DE2036935C3

DE2036935C3 - Diisonicotinsäurehydrazid-methansulfonat des d(+)2^>-(Äthylendiimino)-di-lbutanols, Verfahren zur Herstellung desselben und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2036935C3
Application number: DE2036935A
Authority: DE
Inventors: Juan Colome-Riera; Jorge Ferrer-Batlles; Carlos Ferrer-Salat
Original assignee: Ferrer Internacional SA
Current assignee: Ferrer Internacional SA
Priority date: 1969-07-28
Filing date: 1970-07-24
Publication date: 1978-10-12
Also published as: DE2036935A1; ES369952A1; FR2059568B1; DE2036935B2; BE753862A; GB1294299A; ZA705224B; CH517743A; US3718655A; FR2059568A1

Description

d(+)2,2'-(Äthylendiimino)-di-l -butanols in an sich bekannter Weise umsetzt

3. Arzneimittel, bestehend aus der Verbindung gemäß Anspruch 1 und den pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. Die erfindungsgemäße Verbindung wirkt tuberkulostatisch; im Gegensatz zu Isoniazid hat sie keine toxischen Nebenwirkungen auf die Nerven, dem Isoniazid und dem entsprechenden Methansulfonat ist sie in der bakteriostatischen Wirkung überlegen, und das plötzliche Auftreten von resistenten Stämmen wird vermieden.

Das Methansulfonat des Isonicotinsäurehydrazids ist bekannt, vgl. Wiener Medizin. Wochenschrift, 104, S. 749-- 71, 1954, die erfindungsgemäße Verbindung ist ihm jedoch überlegen.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann entweder durch Addition von Isoniazidmethansulfonsäure an d(+)2,2'-(ÄthyIendiimino)-di-1-butanol oder durch Substitution eines Alkali- oder Erdalkalimetallsalzes der Isoniazidmethansulfonsäure mit dem Dihydrochlorid von d( + )2,2'-(Äthylendiimino)-di-1-butanol hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. In diesen Beispielen sind verschiedene gangbare Wege zur Herstellung dieses Isoniazidderivates beschrieben.

Beispiel 1

138 g Isoniazid wurden mit 30 ecm einer 35- bis 40%igen wäßrigen Formaldehydlösung behandelt unter Bildung eines Formaldehydderivats mit der Summenformel C7H7N3O. Das vorher in Wasser suspendierte Formaldehydderivat wurde gründlich gerührt, und es wurde ein SOrStrom aus einer Druckflasche durchgeleitet. Dabei wurde die Isoniazidmethansulfonsäure erhalten.

462 g der Isoniazidmethansulfonsäure wurden zusammen mit 204 gd( + )2,2'-(Äthylendiimino)-di-1-butanol in 1800 ml Äthanol suspendiert. Die Mischung wurde bis zur vollständigen Lösung auf einem Wasserbad erhitzt. Dabei wurde eine gelbe Lösung erhalten, die nach mehrminütiger Behandlung mit Aktivkohle nach dem Filtrieren praktisch farblos wurde. Nach dem Abkühlen wurde die erhaltene Lösung mit Petroläther behandelt, bis eine bleibende Trübung auftrat und beim Abkühlen eine Kristallisation erfolgte. Das Produkt wurde mit Äthylälher gewaschen und unter Vakuum Ober P2O5 getrocknet. Das Produkt wurde gereinigt, indem man es in heißem Äthanol auflöste, die geringen Verunreinigungen abfiltrierte und das Produkt durch Zugabe von Petroläther kristallisierte.

Beispiel 2

61 g 95%iges NaHSO₃ wurden in 120 ml destilliertem

jo Wasser gelöst, und dann wurden 56 ml HCHO (30%ig) zugegeben. Nach 15 Minuten wurden zu dieser Lösung 76 g Isonicotinsäurehydrazid zugegeben und 4 Stunden lang auf dem Wasserbad erhitzt. Dann ließ man die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Die abgeschiedenen Kristalle wurden abfiltriert und mehrere Male mit Äthanol gewaschen.

Das Produkt war nach 24stündigem Trocknen unter Vakuum über Phosphorpentoxyd vollständig stabil. Die Ausbeute bei diesem Verfahren betrug etwa 60%.

41) Dann ließ man in Methanol unter Rückfluß 1 bis 2 Stunden lang 28 g d( + )2,2'-(ÄthyIendiimino)-di-l-butanol-dihydrochlorid und 58 g Natriumisoniazidmethansulfonat-dihydrat miteinander reagieren. Das gebildete NaCI wurde abfiltriert. Dann wurde das Lösungsmittel

4> durch Eindampfen auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens entfernt. Die dabei erhaltene Lösung wurde mit Petroläther behandelt, und beim Abkühlen auf 4⁰C trat eine Kristallisation auf. Anschließend wurde das Produkt durch einen Büchner-Filtertrichter filtriert und

-,ο mehrere Male mit einem Methanol/F^troläther-Gemisch gewaschen. Das Produkt wurde durch heißes Auflösen und nachfolgende Abkühlung unter vollständiger Auskristallisaiion gereinigt.

Beispiel 3

20,4 g d( + )2,2'-(Äthylendiimino)-di-1-butanol-dihydrochlorid wurden in absolutem Äthylalkohol mit 12,8 g NaHCO] gelöst. Das dabei gebildete NaCI fiel aus und wurde durch Filtrieren abgetrennt. Dann wurden 46 g

bo Isoniazidmethansulfonsäui'e zu der Lösung zugegeben. Ein Teil des Lösungsmittels wurde entfernt, indem man die Lösung auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens eindampfte. Die dabei erhaltene Lösung wurde mit Petroläther behandelt, und beim Abkühlen auf 4°C trat eine Kristallisation auf. Das ausgefallene Produkt wurde durch einen Büchner-Filtertrichter abfiltriert und mehrere: Male mit einem Methanol/Petroläther-Gemisch gewaschen.

Das Produkt wurde durch heißes Auflösen und anschließendes Abkühlen unter vollständiger Auskristallisation gereinigt.

Bei dem so erhaltenen Produkt handelte es sich um

CONHNH-CH₂-SO₃H

das Düsoniazidmethansulfonat von d(+)2,2'-(Äthy|endiimino)-di-l-butanol mit einem Molekulargewicht von 666,81, einer Summenformel von C₃₁H^NaOiQS₂ und der folgenden Strukturformel

CH₁OH CH₁OH

I " I "

CH—NH—CKj—CHj—NH—CH

C₂Hj C₂ H5

25

Dieses Produkt stellt ein weißes Pulver dar, das in Form von Nadeln kristallisiert, es schmilzt unter Zersetzung bei 121 bis 122° C. Es ist in Wasser, Methanol, Ν,Ν-Dimethylformamid, Säuren und Basen löslich, in Äthanol, Äthyläther und Chloroform unlöslich. Sein UV-Spektrum zeigt ein Absorptionsmaximum bei 265 ΐημ und ein Absorptionsminimum bei 237 πιμ. Sein spezifisches Rotationsvermögen in einer 5%igen wäßrigen Lösung bet/ägt [α] 2"° = +3°.

Chromatographie:

Träger: Chromatographieplatten F₂₅₄.
Eluierungsmittel: Methanol.
Entwickler: UV-Lampe.
Testkonzentration:200 mg/ccm.

Das Isoniazidmethansulfonat von d( + )2,2'-(Äthylendiiminq)-di-1 -butanol besaß einen Rf-Wert von 0,56 bis 0,65.

In gleichlaufenden Versuchen wurde die akute Toxizität des Diisoniazidmethansulfonats von d( + )2,2'-(Äthylendiimino)-di-i-butanol f5rdie Komponenten der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindung und für Isoniazid bestimmt. Die LDso-Werte be' oraler Verabreichung bei der Maus waren folgende: 2,800 g/kg für das erfindungsgemäße Produkt, 0,365 g/kg für Isoniazid, 2,175 g/kg für Natriumisoniazidmethansulfonat-dihydrat. Die LD50-Werte für diese Substanzen betrugen bei intraperitoneaier Verabreichung bei der Maus: 2,210 g/kg für das erfindungsgemäße Produkt, 0,280 g/kg für Isoniazid und 1,410 g/kg für das d(+)2,2'-(Äthylendiimino)-di-1 -butanol.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann in Mischung mit geeigneten Arzneimittelträgerstoffen in Form von Tabletten, Kapseln oder injizierbaren Lösungen verabreicht werden.

Versuchsbericht

I. Bakteriostatische Wirksamkeit von

d( + )-2,2'*(ÄthyIendiimino)-di-1 -butanol (Ethambutol),

Isonicotinsäurehydrazidmethansulfonat von

d( + )-2,2'-(Äthylendiimino)-di-1 -butanol

(erfindungsgemäße Verbindung)

und Isoniazid-methansulfonat

Der Bakterienstamm My. tuberculosis Hj₇Rv von der Central Colletion in Lausanne (Schweiz) wurde in Löwenstein- und Sauton-Medium in üblicher Weise kultiviert.

Von den Testsubstanzen wurden drei Lösungen verschiedener Konzentration mit sterilem, destilliertem Wasser hergestellt. Die Konzentration wurde so berechnet, daß zur Erlangung der für jede Versuchsreihe erforderlichen Dosis an Testsubstanz nie mehr als I ml der jeweiligen Lösung verwendet werden mußte. Die Lösungen mit den Testsubstanzen wurden durch Ultrafiltration durch Membranfilter des Typs MF 10 (Göttingen) mit Poren von 0,1 μ sterilisiert.

Die Versuche wurden mit einer subinhibierenden Konzentration von 0,05 μ^/τη\ begonnen, und die Konzentration wurde fortschreitend erhöht bis zu einer Endkonzentration von 3 μg/ml.

Die ermittelten Mindesthemmkonzentrationen (M IC-Werte) sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt:

Testverbindung

MiCfag/m!)
Löwenstein Sauton

55

60

6)

Ethambutol 1 1,50

Isoniazid-methansulfonat 0,10 0,10

Erfindungsgemäße Verbindung 0,10 0,10

Aus der vorstehenden Tabelle ist ersichtlich, daß Ethambutol um mindestens eine Zehnerpotenz weniger wirksam ist als die erfindungsgemäße Verbindung. Aus den in der Tabelle angegebenen Werten ergibt sich aber auch, daß die erfindungsgemäße Verbindung wirksamer ist als das Isoniazid-methansulfonat, obwohl für beide Verbindungen die gleichen M IC-Werte gefunden wurden. Die größere Wirksamkeit für die erfindungsgemäße Verbindung ergibt sich aus der Tatsache, daß der Isoniazid-methansulfonatanteil in ihr nur 6634% ausmacht. Es ist daher überraschend, daß das erfindungsgemäße Salz, das zu etwa V3 seines Gewichtes aus der relativ schwach wirksamen Ethambutolkomponente und zu etwa ²Ii seines Gewichts aus der Isoniazid-methansulfonatkomponente besteht, in summa die gleiche Wirksamkeit aufweist wie eine gleiche Gewichtsmenge reines Isoniazid-methansulfonat. Die gefundene Wirksamkeit setzt sich somit nicht additiv aus den Wirkungen der beiden Einzelkomponenten zusammen, sondern übertrifft jede von ihnen.

11. Untersuchung der induzierten Resistenz

Diese Untersuchung dient dazu, herauszufinden, ob sich bei der Bildung von Subkulturen in Anwesenheit von zunehmenden Dosen der drei obengenannten Testverbindungen der pathogene Bakterienstamm höheren Dosen als den oben unter I. gefundenen Mindesthemmkonzentrationen anpaßt und gegenüber welcher Testverbindung die Anpassung am stärksten ist, d. h. Resistenzerscheinungen am ehesten auftreten.

Die Versuche wurden wieder mit dem Stamm Hj/Rv von der Central Collection in Lausanne (Schweiz) in drei verschiedenen Nährmedien durchgeführt. Bei den Nährmedien handelte es sich um:

a) Löwensteins Nährmedium, mit Malachitgrün;

b) Sautons Nährmedium ohne Sorbimacrogololeat;

c) Dubois' Nährmedium mit Fraktion V von Difco Albumin.

Zum Animpfen der Kulturen wurde ein 30 Tage altes Velum auf Sauton-Medium ohne Sorbimacrogololeat verwendet. Davon wurde ¹Ao mg (Naßgewicht) in 10 ml steriler Salzlösung homogen suspendiert, 0,1 ml dieser Suspension wurden zum Animpfen verwendet,

Die erfindungsgemäße Verbindung und Isoniazidmethansulfonat wurden in verdünnter, wäßriger, steriler Lösung in den unter I, oereits beschriebenen Konzentrationen angewandt. Bei allen Kulturmedien wurde mit einer subinhibierenden Konzentration begonnen, und die Konzentration an Testverbindung wurde sukzessive langsam erhöht, bis Ergebnisse sichtbar wurden.

Da in vitro die inhibierenden Dosen von Ethambutol wesentlich höher liegen als die der beiden anderen Testverbindungen (vergleiche die Versuche unter I.), wurde in dieser Versuchsserie auf parallele Untersuchungen mit Ethambutol verzichtet.

Ergebnisse

Auf dem Löwenstein-Medium entwickelt sich sowohl eine Resistenz gegen Isoniazid-methansulfonat als auch gegen die erfindungsgemäße Verbindung., die doppelt so hohe Hemmkonzentrationen an Testverbindung erforderlich macht als ursprünglich gemessen. Diese induzierte Resistenz ist bei der erfindungsgemäßen Verbindung geringer als bei Isoniazid-methansulfonat.

In Sautons Medium sind die hemmenden Dosen der erfindungsgemäßen Verbindung und des Isoniazid-methansulfonats im wesentlichen gleich, Resistenzerscheinurvgen sind kaum feststellbar.

Im Dubois-Albuminmedium wurde keine Resistenz induziert. Überraschenderweise zeigte die erfindusigsgemäße Verbindung hier eine stärkere bakteriostatische Wirkung gegenüber dem »trainierten« pathogenen Bakterienstamm als gegenüber dem ursprünglichen Stamm, was bei Isoniazidmethansulfonat nicht der Fall war.

111. Therapeutische Wirkung gegenüber
Tuberkulose beim Meerschweinchen ₄₍₎

a) Meerschweinchen leiden normalerweise nicht unter spontaner Tuberkulose — oder nur sehr selten —, sie sind jedoch sehr empfindlich gegenüber einer verursachten Infektion. Sich deutlich zurückentwickelnde histologische Schädigungen sind daher nicht zu erwarten. Bei Verwendung dei gleichen pathogenen Stammes und der gleichen Infektionsdosis lassen sich jedoch, selbst bei Meerschweinchen des gleichen Wurfes, organische Leiden verschiedener Intensität feststellen.

b) Bisher waren auch die wirksamsten therapeutischen Präparate nur in der Lage, die Entwicklung der tuberkulösen Infektion während der Verabreichungsperiode des Präparates zu stoppen, sobald die Behandlung eingestellt wurde, trat die Infektion bei den Meerschweinchen wieder auf. Aus diesem Grunde ist die Ermittlung der Überlebensdauer der Versuchstiere nach Einstellung der Behandlung nicht interessant. Man zieht es vielmehr vor, nach einer vorbestimmten Zeit eine rigorose quantitative und qualitative Untersuchung der Schädigungen der behandelten Tiere vorzunehmen und diese mit den Kontrolltieren zu vergleichen.

c) Es empfiehlt sich, die Meerschweinchen mit zwei verschiedenen Dosen zu behandeln, einer unterdurchschnittlichen und einer etwas überdurchschnittlichen μ Dosis. Auf dieje Weise erhält man sehr brauchbare Vergleichsdaten fü^r den Vergleich mit den nichtbehandellen Tieren.

d) Da die infizierten Meerschweinchen häufig keine makroskopisch sichtbaren Schädigungen bei dor Nekropsie zeigen, die Meerschweinchen aber tatsächlich an Schädigungen leiden, sind peinlich genaue histologisehe Studien unabdingbar.

Durchführung der Versuche

20 Meerschweinchen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 600 g wurden zuerst einmal 15 Tage lang beobachtet und auf Krankheitserscheinungen, insbesondere auf Tuberkulose, untersucht. Natürlich wurden nur tuberkulosefreie Tiere verwendet. Vor und nach der Behandlung wurde alle 8 Tage ihr Körpergewicht ermittelt, und die Mantoux-Reaktion wurde in verschiedenen Zeitabständen durchgeführt. Als krankheitserregender Stamm wurde My. tub. H37RV vom Centre Bacteriologique in Lausanne (Schweiz) verwendet.

0,5 mg (NaOgcwicht) des Stammes wurden in 10 ml steriler Salzlösung homogen suspendiert, und 2ö Meerschweinchen wurden subVutan an der rechten Leiste mit 0,1 ml (0,005 mg Krankheitserreger H₃₇Rv) geimpft. Fünf Tiere wurden für Kontrollzwecke abgetrennt, die 15 verbleibenden Tiere wurden ab dem

8. Tag nach der Impfung täglich nach folgendem Plan benandelt:

Medikament	Y,	Ethambutol · HCI	Zahl	Dosis
		der Tiere	(mg/kg/Tag)
³⁰ Erfindungsgemäße
Verbindung	2	30 mg/kg/Tag
	3	60 mg/kg/Tag
Isoniazid-methan
sulfonat	2	21
3	42
2	25
3	50

Diese täglichen Dosen wurden aus folgenden Gründen gewählt: Wie bereits oben unter c) erwähnt, wird eine schwach unterdurchschnittliche und eine schwach überdurchschnittliche Dosis verabreicht. Für Isoniazid beträgt die übliche Dosis etwa 10 mg/kg/Tag und für Ethambutol · HCI etwa 50 mg/kg/Tag. Da die erfindungsgemäße Verbindung 66,34% Isoniazid-methansulfonsäure und 33,66% Ethambutol enthält, sind die in der Tabelle angegebenen Dosierungen einander äquivalent.

Jede Verbindung wurde unter absolut sterilen Bedingungen in so viel destilliertem Wasser gelöst, daß die zu verabreichende Dosis in nicht mehr als I ml injiziert werden konnte. Die Lösungen wurden unmittelbar vor der Verabreichung zubereitet. Die Verabreichung erfolgte in Form von täglichen subkutanen Injektionen, abwechselnd in beide Pektoralregionen.

Am 54. Tag nach der Infektion wucde ein Meerschweinchen aus jeder Gruppe, einschließlich der Kontrollgruppe, getötet, dabei wurde festgestellt, daß die Infektion tatsächlich die charakteristischen Schäden verursacht hatte. 74 bis 76 Tage nach der Infektion wurden alle Meersehweinehen getötet und sofort einer Nekropsie unterzogen. Von den Organeiv (Lunge, Leber, Milz und Niere) wurden Proben abgetrennt und sofort in eine wäßrige Formaldehydlösung gelegt. Die Paraffineinschl".sse, histologische Schnitte und Färbungen erfolgten in üblicher Weise.

Die Ergebnisse der Untersuchungen lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die bei den infizierten, aber

nicht behandelten, Kontrolltieren gefundenen Schaden wurden gleich 100 gesetzt, die bei den behandelten Tieren gefundenen Schaden wurden in %, bezogen auf die Schäden der Kontrolltiere, ausgedrückt:

	Summe der
	krankhaften
	Veränderungen
Kontrolltiere	100
Erfindungsgemäße Verbindung	20,5%
Koni;) / id-met ha nsu I fön sä ure	45.5%
Ethambutol ■ HCI	76%

Aus der obigen Zusammenstellung ist ersichtlich, daß Ethambutol · HCI relativ schwach wirksam ist. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung ist nicht nur wesentlich stärker als die Wirkung jeder einzelnen Vergleichsverbindung, sondern auch größer als die Summe der Wirkungen der beiden Vergleichsverbindungen. Da die erfindungsgemäße Verbindung und Isoniazid-methansulfonat die gleiche äquivalente Menge Isoniazid enthalten, sind die obigen Zahlenwerte direkt vergleichbar und demonstrieren einen starken Synergismus für die erfindiingsgemiiße Verbindung.

Toxizitätscrscheinungen wurden nicht festgestellt.

Claims

Patentansprüche;
1. Diisonicotinsäurehydrazid-methansulfonat des d( + )-2,2'-(Ätnylendümino)-di-1 -butanols der Formel

CO-NH-NH-CH₁SOjH
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man Isonicotinsäurehydrazidmethansulfonsäure unter Erwärmen mit d(+)-2,2'-(Äthylendi- imino)-di-l-butanol oder eines ihrer Alkali- oder Erdalkalimetallsalze mit dem Dihydrochlorid des

CH₂OH CH₂OH

CH-NH-C₂H₄-NH-CH C₂H₅ C₂H₅