SE501887C2 - Förfarande för framställning av vattenlöslig primycin och dess komponenter samt farmaceutiska kompositioner innehållande dessa - Google Patents

Description

lO 15 20 25 50 55 501 887 2 ga halter av aktivt medel (således är exempelvis halten av det aktiva medlet i den välkända primycinhaltiga Embri- mycin(R) Gel endast 0,2 %). Separationen av de enskilda komponenterna i primycin kräver långvariga och sofistike- rade tillvägagångssätt vilket är en ytterligare nackdel.

Vårt ändamål är att omvandla primycin, framställd exempelvis såsom beskrivas i de ungerska patentskrifterna 146 552 och 155 595, till en vattenlöslig substans genom en enkel och billig metod. Vårt ändamål är dessutom att separera två av huvudkomponenterna i primycin antingen in- dividuellt eller såsom en blandning genom ett enkelt till- vägagångssätt.

Enligt uppfinningen förfar man på följande sätt: (i) Vattenlöslig primycin bringas att reagera i en Cl_5-alkohol med en kondenserbar substans, som innefattar en C-C-C-brygga, i närvaro av natrium- eller kalium-mat- oxid eller -etoxid, varvid den resulterande produkten, som har en vattenlöslighet av 40 - 60 mg/ml, separeras, och om så önskas (ii) underkastas den resulterande produkten pelar- kromatografi på silikagel, varvid en ca l %-ig vattenlös- ning av Partridges-blandning tillföras såsom alueringsme- del så att man erhåller en blandning av komponenterna med formlerna (Al) och (A5) med en vattenlöslighet av ca 50 mg/ml, och om så önskas (iii) underkastas den resulterande tvåkomponent- blandningen jonbyteskromatografi, varvid karboximetylcel- lulosa i ammoniumcykel användes såsom adsorbent och adsor- bentan elueras med vattanlösning av ammoniumvätekarbonat så att man erhåller komponenten med formeln (A5) med en vattenlöslighet av ca 50 mg/ml i ren form, och om så önskas (iv) förlängas alueringen med absolut metanol som innehåller ca 10 mmol ättiksyra så att man erhåller kompo- nenten med formeln (Al) med en vattenlöslighet av ca 10 mg/ml i ren form.

Såväl den empiriska formeln som tunnskiktskromato- grammet för vattenlöslig primycin, som erhålles enligt det första steget vid metoden enligt uppfinningen, är identis- 10 15 20 25 50 55 501 887 _ ka med desamma för utgångssubstansen, varvid den enda skillnaden är den radikala förändringen i vattenlöslighet.

Skälen till detta faktum är inte helt klara men man antar att de steriska ställningarna hos den primycin som man ut- går ifrån ändras vid behandlingen enligt uppfinningen vil- ket resulterar i en abrupt ökning av vattenlösligheten.

De båda huvudkomponenterna i primycin, dvs föreningarna med formlerna (Al) och (A5) är också vattenlösliga när de separeras från den vattenlösliga primycin som erhålles och deras empiriska formler är desamma som beskrives i litte- raturen.

Vattenlöslig primycin och dess komponenter som är framställda i enlighet med uppfinningen kan användas med fördel för terapeutiska ändamål, eftersom de bibehåller sina utmärkta antimikrobiala verkningar hos de motsvaran- de vattenolösliga substanserna och gör det möjligt att fram- ställa farmaceutiska kompositioner med avsevärt högre inne- håll av aktivt medel än tidigare, exempelvis vattenlösning- ar som innehåller till och med 50 - 100 mg/ml av aktivt me- del.

Uppfinningen avser även farmaceutiska eller veteri- nära kompositioner vilka innehåller såsom aktivt medel vat- ten-löslig primycin eller en vattenlöslig blandning av kom- ponenterna med formlerna (Al) och (A3) eller en vattenlös- lig enkel förening med formeln (Al) eller (A5) tillsammans med farmaceutiskt godtagbar bärare, utspädningsmedel eller annat hjälpmedel.

En mera detaljerad beskrivning av förfarandet enligt uppfinningen ges nedan.

Vattenolöslig primycin som framställes i enlighet med de ungerska patentskrifterna 146 352 och 155 595 använ- des såsom utgångssubstans vid förfarandet enligt uppfinning- en. Denna substans har jonofora egenskaper.

Våra tidigare undersökningar har visat att såsom funktion av koncentrationen och tiden blockerar vattenolös- lig primycin som tillföras i en koncentration av l - 10 /umol/ml vilo-K+-kanalerna hos skelettmuskulaturens ytmem- bran. Detta resulterar också i en minskning av membranpo- 10 15 20 25 §O 55 501 887 tentialen, vilket innebär funktionell ändring av kontrak- tilsystemet. Primycinantibiotikum har den unika struktu- rella egenskapen att molekylen med hög komplexitet inne- håller en guanidindel och en arabinosdel. Såväl den bio- logiska verkan som de fysiologiskt kemiska egenskaperna hos molekylen bestämmas av makrolidlakton av icke-polyen- typ samt av de därtill bundna guanidin- och arabinosdelar- na. Dessa delar av molekylen bestämmer tillsammans, genom sina amfipatiska (dvs hydrofila och hydrofoba) egenskaper, orienteringen och bindningen hos antibiotikumet vid mem- branet. Det kan också antas att den kanalbildande egenska- pen hos primycin är förbunden med bildandet av dimerer el- ler högre polymerer.

En partiell eller fullständig rubbning av de ovan nämnda växelverkningarna kan avsevärt påverka polekylens polaritet och sålunda även dess löslighetsbetingelser.

Den partiella eller fullständiga protoniseringen av mole- kylens guanidindel kan avsevärt påverka ytladdningsfördel- ningen (makropolariteten) som antingen direkt eller indi- rekt kan dämpa eller till och med öka förekomsten av inter- molekylär växelverkan.

För att utvärdera det första steget i förfarandet enligt uppfinningen har vi utfört ca 150 experiment under användning av kondensationsreaktioner som tillämpas vitt vid syntes av föreningar med pyrimidinskelett. Ett vanligt kännetecken för dessa reaktioner är att da1heteroaromatiska ringen bildas ur en förening som innehåller en N-C-N- eller C-C-C-brygga.

Såsom föreningar med C-C-C-brygga kan exempelvis an- vändas propargylaldehyd, etylformylacetat, etylcyanoacetat, malonsyradinitril, metyletynylketon, acetylaceton och for- myl-B-etoxipropionsyraestrar av vilka etylcyanoacetat vi- sade sig vara speciellt användbart. Såsom reaktionsmedium (vattenfri) kan användas torra alkoholer med 1 - 5 kolato- mer. Reaktionen sker företrädesvis i absolut etanol som kan framställas ur i förväg torkad etanol genom grignard- reaktion. Såsom regel har de torra lösningsmedel som an- vändas vid våra experiment förvarats över en molekylsil 10 15 20 25 50 35 5 501 887, (exempelvis sigmamolekylsil med en pordiameter av 5 - 4 Ä).

Såsom katalysator kan användas natrium- eller kalium- metoxid eller -etoxid, företrädesvis natriummetoxid.

När etanol användes såsom reaktionsmedium och bland- ningen hålles under återlopp kräver reaktionen ca 5 - 6 timmar. Vid reaktionstidens slut avfärgas reaktionsbland- ningen med aktivt kol (Charcoal activ., Merck), filtreras (företrädesvis genom ett GF/C Whatman glasmikrofiberpap- per) och indunstas partiellt i vakuum. Indunstningen kan ske exempelvis i en apparat av typen Rotavapor R 110 (Büchi).

Etanol som användes såsom reaktionsmedium utbytes kontinuerligt mot torr metanol under indunstningsprocedu- ren och sedan tillsättes absolut eter och aceton till kon- centratet för utfällning av produkten. En vit solid pro- dukt erhålles som pulvriseras och förvaras under 24 tim- mar i en vakuumtorkpistol ("Blaugel", kloroform/etanol, 650 C) så att man erhåller ett prov för identifiering och analys.

De karakteristiska data för den vattenlösliga pri- mycin som erhålles jämfört med den vattenolösliga utgångs- substansen är sammanställda i tabell I nedan. 22E§šl_š Vattenolöslig Vattenlös utgångsprimycin primycinprodukt Empirisk formel C55HlO4N50l7 C55HlO4N30l7 smältpunkt iso - 1s4° c 162 - 1a4° c Biologisk verkan 0,05/ug/ml 0,1 - 0,5/ug/ml Vattenlöslighet 0,04 mg/ml 40 - 60 mg/ml Det framgår av den empiriska formeln för resulteran- de vattenlöslig primycin att kondensationsreaktionen som företages under förhållandena med syntes av pyrimidinföre- ningar inte medför ringslutning, dvs den förmodade hetero- aromatiska ringen bildas inte. Det är troligt att reaktio- nen fortskrider genom bildandet av en "mellanprodukt" vil- 10 15 20 25 50 55 501 887 6 let i grunden ändrar orienteringen hos -OH-grupperna i makrolidringen. Man antar att denna förändring resulte- rar i den avsevärda ökningen av vattenlösligheten och den- na ändring gör det också möjligt att separera huvudkompo- nenterna genom ett förhållandevis enkelt tillvägagångs- sätt. En möjlig förklaring till detta fenomen presente- ras senare. I Förfarandet enligt uppfinningen gör det möjligt att framställa vattenlöslig primycin på ett reproducerbart sätt ur vattenolöslig primycin av godtyckligt ursprung utan någon tidigare rening av utgångssubstansen. Man fö- redrar speciellt att använda med bly kontaminerad vatten- olöslig primycin såsom utgångssubstans. Man har nämligen observerat att förekomsten av bly påverkar gynnsamt såväl utbytet av vattenlöslig primycin (vilket är vanligtvis 80 - 85 %) som den maximalt möjliga vattenlösligheten (som är 50 - 100 mg/ml).

Baserat på atomabsorptionsspektroskopi (Perkin-El- mer Mod.) innehåller orenad utgångsprimycin ca 6 - 10 ppm blyförorening. Om renad vattenolöslig primycin av tera- peutisk klass (såsom Ebrimycin(R)) användes såsom utgångs- substans minskar utbytet av vattenlöslig primycin till ca 50 - 60 % och en maximal vattenlöslighet av endast 5 - 10 mg/ml kan uppnås. Om därför renad vattenolöslig primycin användes såsom utgångssubstans är det lämpligt att till- sätta 15 - 20 ppm bly till reaktionsblandningen i form av en löslig blyförening, företrädesvis blyacetat.

Vattenlöslig primycin har en ytterligare mycket intressant egenskap. Det har konstaterats att dess vat- tenlösning gelar spontant, varvid gelningstiden är beroen- de av lösningens halt av primycin. Graden av gelning så- som funktion av tid och primycinkoncentration är visad i fig. l. Såsom framgår av kurvorna i fig. l kräver full- ständig gelning av en 5 - 10 mg/ml vattenlösning av pri- mycin ca 1 - 2 dagar, en 20 - 40 mg/ml primycinlösning kräver ca 6 - 12 timmar samt en vattenlösning av primycin som innehåller mer än 50 mg/ml primycin gelar fullständigt till och med inom l - 2 timmar. Temperaturens inverkan 10 15 20 25 50 55 501 887' 7 på gelningen är visad i fig. 2. Den koncentrations-, tids- och temperaturberoende gelningen (polymerisation) kan för- modligen tillskrivas ändringarna i orientering hos -OH- -grupperna i molekylen.

Den primycingel som erhålles är helt genomskinlig, stabil och förändras inte om mera lösningsmedel tillsättes.

Denna gynnsamma associeringsegenskap hos vattenlöslig pri- mycin gör det möjligt att använda polymeriserade gel eller frystorkade membraner inom områden av terapi där hög lokal koncentration av aktivt medel är av väsentlig betydelse.

Genom användning av denna gelbildande egenskap hos vatten- löslig primycin kan kolloidala, farmaceutiska kompositio- ner med mycket variabel halt av aktivt medel framställas mycket enkelt utan användning av något speciellt galninga- medel. Användning av etanol, hittills tillblandad med vattenolösliga primycinpreparat för att uppnå en högre halt av aktivt medel, kan också undvikas, varigenom de oönskade sidoeffekterna hos etanol kan elimineras.

Vid ett första betraktande skiljer sig primycin som framställts i enlighet med uppfinningen från utgångssub- stansen endast ifråga om vattenlöslighet. På grund av för- ändringarna i lösningsegenskaper kan emellertid också asso- ciationsbetingelserna och de s.k. heterogena förhållandena ändras, varigenom primycin (som är en multikomponent bland- ning) blir mer tillgänglig för efterföljande behandlingar.

Detta är skälet till varför vi har lyckats med att erhålla en tvåkomponentblandning och två separata, enskilda biolo- giskt aktiva komponenter genom ett förhållandevis snabbt och väl reproducerbart kromatografiskt tillvägagångssätt.

För framställning av en blandning av primycinkompo- nenter med formlerna (A1) och (A5) användes vattenlöslig primycin som framställts i enlighet med uppfinningen såsom utgångssubstans. Kromatografi företagas på en silikagel- kolonn.

De föredragna betingelserna för pelarkromatografi är såsom följer: Kiselgel 60 (partikelstorlek: 0,065 - 0,2 mm eller 0,02 - 0,5 mm) användes såsom adsorbent. Ge- len tvättas flera gånger med avjoniserat vatten, vattenfa- 10 15 20 25 EO 55 501 887 sen dekanteras och gelsuspensionen som erhålles göres bub- belfrí i vakuum. En Pharmacia-kolonn (2,6 x 250 cm) som är försedd med en flödesadapter användes såsom kromatogra- fikolonn. Den kontinuerliga genomströmningen bibehålles med hjälp av en fyrkanals peristaltisk pump av typen Gil- son Miniplus-2. En Gilson-utrustning för vätskekromatogra- fi som innefattar en differentialspektrofotometer av typen Holochrome Model M, en fraktionssamlare av typen Model 201 och en tvåkanals servopotentiometrisk skrivare av typen Model N2 användes för att uppsamla fraktionerna och för att kontinuerligt övervaka kromatografiförloppet. Vatten- löslig primycin tillföras till kolonnen såsom en 5 - lO mg/ml vattenlösning. Kromatografitopparna är visade i fig. 5.

Kolonnen elueras (tvättas) först med vatten varef- ter en väsentlig del av de mindre betydande komponenterna av primycin (fraktion "A" i fig. 5) kan avlägsnas. De en- skilda fraktionerna kontrolleras med tunnskiktskromatogra- fi genom användning av Merck DC Alufolien eller DC Plastik folien Kieselgel 60 F254 såsom kromatografiplatta, den öv- re fasen av en 58:2:lO:5O v/v blandning av n-butanol, eta- nol, ättiksyra och vatten såsom lösningsmedel (Partridges blandning) samt vanillin och svavelsyra vid 1050 C såsom detekteringsmedel.

Substansen som är bunden till kolonnen, vilken är en blandning av komponenterna med formlerna (Al) och (A5) elueras sedan med en l %-ig vattenlösning av Partridges blandning enligt ovan. Såsom framgår av fig. 3 elueras de återstående mindre väsentliga komponenterna först, var- efter en ren blandning av föreningarna med formlerna (Al) och (A5) elueras och sedan vid den nedåtgående delen av elueringsdiagrammet elueras en kontaminerande substans med högre Rf-värde (refererad till såsom komponenten "B" i de ovan nämnda patentbeskrivningarna).

Toppfraktionerna sammanslås, indunstas, urvattnas gradvis genom användning av destillerad metanol och däref- ter absolut metanol, varefter en blandning av absolut eter och aceton tillsättes till det resulterande koncentratet 10 15 20 25 50 55 501 337.. för utfällning av produkten. Den utfällda produkten är en blandning av föreningar med formlerna (Al) och (A3).

Denna blandning är en vattenlöslig, biologisk aktiv pro- dukt. Den erhålles generellt med ett utbyte av 50 - 60 % beräknat på den vattenlösliga primycin som man utgår ifrån.

Tvåkomponentblandningen smälter vid 165 - 1680 C.

I det följande har vi försökt att separera förening- arna med formlerna (Al) och (A5) i ren form ur deras bland- ning. Våra tidigare undersökningar har visat att adsorp- tionsegenskaperna hos dessa två huvudkomponenter är i hu- vudsak desamma, varför deras fullständiga separation visa- de sig vara en långvarig och sofistikerad operation som innebär en avsevärd materialförlust.

I vårt forskningsarbete avseende undersökningen av verkansmekanismen hos primycin har vi alltid tillerkänt en avsevärd betydelse för ändringarna i molekylens ladd- ningsstruktur. Varje ändring i laddningsstruktur kan i grunden modifiera (1) membranorienteringen hos primycin- molekylen (enbart en diskret orientering kan nämligen ga- rantera exempelvis separationen mellan antibakteriell och toxisk verkan) och (2) adsorptionsegenskaperna hos mole- kylen eller hos de enskilda komponenterna i primycin.

Våra tidigare gelkromatografiska försök som utförts med vattenlöslig primycin på Sephadex LH-20 har indikerat att en ändring i polaritet och associationsbetingelser av- sevärt påverkar heterogeniteten hos primycin. Med andra ord beror förhållandet mellan de enskilda komponenter som finns i toppfraktionerna på de dielektriska egenskaperna hos det lösningsmedelsystem som användes. På grundval av dessa observationer har vi försökt att separera de enskil- da komponenterna i den blandning som erhålles såsom beskri- ves ovan genom att använda jonbytekromatografi. En lämp- lig metod som medför en fullständig separation av komponen- terna med formlerna (Al) och (A5) beskrivas nedan.

Den vattenlösliga blandningen av komponenterna med formlerna (Al) och (A5), vilken framställts såsom beskri- ves ovan, användes såsom utgångssubstans. En 4 - 5 mg/ml vattenlösning av denna tvåkomponentblandning tillföres till 10 15 20 25 55 501 887 10 en karboximetylcellulosakolonn i NHÄ-form (Whatman CM-52 cellulosa, försvälld). En Pharmacia K-26-kolonn (2,6 x 5 cm) som är försedd med en flödesadapter användes såsom kolonn. met framgår av fig. 4.

Kromatografibetingelserna och elueringsdiagram- Kolonnen tvättas först med vatten så att återsto- den av de mindre väsentliga komponenterna ("A") avlägsnas och elueringen fortsättes sedan med en 5 - 8 molar vatten- lösning av ammoniumvätekarbonat så att man erhåller den rena komponenten med formeln (A5). Komponenten med for- meln (Al) förblir bunden vid kolonnen. Utflöden av ammo- niumvätekarbonat hopsamlas, en liten mängd n-butanol (an- tiskummedel) tillsättes och blandningen indunstas till i huvudsak torrhet. Tvättning med vatten och indunstning upprepas ett flertal gånger för avlägsnande av ammonium- vätekarbonat, varefter återstoden urvattnas fullständigt genom att först destillerad metanol och sedan absolut me- tanol indunstas från återstoden. Det resulterande koncen- tratet behandlas med absolut eter så att produkten utfäl- les, den separerade fasta formen bortfiltreras och tvättas med en liten mängd torr aceton.

Den resulterande fasta formen smälter vid 159 - 1610 C och erhålles med ett utbyte av ca 45 - 50 % räknat på tvåkomponentblandningen som man utgår ifrån. Vattenlös- ligheten hos den resulterande substansen är ca 2 - 6 mg/ml.

Sänkningen av smältpunkten (densamma hos utgångsblandning- en är 165 - l68° C) och av vattenlösligheten (densamma hos utgångsblandningen är 40 - 60 mg/ml) kan tillskrivas före- komsten av mindre mängder av föroreningar av bundet NH: och av ammoniumvätekarbonat.

För att avlägsna dessa föroreningar upplöses den resulterande substansen i vatten, lösningen tillföras till en karboximetylcellulosakolonn i H+-form, kolonnen tvättas helt med vatten samt urvattnas sedan gradvis först med des- tillerad metanol och sedan med absolut metanol. Substan- sen elueras därefter med absolut metanol som innehåller lO mmol ättiksyra. Utflödet indunstas till en liten vo- lym, absolut metanol tillsättes till koncentratet och in- lO 15 20 25 BO 55 501 ssven 11 dunstning upprepas ett flertal gånger, varefter produkten utfälles ur koncentratet med absolut aceton. Den separe- rade substansen filtreras genom ett G4 sintrat glasfilter, tvättas snabbt med aceton och torkas.

På detta sätt erhålles en förening med formeln (A5) 1 rent tillstånd, som smälter vid 164 - 1ea° c. vet- tenlösligheten hos föreningen med formeln (A5) är ca 50 mg/ml. Den upprepade jonbyteskromatografin sker med en materialförlust av ca 10 %.

Den andra komponenten i den tvåkomponentblandning som man utgår ifrån, dvs föreningen med formeln (Al), som förblir bunden vid CM-52 karboximetylcellulosakolonnen i NH:-form sedan den eluerats med vattenhaltig ammoniumväte- karbonat separeras på följande sätt: Kolonnen tvättas med vatten för att fullständigt avlägsna ammoniumvätekarbonat och urvattnas eller dehydra- tiseras sedan gradvis först med destillerad metanol och sedan med absolut metanol. Den bundna substansen elueras sedan med absolut metanol som innehåller 10 mmol ättiksyra.

Utflödet indunstas till en liten volym, absolut metanol tillsättes till koncentratet och indunstning upprepas ett flertal gånger för avlägsnande av ättiksyra, varefter ab- solut aceton tillsättes till koncentratet för utfällning av produkten. '“ På detta sätt erhålles komponenter med formeln (Al) såsom en ren fast produkt som smälter vid 167 - l68° C.

Föreningen är lättlöslig i vatten. Ingen efterföljande jonbytekromatografi kräves för att rena denna komponent eftersom i elueringssteget med ättiksyra återstoden och "bundet" NHÄ liksom eventuell kvarvarande ammoniumvätekar- bonat elueras såsom ammoniumacetat och denna förening för- blir upplöst i acetonutfällningssteget.

Utgående från vattenolöslig primycin framställes således i enlighet med uppfinningen vattenlöslig primycin ur vilken eventuellt en vattenlöslig blandning av kompo- nenterna med formlerna (A5) och (Al) kan framställas, var- vid de enskilda komponenterna i denna tvåkomponentbland- ning också kan separeras. Alla de produkter som framstäl- 10 15 20 25 50 501 887 12 les i enlighet med uppfinningen är vattenlösliga och bio- logiskt aktiva.

De jämförande tunnskiktskromatogrammen och resulta- ten av biologisk utvärdering är visade i fig. 5. Tunn- skiktskromatografi utfördes på en Kieselgel 60 DC Alufo- lien F254-platta under användning av den övre fasen i en 58:2:l0:50 v/v blandning av butanol, etanol, ättiksyra och vatten såsom lösningsmedel samt en blandning av vanillin och svavelsyra vid l05° C såsom detekteringsmedel. Biolo- gisk utvärdering utfördes genom agardiffusionprov på Ba- cillus subtilis. Minimiinhiberingskoncentrationerna (NIC) mätta vid biologisk utvärdering är uppställda i tabell II nedan. Éëëâllull NIC/ng/ml Vattenlöslig utgångsprimycin 0,04 - 0,06 Vattenlöslig primycin 0,08 - 0,2 Blandning av (Al) och (A5) 0,05 - 0,1 Förening med formeln (A5) 0,5 - 1,0 Förening med formeln (Al) 0,05 - 0,06 Resultaten från den biologiska utvärderingen indi- kerar att de enskilda komponenterna av primycin är olika ifråga om aktivitet. Denna skillnad i aktivitet kan för- modligen tillskrivas det faktum att de enskilda komponen- terna utövar sin antibakteriella verkan på olika sätt el- ler kan ha olika angreppspunkter när de verkar på den le- vande organismen. Detta förklarar det faktum att en en- skild komponent kan samverka med verkan från en annan kom- ponent (se exempelvis ungerska patentskriften 196 509).

Gelningsegenskaperna hos de enskilda komponenterna med formlerna (A1) och (A5) liksom desamma för tvàkompo- nentblandningen har också undersökts. Det har konstaterats att när koncentrationen hållas på ett konstant värde avtar gelningshastigheten. De 5 - 10 mg/ml vattenlösningarna av 10 15 20 25 50 55 su1ass7v 15 _ de enskilda komponenterna kan förvaras under dagar (maxi- malt under en vecka) utan att någon förändring observeras medan en vattenlösning av tvåkomponentblandningen med sam- ma koncentration gelar inom 1 - 2 dagar, varjämte gelnings- tiden för vattenlöslig primycin i samma koncentration är kortare än en dag. Det kan antas att denna fördröjning i gelning har samband med en ändring i uppbyggnad eller med ori ent eri ngen ' hos hydroxi grupperna .

Det är känt från tidigare publikationer att primycin är mycket känslig för elektrolyter. I harmoni med denna observation som också ligger i harmoni med den jonofora na- turen hos primycin har vi observerat att i vattenlöslig primycin kan orienteringen hos hydroxigrupperna omkastas med katjoner vilket medför en abrupt men reversibel minsk- ning av vattenlösligheten hos primycin. När den emeller- tid förvaras i en sockerlösning med lämplig koncentration (såsom i isoton glukoslösning) kan såväl polymerisationen som katjonkänsligheten hos primycin i stor utsträckning undertryckas. 150 NM-spektra för produkterna som framställts i enlighet med uppfinningen är visade i fig. 6 - ll.

Fig. 6 visar det normala 150 NMR-spektrumet för vat- tenlöslig primycin (c = 500 mg/400/ul av metanol-d4, T = = 323 K). '“ Fig. 7 visar det normala, protonavkopplade 150 NMR- spektrumet för tvåkomponentblandningen av komponenterna med formlerna (Al) och (A5) (c = 250 mg/1,5 ml av metanol- -d4, T = 525 K, NS = 5000). 13 Fig. 8 visar det normala, protonavkopplade C NMR- spektrumet för föreningen med formeln (A3) (c = 100 mg/400 /ul av metanol-du, T = 525 K, NS = 5000).

Fig. 9 visar N NMR-spektrumet för den ammonium- acetathaltiga föreningen med formeln (A5). Spektrumet åstadkoms genom användning av EPT-pulsfrekvens (c = 50 mg/400/nl av metanol-da, T = 525 K, NS = 2000). 13 Fig. 10 visar det normala, protonavkopplade C NMR- spektrumet för den ammoniumacetathaltiga föreningen med formeln (A5) (c = 50 mg/400/ul av metanol-d4, T = 525 K, lO 15 20 25 50 55 8501 887 14 ns = 2700).

Fig. 11 visar det normala, protonavkopplade 150 NMR- spektrumet för föreningen med formeln (Al) (c = 80 mg/400 /ul av metanol-d4, T = 523 K, NS = 2700).

Från dessa spektraldata kan följande slutsatser dra- gas: Ingen ringslutning sker i den reaktion som användes för framställning av vattenlöslig primycin. Det är otvety- digt på grundval av 150 NMR-spektrumet att molekylen som undersökes innehåller fyra kvartära kolatomer. för karbonylkol uppträder vid 176,7 ppm. kvartära kolatomen i guanidingrupper uppträder vid 158,8 ppm medan signalerna för de återstående båda kvartära kol- atomerna uppträder vid 145,7 och 155,8 ppm (fig. 6). Om en ringslutning har förekommit skulle två ytterligare kvar- Signalen Signalen för den tära kolatomer ha framträtt i NMR-spektrumet.

Enligt NMR-spektra är det högst troligt att en mel- lanprodukt bildas vid kvasikondensationsreaktionen (fig. 6, signal vid l?O,4 ppm, vilken kan vara signalen för en kvartär karbonyl). Denna signal uppträder endast om vat- tenlöslig primycin separeras från vattenfria (absoluta) lösningsmedel. Primycin kromatograferas sedan i ett vat- tenhaltigt medium, varvid signalen vid 170,4 ppm försvin- ner (se fig. 7, NM-spektrumet för tvåkomponentblandning- en). Detta kan avslöja att den förmodade mellanprodukten genomgår hydrolys eller selektiv adsorption, vilka båda medför att den försvinner.

I det följande har på basis av l5C NMR-spektrumets uppbyggnad (DEPT) och användning av J-modulerad spineko- teknik bestämts antalet kolatomer av olika klass (kvartä- ra, tertiära /CH/, sekundära /CH2/ samt primära /CH5/ i de väsentliga komponenterna. Enligt denna bestämning in- nehåller molekylen fyra kvartära kolatomer som svarar mot de signaler som diskuterats ovan, 22 tertiära kolatomer (signalen vid 105,6 ppm svarar mot det anomera kolet i arabinos och signalerna vid 129,1 och 124,9 ppm svarar mot de tertiära kolatomerna i de båda omättade bindningarna), 22 - 25 sekundära kolatomer (osäkerheten kan tillskrivas 10 15 20 25 50 55 501 as1_ 15_ den olyckliga koincidensen mellan signalerna för etylenkol- atomerna i likadan kemisk miljö) samt sex primära kolatomer.

Av det ovan sagda följer att de empiriska formlerna för huvudkomponenterna i vattenlöslig primycin är praktiskt taget identiska med dem som diskuteras i litteraturen. I NMR-spektrumet för vattenlöslig primycin kan signalerna för två epimerer urskiljas vilka uppträder såsom dubbletter på grund av olika steriska konfigurationer hos -OH-,-CH5- och butylgrupper.

-OH-grupper förekommer i ställningarna 4, 8, 12, 16, 28, 50, 52, 54, 56 och 21' 1 molekylen, -CH5-grupper förekommer i ställningarna 5, 15, 21, 25 och 20' i molekylen och n-butylgruppen förekommer i ställningen 17 i mole- kylen. 150 NMR-spektrumet för tvåkomponentblandningen som framställts i enlighet med uppfinningen visas i fig. 7.

Man kan genom jämförelse av fig. 6 och 7 påstå att viktförhållandena hos huvudkomponenterna ändras. Vatten- löslig primycin innehåller föreningen med formeln (A5) i större mängd (se fig. 6) medan i tvåkomponentblandningen föreningen med formeln (Al) är den dominerande. Detta överensstämmer väl med resultaten från tunnskiktskromato- grafi som visas i fig. 5.

Av 15c NMR-spsktrumsn som visas 1 rig. lo och 11 följer att antalet kolatomer som föreligger i de båda hu- vudkomponenterna med formlerna (A5) och (Al) är praktiskt taget detsamma med den reservationen att på grund av den osäkerhet som diskuterats ovan antalet sekundära (CH2) kol- atomer kan skilja sig med en.

De små, ibland försumbara skillnaderna i kemiska skift hos kolatomerna i identiska ställningar i de båda huvudkomponenterna kan indikera att det inte föreligger någon signifikant skillnad mellan de båda huvudkomponen- terna. Kanske kan en formskillnad eller en växelverkan monomer-dimer förekomma (fig. 8).

Detaljer på uppfinningen (material och metoder) samt exempel som åskådliggör uppfinningen ges nedan. 10 15 20 25 50 55 501 887 16 Material och metoder Samtliga lösningsmedel och kemikalier som användes i exemplen var finkemikalier av högsta analytisk renhet (framställda av Merck, Fluka, Reanal, Whatman, Macherey- Nagel Co., Sigma). Vissa av lösningsmedlen renades eller renades ytterligare (gjordes absoluta) av oss. De torra lösningsmedlen förvarades över en molekylsikt (pordiame- ter: 5 _ 4 Å).

Följande substanser användes såsom adsorbenter för pelarkromatografi: Kieselgel 60 (partikelstorlek: 0,062 - 0,2 mm eller 0,2 - 0,5 mm), karboximetylcellulosa MN 2100 CM (Macherey- Nagel), CM-52, försvälld, mikrokornig (Whatman).

Följande substanser användes såsom adsorbenter vid tunnskiktskromatografi: DC Alufolien Kieselgel 60 F254 20 x 20 cm/0,2 mm (Merck nr 5554), DC Plastikfolien Kieselgel 60 F254 20 x 20 cm/0,2 mm (Merck nr 5755), Polygram Sil. G/UV254 20 x 20 cm/0,25 mm (Macherey- Nagel).

Vätskekromatografi företogs på en apparat från Gil- son Medical Electronics som är försedd med en differential- spektrofotometer (Holochrome HM typ UV monitor) med en Mo- del 201 fraktionssamlare, med en Model N2 skrivenhet och med en Minipuls-2 peristaltisk pump.

Tunnskiktskromatogrammen detekterades med en modi- fierad reagens av vaníllin - svavelsyra. 250 mg vaníllin (pro anal. kvalitet) upplöstes i 100 ml absolut etanol, lösningen kyldes till - lO° C och 2,5 ml koncentrerad sva- velsyra tillsattes droppvis. Lösningen sprutades ut på plattan (under användning av kvävgas såsom drivmedel) eller också nedsänktes plattan i reagenslösningen. Plattorna torkades i en kall luftström och aktiverades sedan vid l05° C under l - 2 minuter.

Sakaguchi-reaktionen utfördes på två sätt: (i) De lämpligt torkade plattorna behandlades utan uppvärmning med en 0,2 %-ig acetonlösning av 8-hydroxikino- 10 15 20 25 50 55 501 887. 17 lin, plattorna torkades i en kall luftström, varefter en 0,5 N natriumhydroxidlösning som innehåller 0,2 % brom sprutades på plattorna, och plattorna torkades utan upp- värmning. _ (ii) 2,5 g natriumhydroxid upplöstes i 5 ml vatten.

Lösningen kyldes till 2 - 50 C, utspäddes med 45 ml i för- väg kyld metanol, filtrerades och 50 mg 8-hydroxikinolin löstes i filtratet. Den resulterande lösningen var den första reagensblandningen. Den andra reagensblandningen framställdes genom upplösning av 250 mg N-bromsuccinimid i 50 ml av 10 %-ig vattenlösning av etanol som var kyld till 2 - 5° C. Plattorna behandlades med reagensblandning- arna såsom beskrivas under punkt (i) ovan.

Sakaguchi-reaktionen användes också för att detek- tera primycin i lösningar. Vid dessa undersökningar an- vändes den mikrokemiska metod som diskuteras i litteratu- ren med följande modifieringar: Mätningarna utfördes med N-bromsuccinimid. Standardserielösningen gjordes på argi- nin och den färgdensitet som bildades mättes på en Opton- spektrofotometer vid 520 nm. Följande reaktanter användes alltid i färskt framställda former: (1) 0,01 %-ig alkalisk a-naftollösning (framställd genom utspädning av 0,2 %-ig etanollösning av a-naftol med en 10 %-ig vattenlösning av natriumhydroxid), (2) 0,45 %-ig N-bromsuccinimidlösning (NBS) i 10 %-ig vattenlösning av etanol samt (5) 40 %-ig vattenlösning av urea.

Bestämningarna ucföraes vid o° c. I motsats 1111 litteraturdata var volymen hos reaktionsblandningen 1,7 ml och reaktionsblandningen bestod av följande komponenter: Lösning som skall undersökas l ml Alkalisk a-naftollösning 0,4 ml NBS-reagenslösning 0,1 ml Urealösning 0,2 ml Det är välkänt att Sakaguchi-reaktionen är mycket känslig för olika alkoholer och i allmänhet för oxoföre- ningar. Således medför exempelvis med primycin även en alkoholhalt (metanol, etanol) av 20 % en avsevärd minsk- 10 15 20 25 50 55 501 887 18 ning av extinktionen mätt vid 520 nm. Denna minskning el- ler nedgång är emellertid inte förbunden med den färgden- sitet som erhålles utan med dess spektrala skiftning (skift- ning mot lägre våglängdaområde). Om primycin inte löses i rent vatten utan i ett organiskt lösningsmedel eller i en blandning av organiska lösningsmedel (såsom i en 1:l:2 v/v blandning av butanol, etanol och vatten) kan den karakte- ristiskt färgade produkt som utvecklas pá Sakaguchi-reak- tionen extraheras i mängd till butanolfasen. Absorptions- maximum för färgen i denna fas ligger vid 480 nm.

Agardiffusionsteknik användes för den biologiska ut- värderingen av primycin. Såsom testorganism användes Ba- cillus subtilis ATCC 6655.

Bacillus subtilis ATCC 6655 odlades på ett Schaeffer- medium (Nutrient Broth No. 2/oxoid) med följande sammansätt- ning: Köttextrakt 5,2 g Pepton 5,2 g NaCl 1,6 g Mgso4.7H2o 0,25 g Kol 1,0 g Feso4.7H2o 278 /ng (1o'6 moi) löst i 900 ml vatten Lösningen uppvärmdes i ett tryckkärl under 50 minu- ter vid ett tryck av 1,5 atm, varefter pH inställdes på 7,0 - 7,2 med 5 - 6 droppar av 10 N natriumhydroxidlösning, varvid portioner om 90 ml av lösningen slogs i odlingsskà- lar och portionerna utökades med 10 ml av vardera av föl- jande lösningar: a) 256 mg (1o'5 mol) av ca(No5)2.4H2o löst 1 1oo ml destillerat vatten och b) 1979 mg (1o'5 moi) av Mnc12.4H2o löst 1 1oo m1 destillerat vatten.

Det titrerande näringsmediet framställdes på följan- de sätt: 5 g köttextrakt (Beef Extract Difco), 0,5 g pepton (Bacto Peptone Difco), 1 g Na2HP04 och 0,1 g KH2P04 löstes i 100 ml destillerat vatten, lösningen kokades under två 10 15 20 25 50 55 501 887 19 ' timmar och pH inställdes därefter på 8. Den varma lösning- en filtrerades, fick stå och svalna, filtratet utspäddes med 900 ml destillerat vatten och 20 g agar (Bacto Agar Difco), upplöst i ett Koch-kärl, tillsattes till 1 liter av lösningen. Den varma lösningens pH kontrollerades.

Portioner om 100 ml av den resulterande lösningen fylldes på förvaringsflaskor och värmebehandlades sedan under 20 minuter i ett tryckkärl under ett tryck av 1,5 atm.

Titreringsplattorna framställdes av det ovan angiv- na näringsmediumet på följande sätt: 100 ml av näringsme- diet smältes på ett vattenbad, smältan kyldes till 40 - 500 C och 0,5 ml av en sporsuspension av Bacillus subtilis ATCC 6655 tillblandades försiktigt med det fortfarande vätskeformiga näringsmediet. Det inympade näringsmediet fylldes i en glasskål med dimensionerna 50 X 50 X 5 cm som var tillverkad av 5 - 4 mm tjocka glasplattor, den stelna- de agarplattan odlades i förväg vid 57° C under 0,5 - 1 timme och därefter skars 42 hål med 10 mm diameter i plat- tan.

Lösningar innehållande 20 - 50/ug/ml aktivt medel framställdes ur de substanser som skulle undersökas [vat- tenolöslig utgångsprimycin; vattenlöslig primycin; en blandning av föreningarna med formlerna (A1) och (A5), en förening med formeln (A1); en förening med formeln (A527 i vatten eller i en l:l:2 v/v blandning av butanol, etanol och vatten, varvid de resulterande lösningarna utspäddes med buffrat, destillerat vatten (0,l5 molar fosfatbuffert, pH = 7,6) till koncentrationer om 0,05 - 0,1, 0,5 - 1,0 och 2,0/ng/ml. Portioner om 0,1 ml av de resulterande lös ningarna fylldes i hålen i de titrerande agarplattorna, varefter agarplattorna odlades i en termostat vid 57° C under 18 - 20 timmar. Därefter mättes diametrarna hos de extinktionszoner som utbrett sig i mm, de erhållna värdena inprickades på en halvlogaritmisk skala mot koncentratio- nerna hos utspädningarna av standardserie och aktivitets- värdena bestämdes genom extrapolation. 10 15 20 25 50 35 501 887 20 E§§a2§l_l Eramëtšllnifls av_vafi§e2lë§lis Brimzcin 500 mg (0,46 mmol) av finfördelad primycin (konta- minerad med bly) och 100 ml absolut etanol fylldes i en rundbottnad flaska med volymen 250 ml. Flaskan anslöts till en återloppskylare som var försedd med ett torkrör fyllt med CaCl2 och natronkalk, varvid blandningen upphet- tades till återlopp tills maximal upplösning nåddes (ca 15 - 50 minuter). Därefter tillsattes 50/ul (0,46 mmol) av etylcyanoacetat till blandningen. Reagensen tvättades i flaskan med en liten mängd absolut etanol. Blandningen upphettades vid återlopp under 15 minuter och därefter tillsattes 25 mg (0,46 mmol) av natriummetoxid till bland- ningen i tre lika delar i intervall om 50 minuter. De en- skilda delarna av reaktanten tvättades i flaskan med 1 - 2 ml destillerad etanol (96 %). Till och med efter till- förseln av den första delen av natriummetoxid började re- aktionsblandningen bli klar, varefter hela mängden primy- cin upplöstes och reaktionsblandningen svängde till att Vid slutet av reaktionstiden (4 timmar) fick blandningen kylas, filtrerades genom ett G4 sintrat bli ljust rosa. glasfilter samt koncentrerades till en liten volym i en Rotavapor R 110 (Büchi) apparat. tionsmediets etanol gradvis mot metanol på sådant sätt att den separerade substansen upplöstes i absolut metanol, lös- Därefter utbyttes reak- ningsmedlet indunstades och denna operation upprepades.

Efter denna behandling blev substansen, som har en begrän- sad löslighet i etanol, mycket löslig i metanol och förblev löst till och med i några få ml metanol. I detta steg ut- fälldes produkten ur metanolkoncentratet med absolut eter.

Den separerade substansen filtrerades genom ett G4 sintrat glasfilter, tvättades med absolut aceton samt torkades i en vakuumtorkpistol ("Blaugel", kloroform/etanol, kokpunkt: 65 - 7o° c). 410 mg (82 %) av vattenlöslig primycin erhölls, var- vid dess tunnskiktskromatogram visas i fig. 5. Vattenlös- lighet; so mg/mi, smä1tpunkt= 162 - 1a4° c, biologisk verkan (på Bacillus subtilis): 0,08 - 0,2/ug/ml. 10 15 20 25 50 55 so1”se7 21, §z§e2sl-š Eramsfiällnifls :vie :vàkefflnmeatälanànins etßi; aysiakemmaeatsraamedierslerafa(A1)__°sh_<¿5.>.

Den vattenlösliga primycin som framställts på sätt som beskrives i exempel l användes såsom utgångssubstans.

Huvudkomponenterna i primycin separerades medelst pelar- kromatografi på silikagel. Silikagel (Kieselgel 60, par- tikelstorlek: 0,2 - 0,5 mm) renades genom upprepade tvätt- ningar med avjoniserat vatten och dekantering. Före på- fyllning gjordes den homogena suspensionen bubbelfri i vakuum.

Silikagel fylldes i en Pharmacia-kolonn med dimen- sionerna 2,6 x 250 cm som var försedd med en flödesadapter.

En 5 - 10 mg/ml vattenlösning av 500 mg av utgångssubstan- sen, som filtrerats genom ett G5 sintrat glasfilter, till- föres kontinuerligt till kolonnen genom flödesadaptern.

Kolonnen eluerades därefter med vatten med en hastighet av 150 ml/timme (= 25 ml/timme/omg) och utströmmande frak- tioner om 24 ml uppsamlades. Kromatografibetingelserna och elueringsdiagrammet är visade i fig. 5.

Elueringen fortsattes sedan med en l %-ig vattenlös- ning av Partridge-blandning (Partridge-blandning är den övre fasen av en 58:2:l0:50 v/v blandning av n-butanol, etanol, ättiksyra och vatten). De enskilda toppfraktioner- na kontrollerades medelst tunnskiktskromatografi. De topp- fraktioner som innehåller de båda komponenterna hopsamla- des, en liten mängd nlntanol (antiskummedel) tillsattes, lösningen koncentrerades i en Rotavapor-apparat och koncent- ratet dehydratiserades gradvis först med destillerad meta- nol och sedan med absolut metanol. Det resulterande kon- centratet behandlades med absolut eter, den utfällda sub- stansen bortfiltrerades, tvättades med aceton och torkades i en torkpistol. 260 mg (52 %) av en fast substans erhölls. smältpunku; 165 - 1ee° c, lösiignet i vattefn so mg/ml, biologisk aktivitet (på Bacillus subtilis): 0,05 - 0,1 /ug/ml. 10 15 20 25 50 55 501 887 22 ɧÉEEÉl_É Eramsfišllnins atkama°aeatsn_msd_feraeln_(A51 Den vattenlösliga tvåkomponentblandningen som fram- ställts sàsom beskrives i exempel 2 användes såsom utgångs- substans. Komponenterna separerades från varandra medelst jonbyteskromatografi på karboximetylcellulosa i NHÄ- form.

CM-52 cellulosa (försvälld, mikrokornig, Whatman) i H+-form suspenderades i vatten, behandlades med l molar vattenlös- ning av ammoniumvätekarbonat, tvättades flera gånger med vatten, dekanterades och behandlades i vakuum för avlägs- nande av bubblorna. Adsorbenten fylldes på en Pharmacia- kolonn (2,6 X 6 cm) som var försedd med en flödesadapter. 450 mg av tvåkomponentblandningen som man utgick ifrån till- föres till kolonnen såsom en 4,5 mg/ml vattenlösning genom flödesadaptern. Eluering företogs med en flödeshastighet av 150 ml/timme (= 29 ml/timme/cm2) och utströmmade frak- tioner om 24 ml uppsamlades. Kromatografibetingelserna och elueringsdiagrammet är visade i fig. 4.

Kolonnen eluerades (tvättades) först med vatten.

Efter fullständig urtvättning fortsattes elueringen med TOPP- fraktionerna av detta eluat innehåller den rena, homogena komponenten med formeln (A3). Ammoniumvätekarbonatfraktio- ner som innehåller föreningen med formeln (A5) såsom enda komponent uppsamlades, en liten mängd av n-butanol tillsat- tes och blandningen indunstades till i huvudsak torrhet.

Vatten avdunstades àterupprepat från återstoden för av- lägsnande av flyktig ammoniumvätekarbonat, varefter koncent- ratet dehydratiserades först med destillerad metanol och sedan med absolut metanol. Substansen utfälldes slutligen från koncentratet med absolut eter. Den separerade substan- sen bortfiltrerades på ett G4 sintrat glasfilter, tvättades med aceton och torkades. 190 mg (42 %) av en förening med førmein (A5) erhölls. smä1tpunkt= 159 - 1e1° c, iösiignet i vatten: ca 5 mg/ml (denna nedgång i vattenlöslighet kan tillskrivas närvaron av visst bundet NH: samt rester av am- moniumvätekarbonat), biologisk aktivitet (på Bacillus sub- tilis): 0,5 - l/ng/ml. en 5 mmolar vattenlösning av ammoniumvätekarbonat. 10 15 20 25 50 55 501 eavg 25A Såsom omnämnts ovan utsattes substansen för uppre- pad jonbyteskromatografi på karboximetylcellulosa i H+-form för avlägsnande av föroreningar som minskar dess vattenlös- lighet. Substansen tillfördes till kolonnen såsom en 2 - 4 mg/ml vattenlösning, kolonnen uttvättades helt med vatten och dehydratiserades sedan gradvis först med destillerad metanol och sedan med absolut metanol. Substansen eluera- des med absolut metanol som innehöll 10 mmol ättiksyra.

Utflödet filtrerades genom ett G4 sintrat glasfilter eller genom en Whatman glasfiberplatta, filtratet koncentrerades till en liten volym och produkten utfälldes ur koncentra- tet med absolut aceton. Därefter följdes den metod som be- skrives i föregående stycke. En ren förening med formeln (A5) erhölls. smä1tpunkt= 164 _ 1ee° c (1 motsats till utgångsvärdet 159 - 16100), löslighet i vatten: 40 - 50 mg/ml. Den upprepade jonbyteskromatografin resulterade i en materialförlust av maximalt lO %. 9521112211 Efâmâïällfilnå šV_k2mB°BeE3Én_mâd_f2rEelfl_(All Vid det förfarande som beskrives i exempel 5 elue- rades komponenten med formeln (A5) medan komponenten med formeln (Al) förblev bunden vid karboximetylcellulosakolon- nen i NHÃ-form. Komponenten med formeln (A1) avlägsnades från kolonnen på följande sätt: Kolonnen tvättades med vatten för fullständigt av- lägsnande av ammoniumvätekarbonat och den dehydratiserades sedan gradvis först med destillerad metanol och sedan med absolut metanol. Därefter eluerades komponenten med formeln (Al) med absolut metanol som innehöll l0 mmol ättiksyra.

Utflödena hopsamlades, filtrerades genom ett G4 sintrat glasfilter, indunstades till en liten volym och produkten utfälldes från koncentratet med absolut aceton. Därefter följdes det förfaringssätt som beskrivas i exempel 5. 150 mg (55 %, räknat på mängden av den utgångssub- stans som användes i exempel 5) av komponenten med formeln (Al) erhölls. Smältpunkt: 164 - 1680 C, löslighet i vatten: 50 mg/ml, biologisk aktivitet (pà Bacillus subtilis): 0,05 - 0,06/ug/ml.

Claims (7)

501 887 24 P a t e n t k r a v

1. Förfarande för framställning av vattenlöslig primycin och separation av dess komponenter med formlerna (Al) och (A5) antingen såsom enkla komponenter eller så- som en blandning av två komponenter, k ä n n e t e c k- n a t av att (i) vattenolöslig primycin bringas att reagera i en Cl_5-alkohol med en kondenserbar substans, som innefat- tar en C-C-C-brygga, i närvaro av natrium- eller kalium- metoxid eller -etoxid, varvid den resulterande produkten, som har en vattenlöslighet av 40 - 60 mg/ml, separeras och eventuellt (ii) underkastas den resulterande produkten pelar- kromatografi på silikagel, varvid en ca l %-ig vattenlös- ning av Partridge-blandning tillföras såsom elueringsme- del så att man erhåller en blandning av komponenterna med formlerna (Al) och (A5) med en vattenlöslighet av ca 50 mg/ml, och eventuellt (iii) underkastas den resulterande tvàkomponent- blandningen jonbyteskromatografi, varvid karboximetylcel- lulosa i ammoniumform användes såsom adsorbent och adsor- benten elueras med en vattenlösning av ammoniumvätekarbo- nat så att man erhåller komponenten med formeln (A5) med en vattenlöslighet av ca 50 mg/ml i ren form, och even- tuellt (iv) fortsëttes elueringen med absolut metanol som innehåller ca lO mmol ättiksyra så att man erhåller kompo- nenten med formeln (Al) med en vattenlöslighet av ca 10 mg/ml i ren form.

2. Förfarande enligt krav 1, k å n n e t e c k- n a t av att etylcyanoacetat användes i steg (i) såsom kondenserbar substans som innehåller en C-C-C-brygga.

3. 5. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e- t e c k n a t av att etanol användes i steg (i) såsom 501 '887_. 25

4. Förfarande enligt något av kraven l - 5, k ä n n e t e c k n a t av att steg (i) företagas i när- varo av natriummetoxid.

5. Förfarande enligt något av kraven 1 - 4, k ä n n e t e c k n a t av att steg (i) företagas i när- varo av 15 - 20 ppm bly som tillförts såsom en löslig blyförening.

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e czk- n a t av att blyacetat användes_sàsom löslig blyförening.

7. Farmaceutisk eller veterinär komposition vilken innehåller såsom aktivt medel vattenlöslig primycin eller en vattenlöslig blandning av komponenterna med formlerna (Al) och (A5) eller en vattenlöslig enda förening med for- meln (A1) eller (A5) tillsammans med farmaceutiskt godtag- bar bärare, utspädningsmedel eller annat hjälpmedel.