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Die ErfindungbetriffteinVerfahren zur Herstellung von neuen sekundären Phosphorsäureestern und Salzen derselben, die wertvolle pharmakologische Eigenschaften aufweisen.
Die neuen Verbindungen weisen sämtlich eine starke Wirksamkeit als selektive Inhibitoren von Prosta- glandinen oder von Verbindungen auf, die bezüglich ihrer Konstitution eine Verwandtschaft zu den natürlich vorkommenden Prostaglandinen zeigen und dieselbe Art von Wirksamkeiten wie diese entfalten. Sie verhalten sich auch als selektive Antagonisten der"Slow Reaeting"-Substanz (SRS), einer ungesättigten Hydroxysäure von Lipidnatur, die den Prostaglandinen nahesteht und die Bildung des Adenosin-3', 5'-monophosphats (cyelisches AMP) inhibiert, einer Schlüsselkomponente des Ansprechens der Zelle auf extrazelluläre Vorgänge, die mit der Prostaglandinwirkung in Wechselbeziehung steht.
Wie viele andere Substanzen mit ss-receptorblockierenden Eigenschaften, z. B. gewisse adrenergische ss-Blocker, üben die Verbindungen, die gemäss der Erfindung erhalten werden, auch eine ihnen innewohnende Wirkung, in diesem Falle eine die glatte Muskulator stimulerende Wirkung aus.
Die Prostaglandine stellen eine neue Gruppe von biologisch wirksamen Substanzen dar, die auf zahlreiche wichtige physiologische Prozesse einwirken, u. zw. in der Hauptsache dadurch, dass sie den intrazellulären Stoffwechsel beeinflussen. Hiezu wird beispielsweise verwiesen auf E. W. Horton in "Prostaglandins" (Monographien, Endocrinologie, Band 7 [19721 ; Springer-Verlag).
Es istauch bekannt, dass Verbindungen mit einer den natürlich vorkommenden Prostaglandinen verwand- tenstruktur ähnliche Wirkungen haben können. Hiezu sei verwiesen auf P. W. Ramwell und Mitarbeiter, Na-
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Es liegt auf der Hand, dass durch die Möglichkeit der Verwendung von prostaglandin-inhibierenden Substanzen äusserst nützliche therapeutische Fortschritte erzielt werden können. Die Inhibierung von verschiedenen Entzündungsreaktionen, die Linderung des Bronchialasthmas, die Regulierung des Blutdruckes, die Beseitigung der gastrointestinalenHypermotilität, sind nur einige wenige Beispiele für die erwarteten therapeutischen Effekte solcher Verbindungen. Mit der Zunahme des Wissens bezüglich der Funktion der Prostaglandine wird die Nützlichkeit von Inhibitoren daher ohne jeden Zweifel noch stärker offenbar.
Es werden nicht nur die Zustände, die durch eine verstärkte Bildung von Prostaglandinen gekennzeichnet sind, verbessert, sondernes ist auch möglich, bestimmte normale physiologische Prozesse gewünschtenfalls zu verbessern, wie z. B. die Konzeption.
Therapeutische Fortschritte können auch dadurch erzielt werden, dass man die erfindungsgemäss erhält- lichenEster vor, gleichzeitig, mit odernach der Verabfolgung von Prostaglandinen appliziert, um Nebenwirkungen, die von den Prostaglandinen hervorgerufen werden, zu verhindern, wie z. B. Diarrhoe, Nausea, Vomitus, örtliche Gewebereaktionen und Fieber. Darüber hinaus üben die erfindungsgemäss erhältlichen Ester eine Inhibitorwirkungauf diehormonstimulierte Bildung des Adenosin-3', 5'-monophosphats (cyclisches- AMP) aus.
Der Ausdruck"Prostaglandine" ("FG's") soll im Rahmen der Erfindung Prostaglandine und Verbindungen verwandter Konstitution, wie sie oben angeführt sind, umfassen, u. zw. sowohl solche natürlicher Herkunft als auch solche synthetischen Ursprungs.
Einige Antagonisten der Prostaglandine sind bereits beschrieben worden. J. Fried und Mitarbeiter, Nature 223 [1969], S. 208, fanden, dass 7-oxa-prostaglandin-artige Verbindungen mit 6-gliedrigen Ringen Pro-
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EtActa physiol. scand 82 [19 711, S. 460).
Es istnun überraschenderweise gefunden worden, dass bestimmte einfache synthetische sekundäre Phosphorsäureester der nachstehend angegebenen Strukturformel sehr gute selektive Inhibitoren der Prostaglandine und der Verbindungen mit Prostaglandinwirkung sind, und dass sie zugleich auch selektive Antagonisten der"Slow Reacting"-Substanz (SRS) darstellen. Diese Effekte werden weiteruntennäherbeschrieben.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen, nämlich von neuen sekundären Phosphorsäureestern der allgemeinen Formel
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worin
M ein Wasserstoffatom oder ein pharmazeutisch verträgliches anorganisches oder organisches Kation, z. B. von Natrium, Calcium, Äthanolaminen oder N-Methylglucamin bedeutet und
A eine Gruppe der allgemeinen Formel
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darstellt, in der der eine Substituent
R13 eine in m-oder p-Stellung zur Phosphorsäureestergruppe gebundene Gruppe der allgemeinen For- mel
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bedeutet, worin der Rest
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nannten Carbonylbestandteile steht, wobei der Rest Y eine gerade Kohlenwasserstoffkette mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen darstellt, gesättigt ist oder eine Doppelbindung aufweist und durch höchstens eine niedere Alkylgruppe, eine niedere Alkenylgruppe, eine Phenylbzw.
Benzylgruppe substituiert ist, wobei diese Phenyl- bzw. Benzylgruppe gegebenenfalls in m-oder p-Stellung durch einen niederen Alkylrest, einen niederen Alkoxyrest, ein F-, 01- oder Br-Atom oder den CF-Rest substituiert ist, und die andern Substituenten
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pen der Formeln -O-CO-R14,-O-P (O)(OM)2
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stehen, wobei R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe bedeutet,
R9 eine niedere Alkylgruppe oder M darstellt, wobei
M die oben angegebene Bedeutung hat, und wobei ferner R14 für eine niedere Alkylgruppe steht.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel
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oderinbezug auf die Hydroxygruppe funktionelles Derivat, z. B. ein Salz derselben, in welcher Formel
T für einen Rest der allgemeinen Formel
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steht, in der R15, R16 und R die Reste R , R und R7 darstellenbzw. in bekannter Weise In diese Reste UberfUhrbar sind, wie z.
B. übliche Schutzgruppen tragende Hydroxy-, Amino- oder Carbonsäuregruppen, mit Phosphorsäuredihalogeniden der allgemeinen Formel E-PO= (Hal) worin
E gleich -OM ist oder einen in -OM überführbaren Substituenten, wie Halogene, Estergruppen oder
Amidreste, bedeutet und
Hal ein Halogenatom darstellt, direkt zu einer Verbindung der Formel (I) bzw. stufenweise über eine Verbindung der allgemeinen Formel
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in der
T und E die angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt, worauf der erhaltene sekundäre Phosphorsäureester (TI) erforderlichenfalls durch Umwandlung der Reste R15, R16 und R17 in die Reste R6, R13 und R bzw. durch Salzbildung bzw. Freisetzung der Säure aus dem Salz bzw. durch Umwandlung des Restes E in die Gruppe-OM in die gewünschte Endverbindung (I) überge- führt wird.
Im Rahmen der Erfindung soll die strukturmässige Darstellung eines substituierten Benzolkernes alle
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treffende Gruppe 1 bis einschliesslich 4 Kohlenstoffatome aufweist. Die Begriffe niedere Alkylgruppe, niedere Alkenylgruppeund niedere Alkoxygruppe umfassen daher z. B. die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, sek. Butyl-, Isobutyl-, tert. Butyl-, Vinyl-, Isopropenyl-, 1-Propenyl-, Allyl-, Methoxy-, Äthoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, Butoxy-, Isobutoxy-, sek. Butoxy- und tert. Butoxygruppe.
Zu den pharmazeutisch veträglichen anorganischen oder organischen Kationen M gehören diejenigen, die sich von den Metallen Calcium, Kalium und Natrium und von den Aminen Monoäthanolamin, Diäthanolamin, Dimethylaminoäthanol, N-methylglucamin, Trishydroxymethyl-methylamin, Morpholin u. dgl. ableiten.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (tri) können nach an sich bekannten Verfahrensweisen hergestellt werden. Hiezu sei beispielsweise auf Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, IV. Auflage, Band XII/2, Seite 226, sowie auf den Abschnitt "Phosphorylation" von D. M. Brown auf Seite 75 in"Advances in Organic Chemistry", Band 3, Interscience Publishers, 1963, verwiesen.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man für die Umsetzung der Verbindung der allgemeinen Formel T-OH zu der Verbindung (tri) eine solche Verbindung der allgemeinen Formel E-PO= (Hal) einsetzt, in der E von-OM verschieden ist.
Als Verbindungen der allgemeinen Formel E-PO=(Hal), kommen vorteilhaft die folgenden Verbindungen in Betracht !
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Phosphoroxychlorid, Phosphorsäurebenzylester-dichlorid, Phosphorsäurealkylester-dichloride, Phos- phorsäureamid-dichloride, wie Phosphorsäure-N-methylamid-dichlorid, Phosphorsäurealkylester-dichloride, bei denen die Alkylgruppe durch eine oder mehrere elektronenabziehende Gruppen substituiert ist, wie
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rere elektronenabziehende Gruppen aufweist, die in o-und bzw. oder p-Stellung zum Phosphorsäurerest gebunden sind, wie Phosphorsäure-4-nitrophenyl-, -2, 4-dinitrophenyl- und -2-chlormethyl-4-nitrophenyl- - ester-dichlorid.
Das Verfahren der Erfindung wird eingehender durch die folgenden, als Methoden a) bis h) bezeichneten Arbeitsweisen erläutert. a) Man lässt eine Verbindung der Formel T-OH mit etwa 0, 5 Mol Phosphoroxychlorid, zweckmässig in Gegenwart eines tertiären Amins, z. B. Pyridin, reagieren. Nach der Veresterung werden nicht um- gesetzte Chloratome mit Wasser hydrolysiert, und der erhaltene sekundäre Phosphorsäureester, der der oben angeführten Formel (tir) entspricht, wird aus dem Reaktionsgemisch in Form einer freien
Säure oder als ein geeignetes Salz derselben isoliert.
Werden nur 0, 3 bis 0, 4 Mol Phosphoroxychlorid verwendet, so kann auch eine grosse Zahl entsprechen- der tertiärer Phosphorsäureester gebildet werden. Solche Ester können-z. B. mit Alkali - hydroly- siert werden, um die Verbindung (n) zu bilden. b) Man lässt eine Verbindung der Formel T-OH mit 0, 5 Mol Phosphorsäuredichlorid-trichloräthylester der Formel Cl CCH OP (O) CI2 inGegenwart von wenigstens 1 Mol eines tertiären Amins, wie Pyridin, reagieren. Sind beide Chloratome des genannten Säurechlorids in Reaktion getreten, so wird der er- haltene tertiäre Phosphorsäureester mit z. B.
Zink in Pyridin/Essigsäure oder Zink/Kupfer in Di- methylformamid behandelt, um die Trichloräthylestergruppe abzuspalten und die Bildung eines sym- metrischen sekundären Phosphorsäureesters der oben angegebenen Formel (H) herbeizuführen. c) Man lässt eine Verbindung der Formel T-OH mit 0, 5 Mol Phosphorsäuredichlorid-N-methylamid in einem inerten organischen Lösungsmittel, z. B. Benzol, und in Gegenwart von wenigstens 1 Mol eines tertiärenAmins, wie z. B. Triäthylamin, reagieren. Die Umsetzung kann auch unter Verwendung eines geeigneten Amins als Lösungsmittel, z. B. von Pyridin, durchgeführt werden. Das erhaltene Phos- phorsäure-N-methylamid-bis-T-esterwirddannineiner sauren Lösung, die z. B.
Ameisensäure oder
Schwefelsäure enthält, hydrolysiert und ergibt einen symmetrischen sekundären Phosphorsäureester, welcher der oben angegebenen Formel (H) entspricht, d) Die Verbindungen, welche der oben angegebenen Formel (II) entsprechen, können auch dadurch her- gestellt werden, dass man den Phosphorsäuredichlorid-2-chlormethyl-4-nitrophenylester in dem nach-
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stehen, wonach man solche Gruppen in an sich bekannter Weise in die Gruppen umwandelt, die der in der oben angeführten allgemeinen Formel (I) gegebenen Definition entsprechen. Als Beispiele für sol- ehe Umwandlungen können die Entfernung von Schutzgruppen, z.
B. von Benzyl-, Trityl-, Methoxyme- thyl-, Tetrahydropyranyl-, Trimethylsilyl-, Carbalkoxy-, Carbobenzoxy- und Benzoylgruppen, ge- nannt werden. g) Es ist auch möglich, nach an sich bekannten Verfahrensweisen Verbindungen, die der oben angegebe- nen allgemeinen Formel (I) entsprechen, aus andern Verbindungen, die unter die Definition der oben
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und R17 dieSubstituentenR, R bzw. R darstellen.
Als Beispiele solcher Umwandlungen können die folgenden erwähnt werden : Freie Hydroxylgruppen werden z. B. erhalten durch Entfernung von Acyl- und Dihydroxyphosphinylgruppen aus Acylestern bzw. primären Phosphorsäureestern, durch Entfernung von niedermolekularen Alkylgruppen aus niedermolekularen Alkoxygruppen und über Diazoniumsalze aus primären aromatischen Aminen. Freie
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äthert werden, primäre und sekundäre Amine zu Amiden acyliert werden und Carbonsäuren verestert und auch in Amide umgewandelt werden. Mit Hilfe der Mannich-Reaktion ist es möglich, Aminome- thylgruppeneinzuführen, und mittels der Schiemann- und Sandmayer-Reaktionen können primäre aro- matische Amine in Fluor-, Chlorid- oder Nitrilgruppen umgewandelt werden.
Soweit die Gruppe X betroffen ist, kann man Beispiele vonumwandlungen, die mit dieser Gruppe vor- genommen werden können, weiter unten bei Erörterung der Methoden zur Herstellung der Verbindun- gen der Formel T-OH finden. h) Wenn die sekundären Phosphorsäureester der oben angeführten Formel (I) in Form der freien Säuren isoliert werden, können solche Säuren in die Salze mit pharmazeutisch verträglichen anorganischen oder organischenKationeninan sich üblicher Weise übergeführt werden. Beispiele von geeigneten an- organischen und organischen Kationen M wurden bereits angegeben.
Wird ein sekundärer Phosphorsäureester gemäss der Erfindung in Form eines Salzes mit einem Kation isoliert, das nichtpharmazeutisch verträglich ist, so wird ein derartiges Salz in die freie Säure oder in Salze mit pharmazeutisch verträglichen Kationen nach an sich bekannten Verfahrensweisen übergeführt, bei- spielsweisedurchBehandeln eines Salzes mit einer starken Säure, durch Anwendung eines geeigneten Ionenaustauschers oder vermittels einer doppelten Umsetzung in einem geeigneten Lösungsmittel.
Die Methoden, die zur Synthese der erfindungsgemäss vorgesehenen sekundären Phosphorsäureester angewendet werden, müssen in einer solchen Weise ausgewählt werden, dass alle Gruppen in den umfassten Aus-
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gangsmaterialien die angewendete Methode überstehen, oder erforderlichenfalls werden empfindliche Gruppen bei der Umsetzung geschützt und danach in die gewünschten Gruppen umgewandelt, so dass Verbindungen
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erhaltenFries'sehe Verschiebung, Grignard-Reaktion, Houben-Hoesch-Reaktion, Knoevenagel-Kondensation, Malonester-Synthese, Nencki-Reaktion und Wittig-Reaktion.
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bindung. T-OH oder ein funktionelles Derivat derselben zu bilden.
Als Beispiele von Umwandlungen in der Gruppe X können die folgenden genannt werden : Doppelbindungen in X können durch Eliminierungsreaktionen gebildet werden. Sie können katalytisch hydriert werden, auch in Gegenwart der Carbonylgruppe, oder es können neue Substituenten durch Additionsreaktionen eingeführt werden.
TrägtX eine geeignete Hydroxylgruppe, so kann eine derartige Gruppe in eine Carbonylgruppe mit einem Oxydationsmittel, z. B. gemäss einer Oppenauer-Oxydation oder einer Sarett-Oxydation, umgewandelt werden.
Bezüglich der Einführung von Gruppen, wie niederen Alkylgruppen, Phenyl-undBenzylgruppeninX wird auf Methoden zurückgegriffen, die den unten angeführten Literaturstellen bzw. den Beispielen zu entnehmen sind.
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Einzelheiten über die erwähnten Namen-Reaktionen finden sich z, B.ofOrganicSyntheses" (NewYork [1970]), S. 623.
Die obenerwähntenUmsetzungenzurHerstellung der Verbindung der Formel T-OH oder von ihren funktionellenDerivaten werden in einer solchen Weise durchgeführt, dass jede Gruppe der umfassten Verbindungen den in Rede stehenden Prozess übersteht oder erforderlichenfalls geschützt ist.
Wenn die Verbindung der Formel T-OH zusätzlich andere reaktionsfähige Gruppen, wie-OH, primäre undsekundäreAmin- und Carbonsäuregruppen trägt, so werden diese Gruppen nötigenfalls während der Synthese der Phosphorsäureester geschützt. Geeignete Schutzgruppen für-OH und Amine findet man in den Monographien von S. Patai"The Chemistry of the Hydroxyl Group" (London, [1971]), S. 1001 und S. Patai"The Chemistry of theAminoGruop" (London [1968]), S. 669. Eine freie Carboxylgruppe kann z.
B. dadurch ge- schützt werden, dass man sie in einen geeigneten Ester überführt. Eine derartige Schutzgruppe oder derartige Schutzgruppen können danach in jeder geeigneten Verfahrensstufe im Zuge der Herstellung der sekundären Phosphorsäureester entfernt werden.
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werden allmählich (innerhalb von 10 min unter Rühren zu einer Lösung von 0, 46 ml Phosphoroxychlorid in 5 ml Pyridin bei einer Temperatur von -200C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 h auf -50C gehalten und dann weitere 70h auf Zimmertemperatur. Es wird Wasser zugesetzt und die entstandene Lösung in einen Schneidetrichtergegeben, derein Gemisch aus 2,5-molarer Salzsäure (100 ml) und Äthylacetat (100 ml) enthält. Die organische Phase wird mit Wasser und gesättigter Natriumsulfaüösung gewaschen.
Die Äthylacetatlösung wird mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird anSilicagelchromatographiert. Die kleine Menge von tertiärem Phosphorsäureester, die vorhanden ist, wird mitÄthylacetateluiert. Der sekundäre Ester wird dann mit einem (l : 9)-Äthylacetat/Methanol-Gemisch eluiert, gesammelt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in einem (1 : 4) -Aceton/Wasser-Gemisch gelöstund mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von etwa 5 eingestellt. Die Hauptmenge des Acetons wird im Vakuum entfernt und die hinterbleibende wässerige Lösung gefriergetrocknet.
Das erhaltene Salz besteht ausdemNatrium-Bis-14- [3- (4-chlorphenyl)-3-oxopropyll-2-methoxyphenyll-phosphat, das sich bei der Dünn- 3chichtchromatographie als rein erweist und ein NMR-Spektrum aufweist, das seine Struktur bestätigt.
In im wesentlichen analoger Weise werden die Natriumsalze der folgenden symmetrischen sekundären Phosphorsäureester erhalten :
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[3- (2-nitrophenyl)-3-oxopropenyl]-phenyll-phosphatNatrium [3- (4-äthoxycarbonylamethylphenyl)-3-oxopropyl]-phenyl]-phosphat
Natrium-Bis- {4-[3-(4-N,N-dimethylcarbamylmethylphenyl)-3-oxopropyl]-phenyl-phosphat.
Die für die Phosphorylierung verwendeten Zwischenprodukte sind 3-Phenylpropiophenone und 3-Phenylacrylophenone, die eine Hydroxygruppe und andere Substituenten in Stellungen aufweisen, die aus den Konstitutionen der Endprodukte erkennbar sind. Die Zwischenprodukte werden erhalten durch Kondensation von Benzaldehyden und Acetophenonen, welche die erforderlichenSubstituentenaufweisen, und nötigenfalls durch Hydrierung der Doppelbindung, die während der Kondensation gebildet wird. Es können die Methoden für diese Reaktion verwendet werden, die in Ind. Chim. Belg. 1961,345, beschrieben sind.
Beispiel2 :2,8mlTriäthylaminin10mltrockenemBenzolwerdentropfenweiseinnerhalbvon40min ineinerückfliessend siedende Lösung von 6, 5 g 3-(4-Diäthylaminophenyl)-4'-hydroxypropionphenon (aus 4-Di- äthylaminobenzaldehyd und 4'-Hydroxyacetophenon erhalten) in 50 ml trockenem Benzol und 0,915 ml POCI gegeben. Das Erhitzen wird eine weitere Stunde lang fortgesetzt. Die abgekühlte, filtrierte Lösung wird im Vakuum eingedampft, es wird Wasser zugegeben und das pH mit 1-molarem Natriumhydroxyd auf 9 eingestellt. Das Gemisch wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, dann wird Aceton zugesetzt, und das ungelöste Natriumchlorid und etwas Dinatriummonophosphat wird abfiltriert.
Es wird etwas Leichtbenzin vorsichtig zugesetzt, um den Dinatriummonoester, den Mononatriumdiester und den Triester voneinander zu trennen. DieDiester-FraktionwirdinAcetongelost, undes wird eine erneute fraktionierte Ausfällung mit Leichtbenzin vorgenommen. Die Dünnschichtchromatographie (Propan-2-01 : 0, 5-molares Triäthylamin, Bicarbonat, 8 : 2) des Niederschlages, des Natrium-Bis-{4-[3-(4-diäthylaminophenyl)-propionyl]-phenyl}-phosphats, ergibt nur einen Flecken. Die Struktur der Verbindung wird durch das NMR-Spektrum bestätigt.
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Die für die Herstellung dieser Phosphorsäureester verwendeten substituierten 3-Phenylpropiophenone werdengemäss Beispiel 11 aus geeignet substituierten Acetophenonen und Benzaldehyden erhalten, in welchen Verbindungen die Hydroxygruppen, die nicht phosphoryliert werden sollen, benzyliert sind, u. zw. im wesentlichen gemäss der Arbeitsweise, die in J. Chem. Soc. 1933, 1381,1384 beschrieben ist.
Beispiel 4 : 12, 6 g des 4', 5-Dibenzoats des Naringenins (Schmelzpunkt 212 bis 214oC, hergestellt durch partielle Entbenzoylierung des Naringenin-4', 5, 7-tribenzoats gemäss einerArbeitsmethode, die L. Farkas und Mitarbeiter in Chem. Ber. 102 [1969], S. 2583, beschrieben haben) werden in 75 ml trockenem Pyridin gelöst und allmählich (innerhalb von 60 min) unter Rühren zu einer Lösung von 1, 2 ml Phosphoroxychlorid in 85 ml trockenem Pyridin bei -100C zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde bei -100C wird das Reaktionsgemisch bis zum nächsten Tag auf Zimmertemperatur gehalten. Es wird dann auf zerstossenes Eis (85 g) gegossen, und die hinterbleibende Lösung wird im Vakuum bis auf ein Volumen von etwa 50 ml eingedampft.
Diese Lösung wird in ein Gemisch aus 5-molarer Salzsäure (250 ml) und zerstossenem Eis (100 g) gegossen.
Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Der getrocknete Niederschlag besteht aus dem Bis- (7-naringenin-4' -5-dibenzoat)-hydrogenphos-
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Verbindung wirdnachderEntbenzoylierungmitAlkaliin wässerigemtrocknung einer wässerigen Lösung seines Natriumsalzes, und es erweist sich bei der Dünnschichtchromato- graphie als rein.
Dieses Chalkonderivat wird dann in Gegenwart eines 10%igen Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysators in wässerigem Alkali zum entsprechenden Dihydrochalkonderivat, d. i. das Natrium-Bis- {3, 5-dihydroxy- - 4- [3- (4-hydroxyphenyl)-propionyl]-phenyl}-phosphat, hydriert. Diese hydrierte Verbindung wird auch un- mittelbar aus dem Bis- (7-naringenin-4', 5-dibenzoat) -phosphat erhalten, u. zw. durch Hydrieren dieser Verbindung (2, 2 g), gelöst in einem Gemisch aus Dioxan (50 ml), Äthanol (30 ml) und 0, 65 molarem Natriumhydroxyd (80 ml) in Gegenwart von 0, 5 g eines 10%igen Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysators.
Unter Anwendung der letztgenannten Methode wird die nachstehende Verbindung erhalten durch Hydrie- rung des entsprechendensubstituierten Bis- (flavanonphosphat)-esters, der aus Phosphoroxychlorid und dementsprechend substituierten Hydroxyflavanon hergestellt worden ist. Die in Rede stehenden Substituenten ergeben sich unmissverständlich aus dem unten angeführten Endprodukt. Das Flavanon wird aus dem zweckentsprechend substituierten Acetophenon und Benzaldehyd in im wesentlichen der gleichen Weise erhalten, wie es in Ind. Chim. Belg. 1961,345 angegeben ist.
Natrium-Bis-3-äthyl-4- [3- (2-hydroxyphenyl)-3-oxopropyl] -2-methoxyphenyl}-phosphat.
Beispiel 5 : Zu einer Lösung von 36g3- (4-Chlorphenyl)-3'-hydroxypropiophenon-4-phenyl-buty- rophenon in trockenem Pyridin (20 ml) werden 2, 66 g frisch destilliertes Phosphorsäuretrichloräthylester- - dichlorid unter Rühren bei einer Temperatur von etwa-15 C zugesetzt. Die Temperatur des so entstandenen Reaktionsgemisches lässt man dann auf Zimmertemperatur ansteigen und hält das Gemisch weitere 70 h aufdieserTemperatur. Es wird dann Wasser zugesetzt und das erhaltene Gemisch in ein Gemisch aus Äthyl- acetatundl-molarerSalzsäure gegossen. Die Äthylacetatlösung wird dann mit 0, 5-molarer Salzsäure, Was- serundO, 5-molarer Natriumbicarbonatlösunggewaschenundschliesslich wieder mit Wasser gewaschen.
Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird das Äthylacetat im Vakuum entfernt. Das entstandene Öl wird in 50 ml eines (8 : 2)-Gemisches aus Pyridin und Essigsäure gelöst. Bei einer Temperatur von 00C wird aktiviertes Zink (vgl. J. Biol. Chem. 230 [1958], S. 447 ; J. Org. Chem. 29 [1964], S. 2048) unter Rühren zugegeben. Nach einer halben Stunde bei 0 C lässt man die Temperatur auf Zimmertemperatur ansteigen. Am folgenden Tag wird das Reaktionsgemisch filtriert und die erhaltene klare Lösung in 2-molare Salzsäure gegossen. Nun wird Äthylacetat zugegeben und die wässerige Lösung verworfen. Die Äthylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst.
Es wird Wasser zugesetzt und der gebildete Niederschlag gesammelt und in Methanol gelöst. Nun wird Wasser zugesetzt. Der dann gebildete Niederschlag besteht aus dem Bis- {2- [3- (4-chlorphenyl)-propionyl]-phenyl}-hydrogenphosphat und ergibt bei der Dünnschichtchromatographie (Silicagel ; n-Butanol/Wasser-Gemisch) einen Flecken. Die Struktur wird durch das NMR-Spektrum bestätigt.
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Die Benzollösung wird abgekühlt, mit 0,5-molarer Salzsäure, Wasser und 0,5-molarem Natriumbicarbonatgewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Benzol abgedampft. Der Rückstand wird in 200 ml eines Gemisches aus 1 Teil 1-molarer Schwefelsäure und 3 Teilen Aceton gelöst und 4 h unter Rückfluss erhitzt.
Das Aceton wird im Vakuum abgedampft und der wässerige Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und danach im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und das PH der Lösung mit 2-molarem Natriumhydroxyd auf 5 eingestellt. Das Methanol wird im Vakuum abgedampft und die hinterbleibende Substanz in Aceton gelöst und mit Äther gefällt. Die Ausfällung (4 g) besteht aus dem Natrium-Bis- {3, 5-dimethoxy-4-[3- (4-methoxy- phenyl)-propionyl]-phenyl}-phosphat, das bei der Dünnschichtchromatographie (Silicagel; n-Butanol/WasserGemisch) einen Flecken ergibt.
In im wesentlichen analoger Weise werden die folgenden Verbindungen aus Phosphorsäure-N-methylamid-dichloridund ss-Phenylpropiophenonen oder 3-Phenylacrylophenonen erhalten, die durch eine Hydroxygruppe und andere Gruppen, wie sie zur Bildung des Endproduktes erforderlich sind, substituiert sind :
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Die Ausgangsmaterialien für diese Phosphorsäureester werden nach der in Ind. Chim. Belg. 1961, S. 345 beschriebenen Methode aus Acetophenonen und Benzaldehyden hergestellt, welche die Substituenten aufweisen, die zur Bildung der Endprodukte erforderlich sind.
Darüber hinaus werden in im wesentlichen analoger Weise das
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aus Ausgangsmaterialien hergestellt, bei denen die Hydroxygruppen, die nicht phosphoryliert werden sollen, durch Methoxymethylgruppen geschützt sind. Die Schutzgruppen werden mittels einerArbeitsmethode einge- führt, die derjenigen analog ist, die in Ann. Chim. (Rom) 48 [1958], S. 111, beschrieben ist, u. zw. ehe die Umsetzung zwischen dem benötigten Benzaldehyd und dem Acetophenon durchgeführt wird.
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- Bis- {4-[3-oxo-3 - (2,sprechend substituierten 3-Phenylpropionitril und 1,3,5-Trimethoxybenzol bzw. 3, 5-Dimethoxyphenol. in im wesentlichen der gleichen Weise erhalten werden, wie sie in J. Chem.
Soc. 1930, 21, beschrieben ist.
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[2, 6-dimethyl-4- (4-phenyl)-butyryl]-phenylphosphatwirdaus 4'-Hydroxy-3', 5'-dimethyl-BortrifluoriddurchAnwendung von Arbeitsmethoden gewonnen wird, wie sie in 11 Friedel-Crafts- und Related Reactions", Bd. 3, S. 171, Interscience, New York [1964], beschrieben sind ; Natrium [4- (2-butyl-3-phenylpropionyl)-phenyl]-phosphat
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-phenyl] -phosphatDieAusgangsmaterialienfiirdiese vier Phosphorsäureester werden hergestellt 1. durch Alkylierung der
CH2-Gruppe, die in Nachbarstellung zur CO-Gruppe steht in methoxysubstituiertem 2-Phenylacetophenon und 3-Phenylpropiophenon in Dimethylsulfoxyd und Kalium-tert. butylat (Fieser und Fieser, Reagents for Org.
Synth. Wiley, New York [1967J, S. 915, und Bd. 2, S. 159 ; und 2. Entmethylierung der Methoxygruppe mit Py- ridinhydrochlorid (ebenda S. 964).
Beispiel 7 : 3- (4-Hydroxyphenyl)-2', 4', 6'-trimethoxypropiophenon (2, 08 g ; 6, 6 mM), Tetrahydrofuran (6 ml), Pyridin (0, 54 ml, 6, 7 mM) und Phosphorsäure-2-chlormethyl-4-nitrophenylester-dichlorid (0, 91 g ; 3 mM) werden 24 h auf Zimmertemperatur und danach 1 h auf 600C gehalten. Nach dem Abkühlen wird das Pyridinhydrochlorid abfiltriert und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wird in Benzol gelöstundan einer Silicagelsäule chromatographiert. Der tertiäre Phosphorsäureester wird mit Benzol elu-
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iert und eingedampft. Die Ausbeute beträgt 1, 05 g.
0, 864 g des tertiären Phosphorsäureesters werden in 10 ml Pyridin gelöst. Es wird Wasser zugesetzt, bis die Lösung opaleszierend wird. Die Lösung wird 2 Tage auf Zimmertemperatur gehalten und dann 8 h auf 800C erhitzt. Der Reaktionsablauf wird an Hand der Dünnschichtchromatographie (Wasser/n-BuOH) überwacht. Das Reaktionsgemisch wird in 20 ml Äthylacetat und 0, 2-molare Salzsäure gegossen. Die filtrierte Äthylacetatlösung wird im Vakuum eingedampft. Es wird Methanol zugegeben, und ungelöste Anteile werden abfiltriert. Das pu der Lösung wird mit 5-molarem Natriumhydroxyd auf 5 eingestellt, dann wird eingedampft, in Aceton gelost und mit Äther gefällt.
Man erhält 0, 31 g des Natrium-Bis-4- [3-oxo-3- (2, 4, 6-trimethoxy- phenyl)-propyl]-phenyl}-phosphats.
Beispiel 8 : Chlorwasserstoff wird 6 h lang unter Rühren in eine Lösung des Phosphorsäure-bis-
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[4- (2-oyanäthyl)-phenylester]-N-methylamidsroglucin (30 g; 0,238 Mol) und Zinkchlorid (31,4 g; 0,238 Mol) in Sulfolan (50 ml), die auf 00C gehalten wird, eingeleitet. Das Gemisch wird über Nacht auf etwa 50C gehalten, mit 150 ml Sulfolan verdünnt und unter Rühren in 2 l Benzol gegossen, und das Rühren wird 20 min lang fortgesetzt. Die Benzollösung wird dekantiert und der Rückstand zunächst mit 11 Benzol und danach mit 2 plus 11 Diäthyläther behandelt. Der ölige Rück-
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le (H-Form), Maschensiebfeinheit 100 bis 200 Maschen, aufgegeben. Das rohe sekundäre Phosphat wird mit Methanol eluiert.
Die Methanollösung wird auf 200 ml eingedampft und an einer 1 m-Sephadex LH 20-Säule chromatographiert, die mit Methanol eluiert wird. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden mit l-molarem Natriumhydroxyd bis zum Pfl 5 titriert. Das Methanol wird unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und die Lösung gefriergetrocknet. Der Rückstand besteht aus dem Natrium-Bis-{4-[3-oxo-3-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-propyl]-phenyl}-phosphat, das bei der Dünn- schichtchromatographie einen Flecken ergibt.
In im wesentlichen analoger Weise werden die folgenden Verbindungen aus Phosphorsäure-N-methylamid-dichlorid und den in Klammern angegebenen Verbindungen in zwei Stufen hergestellt, wie es oben beschrieben ist :
Natrium-Bis- {3-[3-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-oxopropyl]-phenyl}-phosphat [aus 3- (2-Cyanäthyl)-phenol und Resorcin]
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{3- [3-oxo-3- (2, 4, 6-trihydroxyphenyl)-propyl]-phenyl}-phosphat[aus 3- (2-Cyanäthyl)-phenol und Phloroglucin]
Natrium-Bis- {4-[4-(2,4-dihydroxyphenyl)-4-oxo-n-butyl]-phenyl}-phosphat [aus Resorcin und 4- (3-Cyanpropyl)-phenolI Natrium [4-oxo-4- (2, 4, 6-trihydroxyphenyl)-n-butyl]-phenyl}-phosphat [aus Phloroglucin und 4- (4-Cyanbutyl)-phenol]
Natrium-Bis- {4-[4-oxo-4-(2,4,6-trimethoxyphenyl)
-n-butyl]-phenyl}-phosphat [aus 1, 3, 5-Trimethoxybenzol und 4- (4-Cyanbutyl) -phenol].
Beispiel 9: Essigsäureanhydrid (5,1 g; 50 mM) wird zu einer Lösung von Bis-{4-[3-oxo-3-(2,4,6-tri- hydrophenyl)-propyl]-phenyl}-phosphat (Beispiel 3) (3, 16 g ; 5 mM) in 20 ml Pyridin und Triäthylamin (1, 02 g ;
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misch gelöst. Der Pfl der Lösung wird auf 5 eingestellt. Das Aceton wird im Vakuum abgedampft, und der hinterbleibende, sirupöse Niederschlag, der sich beim Stehen verfestigt, besteht aus reinem Natrium-Bis- - {4-[3-oxo-3- (2, 4, 6-triacetoxyphenyl) -propyl] -phenyl} -phosphat. Dessen Struktur wird durch das NMR-Spek- trum bestätigt.
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Als Ausgangsmaterialien für diese Verbindungen werden die Phosphorsäureester verwendet, die in andern Beispielen erwähnt sind.
Beispiel 10 : Natrium-Bis- 3- [3- (4-hydroxyphenyl)-3-oxopropyl]-phenyl}-phosphat (2g) (s. Beispiel 9) wird in trockenem Pyridin (35ml) gelöst. Diese Lösung wird unter Rühren innerhalb von 15 min zu einer Lö- sung von Phosphoroxychlorid (1, 6 ml ; 0, 018 Mol) in trockenem Pyridin (50 ml) bei-10 C zugesetzt. Das entstandene Reaktionsgemisch wird eine weitere Stunde auf -100C gehalten. Dann lässt man die Temperatur auf Zimmertemperatur ansteigen.
Am folgenden Tag wird die klare Lösung auf zerstossenes Eis (50 g) gegossen, und die Hauptmenge des Pyridins wird im Vakuum entfernt. Zu dem Rückstand wird 5-molare Natriumhydroxydlösung (18 ml) gegeben, um ein pH von etwa 8, 5 einzustellen, und die erhaltene Lösung wird mehrere Male mit Äther extrahiert.
Die wässerige Lösung wird dann in kalte 5-molare Salzsäure (50 ml) gegossen, und der erhaltene Niederschlag, der durch Filtration gesammelt, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet wird, besteht aus dem Bis- (dihydrogenphosphat) des Bis-3- [3- (4-hydroxyphenyl)-3-oxopropyl]-phenyl}-hydrogen- phosphats.
Beispiel 11 : Zu einem Gemisch aus 30, 3 g Bis-{4-[3-(3-hydroxyphenyl)-3-oxopropyl]-2-methoxy- phenyl}-hydrogenphosphat (Beispiel 3) und 1000 ml 0, 3-molarem Natriumäthylat, das unter Stickstoff gehalten wird, werden 9, 45 g Chloressigsäure in 50 ml wasserfreien Äthanols tropfenweise unter Rühren zugegeben, und das Gemisch wird am Sieden gehalten. Nachdem die gesamte Säure zugesetzt worden ist, wird das rückfliessende Sieden noch 1 h fortgesetzt. Das Gemisch wird dann abgekühlt und das Natriumchlorid durch Filtrieren entfernt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum abgedampft und der Rückstand in Wasser gelöst, mit 2-molarer Salzsäure angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert.
Die organische Schicht wird mit gesät-
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(Beispiel 1) in 500ml eines (l : l)-Methanol/Wasser-Gemisches werden mit Wasserstoff bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck in Gegenwart von 0, 3 g eines 10%igen Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysators hydriert. Die Reaktion hört nahezu auf, wenn die für die Reduktion der Nitrogruppe und für die Hydrierung der Doppelbindung erforderliche Wasserstoffmenge absorbiert worden ist. Der Katalysator wird durch Fil-
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entferntfriergetrocknet. Man erhält das Natrium-Bis-{4-[3-(3-aminophenyl)-3-oxopropyl]-phenyl}-phosphat in einer Ausbeute von 6, 1 g. Die Struktur wird durch das NMR-Spektrum bestätigt.
In im wesentlichen analoger Weise werden die folgenden Verbindungen aus den nitrosubstituierten Phosphorsäureestern in den Beispielen 1 bzw. 6 erhalten :
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den in 150 ml Wasser gelöst und 5 ml einer 50% lgen Losung von Calciumchlorid in Wasser zugegeben. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Das erhaltene Produkt besteht aus dem Calciumsalz des Bis-4- [3-oxo-3- (2, 4, 6-trimethoxyphenyl)-propyl]- - phenyl-hydrogenphosphats.
Die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäss erhältlichen neuen sekundären Phosphorsäureester geht aus den nachfolgend beschriebenen Untersuchungen im einzelnen hervor.
Untersuchung A :
Die prostaglandininhibierende Wirkung der erfindungsgemäss erhältlichen Ester auf den Grimmdarm von Wünstenmäusen wird unter Anwendung der allgemeinen Methodik, wie sie Eakins, Miller und Karim (J. Pharm.
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aus eigener Zucht, u. zw. männliche und weibliche, mit einem Gewicht zwischen 50 und 80 g verwendet.
Das Tier wird betäubt, das Colon ascendens sofort herausgenommen, und ein 2 bis 3 cm langes Stück wird in ein 6 ml-Bad gehängt, das eine modifizierte de Jalon-Lösung von 280C enthält und ständig mit Sauerstoff begast
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Untersuchung B : Die Inhibitorwirkung der erfindungsgemäss herstellbaren Ester ist ferner an der prostaglandinstimulier- tenCorticosteron-ProduktiondurchdieNebennierenvonmännlichenRatten in vitro getestet worden. Die Versuche wurden mit ausgewachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit Gewichten zwischen 200 und 250 g durchgeführt, die einzeln im Käfig bei geregelter Beleuchtung und Temperatur gehalten wurden. Die Tierställe wurden 18h vor dem Versuch nicht mehr betreten.
Die Tiere wurden um 10 Uhr vormittags unter Bedingungen, die so gewählt waren, dass sie den Tieren ein Mindestmass an Belästigungen gewährleisteten, durch Enthauptengetötet. Die Nebennieren wurden herausgeschält und 8 Nebennieren-Viertel von verschiedenen Tieren wurden auf 10 ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt, die 0, 5 ml 0, 9%ige Kochsalzlösung und 2, 0 ml Krebs-
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Bicarbonatpuffer vom PR 7, 4 enthielten. Es wurdedenAngaben) wurde in die Kolben gegeben, die dann mit dem Gasgemisch aus 95% O2 und 5% 002 begast wurden, und die Kolben wurden 1 h unter ständigem Schütteln auf 37 C gehalten. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Corticosteron-Gehalte nach der Schwefelsäure-Fluoreszenzmethode in aliquoten Teilen von 0, 5 ml des Mediums bestimmt.
Im ersten Versuch (I) wurde Prostaglandin E2 (PGE2) in einer Konzentration von 1 g/ml zum Inkubationsmedium, welches die Nebennieren-Viertel enthielt, zugesetzt. Das Ergebnis ist in der Tabelle zusammengestellt, und es kann hieraus entnommen werden, dass ein hochsignifikanter Anstieg der CorticosteronKonzentration durch PGE ausgelöst wird.
Im nächsten Versuch (II) wurden verschiedene Mengen von "Leo 1235" (vgl. wegen dessen Bedeutung Untersuchung H) zum Inkubationsmedium zugesetzt. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass bei Zusatz von 0, 25 und 1,0 mg "Leo 1235" zum Inkubationsbad eine dosisabhängige Inhibierung der PGE -stimulierten Cortico- steron-Produktion eintrat.
Tabelle
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<tb>
<tb> Versuch <SEP> Gruppe <SEP> Zusätze <SEP> zum <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> CorticosteronNr. <SEP> Nr. <SEP> Inkubationsmedium <SEP> Beobach- <SEP> Produktion <SEP>
<tb> tungen/lg/100 <SEP> mg <SEP> x <SEP> l <SEP> h+)
<tb> Kontrolle <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> xi <SEP> :
<SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> PIGE <SEP> PGE2 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> g/ml <SEP> 4 <SEP> 5,8 <SEP> ¯ <SEP> 0,4 <SEP> < <SEP> 0,05
<tb> A <SEP> Leo <SEP> 1235 <SEP> - <SEP> 250 <SEP> ¯g/ml <SEP> 4 <SEP> 2,0 <SEP> ¯ <SEP> 0,2 <SEP> A/B
<tb> B <SEP> Peg2 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> g/ml <SEP> 4 <SEP> 6,0 <SEP> ¯ <SEP> 0,3 <SEP> < <SEP> 0,05
<tb> PGE2 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> g/ml <SEP> 4 <SEP> 4,2 <SEP> ¯ <SEP> 0,1 <SEP> B/C
<tb> Leo <SEP> 1235 <SEP> - <SEP> 250 <SEP> g/ml
<tb> PGE2 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> g/ml <SEP> B/D
<tb> D <SEP> Leo <SEP> 1235 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> mg/ml <SEP> 4 <SEP> 1,9 <SEP> ¯ <SEP> 0,3 <SEP> < <SEP> 0,05
<tb>
+) bedeutet : mittlerer Standardfehler
Eine prostaglandininhibierende Wirksamkeit in gleicher Grössenordnung ist auch feststellbar, wenn die nachstehenden Verbindungen getestet werden :
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Untersuchung C :
Es wird die Einwirkung der erfindungsgemäss herstellbaren Ester auf die prostaglandinstimulierte Glykolyse der präpubertären Ovarien untersucht. Die angewendete Methode ist in detaillierter Form von Perklev
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undAhrén (LifeSciences, Teil !, 10 : 1387,1971) beschrieben worden. Bei diesen Versuchen werden Ovarien von noch nicht geschlechtsreifen Ratten herausgenommen und in Erlenmeyer-Kolben gegeben, welche die er- findungsgemäss erhältlichen Verbindungen, inKrebs-Bicarbonatpuffer gelost, enthalten. Nachdem die Ovarien 60 min lang bei 370C in diesem Medium inkubiert worden sind, lässt man sie auf Filterpapier abtropfen, und danach werden sie 2 min lang in einem gewöhnlichen Puffer gewaschen.
Die Ovarien werden dann in ein neues Inkubationsmedium gegeben, das Prostaglandine (PG), in Krebs-Bicarbonatpuffer gelöst, enthält, und sie werden 2 h unter ständigem Schütteln bei 370C inkubiert. Die Ovar-Glykolyse wird dann durch Messen der Milchsäure-Konzentration im Inkubationsmedium bestimmt. Ist Polyphloretinphosphat (PPP) im Vorinkubationsmediumin einer Konzentration von 500 jLtg/ml anwesende so wird die nachträgliche Milchsäureproduktion des Ovars, die durch Prostaglandin E hervorgerufen worden ist, auf ungefähr 50% des Wertes herabgesetzt, den man erhält, wenn die Ovarien in einem gewöhnlichen Puffer vorinkubiert worden sind.
Wird Natrium-Bis--J4- [3-oxo-3- (2, 4, 6-trihydroxyphenyl)-propyl]-phenyl}-phosphat in der selben Versuchsanordnung untersucht, so wird eine 50%ige Herabsetzung der Milchsäureproduktion bereits erreicht, wenn nur 50 bis lOOg/ml der Verbindung im Vorinkubationsmedium vorhanden sind. Daraus folgt, dass diese Verbindung als Prostaglandininhibitor 5- bis 10mal wirksamer als PPP bei der verwendeten Versuchsanordnung ist.
Eine prostaglandininhibierende Wirksamkeit in gleicher Grössenordnung ist auch festzustellen, wenn die folgenden Verbindungen untersucht werden :
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Untersuchung D :
Die in vitro-Wirksamkeit der erfindungsgemäss erhältlichen Ester bezüglich der prostaglandinstimulierten Glykose der präpubertären Ovarien wird in folgender Weise untersucht :
Noch nicht geschlechtsreife Ratten des Sprague-Dawley-Stammes, die 24 bis 26 Tage alt sind, erhalten eine intraperitoneale (i. p.) Injektion von 1 ml einer Kochsalzlösung, die 500 Mg Natrium-Bis-J4- [3-oxo- -3- (2, 4, 6-trihydroxyphenyl)-propyll-phenyll-phosphat enthält. 1 h später werden die Tiere durch Bruch des Halswirbels getötet und die Ovarien herausgenommen und von jeglichem Fremdgewebe befreit.
Die Ovarien werden dann in ein Inkubationsbad gelegt, welches Prostaglandin E (PGE ; 0, 4jng/ml), gelöst in Krebs-Bicarbonat-Puffer, enthält, und sie werden 2h unter ständigem Schütteln bei 370C inkubiert. Die Glykolyse des Ovars wird dann bestimmt durch Messen der Milchsäurekonzentration im Inkubationsmedium. Die Einzelheiten dieser Methode sind bereits beschrieben worden (Perklev, T. und Ahrén, K., Life Sciences Part I, 10 : 1387,1971). In den Ovarien der jenigen Tiere, die mit dem oben angeführten Ester behandelt worden sind, ist die Glykolyse signifikant herabgesetzt, wenn man sie mit jener in Vergleich setzt, die man bei Ovarien misst, die von Tieren stammen, denen nur Kochsalzlösung injiziert worden ist.
Die gleiche Herabsetzung der Ovar-Glykolyse ist auch festzustellen, wenn die nachstehend angeführten Verbindungen intraperitoneal injiziert werden, ehe die Ovarien dem Prostaglandin E in der oben beschriebenen Weise ausgesetzt werden :
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ausgesetzt worden sind (vgl. Strandberg und Uvnäs, Acta physiol. scand. 82 : 358,1971). In diesem System wurde natrium-Bis-{4-[3-oxo-3-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-propyl]-phenyl}-phosphatin mehreren K onzentra- tionen getestet.
In Konzentrationen bis herunter zu 5 jUg/ml inhibiert diese Verbindung Kontraktionen, die durch"SRS", aber nicht durch Histamin und Bradykinin, ausgelöst worden sind, in konkurrierender Weise, d. h. es tritt eine ParallelverschiebungderDosierungsempfindlichkeits-Kurven, aber keine Änderung der maximalen Kontraktion ein.
Das Natriumsalz des Diphenylphosphats erweist sich, sie festgestellt wurde, ohne jede Wirkung.
Die nachstehend angeführten Verbindungen inhibieren, wie gefunden wurde, gleichfalls die "Slow Reacting Substance" :
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Untersuchung F :
Die Einwirkungen der erfindungsgemäss herstellbaren Ester auf die anaphylaktische Reaktion bei Meerschweinchen ist unter Verwendung von isolierten, perfundierten Meerschweinchenlungen-Präparaten untersucht worden, wie es von Thattacharya und Delaunois (Arch. Int. Pharmacodyn. 101 : 495, 1955) beschrieben worden ist. Meerschweinchen mit einem Gewicht von etwa 300 g werden mit Eieralbumin nach Fredholm und Strandberg [1969] sensibilisiert. Nach Ablauf der geeigneten Sensibilisierungsperiode werden die Lungen herausgenommen und in eine feuchte, durch Thermostat geregelte Kammer gebracht.
In die Trachea und die Arteria pulmonalis werden Kanülen eingeführt. Die Arterien-Kanüle wird mit einem PerfusionsflüssigkeitsReservoir verbunden, welches Tyrode-Lösung, die mit 10%igem Sörensen-Phosphatpuffer gepuffert ist, enthält. Die Trachea-Kanüle wird mit einer Rohrleitung verbunden, die zu einer Carbogengasquelle führt, die eine bestimmte Menge pro Zeiteinheit liefert. Der Perfusionsdruck wird in einem Seitenarm des Leitungsröhrchens mit einem Quecksilber-Übertragungssystem gemessen, das mit einem Ultralette-UV-Recorder verbunden ist. Wird das Antigen (Eieralbumin) in einer Menge von 0, 1 bis l, 0 jUg über die Arterien-Kanüle injiziert, so wird eine Bronchus-Konstriktion ausgelöst, die sich an einem Anstieg des Perfusionsdruckes zu erkennen gibt.
Wird Natrium-Bis-4- [3-oxo-3- (2, 4, 6-trihydroxyphenyl)-propyl]-phenyl}-phosphat in einer Menge von 4 bis 20 lig/mI der Tyrode-Lösung einverleibt, so kommt diese anaphylaktische Bronchus-Konstriktion entweder ganz in Fortfall oder sie wird merklich verringert. Dem Natriumsalz des Diphenylphosphats fehlt eine derartige Wirkung völlig, selbst wenn es in einerKonzentrationvonlOOg/mIgetestetwird.
Analoge Effekte werden auch mit den nachstehend angeführten Verbindungen in Dosierungen von etwa 0, 5 bis 2, 0 mg erzielt :
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Untersuchung G :
Präpubertäre Rattenovarien werden mit Luteinisierungshormon (LH) im wesentlichen nach der Methode von Perklev und Ahrén (Life Sciences Teil I 10 [1971] S. 1387) inkubiert, wobei eine Modifikation darin besteht, dass man Theophyllin zum Krebs-Ringer-Medium gibt, um den Abbau des cyclischen AMP zu verhindern. Nach der Inkubation werden die Ovarien in Trichloressigsäure homogenisiert, und in diesem Extrakt wird das cyclische AMP nach Entfernung der Säure bestimmt. Das cyclische AMP wird auch im Inkubationmedium bestimmt.
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der von Gilman (PROC. NATL.beschriebenen Methode entsprechend abgewandelt worden.
Der Extrakt oder das Medium, welcher bzw. welches das cyclische AMP enthält, wird mit einer Protein-Kinase (aus Kaninchenskelettmuskel hergestellt) in Gegenwart einer bekannten Menge eines tritium-markierten cyclische AMP inkubiert. Die Menge des markierten cyclischen AMP, die an die Protein-Kinase gebunden ist, ist proportional der Menge des nicht-markierten cyclischen AMP, die ermittelt werden soll, und sie wird bestimmt mittels eines Flüssigkeits-Szin- tillationszählers, der nach Isolierung des Komplexes aus Kinase und cyclischem AMP durch Milliporen-Fil- tration zählt.
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Inkubkubationsmedium bewirkt# 1,5 # 10-5 M.
Die nachstehend angeführten Phosphorsäureester üben, wie gefunden wurde, eine Inhibitorwirkung gleicher Grössenordnung aus, wenn sie in demselben in vitro-System getestet werden :
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Untersuchung H :
Diese Untersuchung veranschaulicht die Reizwirkung der erfindungsgemäss herstellbaren Ester auf die glatte Muskulatur des Wüstenmaus-Grimmdarmes in vivo.
Die Versuche werden mit mongolischen WÚ6tenmäusen durchgeführt, die mit 50 mg/kg Pentobarbital anästhetisiert worden sind. Der Colon ascendens wird freigelegt und vorsichtig zwischen Seidenfadenschlin-
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gen und einem Spannungsmesser-Übertragungssystem ausgestreckt.
Nachdem eine stabile Basis-Linie festgelegt worden ist, wird ein erfindungsgemäss herstellbarer Ester, das Natrium-Bis- :- [3-oxo-3- (2, 4, 6-trihydroxyphenyl)-propyI]-phenyl}-phosphat ("Leol235") intravenös infundiert.
InDosierungen von40 mg/kg bewirkt diese Behandlung, dass der Darm mit einer Reihe von Kontraktionen reagiert. Natrium-Diphenylphosphat bewirkt in keiner Weise einen derartigen Effekt, selbst in Dosierungen bis zu 400 mg/kg.
Wird die Verbindung "Leo 1235" in einer Konzentration von 1 mg/ml der Pufferlösung einverleibt, die den Darm überströmt, so reagiert dieser mit einem Tonus-Anstieg, d. h. einer Kontraktion.
Ähnliche Wirkungen werden mit den nachstehend angeführten Verbindungen gleichfalls erzielt :
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Untersuchung I : Die Einwirkung der erfindungsgemäss herstellbaren Ester auf die glatte Muskulatur der Bronchien ist unter Verwendung eines isolierten, perfundierten Meerschweinchenlungen-Präparates nach der von Thattacharya und Delaunois (Arch. Int. Pharmacodyn. 101 : 495,1955) angegebenen Methode untersucht worden. Die Lungen von Meerschweinchen, deren Gewichte zwischen 300 und 400 g lagen, wurden herausgenommen und die Trachea und die Arteria pulmonalis mit Kanülen versehen. Die Arterien-Kanüle wird mit einem Perfusions- flüssigkeits-Reservoir verbunden, das eine Tyrode-Lösung enthält, die mit 10%igem Sörensen-Phosphatpuf- fer gepuffert ist.
Die Trachea-Kanüle ist mit einem Röhrchen verbunden, das zu einer Carbogengas-Quelle führt, die eine konstante Gasmenge pro Zeiteinheit liefert. Der Perfusionsdruck wird in einem Seitenzweig des Röhrchens mit einem Quecksilber-Übertragungssystem gemessen, das mit einem Ultralette-UV-Recorder verbunden ist. Die Verbindungen werden über die Arterien-Kanüle injiziert, u. zw. dicht am Eintrittsort der Arteria pulmonalis in die Lungen. Bei diesem Typ von Experimenten zeigte das Natrium-Bis- {4- 3-oxo-
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3- (2, 4, 6-trihydroxyphenyl)-propyl-phenyl}-phosphateiner Dosierung von etwa 0, 5 mgund darüber verabfolgt wurde. Dem Natriumsalz des Diphenylphosphats fehlt eine derartige Wirkung vollständig, selbst wenn es in einer Dosierung von 12, 8 mg getestet wird.
Analoge Wirkungen werden auch mit den nachstehenden Verbindungen bei Dosierungen von etwa 0, 5 bis 2, 0 mg erzielt :
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[3- (2, 6-dihydroxyphenyl)-3-oxopropyl]-phenyl}-phosphatNatrium [3-oxo-3- (2, 4, 6-trimethoxyphenyl)-propyl]-phenyl}-phosphat Trinatrium-Bis-ss :- [3- (4-carboxylatophenyl)-2- (4-methoxyphenyl)-acryloyl]-a-methoxyphenyl}-phosphat.
Untersuchung J :
Es wurden auch die Wirkungen der erfindungsgemäss erhältlichen Ester auf ein Ratten-Uteruspräparat untersucht, wobei eine feststehende Arbeitstechnik angewendet wurde (Staff of the Department of Pharmacology, University of Edinburgh : Pharmacological Experiments on Isolated Preparations, E & S Livingstone Ltd., Edinburgh und London [1968]). Bei diesen Versuchen werden Gebärmutterhörner von diäthylstilböstrolbehandelten Ratten in einem 6 ml-Bad suspendiert, welches eine modifizierte de Jalon-Lösung enthält, die
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erzielt, was eine die glatte Muskulatur stimulierende Wirkung dieser Verbindung veranschaulicht.
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.