der Therapie verursacht, da dies die Herstellung von pharmazeutischen Präparaten nur mit ziemlich niedrigem Wirkstoffgehalt ermöglicht (so ist z.B. der Wirkstoffgehalt des bekannten, mit Primycin enthaltenden EmbrimycinR Gels nur 0,2 %). Ein weiterer Nachteil besteht darin, 20 dass die Trennung der einzelnen Komponenten des Primycins eine lange und komplizierte Operation benötigt.

Das Ziel der Erfindung ist die Ausarbeitung eines Verfahrens, das ermöglicht, das z.B. nach den ungarischen Patentschriften z.B. Nr. 146 332 und 153 593 hergestellte Primycin in eine wasserlösliche Substanz einfach und wirtschaftlich umzuformen. Weiterhin war unser Ziel, zwei von den Hauptkomponen-25 ten zu trennen, entweder allein oder als ein Gemisch, mit einer einfachen Operation.

Erfindungsgemäss geht man folgenderweise vor; (i) Das wasserunlösliche Primycin wird in einem C1-3 Alkohol, vorzugsweise in Äthanol, mit einer kondensierbaren Substanz, die eine C-C-C Brücke enthält, vorzugsweise mit Äthylcyanoacetat, in der Anwesenheit von Natrium- oder Kaliummethoxyd oder -äthoxyd, vorzugsweise von Natriummethoxyd, 30 umgesetzt, das Endprodukt mit einer Wasserlöslichkeit von 40-60 mg/ml wird abgetrennt, und falls erwünscht, (ii) die entstandene Substanz wird der Säulenchromatographie auf Silicage unterworfen, wobei als Eluiermittel eine 1%-ige wässrige Lösung eines Partridge-Gemisches angewendet wird, um ein Gemisch zu bekommen, das aus den Komponenten der Formel (Ai) und (A3) mit einer Wasserlöslichkeit von 50 35 mg/ml besteht, und falls erwünscht, (iii) das entstandene Zweikomponenten-Gemisch wird einer lonenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Carboxymethyl-cellulose in Ammonium-Cyklus als Adsorbens unterworfen, wonach das Adsorbens mit wässriger Ammoniumhydrocarbonat-Lösung eluiert wird, wodurch die Komponente der Formel (A3) mit einer Wasserlöslichkeit von etwa 50 mg/ml in reiner Form erhalten wird, und falls 40 erwünscht, (iv) die Eluierung wird mit etwa 10 mMol Essigsäure enthaltendem absolutem Methanol fortgesetzt, wodurch die Komponente der Formel (Ai) mit einer Wasserlöslichkeit von 10 mg/ml in reiner Form gewonnen wird.

Sowohl die empirische Formel als auch das Dünnschichtchromatogramm des wasserlöslichem Primy-45 eins, das im ersten Schritt der erfindungsgemässen Methode gewonnen wurde , sind mit denen der Ausgangssubstanz identisch; der einzige Unterschied ist die grundsätzliche Veränderung in der Wasserlöslichkeit. Die Ursachen davon können nicht vollständig erklärt werden, aber es wird vermutet, dass sich die sterische Stellung der -OH-Gruppen des Ausgangsprimycins aufgrund der erfindungsgemässen Behandlung verändern, was die sofortige Erhöhung der Wasserlöslichkeit ergibt. Die zwei Hauptkomponenten vom 50 Primycin, die Verbindungen der Formeln (Ai) und (A3), die von dem gewonnenen wasserlöslichen Primycin abgetrennt werden, sind auch wasserlöslich, und ihre empirischen Formeln sind die selben, die in der Literatur erwähnt sind.

Das wasserlösliche Primycin und seine Komponenten, die erfindungsgemäss hergestellt sind, können vorzugsweise für therapeutische Zwecke angewendet werden, da sie die ausgezeichneten antimikrobialen 55 Wirkungen der entsprechenden, nicht wasserlöslichen Substanzen behalten, und ermöglichen die Herstellung pharmazeutischer Präparate mit einem viel höheren Wirkstoffgehalt als zuvor, z.B. von Wasserlösungen, die sogar 50-100 mg/ml Wirkstoff enthalten. 2

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Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische oder veterinäre Präparate, die als Wirkstoff wasserlösliches Primycin oder ein wasserlösliches Gemisch der Komponenten (Ai) und (A3), oder eine wasserlösliche Einzelverbindung der Formel (Ai) oder (A3), zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen, enthalten.

Eine ausführliche Beschreibung der erfindungsgemässen Methode ist nachstehend angegeben.

Das nach der ungarischen Patentschift nr. 146 332 und 153 593 hergestellte, nicht wasserlösliche Primycin wird als Ausgangssubstanz in der erfindungsgemässen Methode angewendet.

Unsere früheren Versuche haben gezeigt, dass - abhängig von der Konzentration und der Zeit - das nicht wasserlösliche Primycin in einer Konzentration von 1-10 U.Mol/ml die Ruhe-K+-Kanäle der oberflächlichen Membrane der Gerüstmuskelfasern inhibiert. Das ergibt die Erminderung des Membranpotentials, was auch die funktionelle Veränderung des Kontraktilsystems zur Folge hat. Das Antibiotikum Primycin ist einzigartig im Sinne, dass in der Molekel mit hoher Komplexität eine Guanidin-Einheit und eine Arabinose-Einheit gleichzeitig anwesend sind; so werden sowohl die biologischen Wirkungen als auch die physioche-mischen Eigenschaften des Moleküls durch das makrolide Lakton von nicht Polyen-Typ und durch die dazu gebundenen Guanidin- und Arabinose-Gruppen bestimmt. Diese Teile des Moleküls bestimmen zusammen durch ihre amphipatischen (hydrophilen und hydrophoben) Eigenschaften die Orientation und Bindung des Antibiotikums zur Membrane. Weiterhin kann man voraussetzen, dass die Kanalbildungs-Eigenschaft des Primycins mit der Bildung von dimeren oder höheren Polymeren in Zusammenhang steht.

Die partielle oder ganze Durcheinandersetzung der obigen Wechselwirkungen kann einen erheblichen Einfluss auf die Polarität des Moleküls und so auch auf seine Löslichkeitsverhältnisse ausüben. Die partielle oder ganze Protonierung der Guanidingruppe das Moleküls kann die oberflächliche Ladung-Verteilung (Bruttopolarität) erheblich beeinflussen, was in direkter oder indirekter Weise die intermolekulare Wechselwirkungen vermindern oder sogar befördern kann.

Zur Ausarbeitung des ersten Schrittes der erfindungsgemässen Methode haben wir ungefähr 150 Experimente unter der Anwendung von Kondensationsreaktionen, die in der Synthese von Verbindungen mit Pyrimidingerüst allgemein verwendet werden, durchgeführt. Ein allgemeiner Zug dieser Resktionen ist, dass der heteroaromatische Ring aus einer Verbindung entstent, die eine N-C-N oder C-C-C Brücke enthält.

Als Verbindungen mit einer C-G-C Brücke können z.B. Propargylaldehyd, Äthyl-formylacetat, Äthyl-cyanoacetet, Malonsäure-dinitril, Methiläthynyl-keton, Acetyl-aceton und Formyl-ß-äthoxy-propionsäure-ester angewendet werden, von denen sich Äthyl-cyanoacetat als besonders vorteilhaft erwies. Als Reaktionsmedium können wasserfreie Alkohole mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen angewendet werden. Die Reaktion wird vorzugsweise in absolutem Äthanol durchgeführt, der aus vorgetrocknetem Äthanol mit Hilfe einer Grignard-Reaktion gewonnen werden kann. Im allgemeinen waren die wasserfreien Lösungsmittel, die in unseren Experimenten angewendet wurden, über einem Molekülsieb gelagert (wie Sigma Molekülsieb mit 3-4 Ä Porendurdurchmesser).

Als Katalysator kann Natrium- oder Kalium-methoxyd oder -äthoxyd, vorzugsweise Natrium-methoxyd, angewendet werden.

Falls man Äthanol als Reaktionsmedium anwendet und das Gemisch unter Rückflusskühler erwärmt, fordert die Reaktion 3-6 Stunden. Nach der Vollendung der Reaktion wird das Gemisch mit Aktivkohle (Charcoal activ., "Merck") geklärt, filtriert (vorzugsweise durch ein GF/C Whatman glass Microfibre Papier) und es wird einer partiellen Vakuum-Verdampfung unterworfen. Die Verdampfung kann z.B. in einem Rotavapor R110 (Büchi) durchgeführt werden. Während des Verdampfungsprozesses wird der als Reaktionsmedium angewendete Äthanol fortlaufend mit wasserfreiem Methanol ersetzt, dann werden absoluter Äther und absolutes Aceton zum Konzentrat gegeben, wodurch das Produkt ausgeschieden wird. Ein weisses festes Material wird gewonnen, das pulverisiert und 24 Stunden lang in einer Vakuum-Trocknungspistole ("Blaugel", Chloroform/Äthanol, 65 *C) gelagert wird. So kann ein Muster zwecks Identifizierung und Analyse gewonnen werden.

Die charakteristischen Angaben des erhaltenen wasserlöslichen Primycins, im Vergleich mit denen der nicht wasserlöslichen Ausgangssubstanz, sind in der Tabelle I angegeben. 3

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Tabelle I

Nicht wasserlösliches Ausgangsprimycin Wasserlösliches Primycin Produkt Empirische Formel C55H104N3O17 C55H104N3O17 Schmelzpunkt 180-184 *C 162-164 ‘C Biologische Aktivität 0,05 ug/ml 0,1-0,5 ug/ml Wasserlöslichkeit 0,04 mg/ml 40-60 mg/ml

Es ist aus der empirischen Formel des erhaltenen wasserlöslichen Primycins zu entnehmen, dass die Kondensationsreaktion unter den Bedingungen der Synthese der Pyrimidinverbindungen keinen Ringschluss ergibt, das heisst der vorausgesetzte heteroaromatische Ring sich nicht ausbildet. Es ist wahrscheinlich, dass ein solches "Intermediär" im Laufe der Reaktion entsteht, der die Orientierung der -OH-Gruppe des Makrolidringes grundlegend verändert. Es wird vermutet, dass diese Veränderung die erhebliche Erhöhung der Wasserlöslichkeit ergibt, und dass diese Veränderung auch die Trennung der Hauptkomponenten mit einer relativ einfachen Operation ermöglicht. Auf eine eventuelle Erläuterung dieses Phänomens kommen wir später zurück.

Die erfindungsgemässe Methode ermöglicht die Herstellung von wasserlöslichem Primycin in einer reproduzierbaren Weise aus dem nicht wasserlöslichen Primycin von jeglicher Herkunft, ohne dass eine vorherige Reinigung der Ausgangssubstanz nötig wäre. Es ist besonders vorteilhaft, nicht wasserlösliches, mit Blei verunreinigtes Primycin als Ausgangssubstanz zu verwenden. Es wurde nämlich bemerkt, dass die Anwesenheit von Blei sowohl die Gewinnung des wasserlöslichen Primycins (was im allgemeinen 80-85 % ist) als auch die maximal erreichbare Wasserlöslichkeit (was 50-100 mg/ml ist) günstig beeinflusst.

Aufgrund von Atomabsorptions-spektroskopie (Perkin-Elmer Mod.) enthält das nicht gereinigte Primycin etwa 6-10 ppm Blei-Verunreinigung. Falls ein gereinigtes wasserlösliches Primycin mit therapeutischer Reinheit (wie EbrimycinR) als Ausgangssubstanz angewendet wird, vermindert sich die Ausbeute an wasserlöslichem Primycin auf etwa 50-60 %, und eine maximale Wasserlöslichkeit von nur 5-10 mg/ml kann erreicht werden. Deswegen falls ein gereinigtes wasserunlösliches Primycin als Ausgangssubstanz verwendet wird, ist es vorteilhaft, 15-20 ppm Blei zu dem Reaktionsgemisch zu geben, in der Form einer löslichen Bleiverbindung, vorzugsweise Bleiacetat.

Das wasserlösliche Primycin hat eine weitere sehr interessante Eigenschaft. Es wurde bemerkt, dass seine wässrige Lösung spontan geliert und der Zeitraum der Gelierung vom Primycingehalt der Lösung abhängig ist. Das Mass der Gelierung in Abhängigkeit der Zeit und Primycin-Konzentration ist in Fig. 1 angegeben. Wie es aus den Kurven von Fig. 1 zu sehen ist, benötigt die volle Gelierung einer 5-10 mg/ml Primycin enthaltenden wässrigen Lösung etwa 1-2 Tage, einer 20-40 mg/ml Primycin enthaltenden Lösung etwa 6-12 Stunden, wogegen eine wässrige Primycin-Lösung, die mehr als 50 mg/ml Primycin enthält, geliert sogar binnen 1-2 Stunden. Die Wirkung der Temperatur auf die Gelierung ist in Fig. 2 angegeben. Die Konzentration-, Zeit- und Temperatur-abhängige Gelierung (Polymerisation) kann vermutlicherweise den Veränderungen in der Orientation der -OH-Gruppen in dem Molekül angeschrieben werden.

Das erhaltene Primycingel ist vollständig durchsichtig, fest und verändert sich nicht bei der Zugabe von weiterem Lösungsmittel. Diese günstige Assoziationseigenschaft des wasserlöslichen Primycins ermöglicht die Anwendung von polymerisierten Gelen oder lyophilisierten Membranen auf therapeutischen Gebieten, wo die hohe lokale Wirkstoffkonzentration von grosser Wichtigkeit ist. Unter Anwendung dieser Gelbildungseigenschaft des wasserlöslichen Primycins können kolloidale pharmazeutische Kompositionen mit einem hoch variablen Wirkstoffgehalt ganz einfach hergestellt werden, ohne einen bestimmten Gelierungsstoff anwenden zu müssen. Die Verwendung von Äthanol; der bisher den wasserlöslichen Primycinpräparaten zwecks Erreichung eines höheren Wirkstoffgehalts beigemischt wurde, kann auch vermieden werden, wodurch die unerwünschten Nebenwirkungen des Äthanols eliminiert werden können.

Bei einer ersten Annäherung unterscheidet sich das erfindungsgemäss hergestellte Primycin von der Ausgangssubstanz nur in der Wasserlöslichkeit. Jedoch, infolge der Veränderungen in den Lösungseigenschaften, können sich auch die Assoziationsbedingungen und die sogenannten Heterogenitäts-Verhältnisse verändern, woraufhin Primycin (was ein Mehrkomponentengemisch ist), für weitere Behandlungen leichter zugänglich wird. Das ist der Grund, warum es uns gelungen ist, ein Zweikomponentengemisch und zwei separate einzelne, biologisch aktive Komponenten mit einer relativ schnellen und gut reproduzierbaren chromatographischen Operation zu gewinnen.

Zur Herstellung eines Gemisches, das aus den Primycin-Komponenten der Formeln (Ai) und (A3) besteht, wird als Ausgangssubstanz das erfindungsgemäss hergestelite wasserlösliche Primycin angewendet. Die Chromatographie wird an einer Silicagelsäule durchgeführt. 4

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Die bevorzugten Bedingungen für die Säulenchromatographie sind die folgenden: Kieselgel 60 (Partikelgrösse: 0,063-0,2 mm oder 0,02-0,5 mm) wird als Adsorbens angewendet. Das Gel wird mehrmals mit deionisiertem Wasser gewaschen, die wässrige Phase wird dekantiert und die erhaltene Gelsuspension wird im Vakuum von Blasen befreit. Eine "Pharmacia" Säule (2,6 x 230 cm) mit einem "Flow-Adapter" ausgerüstet wird als chromatographische Säule angewendet. Die ununterbrochene Durchströmung wird mit einer Gilson Mini-plus-2 vierkanäligen peristaltischen Pumpe unterhalten. Ein Gilson-Gerät für Flüssigkeitschromatographie mit einem Holochrome Model M Differential-Spektrophotometer, ein Model 201 Fraktionssammler und ein Model N2 zweikanäliger servopotentiometrischer Rekorder werden für die Partikelsammlung und für die ständige Kontrolle von Ablauf der Chromatographie angewendet. Das wasserlösliche Primycin wird auf der Säule als eine 5-10 mg/mi Primycin enthaltende wässrige Lösung angewendet. Die chromatographischen Spitzen werden in Fig. 3 angegeben.

Zuerst wird die Säule mit Wasser eluiert (gewaschen), wobei ein erheblicher Teil der Nebenkomponenten des Primycins (Partikel "A” in Fig. 3) entfernt werden kann. Die einzelnen Spitzeenfraktionen werden mit Dünnschichtchromatographie kontrolliert, wobei Merck DC Alufolien oder DC Plastikfolien Kieselgel 60 F254 als Chromatographieplatte angewendet werden: die obere Phase eines 38:2:10:50 v/v Gemisches von n-Butanol, Äthanol, Essigsäure und Wasser dient als Lösungsmittel (Partridge-Gemisch), und Vanillin und Schwefelsäure bei 105 “C dienen als Detektiermittel.

Die an der Säule gebundene Substanz, die ein Gemisch der Komponenten der Formeln (Ai) und (A3) ist, wird mit einer 1 %-igen wässrigen Lösung vom oben erwähnten Partridge-Gemisch eluiert. Wie aus Fig. 3 zu sehen ist, werden die zurückgebliebenen Nebenkomponenten zuerst eluiert, dann wird ein reines Gemisch der Verbindungen von Formeln (Ai) und (A3) eluiert, und danach werden in der absteigenden Phase des Elutiogramms die verunreinigenden Substanzen mit höherem RrWert (in den oben erwähnten Patentschriften als Komponente "B" genannt) eluiert.

Die Spitzenfraktionen werden gesammelt, verdampft, unter Verwendung von destilliertem Methanol und dann von absolutem Methanol stufenweise dehydratisiert, danach wird ein Gemisch von absolutem Äther und Aceton dem erhaltenen Konzentrat zugegeben, damit das Produkt ausgeschieden wird. Das ausgeschiedene Produkt ist ein Gemisch der Verbindungen der Formeln (Ai) und (A3): dieses Gemisch ist ein wasserlösliches, biologisch aktives Produkt. Es wird im allgemeinen mit einer Ausbeute von 50-60 % gewonnen, berechnet auf das wasserlösliche Ausgangsprimycin. Das Zweikomponentengemisch schmilzt bei 165-168 °C.

Wir haben versucht, die Verbindungen der Formeln (Ai) und (A3) in reinem Zustand aus ihrem Gemisch zu trennen. Unsere früheren Versuche haben gezeigt, dass die Adsorptionszüge dieser zwei Hauptkomponenten beinahe gleich sind, so erschien ihre Trennung eine lange und komplizierte Operation zu sein, die mit einem erheblichen Verlust verbunden ist. Während unserer Forschung im Zusammenhang mit dem Wirkungsmechanismus des Primycins haben wir immer den Veränderungen in der Ladungsstruktur der Molekel eine grosse Bedeutung beigelegt. Jede Veränderung in der Ladungsstruktur kann (1) die Membranorientation der Primycin-Molekel grundsätzlich modifizieren (es kann nämlich nur eine diskrete Orientierung z.B. die Trennung der antibakteriellen und toxischen Wirkungen sichern) und (2) die Adsorptionseigenschaften der Molekel oder der einzelnen Primycinkomponenten verändern.

Unsere früheren geichromatographischen Untersuchungen mit wasserlöslichem Primycin auf Sephadex LH-20 haben gezeigt, dass eine Veränderung in der Polarität und in den Assoziationsbedingungen die Heterogenität des Primycins erheblich beeinflussen kann. Mit anderen Worten: die Proportion der einzelnen Komponenten der Spitzenfraktionen ist von den dielektrischen Eigenschaften des angewendeten Lösungssystems abhängig. Aufgrund dieser Beobachtungen haben wir versucht, die einzelnen Komponenten des oben beschriebenen Gemisches mit Hilfe von lonenaustausch-Chromatographie zu trennen. Eine bevorzugte Methode, die die vollständige Trennung der Komponenten der Formeln (Ai) und (A3) ergibt, wird nachstehend angegeben.

Als Ausgangssubstanz wird das auf die oben beschriebene Weise hergestellte wasserlösliche Gemisch der Komponenten der Formeln (Ai) und (A3) angewendet. Eine wässrige Lösung dieses Zweikomponentengemisches der Konzentration von 4-5 mg/ml wird auf einer Carboxymethylzellulose-Säule in NKJ -Cyklus (Whatman CM-52 Zellulose, preswollen) angewendet. Eine Pharmacia K-26 Säule (2,6 x 5 cm) mit einem "Flow-Adapter" ausgerüstet wird als Säule angewendet. Die Bedingungen der Chromatographie und das Elutiogramm werden in Fig. 4 angegeben.

Die Säule wird zuerst mit Wasser gewaschen, damit die niedergeschlagenen Nebenkomponenten ("A”) entfernt werden, danach wird die Eluierung mit einer 5-8 mM wässrigen Ammoniumhydrocarbonat-Lösung durchgeführt, wodurch die reine Komponente der Formel (A3) erhalten wird. Die Komponente der Formel (Ai) bleibt an der Säule gebunden. Die Ammoniumhydrocarbonat-Effluenten werden gesammelt, eine kleine 5

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Menge von n-Butanol wird zum Verhindern der Schäumung zugegeben, und das Gemisch wird zur beinahe Trockne verdampft. Das Waschen mit Wasser und die Verdampfung werden mehrmals wiederholt, damit das Ammoniumhydrocarbonat entfernt wird, danach wird der Rückstand vollständig dehydratisiert, wobei zuerst destillierter Methanol und dann absoluter Methanol von dem Rückstand verdampft werden. Das 5 erhaltene Konzentrat wird mit absolutem' Äther behandelt, damit das Produkt abgeschieden wird, das getrennte feste Material wird filtriert und mit einer kleinen Menge von wasserfreiem Azeton gewaschen.

Das gewonnene feste Material schmilzt bei 159-161 °C und wird mit einer Ausbeute von etwa 45-50 % gewonnen, berechnet auf das Zweikomponenten-Ausgangsgemisch. Die Wasserlöslichkeit der erhaltenen Substanz ist etwa 2-6 mg/ml. Die Abnahme des Schmelzpunktes (der Schmelzpunkt des Ausgangsgemi-10 sches ist 165-168 *C) und der Wasserlöslichkeit (die des Ausgangsgemisches ist 40-60 mg/ml) kann der Anwesenheit von geringen Mengen an gebundenem NHj und Ammoniumhydrocarbonat Verunreinigungen zugeschrieben werden.

Um diese Verunreinigungen zu entfernen wird die erhaltene Substanz in Wasser gelöst, die Lösung wird auf eine Carboxymethylcellulose-Säule in H+-Cyklus gebracht, die Säule wird mit Wasser vollständig 75 gewaschen, danach stufenweise dehydriert, zuerst mit destilliertem Methanol und dann mit absolutem Methanol. Danach wird die Substanz mit absolutem Methanol mit einem Gehalt von 10 mMol Essigsäure eluiert. Der Effluent wird zu einer kleinen Menge verdampft, absoluter Methanol wird zu dem Konzentrat gegeben und die Verdampfung wird mehrmals wiederholt. Danach wird das Produkt aus dem Konzentrat mit absolutem Aceton niedergeschlagen. Die getrennte Substanz wird durch ein gesintertes G4 Glasfilter 20 filtriert, mehrmals mit Aceton gewaschen und getrocknet.

Auf diese Weise wird eine Verbindung der Formel (A3) in reinem Zustand gewonnen, die bei 164-166 •C schmilzt. Die Wasserlöslichkeit der Verbindung der Formel (A3) beträgt etwa 50 mg/ml. Die wiederholte lonenaustausch-Chromatographie erfolgt mit einem Verlust von max. 10 %.

Die zweite Komponente des Zweikomponenten-Ausgangsgemisches, das heisst die Verbindung der 25 Formal (Ai), die auf der CM 52 Carboxymethylcellulose-Säule in NHj -Cyklus gebunden bleibt, nachdem . die Säule mit wässrigem Ammonium-hydrocarbonat eluiert wurde, wird folgenderweise getrennt:

Die Säule wird mit Wasser gewaschen, damit das Ammoniumhydrocarbonat vollständig entfernt wird, danach wird sie stufenweise dehydriert, zuerst mit destilliertem Methanol, dann mit absolutem Methanol. Die gebundene Substanz wird danach mit absolutem Methanol mit einem Gehalt von 10 mMol Essigsäure 30 eluiert. Der Effluent wird zu einer kleinen Menge verdampft, absoluter Methanol wird zu dem Konzentrat gegeben, die Verdampfung wird zwecks Entfernung der Essigsäure mehrmals wiederholt, danach wird absolutes Azeton dem Konzentrat zugegeben, damit das Produkt abgeschieden wird.

Auf diese Weise wird die Komponente der Formel (Ai) in reinem Zustand gewonnen, Schmp.: 167-168 •C. Die Verbindung hat eine gute Wasserlöslichkeit. Keine nachträgliche lonenaustauschchromatographie 35 ist zur Reinigung dieser Komponente nötig, da bei der Elution mit Essigsäure das rückgebliebene und "gebundene" NHj sowie das anwesende Ammoniumhydrocarbonat als Ammoniumacetat eluiert werden, und diese Verbindung bleibt während der Abscheidung mit Azeton gelöst.

So wird aus einem nicht wasserlöslichen Primycin erfindungsgemäss ein wasserlösliches Primycin hergestellt, aus dem, falls erwünscht, ein wasserlösliches Gemisch der Komponenten der Formeln (A3) und 40 (Ai) hergestellt werden kann, und die einzelnen Komponenten dieses Zweikomponenten-Gemisches können auch getrennt werden. Alle erfindungsgemäss hergestellten Produkte sind wasserlöslich und biologisch aktiv.

Das komparative Dünnschichtchromatogramm und die Ergebnisse der biologischen Bewertung werden in Fig. 5 angegeben. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf einer Kieselgel 60 DC Alufolien F254. 45 Platte durchgeführt, unter Anwendung der oberen Phase eines 38:2:10:50 v/v Gemisches von Butanol, Äthanol, Essigsäure und Wasser als Lösungsmittel, und ein Gemisch von Vanillin und Schwefelsäure bei 105 °C diente als Detektiermittel. Die biologische Bewertung wurde mit einem Agar-Diffusiontest an Bacillus subtilis durchgeführt. Die in den biologischen Bewertungen bemessenen minimalen Inhibitionskonzentrationen werden in der nachstehenden Tabelle II angegeben. 50 6 55

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Tabelle ll

Minimale Inhibitionskonzentration ug/ml Nicht wasserlösliches Ausgangsprimycin 0,04 - 0,06 Wasserlösliches Primycin 0,08 - 0,2 Gemisch von (Ai) und (A3) 0,05 - 0,1 Verbindung der Formel (A3) 0,5-1,0 Verbindung der Formel (ΑΊ) 0,03 - 0,06

Die Ergebnisse der biologischen Bewertung zeigen, dass die einzelnen Komponenten des Primycins verschiedene Aktivität haben. Dieser Unterschied in der Aktivität kann wahrscheinlich dem zugeschrieben werden, dass die einzelnen Komponenten ihre antibakterielle Wirkungen verschieden ausüben, oder sie während ihrer Wirkung auf den lebendigen Organismus verschiedene Anfallpunkten haben können. Das ist 75 eine Erklärung dafür, dass eine Einzelkomponente die Wirkung einer anderen Komponente synergisieren kann (siehe z.B. die ungarische Patentschrift Nr. 196 309).

Die Gelierungseigenschaften der einzelnen Komponenten der Formeln (Ai) und (A3) sowie die des Zweikomponentengemisches wurden auch untersucht. Es wurde festgestellt, dass wenn die Konzentration bei einem festen Wert gehalten wird, die Geiierungsrate sinkt. Die 5-10 mg/ml wässrige Lösungen der 20 Einzelkomponenten können ohne eine merkbare Veränderung mehrere Tage lang (max. eine Woche) gelagert werden, wogegen die wässrige Lösung der selben Konzentration des Zweikomponentengemisches binnen 1-2 Tagen geliert, und die Gelierungszeit des wasserlöslichen Primycins der selben Konzentration ist kürzer als ein Tag. Es kann vermutet werden, dass dieser Verzug in der Gelierung mit der Veränderung der Konformation oder mit der Orientation der Hydroxylgruppen in Zusammenhang steht.

Es ist von früheren Literaturstellen bekannt, dass Primycin auf Eiektrolyte stark empfindlich ist. Mit dieser Beobachtung übereinstimmend, die auch mit der ionophorischen Eigenschaft des Primycins in Einklang steht, haben wir bemerkt, dass die Orientation der Hydroxylgruppen im wasserlöslichen Primycin mit Kationen umkehrbar ist, was eine plötzliche, aber reversible Abnahme der Wasserlöslichkeit des Primycins ergibt. Jedoch kann in einer Zuckerlösung von entsprechender Konzentration (wie z.B. eine 30 isotonische Glykose-Lösung) sowohl die Polymerisation als auch die Kation-Sensibilität des Primycins in grossem Masse unterdrückt werden.

Die 13C NMR-Spektra der erfindungsgemäss hergestellten Produkte sind in den Figuren 6 bis 11 angegeben.

Fig. 6 zeigt das normale 13C NMR-Spektrum des wasserlöslichen Primycins (c = 500 mg/400 ul von 35 Methanol-d*, T = 323K).

Fig. 7 zeigt das normale, proton-ungekuppelte 13C NMR-Spektrum des Zweikomponentengemisches der Komponenten von Formeln (Ai) und (A3) (c = 250 mg/1,5 ml von Methanol-d*, T = 323 K, NS = 3000).

Fig. 8 zeigt das normale, proton-ungekuppelte 13C NMR-Spektrum der Verbindung der Formel (A3) (c 40 = 100 mg/400 Ul von Methanol-d*, T = 323 K, NS = 5000).

Fig. 9 zeigt das 13C NMR-Spektrum der Ammoniumacetat enthaltenden Verbindung der Formel (A3); das Spektrum wurde mit der Anwendung von EPT Puls-frequenz konstruiert, (c = 50 mg/400 ul von Methanol-d*, T = 323 K, NS = 2000).

Fig. 10 zeigt das normale proton-ungekuppelte 13C NMR-Spektrum der Ammoniumacetat enthaltenden 45 Verbindung der Formel (A3) (c = 50 mg/400 ul von Methanol-d4, T = 323 K, NS = 2700).

Fig. 11 zeigt das normale proton-ungekuppelte 13C NMR-Spektrum der Verbindung der Formel (Ai) (c = 80 mg/400 ul von Methanol-d*, T = 323 K, NS = 2700).

Die folgenden Folgerungen können aus den Spektraldaten gezogen werden: Während der Reaktion, die bei der Herstellung des wasserlöslichen Primycins angewendet wird, geschieht kein Ringschluss. Auf Grund des 13C NMR-Spektrums ist es eindeutig, dass das untersuchte Molekül vier quaternäre Kohlenstoffatome enthält. Das Signal des Carbonyl-Kohlenstoffs erscheint bei 176,7 ppm. Das Signal des quaternären Kohlenstoffatoms in der Guanidingruppe erscheint bei 158,8 ppm, wogegen die Signale der weiteren zwei quaternären Kohlenstoffatome bei 145,7 und 135,8 ppm erscheinen (Fig. 6). Falls ein Ringschluss entstanden wäre, wären zwei weitere quaternäre Kohlenstoffatome in dem NMR-Spektrum erschienen.

Dem NMR-Spektrum entsprechend ist es sehr wahrscheinlich, dass in der Quasi-Kondensationsreaktion ein Intermediär geformt wird (Fig. 6, Signal bei 170,4 ppm, was das Signal eines quaternären Carbonyls sein kann). Dieses Signal erscheint nur dann, wenn das wasserlösliche Primycin von wasserfreien (absolu- 7

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Es folgt aus dem oben Angeführten, dass die empirischen Formeln der Hauptkomponenten des is wasserlöslichen Primycins mit den in der Literatur behandelten praktisch identisch sind. In dem NMR-Spektrum des wasserlöslichen Primycins können die Signale von zwei Epimeren unterschieden werden, die infolge der abweichenden sterischen Stellung der -OH, -CH3 und Butylgruppen als Doublets (Doppelsignale) erscheinen. -OH-Gruppen erscheinen in den Stellungen 4, 8; 12, 16, 28, 30, 32, 34, 36 und 21' der Molekel. 20 -CH3-Gruppen erscheinen in den Stellungen 3,15, 21, 23 und 20' der Molekel, und die n-Butyl-Gruppe erscheint in der Stellung 17 der Molekel.

Das 13C NMR-Spektrum des erfindungsgemäss hergestellten Zweikomponentengemisches ist in Fig. 7 angegeben.

Beim Vergleich der Figuren 6 und 7 kann es festgestellt werden, dass die Mengenverhältnisse der 25 Hauptkomponenten umgekehrt sind; wasserlösliches Primycin enthält die Verbindung der Formel (A3) in grösserer Menge (siehe Fig. 6), wogegen in dem Zweikomponentengemisch die Verbindung der Formel (Ai) dominiert. Das entspricht den Ergebnissen der Dünnschichtchromatographie (siehe Fig. 5).

Es folgt aus den in den Figuren 10 und 11 angegeben 13C NMR-Spektren, dass die Anzahl der in den zwei Hauptkomponenten der Formeln (A3) und (Ai) anwesenden Kohlenstoffatome praktisch gleich ist, mit 30 der Bemerkung, dass infolge der oben behandelten Unsicherheiten die Anzahl der sekundären (CH2) Kohlenstoffatome um eins verschieden sein kann.

Der kleine, manchmal vernachlässigbare Unterschied in der chemischen Verschiebung der Kohlenstoffatome in gleichen Stellungen in den zwei Hauptkomponenten kann darauf hinweisen, dass es keinen wesentlichen Unterschied zwischen den zwei Hauptkomponenten gibt; eventuell kann eine Konformationsdif-35 ferenz oder eine Monomer-Dimer Wechselwirkung entscheidend sein. (Fig. 8).

Die Einzelheiten der Erfindung (Stoffe und Methoden) und die Beispiele zur Illustration der Erfindung werden nachstehend angegeben.

Stoffe und Methoden 40

Alle in den Beispielen angewendeten Lösungsmittel und Chemikalien waren feine Chemikalien von höhster analytischer Reinheit (hergestellt von Merck, Fluka, Reanal, Whatman, Macherey-Nagel Co., Sigma). Manche Lösungsmittel wurden von uns gereinigt oder neu gereinigt (in absolutes Mittel verwandelt). Die wasserfreien Lösungsmittel wurden über einem Molekülsieb (Ausgangsdurchmesser 3-4 Ä) 45 gelagert.

Die folgenden Substanzen wurden als Adsorbentien für die Säulenchromatographie verwendet:

Kieselgel 60 (Partikelgrösse: 0,062-0,2 mm oder 0,2-0,5 mm), Carboxymethyl-cellulose MN 2100 CM (Macherey-Nagel), CM-52, Presswolle, microgranular (Whatman).

Die folgenden Substanzen wurden als Adsorbentien bei der Dünnschichtchromatographie verwendet: 50 DC Alufolien Kieselgel 60 F254 20x20 cm/0,2 mm (Merck No. 5554), DC Plastikfolien Kieselgel 60 F254. 20x20 cm/0,2 mm (Merck No. 5735),

Polygram Sil. G/UV254 20x20 cm/0,25 mm (Macherey-Nagel).

Die Flüssigkeitschromatographie wurde mit einem Gilson Medical Electronics Apparat, ausgerüstet mit einem Differential-Spektrophotometer (Holochrome HM type UV Monitor), mit einem Model 201 Fraktions-55 ammler, mit einem Model N2 Registrator und mit einer Minipuls-2 peristaltischen Pumpe, durchgeführt.

Die Dünnschichtchromatogramme wurden mit einem modifizierten Vanillin-Schwefelsäure Reagens detektiert. 250 mg Vanillin (pro anal. Qualität) wurde in 100 ml absolutem Äthanol gelöst, die Lösung wurde auf -10 *C gekühlt, und 2,5 ml cc. Schwefelsäure wurden tropfenweise zu gegeben. Die Lösung wurde auf 8

AT 398 975 B die Platte gesprüht (mit der Anwendung von Nitrogen als Treibgas) oder die Platte wurde in die Reagenslösung getaucht. Die Platten wurden in kaltem Luftstrom getrocknet und danach 1-2 Minuten lang bei 105 *C aktiviert.

Die Sakaguchi-Reaktion wurde auf zweifache Weise durchgeführt: (i) Die entsprechend getrockneten Platten wurden ohne Erwärmung mit einer 0,2 % Aceton enthaltenden 8-Hydroxy-chinolin-Lösung behandelt, die Platten wurden in kaltem Luftstrom getrocknet, danach wurde eine 0,5 N Natriumhydroxid-Lösung mit 0,2 % Bromgehalt auf die Platten gesprüht, und die Platten wurden ohne Erwärmung getrocknet. (ii) 2,5 g Natriumhydroxyd wurden in 5 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf 2-5 * C gekühlt, mit 45 ml vorgekühltem Methanol verdünnt, filtriert, und 50 mg 8-Hydroxy-chinolin wurden im Filtrat aufgelöst. Die erhaltene Lösung war das erste Reagensgemisch. Das zweite Reagensgemisch wurde durch die Auflösung von 250 mg N-Bromsukzinimid in 50 ml auf 2-5 °C gekühltem 10 %-igem wässrigem Äthanol hergestellt. Die Platten wurden mit dem Reagensgemisch wie unter Punkt (i) oben beschrieben behandelt.

Die Sakaguchi-Reaktion wurde auch für die Detektierung von Primycin in Lösungen angewendet. In diesen Untersuchungen wurde die in der Literatur behandelte mikrochemische Methode mit den folgenden Abänderungen angewendet: Die Messungen wurden mit N-Bromsukzinimid durchgeführt. Die Standard-Verdünnungsreihe wurde auf Arginin durchgeführt, und die entstandene Farbendichte wurde mit einem Opton-Spektrophotometer bei 520 nm gemessen. Die folgenden Reagenzien wurden immer in frisch hergestellter Form angewendet: (1) 0,01 %-ige alkalische β-Naphthol-Lösung (hergestellt durch die Verdünnung einer 0,2 %-igen äthanolischen Lösung von «-Naphthol mit einer 10 %-igen wässrigen Natriumhydroxyd-Lösung), (2) 0,45 %-ige N-Bromsukzinimid (NBS)-Lösung in 10 %-igem wässrigem Äthanol, und (3) 40 %-ige wässrige Karbamid-Lösung.

Die Bestimmungen wurden bei 0 °C durchgeführt. Im Gegensatz zu den Angaben der Literatur war der Rauminhalt des Reaktionsgemisches 1,7 ml, und das Reaktionsgemisch bestand aus den folgenden Komponenten: zur Untersuchung angewendete Lösung 1 ml alkalische e-Naphthol-Lösung 0,4 ml NBS Reagenslösung 0,1 ml Karbamid-Lösung 0,2 ml

Es ist gut bekannt, dass die Sakaguchi-Reaktion auf verschiedene Alkohole und im allgemeinen auf Oxo-Verbindungen sehr empfindlich ist. So z.B. mit Primycin ergibt sogar ein Alkoholgehalt von 20% (Methanol, Äthanol) eine erhebliche Abnahme der bei 520 nm gemessenen Extinktion. Diese Abnahme steht aber nicht im Zusammenhang mit der entstandenen Farbendichte, sondern mit ihrer spektralen Verschiebung (Verschiebung zu den niedrigeren Wellenlängen). Falls Primycin nicht in reinem Wasser, sondern in einem organischen Lösungsmittel oder in einem organischen Lösungsmittelgemisch (wie z.B. in einem 1:1:2 v/v Gemisch von Butanol, Äthanol und Wasser) aufgelöst wird, kann das durch die Sakaguchi-Reaktion ausgebildete charakteristisch gefärbte Produkt quantitativ in die Butanolphase ausgezogen werden; die maximale Absorption der Farbe in dieser Phase ist bei 480 nm. Für die biologische Bewertung des Primycins wurde Agardiffusionstechnik angewendet. Als Testorganismus wurde Bacillus subtilis ATCC 6633 angewendet.

Der Bacillus subtilis ATCC 6633 wurde auf einem Schaeffer-Medium (Nutrient Broth No. 2/oxoid) der folgenden Komposition gezüchtet:

Rindfleisch-Extrakt 3,2 g Pepton 3,2 g NaCI 1,6 g MgS0*.7H20 0,25 g KCl 1,0 g FeSO<..7H20 278 ug (10~6 Mol) in 900 ml Wasser gelöst. 9

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Die Lösung wurde in einem Gefäss unter 1,5 atm Druck 30 Minuten lang erwärmt, danach wurde das pH auf 7,0-7,2 mit 5-6 Tropfen von 10N Natriumhydroxid-Lösung eingestellt, je 90 ml Portionen der Lösung wurden in Kulturgefässe ausgegossen, und die folgenden Lösungen wurden in einer Menge von je 10 ml jeder Portion zugegeben: a) 236 mg (10-3 Mol) Ca(NC>3)2.4H20 in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und b) 1979 mg (10~5Mol) MnCl2.4H20 in 100 ml destilliertem Wasser gelöst.

Das Titrierungs-Nährmedium wurde folgenderweise hergestellt: 5 g Fleischextrakt (Beef Extract Difco), 0,5 g Pepton (Bacto Peptone Dico), 1 g ΝθςΗΡΟ* und 0,1 g KH2PO4. wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, die Lösung wurde 2 Stunden lang gekocht, danach wurde das pH auf 8 eingestellt. Die warme Lösung wurde filtriert, auskühlen gelassen, das Filtrat wurde mit 900 ml destilliertem Wasser verdünnt, und 20 g Agar (Bacto Agar Difco) in einem Koch-Topf gelöst wurden zu 1 Liter der Lösung gegeben. Das pH der warmen Lösung wurde kontrolliert. 100 ml Portionen der erhaltenen Lösung wurden in Lagerkolben gefüllt und danach in einem druckbeständigen Gefäss unter einem Druck von 1,5 atm 20 Minuten lang einer Wärmebehandlung unterworden.

Die Titrierungsplatten wurden aus dem obigen Nährungsmedium folgenderweise hergestellt: 100 ml des Nährmediums wurden am Wasserbad geschmolzen, auf 40-50 · C gekühlt, und 0,5 ml einer Sporensuspension des Bacillus subtilis ATCC 6633 wurden vorsichtig dem noch flüssigen Nährmedium zugemischt. Das inokulierte Nährmedium wurde in eine Glaspfanne von 30x30x3 cm Abmessungen gefüllt, die aus 3-4 mm dicken Glasplatten zusammengestellt wurde. Die verfestigte Agarplatte wurde bei 37 · C 0,5-1 Stunden lang vorinkubiert, danach wurden 42 Löcher von 10 mm Durchmesser in die Platte geschnitten. Lösungen mit einem Wirkstoffgehalt von 20-50 ug/ml wurden aus den zu untersuchenden Substanzen [wasserunlösliches Ausgangsprimycin, wasserlösliches Primycin, Gemisch der Verbindungen der Formeln (Ai) und (A3); Verbindung der Formel (Ai); Verbindung der Formel A3)] in Wasser oder in einem 1:1:2 v/v Gemisch von Butanol, Äthanol und Wasser hergestellt, die erhaltenen Lösungen wurden mit gepuffertem destilliertem Wasser (0,15 M Phosphat-Puffer, pH = 7,6) auf Konzentrationen von 0,05-0,1, 0,5-1,0 und 2,0 u.g/ml verdünnt. 0,1 ml Portionen der erhaltenen Lösungen wurden in die Löcher der Agar-Titrierplatten gefüllt, und die Agar-Platten wurden in einem Thermostat bei 37 *C 18-20 Stunden lang inkubiert. Danach wurden die Durchmesser der diffusiven Extinktionszonen in mm gemessen, die erhaltenen Werte wurden auf einer semilogarithmischen Skala gegen die Standard-Verdünnungsreihe abgebildet, und die Aktivitätswerte wurden durch Extrapolation bestimmt.

Beispiel 1

Herstellung von wasserlöslichem Primycin 500 mg (0,46 mMol) von fein pulverisiertem (mit Blei verunreinigtem) Primycin und 100 ml absoluter Äthanol wurden in einen Kugelkoiben von 250 ml Inhalt gefüllt. Der Kolben wurde mit einem Rückflusskühler gekuppelt, der mit einem CaCfe und Sodakalk gefülltem Trocknungsrohr versehen wurde, und das Gemisch wurde so lang unter dem Rückflusskühler gesiedet, bis die maximale Auflösung erreicht wurde (etwa 15-30 Minuten). Danach wurden 50 ul (0,46 mMol) Äthylcyanoacetat dem Gemisch zugegeben; das Reagens wurde mit wenig absolutem Äthanol in den Kolben gewaschen. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang refluxiert, dann wurden 25 mg (0,46 mMol) Natrium-methoxyd in drei gleichen Portionen mit Abständen von 30 Minuten dem Gemisch zugegeben. Die einzelnen Portionen wurden mit 1-2 ml destilliertem (96 %) Äthanol in den Kolben gewaschen. Bereits nach der Zugabe der ersten Portion des Natrium-methoxyds begann das Reaktionsgemisch reiner zu werden, danach wurde die ganze Menge des Primycins aufgelöst und das Reaktionsgemisch wurde blass rosenfarbig. Am Ende der Reaktionszeit (4 Stunden) wurde das Gemisch abkühlen gelassen, durch einen gesinterten GH Glasfilter filtriert, und in einem Rotavapor R 110 (Büchi) Apparat zu einer kleinen Menge eingeengt. Danach wurde der Äthanolgehalt des Reaktionsmediums stufenweise für Methanol derart ausgetauscht, dass die getrennte Substanz in absolutem Methanol aufgelöst wurde, das Lösungsmittel verdampft, und die ganze Operation wiederholt wurde. Durch diese Behandlung wurde die Substanz, die eine begrenzte Löslichkeit in Äthanol hat, in Methanol gut löslich, und blieb sogar in einigen Millilitern von Methanol gelöst. Dann wurde das Produkt von dem methanoiischen Konzentrat mit absolutem Äther ausgeschieden. Die getrennte Substanz wurde durch einen gesinterten G4 Glasfilter filtriert, mit absolutem Aceton gewaschen, und in einer Vakuum-Trocknungspistole ("Blaugel", Chloroform/Äthanol, Siedep.: 65-70 · C) getrocknet. 410 mg (82 %) wasserlösliches Primycin wurden erhalten; sein Dünnschichtchromatogramm ist in Fig. 5 angegeben. Wasserlöslichkeit: 50 mg/ml, Schmp.: 162-164 ”C, biologische Aktivität (am Bacillus subtiiis): 0,08-0,2 u.g/ml. 10

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Beispiel 2

Herstellung des Zweikomponentengemisches der Primycin-Komponenten der Formeln (Ai) und (A3)

Das in Beispiel 1 beschriebene wasserlösliche Primycin wurde als Ausgangssubstanz angewendet. Die Hauptkomponenten des Primycins wurden durch Säulechromatographie auf Silicagel getrennt. Das Silicagel (Kieselgel 60, Partikelgrösse: 0,2-0,5 mm) wurde durch wiederholtes Waschen mit deionisiertem Wasser und durch Dekantieren gereinigt. Vor dem Einfüllen wurde die homogene Suspension im Vakuum blasenfrei gemacht.

Das Silicagel wurde in eine Pharmacia Säule der Abmessungen von 2,6 x 230 cm (und mit einem Flow-Adapter versehen) eingefüllt. Eine 5-10 mg/ml wässrige Lösung von 500 mg der Ausgangssubstanz, die durch einen gesinterten G3 Glasfilter filtriert wurde, wurde fortlaufend durch den Flow-Adapter auf die Säule gebracht. Danach wurde die Säule mit Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 130 ml/Stunde {= 25 ml/Stunde/cmz) eluiert, und die Effluent-Fraktionen von je 24 ml wurden gesammelt. Die Bedingungen der Chromatographie und das Elutiogramm sind in Fig. 3 angegeben.

Die Elution wurde danach mit einer 1 %-igen wässrigen Lösung eines Partridge-Gemisches (Partridge-Gemisch ist die obere Phase eines 38:2:10:50 v/v Gemisches von n-Butanol, Äthanol, Essigsäure und Wasser) fortgesetzt. Die einzelnen Spitzenfraktionen wurden mit Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Die zwei Komponenten enthaltenden Spitzenfraktionen wurden gesammelt, eine kleine Menge von n-Butanol (zum Verhindern der Schäumung) wurde zugegeben, die Lösung wurde in einem Rotavapor-Apparat konzentriert, das Konzentrat wurde stufenweise zuerst mit destilliertem Methanol, danach mit absolutem Methanol dehydratisiert. Das erhaltene Konzentrat wurde mit absolutem Äther behandelt, die ausgeschiedene Substanz wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen und in einer Trocknungspistole getrocknet. 260 mg (52 %) einer festen Substanz wurden erhalten; Schmp.: 165-168 °C, Wasserlöslichkeit: 50 mg/ml, biologische Aktivität (am Bacillus subtilis): 0,05-0,1 ug/ml.

Beispiel 3

Herstellung der Komponente der Formel (A3)

Das in Beispiel 2 beschriebene wasserlösliche Zweikomponentengemisch wurde als Ausgangssubstanz angewendet. Die Komponenten wurden von einander mit ionenaustauschchromatographie auf Carboxyme-thylcellulose in NHj -Cykius getrennt. CM52 Cellulose (Presswolle, microgranular, Whatman) in H+-Cyklus wurde in Wasser suspendiert, mit 1 molarer wässriger Ammoniumhydrocarbonat-Lösung behandelt, mehrmal mit Wasser gewaschen, dekantiert, und um die Blasen zu entfernen, im Vakuum behandelt. Dieses Adsorbent wurde in eine Pharmacia-Säule (2,6x6 cm), die mit einem Flow-Adapter ausgerüstet wurde, eingefüllt. 450 mg des Zweikomponenten-Ausgangsgemisches wurden auf die Säule als eine 4,5 mg/ml wässrige Lösung durch den Flow-Adapter aufgetragen. Die Eluierung wurde bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde (= 29 ml/Stunde/cm2) durchgeführt, und die Effluentfraktionen von je 24 ml wurden gesammelt. Die Bedingungen der Chromatographie und das Elutiogramm sind auf Fig. 4 angegeben.

Die Säule wurde zuerst mit Wasser eluiert (gewaschen). Nach vollständigem Waschen wurde die Elution mit einer 5 molaren wässrigen Ammoniumhydrocarbonat-Lösung fortgesetzt. Die Spitzenfraktionen dieses Eluats enthalten die reine, homogene Komponente der Formel (A3). Die Ammoniumhydrocarbonat-Fraktionen, die die Verbindung der Formel (A3) als Einzelkomponente enthalten, wurden gesammelt, ein wenig n-Butanol wurde zugegeben, und das Gemisch wurde beinahe zur Trockne eingedämpft. Das Wasser wurde zwecks Entfernung des flüchtigen Ammoniumhydrocarbonats aus dem Rückstand wiederholt verdampft, danach wurde das Konzentrat zuerst mit destilliertem Methanol, dann mit absolutem Methanol dehydratisiert. Schliesslich wurde die Substanz aus dem Konzentrat mit absolutem Äther ausgeschieden. Die getrennte Substanz wurde auf einem gesinterten G4 Glasfilter abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. 190 mg (42 %) der Verbindung der Formel (A3) wurden erhalten; Schmp.: 159-161 *C, Wasserlöslichkeit: etwa 5 mg/ml (diese Abnahme in der Wasserlöslichkeit kann der Anwesenheit von gebundene NH4 und von Ammoniumhydrocarbonat-Resten zugeschieben werden), biologische Aktivität (am Bacillus subtilis): 0,5-1 u.g/ml.

Wie oben erwähnt, wurde die Substanz einer wiederholten lonenaustausch-Chromatographie auf Car-boxymethyl-Cellulose in H+-Cyklus unterworfen, damit die Verunreinigungen, die ihre Wasserlöslichkeit vermindern, entfernt werden. Die Substanz wurde auf die Säule als eine 2-4 mg/ml wässrige Lösung gebracht, die Säule wurde vollständig mit Wasser ausgewaschen und danach stufenweise dehydratisiert, 11

Claims (4)

1. AT 398 975 B zuerst mit destilliertem Methanol, dann mit absolutem Methanol. Die Substanz wurde mit 10 mMol Essigsäure enthaltendem absolutem Methanol eluiert. Das Effluent wurde durch einen gesinterten G4 Glasfilter oder durch eine Whatman Glasfaserplatte filtriert, das Filtrat wurde zu kleiner Menge eingeengt, und das Produkt wurde aus dem Konzentrat mit absolutem Aceton ausgeschlagen. Danach wurde der in 5 vorigem Absatz beschriebenen Methode gefolgt. Eine reine Verbindung der Formel (A3) wurde erhalten; Schmp.: 164-166 *C (im Gegensatz zum Anfangswert von 159-161 °C), Wasserlöslichkeit: 40-50 mg/ml. Die wiederholte lonenaustauschchromatographie ergab einen Materialverlust von höchstens 10 %. Beispiel 4 10 Herstellung der Komponente der Formel (Ai) Die Komponente der Formel (A3) wurde der in Beispiel 3 beschriebenen Methode entsprechend eluiert, wohingegen die Komponente der Formel (Ai) auf der Carboxymethylcellulose-Säule im NHt -Cyklus 75 gebunden bleibt. Die Komponente der Formel (Ai) wurde folgenderweise von der Säule entfernt. Die Säule wurde zwecks vollständiger Entfernung des Ammoniumhydrocarbonats mit Wasser gewaschen, danach wurde sie stufenweise dehydratisiert, zuerst mit destilliertem Methanol, danach mit absolutem Methanol. Danach wurde die Komponente der Formel (Ai) mit 10 mMol Essigsäure enthaltendem absolutem Methanol eluiert. Die Effluenten wurden gesammelt, durch einen gesinterten G4 Glasfilter filtriert, 20 zu kleiner Menge verdampft, danach wurde das Produkt aus dem Konzentrat mit absolutem Aceton ausgeschieden. Darauffolgend wurde der in Beispiel 3 beschriebenen Methode gefolgt. 150 mg (33 %, auf die Menge der in Beispiel 3 angewendeten Ausgangssubstanz berechnet) der Komponente der Formel (Ai) wurden erhalten; Schmp.: 164-168 °C, Wasserlöslichkeit: 50 mg/ml, biologische Aktivität (am Bacillus subtilis): 0,03-0,06 ug/ml. 25 Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichem Primycin und zur Trennung seiner Komponenten der Formeln (Ai) und (A3), entweder als Einzelkomponenten oder als Gemisch der zwei Komponenten, 30 dadurch gekennzeichnet, dass (i) das wasserunlösliche Primycin in einem C1-3 Alkohol, vorzugsweise in Äthanol, mit einer kondensierbaren Substanz, die eine C-C-C Brücke enthält, vorzugsweise mit Äthylcyanoacetat, in der Anwesenheit von Natrium- oder Kaliummethoxyd oder -äthoxyd, vorzugsweise von Natriumme-thoxyd, umgesetzt, das Endprodukt mit einer Wasserlöslichkeit von 40-60 mg/ml abgetrennt wird, 35 und falls erwünscht. (ii) die entstandene Substanz der Säulechromatographie auf Silicagel unterworfen wird, wobei als Eluiermittel eine 1 %-ige wässrige Lösung eines Partridge-Gemisches 'angewendet wird, um ein Gemisch zu bekommen, das aus den Komponenten der Formel (Ai) und (A3) mit einer Wasserlöslichkeit von 50 mg/ml besteht, und falls erwünscht, 40 (iii) das entstandene Zweikomponenten-Gemisch einer lonenaustausch-Chromatographie unter Ver wendung von Carboxymethyl-cellulose in Ammonium-Zyklus als Adsorbens unterworfen wird, wonach das Adsorbens mit wässriger Ammoniumhydrocarbonat-Lösung eluiert wird, wodurch die Komponente der Formel (A3) mit einer Wasserlöslichkeit von etwa 50 mg/ml in reiner Form erhalten wird, und falls erwünscht, 45 (iv) die Eluierung mit etwa 10 mMol Essigsäure enthaltendem absolutem Methanol fortgesetzt wird, wodurch die Komponente der Formel (Ai) mit einer Wasserlöslichkeit von 10 mg/ml in reiner Form gewonnen wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Äthyl-cyanoacetat als eine kondensieba- 50 re Substanz mit einer C-C-C Brücke in Schritt (i) eingesetzt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Äthanol als ein Ci -3 Alkohol in Schritt (i) eingesetzt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (i) in der Anwesenheit von Natrium-methoxyd durchgeführt wird. 12 AT 398 975 B Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (i) in der Anwesenheit von 15-20 ppm einer löslichen Bleiverbindung durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass Bleiacetat als lösliche Bleiverbindung eingesetzt wird. Ein pharmazeutisches oder veterinäres Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff wasserlösliches Primycin oder ein wasserlösliches Gemisch der Komponenten der Formeln (Ai) und (A3) oder eine wasserlösliche Einzelverbindung der Formeln (Ai) oder (A3) zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln oder anderen Hilfsstoffen enthält. Hiezu 13 Blatt Zeichnungen 13