AT336785B - Verfahren zur gewinnung von interferon - Google Patents

Description

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   Es wurde gefunden, dass Zweikomponenten-Komplexe, bestehend aus Polyriboinosinsäure (=A) der Formel 
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 worin 
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 k eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 und b eine ganze Zahl zwischen 1 und 2000 bedeuten, oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen, und
Polyribo-2-thiocytidylsäure (= B) der Formel 
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 worin 
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 m eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 2000 bedeuten, oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen zum Schutz bzw. zur Behandlung von Wirbeltieren gegen Infektionen durch Viren, Bakterien und Protozoen verwendet werden können ; ausserdem besitzen sie tumorhemmende Eigenschaften. 



   Die oben beschriebenen Zweikomponenten-Komplexe (= A + B) oder deren Metall- oder Ammoniumsalze wirken in Zellkulturen von Wirbeltieren antimikrobiell, vorzugsweise antiviral. 



   Die hier beschriebenen Zweikomponenten-Komplexe können daher zur Gewinnung von Interferon verwendet werden. 



   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Interferon, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellkulturen von Wirbeltieren mit Zweikomponenten-Komplexen, bestehend aus Polyriboinosinsäure der Formel (I) und   Polyribo-2-thiocytidylsäure   der Formel (II) oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen behandelt und aus diesen Zellkulturen Interferon gewinnt. 



   Unter einem Zweikomponenten-Komplex sollen Aggregate verstanden werden, die sich aus A der For-   mel (I)   und B der Formel   (tri)   aufbauen und die in der Folge mit A + B bezeichnet werden, wobei verschiedene Strukturen des Komplexes vorliegen können. 



   Der Komplex kann   z. B.   ein Doppelstrang sein, der aus je einem Homopolynucleotid besteht, welche gleich lang sind, d. h. eine gleiche Anzahl von Basen besitzen. Da es sich bei diesen   Homopolynucleotiden   um Polymeren handelt, die bekannterweise kein einheitliches Molekulargewicht besitzen, d. h. deren Basenanzahl und damit Kettenlänge variiert, kommen auch andere Aggregate vor. Dabei kann die Anzahl der komplementären Basen innerhalb eines Komplexes ungleich sein. 



   Es kann sich z. B. auf Grund des nicht einheitlichen Molgewichtes ein A-Strang mit entweder zwei (oder mehreren) zu langen oder zu kurzen B-Strängen zusammenlagern und vice versa. Dies kann auch dann der Fall sein, wenn die Gesamtkonzentrationen an Inosinsäure und   2-Thiocytidylsäure   gleich sind. Es sind auch Strukturen möglich, welche am besten durch Dreifachstränge repräsentiert werden. 



   In allen Fällen wird sich ein wegen der Stöchiometrie des wirksamen Komplexes (welche zur Zeit noch nicht genau bekannt ist) gegebenenfalls im Überschuss vorliegendes Homopolynueleotid neben diesem Komplex frei in der Reaktionslösung befinden und von diesem in vielen Fällen auch nicht vollständig abgetrennt werden können, was dessen Wirksamkeit aber im allgemeinen nicht beeinflusst. 



   Die Bedeutung der Interferone, welche auch mit andern Ausdrücken, wie "Vireninhibierender Faktor" und "Vireninhibierungssubstanz" bezeichnet werden, wurde in der Literatur diskutiert und liegt darin, dass sie das bis heute einzige bekannte antivirale Mittel mit breitem Spektrum sind. Interferone werden nach dem heutigen Stand der Kenntnisse definiert als Proteine zellulärer Herkunft mit verschiedenen Molekulargewichten. 



   Sie hemmen die Virusvermehrung durch einen intrazellulären Mechanismus, der Ribonucleinsäure-und Proteinsynthese benötigt. Die Interferone sind artspezifisch, d. h. sie wirken nur in Zellen der gleichen (oder einer nahe verwandten) Tierart, aus der sie stammen. Sie   sind virus-unspezifisch, d. h.   sie wirken gegen verschiedene nicht-verwandte Virusarten. Sie haben keine direkt virusinaktivierende Wirkung. Als Proteine können sie durch Trypsin abgebaut, also unwirksam gemacht werden. 



   Man kann die Interferonbildung mit Hilfe von A + B in einer Zellkultur, vorzugsweise der zu behandelnden Wirbeltierart, induzieren und die aus diesen Zellkulturen gewonnenen Interferone, gegebenenfalls nach   Aufreinigung, applizieren.    

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   Besonders vorteilhaft ist die überraschend grosse Stabilität von A + B. So weisen die Zweikomponenten-
Komplexe bis 1000C eine    Tm   (das ist jene Temperatur, bei welcher der Komplex wieder zur Hälfte in seine
Komponenten zerfallen ist) auf und sind auch nach 24-stündiger Behandlung mit Humanserum noch wirk- sam. 



   Die zur Herstellung von A + B oder dessen Metall- oder Ammoniumsalzen verwendeten Homopolynucleo- tide haben ein   Pentosephosphatgerüst, worin   die Pentose Ribose ist. Sie enthalten entweder Hypoxanthinoder
2-Thio-cytosin als Basen. Sie werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt, beispielsweise durch
Behandeln der   Nucleosiddi-oder-triphosphate   mit einem polymerisierenden Enzym. 



   Die Herstellung von A + B oder dessen Metall-oder Ammoniumsalzen aus A der Formel (I) und B der   Formel (n)   gelingt nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch   Vermischen wässeriger Lösungen   der beiden Homopolynucleotide bei Temperaturen zwischen 10 und 950C. 



   Im allgemeinen wird dabei durch Zugabe von anorganischen   und/oder   organischen Salzen, vorzugsweise
Alkalimetallhalogeniden, insbesondere   NaCl,   eine definierte Ionenstärke eingestellt, die vorzugsweise zwi- schen 0,001 und 1,   0 liegt.   Der pH-Wert der Lösungen kann zwischen 5,0 und 11,5 liegen ; vorzugsweise ar-   i   beitet man bei pH-Werten zwischen 6,5 und 11. 



   Um die Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Wertes zu erzielen, arbeitet man meist mit gepufferten
Lösungen der Homopolynucleotide. Als Puffersubstanzen verwendet man z. B. organische oder anorganische
Alkalimetallsalze, vorzugsweise Natriumsalze, insbesondere Natriumkakodylat. Daneben kann man als Puf- fersubstanzen bzw. in Puffergemischen gebräuchliche Salze verwenden, wie z. B. Na-Acetat,   KHPO,      NaHPO , K-Hydrogentartrat oder Na-Citrat ; aber z. B. auch Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan/HCl.   Ge- gebenenfalls kann man auch organische, mit   HO mischbare Lösungsmittel zusetzen, beispielsweise ein-oder   mehrwertige Alkohole, wie Methanol, Propanol, Äthylenglykol oder Glycerin oder z. B. aprotisch dipolare
Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxyd, Formamid oder Dimethylformamid. 



   Um die gewünschte und eine für die Komplexbildung günstige Ionenstärke zu erzielen, kann man gleiche
Volumina von Lösungen vermischen, die vorzugsweise gleiche Konzentrationen (bezogen auf die Basen) der
Komponenten enthalten und jeweils die gewünschte Ionenstärke besitzen. Man kann aber auch verschieden   grosse Volumina von Lösungen unterschiedlicher   Konzentration und unterschiedlicher Ionenstärke in der Form vermischen, dass das Reaktionsgemisch schliesslich die gewünschte Ionenstärke besitzt. Vorzugsweise wird man danach trachten, dass auch in diesem Fall gleiche Molzahlen der beiden Komponenten (wieder bezogen auf die Basen) im Reaktionsgemisch vorliegen. 



   Da durch das Puffervermögen und den Salzgehalt des physiologischen Systems des Wirbeltieres sowohl ein bestimmter pH-Wert, als auch eine bestimmte Ionenstärke festgelegt werden, ist es in weiten Grenzen unkritisch, unter welchen Bedingungen A + B gewonnen wurde. 



   Die Wirkung wird im allgemeinen durch den unter den physiologischen Bedingungen stabilsten Komplex hervorgerufen. Gegebenenfalls lagern sich auch andere Komplexe, die unter Umständen unter nichtphysiologischen Bedingungen gewonnen wurden, erst mit tierischen Organismus oder in der unter physiologischen Bedingungen gehaltenen Zellkultur in den wirksamen Komplex um. 



   A + B kann entweder durch physikalische Methoden, wie Bestimmung der hyperchromen Verschiebung im ultravioletten Absorptionsspektrum,   des ORD-Spektrums, der Svedberg-Konstante, derT , durch Sac-     charose-Dichtegradient-Fraktionierung   oder Chromatographie, insbesondere aber auch durch biologische Methoden, wie die Fähigkeit, die Erzeugung von Interferon zu induzieren, charakterisiert werden. Unter den im folgenden beschriebenen Versuchsbedingungen weist keiner   der Polynucleotideinzelstränge diese Aktivität   auf. 



   Eine besonders   gute Charakterislerungsmöglichkeit für   einen solchen Zweikomponenten-Komplex ist der Nachweis seiner biologischen Wirkung, der am einfachsten dadurch erbracht werden kann, dass man seine Schutzwirkungen gegen eine Virusinfektion in der Zellkultur misst. Man stellt beispielsweise eine Verdünnungsreihe des Komplexes in   Zellkultur- Erhaltungsmedium   her, überschichtet z. B. geschlossene Zellrasen von sekundärenKaninchennierenzellen mit den   verschiedenenverdünnungen   und bebrütet etwa 18 bis 24 h bei 35 bis 370C. 



   Anschliessend wird die Flüssigkeit aus den Zellkulturgefässen entfernt, die Zellen werden mit einem geeigneten Virus, beispielsweise Herpessimplex-Virus, infiziert, mit Agar überschichtet und so lange bebrütet, bis die als Folge der Virusinfektion auftretende Zellzerstörung in unbehandelten Kontrollen zu sichtbaren Löchern im Zellrasen, sogenannte "Plaques", geführt hat. Nach Anfärben der Zellen werden die Plaques gezählt und diejenige Komplex-Konzentration ermittelt, die zu einer 50%igen Verminderung der Plaquezahlgegenüber der unbehandelten Kontrolle führt. 



   In analoger Versuchsanordnung kann durch Verwendung verschiedener Zellarten und verschiedener Virusarten nachgewiesen werden, dass die Schutzwirkung des Komplexes weder an eine bestimmte Zellart, noch an eine bestimmte Virusart gebunden ist. 



   Zum Nachweis der Interferoninduzierung durch A + B überschichtet man einen geschlossenen Zellrasen 

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 beispielsweise   vonKaninchennieren- oder   Mäuseembryonalzellen mit einer Lösung von A + B im Erhaltungsmedium. Dadurch werden die Zellen zur Abgabe von Interferon angeregt. Dieses Interferon kann nach bekannten Methoden aus der überstehenden Flüssigkeit isoliert und als solches charakterisiert werden. 



   Zum Nachweis der Virushemmung durch Interferon werden z. B. Zellrasen von Kaninchennierenzellen mit Kanincheninterferon über Nacht bebrütet und anschliessend mit Virus infiziert. Der weitere Versuchsablauf entspricht dem oben beschriebenen Plaquereduktionstest. Auf diese Weise kann der Interferongehalt gemessen werden. 



     Durch Verwendung verschiedener Virusarten, z. B.   Herpes simplex-, Vaccinia-, Vesicular-StomatitisVirus, wird die Virus-Unspezifität nachgewiesen. Die Artspezifität wird bewiesen, indem z. B. Mäuseembryonalzellen mit Kanincheninterferon behandelt werden. In diesem Versuch wird die Virusvermehrung nicht gehemmt. 



   Es kann auch gezeigt werden, dass das Interferon nach Trypsinbehandlung keine Schutzwirkung mehr hat. 



  Die Abhängigkeit der Interferonwirkung von der RNA- und Proteinsynthese der Zellen kann z. B. dadurch bewiesen werden, dass man Zellen, deren Syntheseapparat mit Actinomycin D blockiert wurde, mit Interferon behandelt. In diesen Zellen wird beispielsweise die Vermehrung von   Vesicular-Stomatitis-Virus   nicht gehemmt. 



   Nachfolgend wird die erfindungsgemässe Gewinnung von Interferon unter Verwendung der Zweikomponenten-Komplexe veranschaulicht. 



   An Stelle des   im folgenden genannten Zellkulturerhaltungsmediums können   selbstverständlich auch andere Medien verwendet werden, da jene auf die Wirkung der Zweikomponenten-Komplexe keinen Einfluss haben und nur für die Zellkulturen selbst von Bedeutung sind. 



   Die in den folgenden Abschnitten verwendete Polyriboinosinsäure   (= A)   ist übliche Handelsware und besitzt einen    S2 -Wert   von 5,3. Die   Polyribo-2-thiocytidylsäure   (= B), welche in den folgenden Beispielen eingesetzt wurde, ist nach bekannten Methoden, welche in der deutschen Offenlegungsschrift 2041735, 
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   8, 3), enthaltend 0, 4 mMol Tris- (hydroxymethyl) -aminomethanhydrochlorid (= Tris. HC1), 0, 008 mMolMgCl, 0, 04mMol Dinatriumsalz des 2-Thioeytidin-5'-diphosphats, 0, 04mMolDithiothreitolund 10 Enzymeinheiten Polynucleotidphosphorylase (spezifische Aktivität 0,165 Mol UDP/h x mg Protein bei 370) 4 h bei   370 inkubiert. Nach Abtrennung des Proteins und 48-stündiger Dialyse der auf 1,5 ml eingeengten wässerigen Phase bei 30 gegen 0,01 Mol Tris.

   HC1 (PH 7,0) wurde B erhalten, welches einen    s,. w-Wert   von 8,3 aufwies und in den folgenden Beispielen eingesetzt wurde. (Selbstverständlich kann man auch Präparationen von A bzw. B mit andern    s20,     w-Werten   verwenden.)
Vorschrift :
Zu 0,53 ml einer 0,01 molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung (PH = 7), welche 
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 temperatur stehen und erhält so eine Lösung von A +   B ;

   Hyperchromie gegenüber   einem Summenspektrum der Komponenten beträgt bei
250 nm 18   %,   bei 260 nm 18,2%, bei
270 nm 20, 8%, bei 280 nm 17 %. 
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<tb> 5 <SEP> nm <SEP> ; <SEP> s <SEP> C'/C
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<tb> 5, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 
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<tb> 12, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 
<tb> 13, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 83 <SEP> 
<tb> 14, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 93 <SEP> 
<tb> 15, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI5.2 
 
 EMI5.3 
 
<tb> 
<tb> Versuch <SEP> Zellen <SEP> Virus <SEP> PRD
<tb> y/ml
<tb> 1 <SEP> Prim.

   <SEP> Kaninchen-Niere <SEP> Herpes-simpl. <SEP> 0,0035
<tb> 2 <SEP> Prim. <SEP> Kaninchen-Niere <SEP> Herpes-simpl. <SEP> 0,0065
<tb> 3 <SEP> Sek. <SEP> Kaninchen-Niere <SEP> Vaccina <SEP> 0,0030
<tb> 4 <SEP> Sek. <SEP> Kaninchen-Niere <SEP> Herpes-simpl. <SEP> 0,0061
<tb> 
 
Es wurde auch A bzw. B allein geprüft ; dabei konnte bis zu einer Konzentration von 0,   61 l'Im !   unter den oben angegebenen Versuchsbedingungen keine Reduktion der Plaquezahl beobachtet werden. 



     Beispiel 2 :   Zur Messung der biologischen Aktivität des nach der obigen Vorschrift hergestellten Komplexes wurden Plaquereduktionstests durchgeführt. Die Versuchsanordnung entspricht der   inBeispielA   beschriebenen mit dem Unterschied, dass ausschliesslich   sekundäre     Kaninchennierenzellen   verwendet wurden. 



  Das   Zellkulturerhaltungsmedium   enthielt in den Versuchen 3 und 4 kein Streptomycin. 

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<tb> 
<tb> 



  Versuch <SEP> Zellen <SEP> Virus <SEP> PRD
<tb> &gamma;/ml50
<tb> 1 <SEP> sek. <SEP> Kaninchen-Niere <SEP> Herpes <SEP> simpl. <SEP> 0,013
<tb> 2 <SEP> sek. <SEP> Kaninchen-Niere <SEP> Vaccinia <SEP> 0,00067
<tb> 3 <SEP> sek. <SEP> Kaninchen-Niere <SEP> Herpes <SEP> simpl. <SEP> 0,0015
<tb> 4 <SEP> sek. <SEP> Kaninchen-Niere <SEP> Herpes <SEP> simpl. <SEP> 0,0057
<tb> 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Gewinnung von Interferon, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellkulturen von Wirbeltieren mit Zweikomponenten-Komplexen, bestehend aus Polyriboinosinsäure der Formel EMI6.2 worin EMI6.3 k eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 und b eine ganze Zahl zwischen 1 und 2000 bedeuten, oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen und Polyribo-2-thiocytidylsäure der Formel <Desc/Clms Page number 7> EMI7.1 EMI7.2 EMI7.3