-
Zweikomponenten-Komplexe mit biologischer Wirkung Es wurde gefunden,
daß Zweikomnponenten-Komplexe, bestehend aus Polyriboinosinsäure (= A) der Formel
I
I k eine ganze Zahl zwischen 1 uxid 3 und b eine ganze Zahl zwischen 1 und 2000
bedeuten, oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen und
Polyribo-2-thiocytidylsäure
(= B) der Formel II
II m eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 2000
bedeuten, oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen zum Schutz bzw. zur Behandlurig
c Wirbeltieren gegen Infektionen durch Viren, Bakterpen und Protczoen verwendet
werden können; außerdem besitzen sie tumorhemmende Eingeschaften.
-
Die oben beschriebenen Zweikomponenten-Komplexe (= A+B) oder deren
Metall- oder Ammoniumsalze wirken in Wirbeltieren bzw.
-
in Zellkulturen von Wirbeltieren antimikrobiell, vorzugsweise antivira@,
aber auch tumorhemend.
-
Die hier beschriebenen Zweikomponenten-Komplexe können daher als Arzneimittel
oder zur Gewinnung von Arzneimitteln verwendet werden Die Erfindung betrifft Zweikomponenten-Komplexe,
dadurch gekennzeichnet, daß sie aus
a) Polyriboinosionsäure der
Formel 1, oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen und b) Polyribo-2-thiocytidylsäure
der Formel II, oder deren Metall-oder Ammoniumsalzen bestehen.
-
Bevorzugt sind Zweikomponenten-Komplexe, dadurch gekennzeichnet daß
k=1 ist, und Zweikomponenten-Komplexe, dadurch gekennzeichnet, daß m=1 ist. Insbesondere
betrifft die Erfindung Zwei.-komponenten-Komplexe, dadurch gekennzeichnet, daß k=m=1
ist Zweckmäßigerwe.ise ist bei diesen bevorzugten Zweikomponenten-Komplexen b größer
als 2, vorzugsweise größer als 10, insbesondere größer als 100. Ebenso ist es vorteilhaft,
wenn n größer als 2, vorugsweise größer als 10, insbesondere größer als 100 ist.
Besonders bevorzugt sind daher Zweikomponenten-Komplexe mit k = m = 1 und b größer
als 10, insbesondere größer als 100, sowie ii größer als 10, insbesondere größer
als 100.
-
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von Zweikomponenten-Komplexen, die aus a) Polyriboinosinsäure der Formel I, oder
deren Netall- oder Ammoniumsalzen und b) Polyribo-2-thiocytidysäure der Formel II,
oder deren Metall oder Ammoniumsalzen bestehen,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Lösungen, vorzugsweise wässrige Lösungen mit bestimmter Ionenstärke der
Homopolynucleotide der Formel I bzw. der Formel II vermischt, oder daß man die eine
Komponente in einer Lösung der anderen Komponente herstellt.
-
Nach dem erfindungsgemäße Verfahren können vor allem auch die besonders
bevorzugten Zweikomponenten-Komplexe hergestellt werden.
-
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von
pharmazeutischen Präparaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Zweikomponenten-Komplexe,
bestehend aus A der Formel I und 33 der Formel II oder Metall- oder Ammoniumsalze
derselben, ge gebenenfulls zusammen mit mindestens einen festen, flüssigen, halbflüssigen
und/oder gasförmigen Hilfs-, Träger- oder Treibstoff und gegebenenfalls zusammen
mit mindestens einem weiteren Wirkstoff in eine geeignete Dosierungsform bringt,
sowie pharma zeutis ehe Zubereitungen, enthaltend eine wirksame Dosis der Zweikomponenten-Komplexe,
bestehend aus A der Formel I und B der Formel II oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen,neben
m:i.ndestens einem festen, flüssigen, halbflüssigen und/oder ga.sförmigen Träger-,
Treib- oder Zusatzstoff.
-
Bevorzugt sind pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend 0,001 bis
200 mg der Zweikomponenten-Komplexe, bestehend aus A der Formel I und B der Formel
II oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen, neben mindestens einem festen, flüssigen,
halbflüssigen und/oder gasförmigen Träger-, Treib- oder Zusatzstoff.
-
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erzielung eIner antimikrobiellen
und/oder tumorhemmenden Wirkung in Wirbeltieren dadurch gekennzeichnet, daß man
eine wirksame Dosis der Zweikomponenten-Komplexe, bestehend aus A der Formel I und
B der Formel II oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen verabreicht.
-
Außerdem betrifft die Erfindung insbesondere die Verwendung der Zweikomponenten-Komplexe,
bestehend aus A der Formel 1 und B der Formel II oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen
als interferoninduzierendes Mittel.
-
Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Interferon Gegenstand
der Erfindung, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen turen mit Zweikomponenten-Komplexen,
bestehend aus Polyriboinosinsäure der Formel I und Polyribo-2-thiocytidylsäure der
Formel II oder deren Metall- oder Ammoniumsalzen behandelt und aus diesen Zellkulturen
Interferon gewinnt.
-
Unter einem Zweikomponenten-Komplex sollen Aggregate verstanden werden,
die sich aus A der Formel I und E der Formel II aufbauen und die in der Folge mit
A+B bezeichnet werden, wobei verschiedene molare Verhältnisse im Komplex und verschiedene
Strukturen des Komplexes vorliegen können. Der Komplex kann z.B. ein Doppelstrang
sein, der aus je einem Homopolynucleotid besteh, welche gleich lang sind, d.i. eine
gleiche Anzahl von Basen t)esitzen. Da es sich bei diesen Homopolynucleotiden um
Polymere handelt, die bekannterweise kein einheitliches Mo lekulargcwici1it besitzen,
d.h., deren Basenanzahl und damit Kettenlänge variiert kommen auch andere Aggregate
vor. Dabei kann die Anzahl der komplementären Basen innerhalb eines Komplexes ungleich
sein.
-
Es kann sich z.B. auf Grund des nicht einheitlichen Molgewichtes ein
A-Strang mit entweder zwei (oder mehreren) zu langen oder zu kurzen B-Strängen zusammenlagern
und vice versa. Dies kann auch dann der Fall sein, wenn die Gesamtkonzentrationen
an Inosinsäure und 2-Thiocytidylsäure gleich sind. Es sind auch Strukturen möglich,
welche am besten durch Dreifachstränge repräsentiert werden. In allen Fällen wird
sich ein wegen der Stöchiometrie des wirksamen Komplexes (welche zur Zeit noch nicht
genau bekannt ist) gegeben.enfalls im Überschluß vorliegen des Homopolynucleotid
neben diesem Komplex frei in der Reaktionslösung befinden und von diesem in vielen
lvällen auch nicht vollständig abgetrennt werden können, was dessen Wirksamkeit
aber im allgemeinen nicht beeinflußt.
-
Ein besonders wichtiger Aspkt der vorliegenden Erfindung ist die Induzierung
der Bildung von Substanzen - insbesondere von Interferonen - , die das Virenwachstum
in Wirbeltieren bzw. in Zellkulturen von Wirbeltieren inhibieren.
-
Die Bedeutung der Interferone, welche auch mit anderen Ausdrücken,
wie "Vireninhibierender Faktor" und "Vireninhibierungssubtanz" bezeichnet werden,
wurde in der Literatur diskutiert und liegt darin, daß sie das bis heute einzige
bekannte antivirale Mittel mit breitem Spektrum sind. Interferone werden nach dem
heutigen Stand der Kenntnisse definiert als Pro-teine zellulärer Herkunft mit verschiedenem
Molekulargewichten. Sie hemmen die Virusvermehrung durch einen intrazellulären Mechanismus,
der Ribonucleinsäure- und Proteinsynthese benötigt. Die Interferone sind artspezifisch,
d,h. sie wiMen nur in Zellen der gleichen (oder einer nahe verwandten) Tierart,
aus der sie stammen. Sie sind virus-@@spezifisch, d.h. sie wirken gegen verschiedene
nicht-verwandte Virusarten. Sie haben keine direkt virusinaktivierende Wirkung Als
Proteine können sie durch Trypsin abgebaut, al 0 unwirksam gemacht werden.
-
Der Schutz bzw. die Behandlung eines Wirbeltier es gegen Virus-@infectionen
kann durch direkte Verabreichung ron A+B oder dessen Metall- oder Ammoniumsalzen
sei es beispielsweise oral, etwa i Form von Kaspeln oder durch Injektion (i.v.,
i.m. oder s.c.) einer sterilen Lösung derselben oder durch topische Anwendung z.B.
in Torm von Tropfen, Salben, Cremes oder Sprays erfolgen..
-
Man kann aber auch die Interferonbildung mit Hilfe von A+B in einer
Zellkultur, vorzugsweise der zu behandelnden Wirbeltierart, induzieren und die aus
diesen Zellkulturen gewonnenen Interferone, gegebenenfalls nach Aufreinigung, applizieren.
-
Dcs weiteren bewirkt die Verabreichung von A+B oder dessen Metall-
oder Ammoniumsalzen auch einen Schutz gegen Infektionen z.B. durch Bakterien oder
Protozoen. Man kann annchmen, daß die spezifischen und die unspezifischen Abwehrkräfte
des Orgamismus gegen Infektionen gesteigert werden.
-
Die Steigerung der spezifischen, d.h. immunologischen Abwehrkräfte
beruht z.B. auf einer verstärkten Antikörperbildung.
-
Dieser Effekt kann auch zur Verbesserung des Impferfolges bei Impfungen
mit Impfstoffen, welche keine vermehrungsfähigen Erreger enthalten, verwendet werden.
-
Die durch den Impfstoff bewirkte Antikörperbildung kann durch die
simultane Verabreichung von AqB oder dessen Metall- oder Ammoniumsalzenpotenziert
werden. Dadurch kann entweder bei geringerer IQnfstoffmenge - und damit verkleinertem
Risiko gleiche Imperfolg erzielt, oder aber bei gleicher Impfstoff menge eine bessere
Impfirkung erreicht werden.
-
Besonders vorteilhaft ist die überraschen große Stabilität von A-B.
So weisen die Zweikomponenten-Komplexe bis 1000 keine (das ist jene Temperatur,
bei welcher der Komplex wieder zur Hälfte in seine Komponenten zerfallen ist) auf
und sind auch nach 24-stündiger Behandlung mit Humanserum noch wirksam.
-
Die zur Herstellung von A+B oder dessen Metall- oder Ammoniumsalzen
verwendeten Homopolynucleotide haben ein Pentosephosphatgerüst, worin die Pentose
Ribose ist. Sie enthalten entxfeder Hypoxanthin oder 2-Thi.o-cytos:in als Basen.
Sie werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt, bei.spielsweise durch Be
handeln der Nucleosiddi- oder -triphosphate mit einem polymerisierenden Enzym.
-
Die Herstellung von A+B oder dessen Metall- oder Ammoniumsalzen aus
A der Formel I und B der Formel II gelingt nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise
durch Vermischen wässeriger Lösungen der beiden Homopolynucleotide bei Temperaturen
zwischen 10 und 950. Im allgemeinen wird dabei durch Zugabe von anorganischen und/oder
organischen Salzen, vorzugsweise Alkalimetallhalogeniden, insbesondere Nach, eine
definierte Ionenstärke eingestellt, die vorzugsweise zwischen 0,001 und 1,0 liegt.
Der pH-Wert der Lösungen kann zwischen 5,0 und 11,5 liegen; vorzugsweise arbeitet
man bei pH-Werten zwischen 6,5 und 11. Um die Aufrechterhaltung eines bestimmten
pH-Wertes zu erzielen, arbei tet man meis-t mit gepufferten Lösungen der Homopolynucleotide.
-
Als Puffersubstanzen verwendet man z.B. organische oder ancrganische
Alkalimetallsalze, vorzugsweise Natriumsalze, insbesonder Natriunakodylat. . Daneben
kann man als Puffersubstanzen bzw. in Puffergemischen gebräuchliche Salze verwenden,
wie z.B. Na-Acetat, KH2PO4: Na2HP04, E-Hydrogentartrat oder Na-Citrat; aber z.B.
auch Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan/HCl. Gegebenenfalls kann man auch organische,
mit H2O mischbare Lösungsmittel zusetzen, beispielsweise ein- oder mehrwertige Alkohole,
wie Methanol, Propanol, Äthylenglykol oder Glycerin oder z.B.
-
aprotisch dipolare Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid, Formamid oder
Dimethylformamid.
-
Um die gewünschte und eine für die Komplexbildung günstige Ionenstärke
zu erzielen, kann man gleiche Volumina von
Lösungen vermisc:hen,
die Vorzugsweise gleiche Konzentrationen (bezogen auf die Basen) der Komponenten
enthalten und jeweils die gewünschte lonenstärke besitzen Man kann aber auch vorschieden
große Volwiiina von Lösungen unterschiedlicher Konzentration und ulltersch.iedlicher
Ionenstärke in der Form vermische| daß das Reaktionsgemisch schließlich die gewünschte
lonenstärke besitzt. Vorzugsweise wird man danach trachten, daß auch in diesem Fall
gleiche Molzahlen der beiden Komponenten (wieder bc zogen auf die Basen) im Reaktionsgemisch
vorliegen.
-
Man kann aber auch unterschiedliche molare Mengen der beiden Komponenten
bei der Komplexbildung einsetzen, da die Art des sich bildenden Zweikomponenten-Komplexes
im wesentlichen unabhängig vom Molverhältnis der Komponenten ist und hauptsächlich
durch die Ionenstärke und den pH-Wert des Reaktionsmediums bestimmt wird.
-
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von A+B oder dessen Metall oder
Ammoniumsalzen besteht darin, die eine Komponente in Gegenwart der anderen im Reaktionsgemisch
herzustellen. Beispielsweise kann man in einer wässerigen Lösung von A und Polyribo-2,4-dithiouridylsäure
das letztere Homopolynucleotid durch Behandeln mit Sulfitionen und/oder Bisulfitionen
in Gegenwart eines Oxidationsmittels, wie. molekularem Sauerstoff, vorzugsweise
bei pH-Werten zwischen 4,5 und 9, insbesondere bei pH 7 in Polyribo-4-sulfo-2-thiouridylsäure
umwandeln und diese durch Behandeln mit Ammoniak und/oder Ammoniumionen, vorzugsweise
bei pH-Werten zwischen 7 und 10, insbesondere bei pH 8,5 zu B umsetzen, welches
entweder sofort oder nach Einstellung der eriorderlichen Ionenstärke bzw. eines
geeigneten pH-Wertes mit der zweiten, im Reaktionsgemisch bereits vorliegenden Komponente
den erfindungsgemäßen Zwe ikomponenten-Komplex bildet.
-
Als Sulfitionen- bzw. Bisulfitionquelle dienen vorzugsweise Alkalimetallsulfite
und/oder -bisulfite, vorzugsweise Natriumsulfit. Als Ammonium ionenquelle kann man
Ammoniumsalze, vorzugs weise Ammoniumhalogenide, insbesondere Ammoniumchlorid verwenden
Ein
weiteres Verfahren besteht darin, eine wässerige Lösung, welche die eine Komponente
bereits als Homopolynucleotid, die Andere Komponente aber als monomeren Nucleosiddi-
oder -triphosphat enthält, mit einem polymerisierenden Enzym zu versetzen. Auch
hier wird die zweite Komponente in situ erzeugt; wobei es nicht von Bedeu-tung ist,
ob die monomeren Nucl eosidphosphate, z. B. durch Wasserstoffbrückenbildungen, mit
der bereits vorliegenden polymeren Komponente assoziiert sind oder nicht.
-
Da durch das Alffervermögen und den Salzgehalt des physiologischen
Systems des Wirtbeltieres sowohl ein bestimmter pH-Wert, als auch eine bestimmte
Ionenstärke festgelegt werden, ist es in weiten Grenzen unkri-tisch, unter welchen
Bedingungen A+B gewollen wurde. Die Wirkung wird in allgemeinen durch den unter
den physiologischen Bedingungen s-tabilsten Komplex hervorgerufen. Gegebenenfalls
lagern sich auch andere Komplexe, die unter Umständen unter nichtphysiologischen
Bedigungen gewonnen wurden, erst im tierischen Organismus oder in der unter physiologischen
Bedingungen gehaltenen Zellkultur in den wirksamen Komplex um.
-
Es ist sogar möglich, eine Schutzwirkung zu erzielen, wenn man die
beide Homopolynucleotide getrennt verabreicht und so die Bildung eines Komplexes
erst im Organismus bzw. in der Zellkultur erfolgt.
-
A+B kann entweder durch physikalische Methoden,wie Bestimmung der
hyperchromen Verschiebung im ultravioletten Absorptionsspektrum, des ORD-Spektrums,
der Svedberg-Konstante, der Tm, durcjh Saccharose-Dichtegradient-Fraktionierung
oder Chromatographie, insbesondere aber auch durch biologische Methoden, wie die
Fähigkeit, die Erzeugung von Interferon zu induzieren, charakterisiert werden. Unter
den im folgenden beschriebenen Versuchsbedingungen weist keiner der Polynucleotideinzelstränge
diese Aktivität auf. Die Erzeugung von Interferon ist; die bedeutendste Möglichkeit
für die Charakterisierung der erfindung
gemäß verwendeten Zweikomponenten-Komplexe,
da die Empfindlichkeit physikalischer Methoden zur Charakterisierung oft nicht ausreicht.
-
Da das UV-Spektrum des Komplexes eine hyperchrome Verschiebung gegenüber
einem Summenspektrum der beiden Komponenten aufweist (beispielsweise erhalten durch
graphische Addition der Spek-tren von Lösungen, welche jeweils gleiche Konzentrationen
- die aber nur 50 /o der Komplexkonzentration ausmachen - der Komponenten enthalten),
kann man die Bildung von A+B durch Messung der Hyperchromie (in Prozent) bei vorzugsweise
mehreren Wellenlänge nachweisen.
-
Eine besonders gute Charalfterisierungsmöglichkeit für einen solchen
Zweikomponenten-Komplex ist der Nachweis seiner biologischen Wirkung, der am einfachsten
dadurch erbracht werden kann, daß man seine Schutzwirkung gegen eine Virusinfektion
in der Zellkultur mißt. Man stell-t beispielsweise eine Verdüirnunesreihe des Komplexes
in Zellkultur-Erhaltungsmedium her, überschichtet zum Beispiel geschlossene Zellrasen
von sekundären Kaninchennierenzellen mit den verschiedenen Verdünnungen und bebrütet
etwa 18 bis 24 Stunden bei 35 bis 370C. Anschließend wird die Flüssigkeit aus den
Zellkulturgefäßen entfernt, die Zellen werden mit einem geeigneten Virus, beispielsweise
Herpessimplex-Virus, infiziert, mit Agar überschichtet und solange bebrütet, bis
die als Folge der Virusinfektion auftretende Zellzerstörung in unbehandelten Kontrollen
zu sichtbaren Löchern im Zellrasen, sog. "Plaques", geführt hat. Nach Anfärben der
Zelle werden die Plaques gezählt und diejenige Komplex-Konzentration ermittelt,
die zu einer 50%igen Verminderung der Plaquezahl gegenüber der unbehandelten Kontrolle
fuhrt.
-
In analoger Versuchsanordnung kann durch Verwendung verschiedener
Zellarten und verschiedener Virusarten nachgewiesen werden, daß die Schutzwirkung
des Komplexes weder an eine bestimmte Zellart, noch an eine bestimmte Virusart gebunden
ist.
-
Zum Nachweis der Interferoninduzierung durch A+B überschichtet man
einen geschlossenen Zellraschen beispielsweise von Kaninclennieren- oder Mäuseembrylonalzellen
mit einer Lösung von AB in Erhaltungsmedium. Dadurch werden die Zellen zur Abgabe
von Interferon angeregt. Dieses Interferen kann nach bekannten Mehoden aus der überstehenden
Flüssigkeit isoliert und als solches charakterisiert werden.
-
Zum Nachweis der Virushemmung durch Interferon werden z.B. Zellen
rasen von Kaninchennierenzellen mit Kanincheninterferon über Nacht bebrütet und
anschließend mit Virus infiziert. Der weitere Versuchs ablauf entspricht dem oben
beschriebenen Plaquereduktionstest. Auf diese Weise kann der Interferongehalt gemessen
werden. Durch Verwendung verschiedener Virusarten, z.B. Herpes simplex-, Vaccinia-,
Vesicular-Stomatitis-Virus, wird die Virus-Unspezifität nachgewiesen. Die Artspezifität
wird bewiesen, indem z.B. Näuseembryonalzellen mit Kanincheninterferon behandelt
werden. In diesem Versuch wird die Virusvermehrung nicht gehemmt. Ps kann auch gezeigt
werden, daß das Interferon nach Trypsinbehandlung keine Schutzwirkung mehr hat.
Die Abhängigkeit der Interferonwirkung von der RNA- und Proteinsynthese der Zellen
kann zum Beispiel dadurch bewiesen werden, daß man Zellen, deren Syntheseapparat
mit Actinomycin D blockiert wurde, mit Interferon behandelt. In diesen Zellen wird
beispielsweise die Vermehrung von Vesicular-Stomatitis-Virus nicht gehemmt.
-
Die Freisetzung von Interferon beim Wirbeltier bzw. beim Menschen
nach Verabreichung von A+B kann z.B. nachgewiesen werden, indem man eine Komplex-Lösung
in einem physiologischen Lösungsmittel, beispielsweise Hanks'scher Pufferlösung,
einem Kaninchen oder einer Maus intravenös injiziert, dem Tier bei spielsweise nach
2 bis 6 Stunden Blut entnimmt und im Blutserum das Interferon nach den oben beschriebenen
Methoden mißt und charakterisiert.
-
Der Nachweis der Schutzwirkung von A+B gegen Viren kann auch direkt
im Tierversuch geführt werden, indem man z.B. Mäuse ìn.it
einer
Lösung von A-sB in einem physiologischen Lö sungsmitt ei intraperitoneal behandelt
und, sie einen Tag später z.B4 mit Herpes-simplex-Virus infiziert. Je nach Dosis
führt die Behandlung zu einer Verlängerung der Überlebenszeit oder zu volligem Überleben
der Infektion, während unbehandelte Kontroll-| mäuse an der Infektion sterben.
-
In ähnlicher Weise kan-n die Schutzwirkung des Komplexes gegen über
einer Vielzahl von Viren, wie Vaccinia-Virus, Vesicular-Stomatitis-Virus oder Influenzavirus
gezeig-t werden.
-
Analog kann man den Schutz gegenüber anderen Infektionen, bespielsweise
durch Hefen, wie Cryptococcus neoformans, gegen Bakterien, wie Pneumokokken, oder
gegen Protozoen, wie Plasmodium berghei oder Eperythrozoon coccoides, nachweisen.
-
Eine besondere Eigenschaft von A+B ist die Steigerung der spezi fischen
Abwehrvorgänge. Impft man zum Beispiel Meerschweinchen mit einem Influenzavirusimpfstoff
und behandelt die Hälfte der Tiere außerdem mit A+B, so sind im Serum der behandelten
Tiere früher Antikörper nachweisbar. und sie erreichen einen höheren Titer. Die
Antikörper werden in bekannter Weise mit der Hä.magglutinationshemmungs- oder mit
der Komplementbindungsreaktion gemessen.
-
Die Steigerung des Impfschutzes kann auch direkt nachgewiesen werden,
indem man z.B. Mäuse mit einem Influenzavirusimpfstoff impft, die Hälfte der Tiere
mit A+B behandelt und z.B. 14 Tage nach der Impfung alle Tiere mit Influenzavirus
infiziert. Von den mit A+B behandelten Tieren überlebt ein größerer Prozentsatz
die Infektion als von den unbehandelten.
-
A+B zeigt nicht nur bei Infektionen eine Wirkung, sondern auch bei
Tumoren. Dies kann z.B. an Mäusen gezeigt werden, denen Ehrlich-Ascites-Tumorzellen
eingeimpft wurden. Mit A+B behandel te Tiere überleben in diesem Versuch länger
als unbehandelte.
-
Die Verabreichung von A+B oder dessen Metall- oder Ammoniumsalzen
kann parenteral oder topisch erfolgen, insbesondere auf eine Schleimhaut, wie intranasal,
konjunktival oder in die Atemwege. Die wirksame Dosis hängt ab von der Wirtspecies
und in gewissem Ausmaß von dcm Virus, gegen das Schutz angestrebt wird. Bei Mäusen
ist die Schwellendosis etwa 0,5 mg/kg, während sie bei Kaninchen etwa 0,05 µg/kg
betragt.
-
Nachfolgend wird die Herstellung der erfindungsgemäßen Zweikomponenten-Komplexe
sowie ihre erfindungsgemäße Verwenden veranschaulicht.
-
Die irn folgenden für die Polynucleotide angegebenen Konzentrationen
beziehen sich immer auf die monomeren Nucleotide, welche die Polymeren aufbauen
und als deren Molgewichte das berechnete Molgewicht (Nucleosidmonophosphats minuts
Wasser) angenommen wird Der dabei durch Nichtberücksichtigung von endgruppen entstchende
Fehler kann vernachlässigt werden.
-
An Stelle des im folgenden genannten Zellkulturerhaltungsmediums können
selbstverständlich auch andere Medien verwendet werden, da jene auf die Wirkung
der Zweikomponenten-Komplexe keinen Einfluß haben und nur für die Zellkulturen selbs-t
von Bedeutung sind.
-
Die in den folgenden Beispielen verwendete Polyriboinosinsäure (=
A) ist übliche Handelsware und besitzt ei.nen s20,w-Wert von 5,3. Die Polyribo-2-thiocytidylsäure
(= B), welche in den folgenden Beispielen eingesetzt wurde, ist nach bekannten Methoden,
welche in der Deutschen Offenlegungsschrift 20 41 735, insbesondere im Beispiel
ib beschrieben sind, herstellbar. So wurden 4 ml eines wässerigen Gemisches (pH
8,3) enthaltend 0,4 m Mol tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid (= Tris.HCl),
0,008 m Mol MgCl2, 0,04 m Mol
Dinatriumsalz des 2-Thiocytidin-5'-diphosphats,
0,04 m Mol Dithiothreitol und 10 Enzymeinheiten Polynucleotidphosphorylase (spezifische
Aktivität 0,165 m Mol UDP/Stunde x mg Protein bei 370) 4 Stunden bei 37° inkubiert.
Nach Abtrennung des Proteins und 48stündiger Dialyse der auf 1,5 ml eingeengten
wässerigen Phase bei 30 gegen 0,01 II Tris.HCl (pE 7,0) wurde B erhalten, welches
einen s20,w-Wert von 8,3 aufwies und in den folgenden Beispielen eingesetzt wurde.
-
(Selbstverständlich kann man auch Präparationen von A bzw. 3 mit anderen
s w-Werten verwenden).
-
Beispiel 1 Zu 0,53 ml einer 0,01 molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Pufferlösung
(pH = 7), welche 0,19 µmol/ml B enthält, gibt man 1,37 ml Hanks'scher Salzlösung
(siehe z.B.: J.M Hoskins, Virological Procedures, London, 1967, Seite 313) und ver.
-
mischt dann mit 0,10 ml Hanks'scher Salzlösung (pH = 7,0), welche
1 µmol/ml A enthält. Die Mischung, welche daher je 0,1 µmol/ml an A und B enthält,
läßt man 1 Stunde bei Zimmertemperatu stehen und erhält so eine Lösung von A+B;
Hyperchromie gegenüber einem Summenspektrum der Komponenten beträgt bei 250 nm 18
%, bei 260 nm 18,2 , bei 270.nm 20,8 , bei 280 nm 17 o/o.
-
#max = 247,5 nm;#min = 226 nm; [M]340 = -1,2.10, [M]320 = 0 [M]303
= 1,4.10³, [M]297 = 0: [M]206 = 21,8.10³; [M]242 = 0 [M]232 = 18,8.10³; scheinbarer
pK = 11,5; isosbestischer Punkt = 230 nm; zwischen 0° und 1000 weist A-B in Wasser
keine Tm auf; in einem wässerigen Gemisch enthaltend 30 % Äthylen glykol und 0,05
M Na+-Ionen zeigt sich ein scharfer Übergang bei Tm = 77°. Der mittlere s20,w-Wert
von A+B 12,4; die integrale Verteilung der s20,w-Werte von A+D ergibt sich aus nachfolgender
Tabelle (Messung in 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH 7, nach 97 Minuten bei 20 000
rpm):
| s20,w C'/C |
| 5,5 0,02 |
| 6,5 0,04 |
| 7,5 0,08 |
| 8,5 0,13 |
| 9,7 0,20 |
| 10,5 0,2u |
| 11,5 0,39 |
| 12,5 0,50 |
| 13,5 0,83 |
| 14,5 0,93 |
| 15,5 1,00 |
Im Gegensatz zur freien Polyrib o-2-thi oc ytidylsäure wird diese im Zweikomponenten-Komplex
von Polynucleotidphosphorylasen nicht angegriffen.
-
Beispiel 2 Man löst 0,32 mg A in 10 ml einer 0,001 molaren Natriumkakodylat
Lösung (pH = 7),-welche 59 mg NaCl enthält, gibt 1 ml einer -0,001 molaren B-Lösung
zu und läßt bei Zimmertemperatur stehen.
-
Die Komplexbildung wird spektrometrisch verfolgt. Man erhält eine
Lösung des Komplexes AFB, dessen Eigenschaften mit denen des nach Beispiel 1 erhaltenen
Komplexes übereinstimmen.
-
Beispiel 3 5 ml eines wässerigen Gemisches (pH = 8,3), enthaltend
0,5 Millimol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer, 0,01 Millimol MgCl2, 0,05
Millimol B und 0,16 mg Dinatrium-2-thiocytidin-5'-diphosphat wird mit 5 Enzymeinheiten
Polynucleotidphosphorylase (spezifische Aktivität 0,165 Millimol UPD/Stunde mg Protein
bei 370) versetzt und 4 Stunden bei 370 gehalten.
-
Nach Entfernung des Proteins durch Inehrfache Extraktion mit CHCl3/Isoamylalkohol
engt man die wässerige Phase bei 150 auf 2 ml ein Ulld dialysiert 48 Stunden bei
30 gegen 0,01 molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer. Man erhält eine
Lösung des Komplexes A+B, welcher die gleichen Eingeschaften wie der nach Beispiel
1 erhaltene Komplex aufweist.
-
Beispiel 4 Zu 4 ml einer 0,001 molaren Natriumkakodylat-Lösung, enthaltend
24 ml NaCl, 0,1 mMol Polyribo-2,4-dithiouridylsäure und 0,1 mMol B, gibt man 20
µm eines Sulfitreagenzes, bestehend aus 3 Volumteilen einer 1 inolaren Na2SO3-Lösung
und 1 Volumteil einer molaren NaHSO3-Lösung, saugt Luft durch das Reaktionsgemisch
und gibt nach 1 Stunde nochmals 20 µm des Sulfitreagenzes zu. Nach einer weiteren
Stunde bricht man die Reaktion ab, gibt 0,5 ml einer 0,2 m NH4Cl-Lösung zu, stellt
mit wässeriger NH3-Lösung einen pH von 8,5 ein, läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur
stehen, engt auf 2 ml ein und dialysiert 60 Stunden bei 30 gegen 0,01 molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer.
Man erhält eine Lösung von A+B, welcher di.e gleichen Eigenschaften wie der nach
Beispiel 1 erhaltene Komplex aufweist.
-
Beispiel A Aus einer nach Beispiel 1 erhaltenen A+B-Lösung bereitet
man durch Zusatz von 18 ml Zellkulturerhaltungsmedium, bestehend aus käuflichem
Tissue culture medium (TCM) 199 mit Zusätzen von 0,168 % NaHCO3 sowie 100 IE Penicillin
und 100 µm Streptomycin pro ml eine Stammlösung. Aus dieser wird durch mehrmaliges
Verdünnen mit dem oben genannten Kulturerhaltungesmedium im Verhältnis 1:10 eine
Verdünnungsreihe hergestellt. Mit je 10 ml dieser Verdünnungen werden 7 Tage alte
Zellrasen von primären Kaninchennierenzellen in Vierkantflaschen überschlichter
Für jede Verdünnungsstufe werden drei Flaschen angesetzt, dazu drei Kontrollflaschen,
die nur mit Erhaltungsmedium ohne AD beschick-t werden. Die Flaschen werden über
Nacht bei 350 C
Brutschrankt berütet, anschließend in üblicher
Weise mit Herpes simplex-Virus infiziert, mit Agar überschichtet, nochmals 48 Stunden
bei 35° ° C C bebrütet und erhalten dann eine zweite, farbstoffhaltige Agarschicht
zum Anfärben der Zellen. Nach weiteren 24 Stunden Bebrütung bei 70 C werden die
nun makroskopisch sichtbaren Virusplaques unter der Lupe gezählt. Aus den drel Einzelwerten
für jede Verdünnungsstufe wird der Mittelwert errechnet und in Beziehung zum Mittelwert
der Kontrolle gesetzt.
-
Auf grafischem Wege wird aus diesen Werten die PRD50 ermittelt, d.h.
die 50%-Plaque-Reduktions-Dosis, die die Plaquezahl um 50 % reduzieren würde.
-
In weiteren Versuchen mit der gleichen A+B-Lösung wurden Verdünnsreihen
im Verhältnis 1:2 oder 1:4 hergestellt. Außerdem wurden in spä-teren Versuchen sekundäre
statt primäre Kanichennierenzellen verwendet, in einem Versuch Vaccinia- statt Herpes
simplex-Virus.
| PRD50 |
| Versuch Zellen Virus µg/ml |
| 1 Prim. Kaninchen-Niere Herpes-simpl. 0,0035. |
| 2 " " " " " 0,0065 |
| 3 Sek. " " Vaccinia 0,0030 |
| 4 | " " " | Herpes-simpl. | 0,0061 |
Es wurde auch A bzw. B allein geprüft; dabei konnte bis zu Konzentration von 0,61
µm/ml unter den oben angegebenen Ver- | suchsbedingungen keine Reduktion der Plaquezahl
beobachtet werden.
-
Beispiel B Zur Messung der biologischen Aktivität des nach Beispiel
2 hergestellten Komplexes wurden Plaquereduktionstests durchgeführt.
Die
Versuchsanordnung entsprach der in Beispiel A beschriebenen mit dem Unterschied,
daß ausschließlich sekundäre Kaninchennierenzellen verwendet wurden. Das Zellkulturerhaltungsmedium
enthielt in den Versuchen 3 und 4 kein Streptomycin.
| Versuch Zellen Virus PRD/µg/ml |
| 1 sek. Kaninchen-Niere Herpes simpl. 0,013 |
| 2 " " " Vaccinia 0,00067 |
| 3 " " " Herpes simpl. 0,0015 |
| 4 " " " " " 0,0057 |