IT8922446A1 - Procedimento per la preparazione di primicina idrosolubile e suoi componenti e composizioni farmaceutiche che li contengono. - Google Patents

Description

l'eluzione viene continuata con metanolo assoluto comprendente 10 mmoli di acido acetico per ottenere il componente della formula (A1) con una solubilit? in acqua di 10 mg/ml in forma pura.

TESTO DELLA DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un procedimento per la preparazione di primicina solubile in acqua e la separazione dei suoi componenti individuali. L'invenzione riguarda anche composizioni farmaceutiche e veterinarie comprendenti primicina solubile in acqua o suoi componenti come ingredienti attivi.

La primicina ? un antibiotico ampiamente applicato con forte attivit? antimicrobica. La sua formula empirica ? stata descritta da J. Aberhart et. al. [J. Am. Chem. Soc. 92, 5816 (1970)]; gli autori hanno anche dato la supposta formula strutturale della primicina. Ricerche successive hanno tuttavia rivelato che l'antibiotico primicina ? una miscela comprendente tre componenti principali ed almeno dieci componenti minori [J. Chromatogr. 295, 141-151 (1984)]. Il termine primicina ogni volta che esso ? usato nella descrizione e nelle rivendicazioni, si riferisce a questa miscela a molti componenti; i componenti individuali della miscela vengono contrassegnati da specifiche lettere di codice.

Molti lavori trattano la preparazione della primicina e dei suoi componenti, tra i quali oltre alle referenze citate sopra, vengano menzionati i brevetti ungheresi N?146.332, 153.593, 158.241, 177.299, 194.493 e 195.514. La primicina ed i suoi componenti preparati in conformit? di tutti i metodi fino ad ora noti sono scarsamente solubili in acqua, il che comporta diverse difficolt? quando li si applichi in terapia, poich? permette di preparare composizioni farmaceutiche con contenuto di sostanza attiva piuttosto basso (cosi per esempio il contenuto di sostanza attiva del ben noto gel Embrimicina contenente primicina ? soltanto dello 0,Z%). Come ulteriore svantaggio, la separazione dei componenti individuali della primicina richiede operazioni lunghe e sofisticate.

Lo scopo della presente invenzione ? quello di convertire la primicina preparata per esempio come descritto nei brevetti ungheresi N?146.332 e 153.593, in una sostanza idrasolubile mediante un metodo semplice ed economico. Lo scopo dell'invenzione ? inoltre quello di separare due dei componenti principali della primicina o individualmente oppure come miscela mediante una semplice operazione.

In conformit? della presente invenzione si procede come segue: (I) la primicina insolubile in acqua viene fatta reagire in un alcool , preferibilmente in etanolo, con una sostanza condensabile comprendente un ponte C-C-C, preferibilmente con etilcianoacetato, in presenza di metossido od etossido di sodio o di potassio, preferibilmente metossido di sodio, si separa il prodotto risultante con una solubilit? in acqua di 40-60 mg/ml e se lo si desidera, (II), la sostanza risultante viene sottoposta a cromatografia su colonna su gel di silice applicando una soluzione acquosa circa all'1% di miscela di Partridge come agente eluente per ottenere una miscela di componenti delle formule ed A1 con una solubilit? in acqua di circa 50 mg/ml, e se lo si desidera (III) la miscela risultante a due componenti viene soggetta a cromatografia a scambio ionico applicando carbossimetilcellulosa nel ciclo deH'ammonio come assorbente ed eluendo l'assorbente con soluzione di idrocarbonato di ammonio acquosa per ottenere il componente della formula A1 con una solubilit? in acqua di circa 50 mg/ml in forma pura, e se Io si desidera (IV) l'eluizione viene continuata con metanolo assoluto comprendente circa 10 millimoli di acido acetico per ottenere il componente della formula A1 con una solubilit? in acqua di circa 10 mg/ml in forma pura.

Sia la formula empirica e il cromatogramma su strato sottile della primicina idrosolubile ottenuta nella prima fase del metodo della presente invenzione, sono identici con quello della sostanza di partenza, l'unica differenza essendo il cambiamento radicale nella solubilit? in acqua. Le ragioni di questo fatto non sono state completamente spiegate, ma si ritiene che le posizioni eteriche dei gruppi -OH della primicina di partenza variano al trattamento in conformit? della presente invenzione, il che d? come risultato l'aumento improvviso della solubilit? in acqua. I due componenti principali della primicina, vale a dire i composti delle formule A1 ed separati dalla primicina risultante idrosolubile, sono anch'essi idrosolubili, e le loro formule empiriche sono le stesse di quelle descritte nella letteratura.

La primicina solubile in acqua ed i suoi componenti preparati in conformit? della presente invenzione possono essere applicati con vantaggio a scopo terapeutico, poich? essi mantengono gli eccellenti effetti antimicrobici delle corrispondenti sostanze insolubili in acqua, e permettono di preparare composizioni farmaceutiche con un contenuto molto pi? elevato di sostanza attiva rispetto a quanta noto in precedenza, per esempio soluzioni acquose comprendenti anche 50-100 mg/ml di agente attivo.

La presente invenzione riguarda anche composizioni farmaceutiche o veterinarie comprendenti come sostanza attiva primicina idrosolubile oppure una miscela idrosolubile dei componenti delle formule A1 ed oppure un singolo composto idrosolubile della formula A oppure A1 assieme con un veicolo, diluente od altro agente ausiliario farmaceuticamente accettabile.

Una descrizione pi? dettagliata del metodo della presente invenzione viene riportata appresso.

Primicina insolubile in acqua preparata in conformit? dei brevetti ungheresi N?146.332 e 153.593 viene applicata come sostanza di partenza nel metodo della presente invenzione. Questa sostanza ha propriet? ionofore.

Le nostre precedenti ricerche hanno rilevato che come funzione della concentrazione e del tempo, la primicina insolubile in acqua introdotta in una concentrazione d? 1-10 um oli/ml blocca i canali K di rilassamento della membrana superficiale dei muscoli scheletrici. Ci? risulta in una diminuzione del potenziale di membrana, che comporta anche la variazione funzionale del sistema contrattile. L'antibiotico primicina ha la caratteristica strutturale unica che ? una molecola con elevata complessit? comprende una parte componente guanidina ed una parte componente arabinosio; cosi sia gli effetti biologici che le caratteristiche fisico chimiche della molecola vengono determinati dai lattane macrolide tipo non pal?ene e dalle parti componenti guanidina ed arabinosio attaccate ad esso. Queste parti della molecola definiscono congiuntamente attraverso le loro propriet? antipatiche (vale a dire idrofile ed idrofobe) l'orientamento e il legame dell'antibiotico alla membrana. Si pu? anche presumere che la propriet? di formazione di canale della primicina ? commessa con la formazione di dimeri o polimeri pi? elevati.

Un rovesciamento parziale o completo delle suddette interazioni pu? influenzare considerevolmente anche la polarit? della molecola e cos? le sue condizioni di solubilit?. La protonazione parziale o completa della parte componente guanidina della molecola pu? influenzare considerevolmente la distribuzione superficiale di carica (polarit? lorda) che pu? sopprimere o anche aumentare direttamente od indirettamente l'apparizione di interazioni intermolecolari.

Per elaborare la prima fase del metodo secondo la presente invenzione si sono effettuati circa 150 esperimenti utilizzando reazioni di condensazione ampiamente applicate nella sintesi di composti con scheletro di pirimidina. Una caratteristica comune di queste reazioni ? che l'anello eteroaromatico ? formato da un composto contenente un ponte NCN oppure C-C-C.

Come composti col ponte C-C-C possono essere applicati per esempio propargilaldeide, etilformilacetato, etilcianoacetato, dinitrile dell'acido malonico, metiletinilchetone, acetilacetone ed esteri dell'acido formil-?etossipropionico, tra i quali etilcianoacetato ? risultato essere particolarmente preferibile. Come mezzo di reazione si possono applicare alcoli secchi (anidri) da 1 a 3 atomi di carbonio, la reazione viene effettuata preferibilmente in etanolo assoluto, che pu? essere preparato da etanolo pressiccato mediante la reazione di Grignard. Come regola generale i solventi secchi utilizzati negli esperimenti sono stati conservati su un setaccio molecolare (quale il setaccio molecolare Sigma con un diametro di pori di 3-4 A).

Come catalizzatore si pu? applicare metossido od etossido di sodio e di potassio e preferibilmente metossido di sodio.

Quando si utilizza etanolo come mezzo di reazione e si mantiene la miscela sotto riflusso, la reazione richiede circa 3-6 ore. Alla fine di questo tempo di reazione la miscela di reazione viene decolorata con carbone attivato (carbon dolce attivo Merk), filtrata (preferibilmente attraverso una carta microfibra di vetro GF/C Whatman) e parzialmente evaporata sotto vuoto. L'evaporazione pu? essere effettuata per esempio in un apparecchio Rotavapor R 110 (Buchi).

L'etanolo applicata come mezzo di reazione viene variato continuamente da metanolo secco durante la procedura di evaporazione, e quindi si aggiungono etere assoluto ed acetone al concentrato per far precipitare il prodotto. Si ottiene un solido bianco che viene polverizzato e conservato per 24 ore in una pistola di essiccazione sottovuoto (Blaugel, cloroformio/etanola 65?C) per ottenere un campione per l'identificazione e l'analisi.

I dati caratteristici della primicina idrosolubile risultante, confrontati con la sostanza di partenza Insolubile in acqua, vengono riassunti nella tabella I qui appresso.

TABELLA I

Dalla formula empirica della primicina idrosolubile risultante appare che la reazione di condensazione effettuata nelle condizioni della sintesi dei composti pirimidinici non risulta nella chiusura dell'anello, vale a dire che non si forma il supposto anello eteroaromatico. E' probabile che la reazione proceda attraverso la formazione di un intermedio che sostanzialmente cambia l?orientamento dei gruppi -OH dell'anello macrolide. Si presume che questo cambiamento risulta nell'aumento considerevole della solubilit? in acqua, ed anche questa variazione permette di separare i componenti principali mediante un'operazione relativamente semplice. Una spiegazione possibile di questo fenomeno verr? presentata appresso.

Il metodo della presente invenzione permette di preparare primicina idrosolubile in maniera riproducibile da primicina idrosolubile in acqua di qualsiasi origine, senza .alcuna precedente purificazione della sostanza di partenza. Si preferisce particolarmente applicare primicina insolubile in acqua contaminata con piombo come sostanza di partenza. Infatti ? stata osservato che la presenza di piombo influenza favorevolmente sia la resa della primicina solubile in acqua (che ? generalmente dell'80-85%) che la solubilit? in acqua massima ottenibile (che ? 50-100 mg/ml).

Sulla base della spettroscopia di assorbimento atomico (modello Perkin-Elmer) la primicina di partenza non purificata comprende circa 6-10 parti per milione di contaminazione di piombo. Se si utilizza come sostanza di partenza una primicina insolubile in acqua purificata di qualit? terapeutica (come la Ebrimicina) la resa di primicina idrosolubile diminuisce a circa 50-60%, e si pu? raggiungere una solubilit? massima in acqua soltanto di circa 5-10 mg/ml. Perci? se si applica una primicina insolubile in acqua purificata come sostanza di partenza, si preferisce aggiungere 15-20 parti per milione di piombo alla miscela di reazione sotto forma di un composto del piombo solubile, preferibilmente acetato di piombo.

La primicina idrosolubile ha un ulteriore caratteristica molto interessante. E' stato osservato che la sua soluzione acquosa gelifica spontaneamente, il tempo di gemicazione essendo dipendente dal contenuto di primicina della soluzione. La misura della gelificazione come funzione del tempo e della concentrazione di primicina, viene mostrata in Figura 1. Come appare dalle curve della Figura 1, la gelificazione completa di una soluzione acquosa di primicina di 5-10 mg/ml richiede circa 1-2 giorni, quella di una soluzione di primicina di 20-40 mg/mi richiede 6-12 ore, mentre una soluzione acquosa di primicina comprendente pi? di 50 mg/ml di primicina gelifica completamente anche entro 1-2 ore. L'effetto della temperatura sulla gelificazione viene mostrato in Figura 2. La gelificazione dipendente dalla concentrazione, dal tempo e dalla temperatura (polimerizzazione) pu? essere attribuita presumibilmente alle variazioni nell'orientamento dei gruppi OH nella molecola.

Il gel di primicina risultante ? completamente traslucido, stabile e non varia aggiungendo piti solvente ad esso. Questa propriet? di associazione favorevole di primicina idrosolubile permette di applicare geli polimerizzati a membrane essiccate per congelamento in campi terapeutici ove l'elevata concentrazione locale di sostanza attiva ? di importanza essenziale. Utilizzando questa propriet? formatrice di gel della primicina idrosolubile, si possono preparare molto facilmente composizioni farmaceutiche colloidali con contenuto di sostanza attiva altamente variabile senza applicare alcun agente di gelificazione particolare. L'uso di etanolo mescolato fino ad ora in modo dosato con preparazioni di primicina insolubili in acqua allo scopo diraggiungere un contenuta superiore di sostanza attiva, pu? anche essere evitato e cosi si possono eliminare gli effetti collaterali indesiderati dell'etanolo.

In un primo momento la primicina preparata in conformit? della presente invenzione differisce dalia sostanza di partenza soltanto per la solubilit? in acqua. Tuttavia a causa delle variazioni nelle propriet? di solvatazione, le condizioni di associazione e i cosiddetti rapporti di eterogeneit? possono anche cambiare, dopo di che la primicina (che ? una miscela a pi? componenti) diventa pi? accessibile per i successivi trattamenti. Questa ? la ragione per la quale si ? avuto successo nell'ottenere una miscela a due componenti e due componenti biologicamente attivi singoli e separati mediante un'operazione cromatografica ben riproducibile e relativamente rapida.

Per preparare una miscela di componenti di primicina delle formule ed ?3, la primicina idrosolubile preparata in conformit? della presente invenzione viene applicata come sostanza di partenza. La cromatografia viene effettuata su una colonna di gel di silice.

Le condizioni preferite per la cromatografia su colonna sono le seguenti: Kieselgel 60 (dimensione di particelle 0,063-0,2 mm oppure 0,02-0,5 mm) viene applicato come assorbente. Il gel viene lavato diverse volte con acqua deionizzata, la fase acquosa viene decantata e la sospensione di gel risultante viene resa priva di bolle sottovuoto. Una colonna farmacia (2,6 x 230 cm) equipaggiata con un adattatore di flusso viene applicata come colonna cromatografica. Il passaggio di flusso continuo viene mantenuto mediante una pompa peristaltica a 4 canali tipo Gilson miniplus-2. Un'attrezzatura Gilson per la cromatografia liquida, comprendente uno spettrofotometro differenziale modello M Holocrome, un raccoglitore di frazioni modello 201 e un registratore servopotenziometro a due canali modello viene applicata per raccogliere le frazioni e sorvegliare il corso della cromatografia in modo continuo. La primicina idrosolubile viene applicata sulla colonna come soluzione acquosa a 5-10 mg/ml. I picchi cromatografici vengono mostrati in Figura 3.

Dapprima la colonna viene eluita (lavata) con acqua dopo di che una parte sostanziale dei componenti minori della primicina (frazione A in Figura 3) pu? essere rimossa. Le frazioni di picco individuali vengono controllate mediante cromatografia su strato sottile utilizzata Merk DC Alufolien o DC Plastikfolien Kieselgel 60 F come lastra cromatografica, la fase superiore di una miscela 38:2:10:50 v/v di n-butanolo, etanolo, acido acetico ed acqua come solvente (miscela Partridge), e vanillina ed acido solforico a 105?C come agente di rilevamento.

La sostanza legata alla colonna che ? una miscela dei componenti delle farmule A1 ed A3 viene eluita quindi come una soluzione acquosa all'1% di miscela di Partridge indicata sopra. Come appare dalla Figura 3, i componenti minori residui vengono eluiti per primi, quindi viene eiuita una miscela pura di composti delle formule ed e quindi in corrispondenza dello stadio discendente del eluitogramma si eluisce una sostanza contaminate con un valore Rf superiore indicata come componente b nelle descrizioni di brevetto citate sopra).

Le frazioni di picco vengono raccolte, evaporate, gradualmente disidratate utilizzando metanolo distillato e quindi metanolo assoluto, e quindi si aggiunge una miscela di etere assoluto ed acetone al concentrato risultante per far precipitare il prodotto. Il prodotto precipitato ? una miscela di composti delle formule A1 ed A3; questa miscela ? un prodotto biologicamente attivo solubile in acqua. Essa viene ottenuta generalmente con una resa di 50-60% calcolata per la primicina idrosolubile di partenza. La miscela a due componente fonde a 165-16B?C.

Successivamente si ? tentato di separare i composti delle formule A1 e in stato puro dalla loro miscela. Le precedenti ricerche hanno mostrato che le caratteristiche di assorbimento di queste due componenti principali sono quasi le stesse, ma la loro separazione completa appare essere un'operazione lunga e sofisticata che comporta una notevole perdita di materiale.

Nei lavori di ricerca diretti ad investigare il meccanismo deH'effetto della primicina si ? sempre attribuita un'importanza essenziale alle variazioni nella struttura di carica della molecola. Qualsiasi variazione nella struttura di carica pub modificare sostanzialmente (1) l'orientamento di membrana della molecola di primicina, vale a dire soltanto un orientamento individuale pu? assicurare per esempio la separazione degli effetti antibatterici etossici e (2) le propriet? di assorbimento della molecola e dei componenti individuali della primicina.

Le precedenti prove gelcromatografiche effettuate con primicina solubile in acqua su Sephadex LH-20 hanno indicato che una variazione nella polarit? e le condizioni associate possono influenzare notevolmente l?eterogeneit? della primicina. In altre parole il rapporto dei componenti individuali presenti nelle frazioni di picco dipende dalle propriet? dielettriche del sistema solvente applicato. Sulla base di queste osservazioni si ? tentato di separare i componenti individuali della miscela ottenuti come descritto sopra mediante cromatografia di scambio ionico. Un metodo preferita risultante in una separazione completa dei componenti delle formule e viene riportato appresso.

La miscela solubile in acqua dei componenti delle formule A1 e A3 preparata come descritto sopra viene applicata come sostanza di partenza. Una soluzione acquosa di 4-5 mg/ml di questa miscela a due componenti viene applicata su una colonna di carbossimetilcellulosa nel ciclo NH4<+ >(cellulosa Whatman CM-52, lana pressata). Una colonna farmacia K- 26 (2,6 x 5 cm) equipaggiata con un adattatore di flusso viene utilizzata come colonna. Le condizioni di cromatografia e l'eluitDgramma vengono ripartati nella Figura 4.

La colonna viene lavata dapprima con acqua per rimuovere i componenti minori residui (A) e quindi l'eluizione viene continuata con una soluzione acquosa 5-8 molare di idrocarbonato di ammonio per ottenere il componente puro della formula A3 I componente della formula A1 rimane legato alla colonna. Gli effluenti di idrocarbonato di ammonio vengono raccolti, si aggiunge una piccola quantit? di n-butanolo (agente antischiumogeno) e la miscela viene evaporata quasi fino a secchezza. Il lavaggio con acqua e l'evaporazione vengono ripetuti diverse volte per togliere l'idrocarbonato di ammonio, dopo di che il residuo viene , completamente disidratato evaporando dapprima a metanolo distillato e quindi metanolo assoluto dal residuo. Il concentrato risultante viene trattato con etere assoluto per far precipitare il prodotto, il solido separato viene filitrato via e lavato con una piccola quantit? di acetone secco

II solido risultante fonde a 159-161?C e viene ottenuto con una resa di 40-50% calcolata per la miscela a due componenti di partenza. La solubilit? in acqua della sostanza risultante ? di circa 2-6mg/ml. La diminuzione nel punto di fusione (quello della miscela di partenza ? 165-168?C) e nella solubilit? in acqua (che nella miscela di partenza ? di 40-60 mg/ml) pu? essere attribuita alla presenza di quantit? minori di NH4 legata e di contaminazioni di idrocarbonato di ammonio.

Per rimuovere queste contaminazioni la sostanza risultante viene sciolta in acqua, la soluzione viene applicata su una colonna di carbossimetilcellulosa nel ciclo H , la colonna viene completamente lavata con acqua e quindi gradatamente disidratata dapprima con metanolo distillato e quindi con metanolo assoluto. Dopo di cib la sostanza viene eluita con metanolo assoluto comprendente 10 mmoli di acido acetico. L'effluente viene evaporato fino ad un piccolo volume, metanolo assoluto viene aggiunto al concentrato e l'evaporazione viene ripetuta diverse volte, e quindi il prodotto viene precipitato dal concentrato con acetone assoluto. La sostanza separata viene filtrata attraverso un filtro di vetro sinterizzato G4, lavata ripetutamente con acetone ed essiccata.

In questa maniera si ottiene un composta della formula allo stato puro, che fonde a 164-166?C. La solubilit? in acqua del composto della formula A1 ? di circa 50 mg/ml. La cromatografia a scambio ionico ripetuta si esegue con una perdita di materiale massima al 10%.

II secondo componente della miscela di partenza a due componenti, vale a dire il composto della formula A1 che rimane legato alla colonna di carbossimetilcellulosa CM-52 nel ciclo NH4 dopo l'eluizione con idrocarbonato di ammonio acquoso, viene separata come segue:

la colonna viene lavata con acqua per rimuovere completamente l'idrocarbonato di ammonio, e quindi gradatamente disidratata dapprima con metanolo distillato e quindi con metanolo assoluto. La sostanza delimitata viene quindi eluita con metanolo assoluto comprendente 10 immoli di acido acetico. L'effluente viene evaporato ad un piccola volume, il metanolo assoluto viene aggiunto al concentrato e l'evaporazione viene ripetuta diverse volte per rimuovere l'acido acetico, e quindi acetone assoluto viene aggiunto al concentrato per far precipitare il prodotto.

In questa maniera il componente della formula viene ottenuto sotto forma di solido puro che fonde a 167-168?C. Il composto ? ben solubile in acqua. Nessuna successiva cromatografia di scambio ionico ? necessaria per purificare questo componente, poich? nella fase di eluizione di acido acetico il residuo e l' NH4 legato nonch? qualsiasi idrocarbonato di ammonio presente vengono eluiti come acetato di ammonio, e questo composto rimane sciolto nella fase di precipitazione dell'acetone.

Cos? partendo da una primicina insolubile in acqua secondo la presente invenzione si prepara una primicina solubile in acqua dalla quale se lo si desidera si pu? preparare una miscela idrosolubile dei componenti delle formule ed A1, e si possono anche separare i componenti individuali di questa miscela a due componenti. Tutti i prodotti preparati in conformit? della presente invenzione sono solubili in acqua e biologicamente attivi.

I cromatogrammi comparativi su strato sottile e i risultati della valutazione biologica vengono mostrati nella Figura 5. La cromatografia su strato sottile viene effettuata su una lastra Kieselgel 60 DC Alufolien F254 utizzando la fase superiore di una miscela 38:2:10:50 v/v di butanolo, etanolo, acido acetico ed acqua come solvente ed una miscela di vanillina ed acido solforico a 105?C come agente di rilevamento. La valutazione biologica viene effettuata mediante la prova di fusione su agar sul Bacillus subtilis. La concentrazione inibitoria minima (MIC) misurata in valutazione biologica viene riassuma nella tabella II qui appressa.

TABELLA II

I risultati della valutazione biologica indicano che i componenti individuali della primicina sono diversi in attivit?. Questa differenza in attivit? pu? essere attribuita presumibilmente al fatto che i componenti individuali esercitano i loro effetti antibatterici in modo diversi, o possono avere punti diversi di attacco quando agiscono sugli organismi viventi. Ci? spiega il fatto che un singolo componente possa sinergizzare l'effetto di un altro componente (vedere per esempio il brevetto ungherese N?196.309).

Le propriet? di gelificazione dei componenti individuali delle formule (A1) e (A3) e quelle della miscela a due componenti sono anche state esaminate. E' stato trovato che quando la concentrazione viene mantenuta ad un valore costante, il regime di gelificazione diminuisce. Le soluzioni acquose a 5-10 mg/ml dei singoli componenti possono essere conservate per giorni (massimo 1 settimana) senza alcuna variazione osservabile, mentre una soluzione acquosa della miscela a due componenti con la stessa concentrazione gelifica entro 1-2 giorni, ed il tempo di gelificazione della primicina idrosolubile nella stessa concentrazione ? pi? breve di 1 giorno. Si pu? presumere che questo ritardo nella gelificazione ? collegato con una variazione nella conformazione o con l'orientamento dei gruppi ossidrile.

E 'noto dalle pubblicazioni precedenti che la primicina ? altamente sensibile agli elettroliti. In armonia con questa osservazione che ? anche in armonia con la natura ionofora della primicina, si ? osservato che nella primicina idrosolubile l'orientamento dei gruppi ossidrile pu? essere invertito con cationi, il che risulta in una diminuzione improvvisa ma reversibile nella solubilit? in acqua della primicina. Tuttavia quando conservata in una soluzione di zucchero di concentrazione appropriata (come in soluzione di glucosio isotonica) sia la polimerizzazione che la sensibilit? catonica della primicina possono essere soppresse in grande misura.

Gli spettri 13C dei prodotti preparati in conformit? della presente invenzione vengono presentati nelle Figure da 6 a 11.

La Figura 6 mostra il normale spettro 13 NMR di primicina solubile in acqua ( c = 500 mg/400 ?l di metanolo -d4 T = 323 K).

La Figura 7 mostra Io spettro normale protone disaccoppiato 13C della miscela a due componenti dei componenti delle formule ed C = 250 mg/ 1,5 mi di metanolo-d4 T = 323 K , NS = 3000).

La Figura 8 mostra Io spettro normale del protone disaccoppiato 13C del composto della formula Ay C = 100 mg/400 ?l di metanalo-d4 T= 323 K NS= 5000).

La Figura 9 mostra lo spettro 13C del composto della formula A1 contenente acetato di ammonio; lo spettro viene costruito utilizzando frequenza di impulso EPT C = 50 mg/400 yul di metanolo-d^ T = 323 K NS = 2000.

La Figura 10 mostra lo spettro normale protone disaccoppiato 13 NMR del composto della formula A3 contenente acetato di ammonio, (c = 50 mg/400 ?l di metanolo-d4, T - 323 K NS = 2700).

La Figura 11 mostra lo spettro normale protone disaccoppiato 13C del composto della formula (A1) (c = 80 mg/400 ?l di metanolo-d4, T = 323 K, NS = 2700).

Dai dati spettrali si possono tirare le seguenti conclusioni.

Nessuna chiusura di anello procede nella reazione applicata per preparare primicina idrosolubile. E' un fatto non ambiguo sulla base dello spettro 13 NMR che la molecola esaminata contiene quattro atomi di carbonio quaternario. Il segnale di carbonilcarbonio appare a 176,7 ppm. Il segnale dell?atomo di carbonio quaternario nel gruppo guanidina appare a 158,8 ppm, mentre i segnali dei due restanti atomi di carbonio quaternari appaioni a 145,7 e rispettivamente 135,8 ppm (Figura 6). Se si fosse desiderata una chiusura di anello, due ulteriori atomi di carbonio quaternari sarebbero apparsi nello spettro NMR.

In conformit? degli spettri NMR ? altamente probabile che si sia formato un intermedio nella reazione di quasi condensazione (Figura 6) segnale a 170,4 ppm che pu? essere il segnale di un carbonile quaternario. Questo segnale appare soltanto se la primicina idrosolubile viene separat dai solventi anidri (assoluti). La primicina viene quindi cromatografata in un mezzo acquosa, dopo di che il segnale a 170,4 ppm scompare (vedere la Figura 7) lo spettro NMR della miscela a due componenti). Ci? pu? rivelare che il supposto intermedio subisce l'idrolisi o l'assorbimento selettivo. Entrambi producendo la sua scomparsa.

Successivamente sulla base della costruzione di spettro 13C (DEPT) ? utilizzando la tecnica dell'eco in rotazione J-modulato, il numero di atomi di carbonio di ordini differenti (quaternario, terziario [CH] secodario, [CH2]primario [C ? stato determinato nei componenti principali. In conformit? di questa determinazione la molecola contiene quattro atomi di carbonio quaternari corrispondenti ai segnali discussi sopra, 22 atomi di carbonio terziario (il segnale a 105,6 ppm) corrisponde al carbonio anomerico dell'arablnosio e i segnali a 129,1 e 124,9 ppm corrispondono agli atomi di carbonio terziari dei due legami insaturi), 22-23 atomi di carbonio secondari (l'incertezza pu? essere attribuita alla coincidenza accidentale dei segnali dei carboni di metilene in ambienti chimici e fisici) e 6 atomi di carbonio primario.

Da quanto sopra ne segue che le formule empiriche dei componenti principali della primicina idrosolubile sono praticamente identiche a quelle discusse in letteratura. Nello spettro NMR della primicina idrosolubile i segnali dei due epimeri possono essere distinti ed a causa delle diverse configurazioni sieriche dei gruppi OH-, -CH3 e butile appaiono come doppietti.

I gruppi -OH appaioni nelle posizioni 4, 8, 12, 16, 28, 30, 32, 34, 36 e 2? della molecola;

i gruppi -CH3 appaiono nelle posizioni 3, 15, 21, 23 e 20') della molecola e il gruppo n-butile appare alla posizione 17 della molecola.

Lo spettro 13C della miscela a due componenti preparata secondo la presente invenzione viene mostrato in Figura 7.

Confrontando le Figure 6 e 7 si pu? stabilire che i rapporti in peso dei componenti principali variano; la primicina idrosolubile contiene il composto della formula nella quantit? maggiore (vedere la Figura 6), mentre nella miscela a due componenti il composto della formula ? quello dominante. Ci? ? in buon accordo con i risultati della cromatografia su strato sottile mostrati in Figura 5.

Dagli spettri 13C mostrati nelle figure 10 ed 11 ne segue che il numero di atomi di carbonio presenti nei due componenti principali delle formule A3 ed A1 ? praticamente identico, con l'accorgimento che a causa delle incertezze discusse sopra, il numero degli atomi di carbonio secondario (CH2) pu? differire di 1.

Le piccole differenze qualche volta trascurabili negli spostamenti chimici degli atomi di carbonio in posizioni identiche nei due componenti principali possono indicare che non vi ? alcuna differenza notevole tra i due componenti principali; forse una differenza di conformazione oppure pu? verificarsi un?interazione monomero-dimero (Figura 8).

I dettagli della presente invenzione (materiali e metodi) e gli esempi che illustrano l'invenzione stessa vengono riportati appresso.

Materiali e metodi

Tutti i solventi e sostanze chimiche utilizzati negli esempi sono sostanze chimiche fini della pi? elevata purezza analitica (prodotte da Merck, Fluka, Reanal, Whatman, Macherey-Nagel Co., Sigma). Alcuni dei solventi sono stati purificati o ripurificati (resi assoluti). I solventi secchi sono conservati su un setaccio molecolare (diametro dei pori 3-4 A).

Le seguenti sostanze vengono applicate come assorbenti per la cromatografia su colonna: Kieselgei 60 (dimensione di particelle: 0,062-0,2 mm oppure 0,2-0, 2 mm), carbossimetil cellulosa MN 2100 CM (Macherey-Nagel), CM-52 lana pressata microgranulare (Whatman).

Le seguenti sostanze sono state applicate come assorbenti nella cromatografia su strato sottile:

La cromografia liquida viene effettuata su un apparecchio della Gilson

Medicai Elecrtonics equipaggiato con uno spettrofotometro differenziale (monitore

UV tipo Holochrome HM), con un raccoglitore di frazioni modello 201, con un'unit?

di registrazione modello N e con una pompa peristaltica Miniplus 2.

I cromatogrammi su strato sottile vengano rilevati con un reagente, di acido

solforico e vanillina modificata. 250 mg di vanillina (qualit? per analisi) vengono

sciolti in 100 mi di etanolo assoluto, la soluzione viene raffreddata a -10?C e si

aggiungono a gocce 2,5 mi di acida solforico C-C. La soluzione viene spruzzata

sulla lastra (utilizzando azoto come propellente) oppure la lastra viene immersa

nella soluzione di reagente. Le lastre vengono essiccate in corrente d'aria fredda e

quindi attivate a 105?C per 1-2 minuti.

La reazione di Sakaguchi viene effettuata in due maniere:

(I) le lastre appropriatamente essiccate vengono trattate senza riscaldamento con

una soluzione di acetone allo 0,2% di 8-idrossichinolina, le lastre vengono essiccate

in corrente d'aria fredda, quindi una soluzione di idrossido di sodio 0,5 N

comprendente 0,2% di bromo viene spruzzata sulle lastre, e le lastre vengono

essiccate senza riscaldamento.

(II) 2,5 g di idrossido di sodio vengono sciolti in 5 mi di acqua. La soluzione viene

raffreddata a 2-5?C, diluita con 45 mi di metanolo preraffreddato, filtrata, e 50

mg di 8-idrossichinolina vengono sciolti nel filtrato. La soluzione risultante ? la

prima miscela reagente. La seconda miscela reagente viene preparata sciogliendo

250 mg di ?-bromo sucinimmide in 50 mi di etanolo acquoso al 10% raffreddato a 2-

5?C. Le lastre vengono trattate con le miscele reagenti come descritto nel punto I

qui sopra.

?

La reazione di Sakaguchi viene anche applicata per rilevare la primicina nelle soluzioni. In questi esami il metodo microchimico discusso in letteratura viene applicato con le seguenti modifiche: le misurazioni vengono effettuate con nbromo sucinimmide. La diluizione seriale standard viene fatta su arginina, e la densit? di colore sviluppata viene misurata su uno spettrofotometro opton a 520 nm. I seguenti reagenti vengano applicati sempre in forme preparate i fresco: (1) soluzione allo 0,01% di /-naftolo alcalina (preparata diluendo una soluzione etanolica allo 0,2% di /-naftolo con una soluzione acquosa al 10% di idrossido di sodio,

(2) soluzioone al 0,45% di N-bromosucinimmide in etanolo acquoso al 10%, e

(3) soluzione acquosa al 40% di urea.

Le determinazioni vengono effettuate a 0?C. In contrasto ai dati di letteratura, il volume della miscela di reazione ? di 1,7 mi e la miscela di reazione consiste nei seguenti componenti:

soluzione da esaminare 1 ml

soluzione alcalina di -naftolo 0,4 ml

soluzione reagente NBS 0,1 ml

soluzione di urea 0,2 ml

E' ben noto che la reazione di Sakaguchi ? molto sensibile ai vari alcoli e in generale agli ossocomposti. Cosi per esempio con la primicina anche un contenuto di alcool (metanolo, etanolo) del 20% risulta in una considerevole diminuzione dell'estinzione misurata a 520 nm. Questa diminuzione tuttavia non ? connessa con la densit? di colore sviluppato ma con la sua deviazione spettrale (deviazione versa la gamma di lunghezza d'onda inferiore). Se la primicina non viene sciolta in acqua pura ma in un solvente organico oppure in una miscela d? solvente organico (come in una miscela 1:1:2 v/v di butanolo, etanolo ed acqua), il prodotto colorato caratteristico sviluppato con la reazione di Sacaguchi pu? essere estratto quantitativamente nella fase butanolo; il massimo di assorbimento del colore in questa fase ? a 480 nm.

La tecnica di diffusione su agar viene applicata per la valutazione biologica della primicina. Come organismo di prva si applica Baccillus subtilus ATCC 6633.

Il Bacillus subtilis ATCC 6633 viene coltivato su un mezzo di Schaeffer (brodo nutriente Na2 ossoide) con la seguente composizione:

La soluzione viene riscaldata in un recipiente presurrizato per 30 minuti ad una pressione di 1,5 atmosfere, dopo di che il pH viene regolato a 7,0-7, 2 con 5-6 gocce di soluzione di idrossido di sodio 10N, porzioni da 90 ml della soluzione vengono versate nei piatti di coltivazione, e le porzioni vengono additi vate con 10 ml ciascuna delle seguenti soluzioni:

Il mezzo nutriente di titolazione viene preparato come segue:

5 g di estratto di carne (estratta di bue Difco), 0,5 g di peptone (Bacto Peptone Difco), 1 g di Na2HPO4 e 0,1 g di KH2PO4 vengono sciolti in 100 mi di acqua distillata, la soluzione viene sollita per 2 Ore e quindi il Ph viene regolato ad 8. La soluzione calda viene filtrata, lasciata raffreddare, il filtrato viene diluito con 900 mi di acqua distillata, e si aggiungono 20 g di agar (Bacto agar Difco) sciolti in vaso di Kach, ad un litro della soluzione. Il pH della soluzione calda viene controllato. Porzioni da 100 mi della soluzione risultante vengono riempiti in palloni di conservazione e quindi trattati a caldo per 20 minuti con un recipiente presurizzato sotto una pressione di 1,5 atmosfere.

Le lastre di titolazione vengono preparate dal mezzo nutriente di cui sopra come segue: 100 ml del mezzo nutriente vengono fusi su un bagno d'acqua, la fusione viene raffreddata a 40-50?C e 0,5 mi di una sospensione di spore di Bacillus subtilis ATCC 6633 vengono mescolati con precauzione col mezzo nutriente liquido fermo. Il mezzo nutriente inoculato viene riempito in un vassoio di vetro delle dimensioni da 30 x 30 x 3 cm, fatto con lastre di vetro spesse 3-4 mm, la lastra di agar solidificata viene preincubata a 37?C per 0,5-1 ora, e quindi si tagliano nella lastra 42 fori del diametro di 10 mm.

Soluzioni contenenti 20-50 ?g/ml di sostanza attiva vengano preparate dalle sostanze da esaminare (primicina insolubile in acqua di partenza); primicina idrosolubile, una miscela dei composti delle formule e A3; un composto della formula A1, un composto della formula A3 in acqua oppure in una miscela 1:1:2 v/v di butanolo, etanolo ed acqua, e le soluzioni risultanti vengono diluite con acqua distillata tamponata (tampone fosfato 0,15 molare pH 7,6) a concentrazioni di 0,05-0,1, 0, 5-1,0 e 2,0 ?g/ml. Porzioni da 0,1 mi delle soluzioni risultanti vengono riempite nei fori delle lastre di agar di titolazione, e le lastre di agar vengono icnubate in un termostato a 37?C per 18-20 ore. Dopo di ci? si misurano in mm i diametri delle zone di estinzione diffusive i valori ottenuti vengono tracciati su una scala semilogaritmica rispetto alle concentrazioni delle diluizioni seriali convenzionali, ed ? valori di attivit? vengono determinati per estrapolazione.

ESEMPIO 1

Preparazione di primicina idrosolubile

500 mg (0,46 mmoli) di primicina finemente polverizzata (contaminata con piombo e 100 m di etanolo assoluto vengono riempiti in un pallone a fondo rotondo della capacit? di 250 mi. Il pallone viene attaccato ad un condensatore a riflusso dotato di un tubo di essiccazione riempito con CaCl2 e calce sodata, e la miscela viene fatta bollire a riflusso finch? si raggiunge la dissoluzione massima (circa 15-30 minuti). Dopo di ci? si aggiungono alla miscela 50 ?l (0,46 mmoli) di etilciano acetato; il reagente viene lavato nel pallone con una piccola quantit? di etanolo assoluto. La miscela viene bollita a riflusso per 15 minuti, e quindi si aggiungono 25 mg (0,46 mmoli) di metossido di sodio alla miscela in tre porzioni eguali ad intervalli di 30 minuti. Le porzioni individuali del reagente vengono lavate nel pallone con 1-2 mi di etanolo distillato (96%). Anche dopo l'introduzione della prima porzione di metossido di sodio, la miscela di reazione inizia a diventare limpida, quindi la quantit? totale di primicina disciolta e la miscela di reazione diventa rosa pallido. Alla fine del tempo di reazione 4 ore) la miscela viene lasciata raffreddare, viene filtrata attraverso un filtro di vetro sinterizzato G4 e concentrata ad un piccolo volume in un apparecchio Rotavapor R 110 (Buchi). Dopo di ci? il contenuto di etanolo del mezzo di radiazione viene gradualmente sostituito con metanolo in maniera tale che la sostanza separata viene sciolta in metanolo assoluto, il solvente viene evaporato e questa operazione viene ripetuta. Con questo trattamento la sostanza che ha una solubilit? limitata in etanolo, diventa altamente solubile in metanolo e rimane sciolta anche in alcuni mi di etanolo. A questo stadio il prodotto viene precipitato dal concentrato metanolico con etere assoluti. La sostanza separata viene filtrata attraversa un filtro di sinterizzato G4, lavata con acetone assoluto ed essiccata in una pistona di essiccazione sottovuoto (Blaugel cloroformio/etanolo punto di ebollizione 65-70?C).

Si ottengono 410 mg (82%) di primicina idrosolubile, e il suo cromatogramma su strato sottile viene mostrato in Figura 5. Solubilit? in acqua 50 mg/ml punta di fusione 162-164?C, attivit? biologica (su Bacillus subtilis): 0,08-0,2 ?g/ml.

ESEMPIO 2

Preparazione di una miscela a due componenti dei componenti di primicina delle formule ed A1.

La primicina idrasolubile preparata come descritto nell'esempio 1 viene applicata come sostanza di partenza. I componenti principali della primicina vengono separati mediante cromatografia su colonna su gel di silice. Gel di silice (Kieselgel 60, dimensione di particelle 0,2-0, 5 mm) viene purificato mediante lavaggi ripetuti con acqua deionizzata e decantazione. Prima del riempimento la sospensione omogenea viene resa priva di bolle sottovuoto.

Il gel di silice viene riempito in una colonna farmacia delle dimensioni di 2,6 x 230 cm, equipaggiata con un adattatore di flusso. Una soluzione acquosa di 5-10 mg/ml di 500 mg della sostanza di partenza, filtrata attraversa un filtra di vetro sinterizzato G3, viene applicata continuamente sulla colonna attraverso l'adattore di flusso. Dopo di ci? la colonna viene eluita con acqua ad un ritmo di 130 ml/ora (uguale 25 ml/ora/cm<2 >), e si raccoglie la frazione effluente di 24 mi. Le condizioni di cromatografia e l'eluitogramma vengono mostrati in Figura 3.

L'eluizione viene continuata quindi con una soluzione acquosa all'1% di miscela di Partridge (la miscela di Partridge ? la fase superiore di una miscela superiore di 38:2:10:50 v/v di n-butanolo, etanolo, acido acetico ed acqua). Le frazioni di picco individuali vengono controllate mediante cromatografia su strato sottile. Le frazioni di picco contenenti i due componenti vengono raccolte, si aggiunge una piccola quantit? di N-butanolo (agente antischiuma), la soluzione viene concentrata in un apparecchio Rotavapor, ed il concentrato viene gradatamente disidratato dapprima con metanolo distillato e quindi con metanolo assoluto. Il concentrato risultante viene trattata con etere assoluto, la sostanza precipitata viene filtrata via, lavata con acetone ed essiccata in una pistola di essiccazione. Si attengono 260 mg (52%) di una sostanza solida; punto di fusione 165-168?C solubilit? in acqua 50 mg/ml, attivit? bioligica (su Bacilluls subtilis): 0,05-0,1 ug/1.

ESEMPIO 3

Preparazione del componente della formula A.,

La miscela idrosolubile a due componenti preparata come descritto nell?esempio 2 viene applicata come sostanza di partenza. I componenti vengono separati l'uno dall'altro mediante cromatografia a scambio ionico su carbossimetilcellulosa nel ciclo NH4 . Cellulosa CM 52 (lana pressata microgranulare Whatman) nel ciclo H<+ >viene sospesa in acqua, trattata con soluzione 1-molare acquosa di idrocarbonato di ammonio, lavata diverse volte con acqua, decantata e lavata sottovuoto per rimuovere le bolle. Questo assorbente viene filtrato in una colonna farmacia (2,6 x 6 cm) equipaggiata con un adattatore di flusso. 450 mg della miscela di partenza a due componenti vengono applicati sulla colonna come soluzione acquosa a 4,5 mg/ml attraverso l?adattatore di flusso. L'eluizione viene effettuata ad un regime di flusso di 150 ml/ora ( = 29 ml/ora/cm<2 >) e le frazioni effluenti di 24 mi vengono raccolte. Le condizioni di cromatografia e l'eluitogramma vengono mostrati in Figura 4.

La colonna vieen eluita (lavata) dapprima con acqua. Dopo un completo lavaggio, l'eluizione viene continuata con una soluzione acquosa 5 m molare di idrocarbonato di ammonio. Le frazioni di picco di questo eluato contengono il componente puro omogeneo della formula A1? Le frazioni di idrocarbonato di ammonio comprendenti il composto della formula come singolo componente vengono raccolte, si aggiunge una piccala quantit? di n-butanolo, e la miscela viene evaporata fina quasi a secchezza. L'acqua viene evaporata ripetutamente dal residuo allo scopo di rmuovere l'idrocarbonato di ammonio volatile, quindi il concentrato viene disidratato dapprima con metanolo distillato e quindi con metanolo assoluto. Infine la sostanza viene precipitata dal concentrato con etere assoluto. La sostanza separata viene filtrata via su un filtro di vetro sinterizzato G4; lavata con acetone ed essiccata. Si ottengono 190 mg (42%) di un composto della formula A1; punto di fusione 159-161?C, solubilit? in acqua circa 5 mg/ml (questa diminuzione nella solubilit? in acqua pu? essere attribuita alla presenza di un po' di NH4 legato e di residui di idrocarbonata di ammonio) attivitit? biologica (su Bacillus subtilis): 0,5-1 ?g/ml.

Come menzionato sopra, la sostanza viene sottoposta a ripetuta cromatagrafia di scambio ionico su carbossimetilcellulosa in ciclo H allo scopo di rimuovere le contaminazioni che diminuiscono la sua solubilit? in acqua. La sostanza viene applicata sulla colonna come soluzione acquosa di 264 mg/ml, la colonna viene completamente lavata con acqua, e quindi disidratata gradatamente dapprima con metanolo distillata e quindi con metanolo assoluto. La sostanza viene eluita con metanolo assoluto comprendente 10 immoli di acido acetico. L'effluente viene filtrato attraverso un filtro di verto sinterizzato G4 o attraverso una lastra di fibra di vetro Whatman), il filtrato viene concentrato ad un piccolo volume, ed il prodotto viene precipitato dal concentrato con acetone assoluto. Dopo di ci? si segue il metodo descritto nel precedente paragrafo. Si ottiene un composto puro della formula A ; punto di fusione 164-166?C (in contrasto al valore iniziale di 159-161?C), solubilit? in acqua 40-50 mg/ml. La cromatografia ripetuta di scambio ionico risulta in una perdita di materiale massima del 10%.

ESEMPIO 4

Preparazione del componente della formula Al

Nel metodo descritto nell'esempio 3 il componente della formula A1 viene eluito, mentre il componente della formula A1 rimane legato alla colonna di carbossimetilcellulosa nel ciclo NH4 . Il componente della formula A1 viene rimosso dalla colonna come segue: la colonna viene lavata con acqua per rimuovere completamente l?idrocarbonato di ammonio, e quindi viene gradatamente disidratata dapprima con metanolo distillato e quindi con metanolo assoluto, dopo di ci? il componente della formula A1 viene eluito con metanolo assoluto comprendente 10 mmoli di acido acetico. Gli effluenti vengono raccolti, filtrati attraverso un filtro di vetro sinterizzato G4, evaporati fina ad un piccolo volume ed il prodotto viene precipitato dal concentrato con acetone assoluto. Dopo di cio? si segue il metodo descritto nell?esempio 3.

Si attengono 150 mg (33% calcolati per la quantit? della sostanza di partenza applicata nell'esempio 3) nel componente della formula A1; punto di fusione 164-168?C, solubilit? in acqua 50 mg/ml, attivit? bioliogica (su Bacillus Subtilis) 0,03-0,06 ?g/ml.

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di primicina idrosolubile e per la separazione dei suoi componenti delle formule (A1) e (A3) sia come singoli componenti che come miscela dei due componenti, caratterizzato dal fatto che (I) si fa reagire primicina insolubile in acqua in un alcool ( ) con una sostanza condensabile comprendente un ponte C-C-C in presenza di metossido od etossido di sodio o di potassio, si separa il prodotto risultante con una solubilit? in acqua di 40-60 mg/ml e se lo si desidera (II) la sostanza risultante viene soggetta a cromtografia su colonna su gel di silice applicando una soluzione acquosa a circa l'l% di miscela di Partridge come agente eluente per ottenere una miscela dei componenti delle formule (A1 ed A3) con una solubilit? in acqua di circa 50 mg/ml e se Io si desidera (III) la miscela risultante a due componenti viene sottoposta a cromatografia di scambio ionico applicando carbossimetilcellulosa nel ciclo dell'ammonio come assorbente ed eluendo l'assorbente con soluzione acquosa di idrocarbonato di ammonio per ottenere il componente della formula A1 con una solubilit? in acqua di circa 50 mg/ml in forma pura, e 3e lo si desidera (IV) l'eluizione viene continuata con metanolo assoluto comprendente circa 10 millimoli di acido acetico per ottenere il componente della formula (A1) con una solubilit? in acqua di circa 10 mg/ml in forma pura.
2. 2. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che si applica etilcianoacetato come sostanza condensabile comprendente un ponte C-C-C nella fase (I).
3. 3. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1 oppure 2, caratterizzato dal fatto che l'etanola viene applicato come alcool nella fase I.
4. 4. Procedimento come rivendicato in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dai fatto che la fase I viene effettuata in presenza di metossidi di sodio.
5. 5. Procedimento come rivendicato in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzato dal fatto che la fase I viene effettuata in presenza di 15-2D parti per milione di piombo introdotte come composto di piombo solubile.
6. 6. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che acetato di piombo viene applicato come composto del piombo solubile.
7. 7. Composizione farmaceutica o veterinaria comprendente come sostanza attiva pirimicina idrosolubile oppure una miscela idrosolubile dei componenti delle formule (A1) ed (A3 oppure un singolo composto idrosolubile avente la formula (A1) oppure (A3) assieme ad un veicolo diluente od altro agente ausiliario farmaceuticamente accettabile.