AT330960B - Verfahren zur herstellung eines reagens' fur die bestimmung von antikorpern - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Reagens'für die Bestimmung von Antikörpern, bei dem Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, in einem Medium mit einem Gehalt an Aminosäuren, Kohlehydraten, Hefeextrakt, anorganischen Salzen und Lecithin sowie gegebenenfalls Cholesterin vermehrt und sodann unter Inaktivierung mittels an sich bekannter Inaktivierungsmittel, beispielsweise Formaldehyd, zu einem Reagens aufgearbeitet werden. 



   Inaktivierte Mycoplasmen, insbesondere Mycoplasma pneumoniae, der Erreger infektiöser Erkrankungen der Atemwege, dienen zur Herstellung von Reagenzien für serologische Untersuchungen. 



   Es sind bereits Medien zur Vermehrung von Mycoplasmen beschrieben worden (siehe z. B. Schweizer Patentschrift Nr. 490496). Sie enthalten jedoch tierische Bestandteile, wie Kälberserumfraktionen,   Hühnerei-Allantoisflüssigkeit   oder   Eidotter-Chloroform-Extrakt   und besitzen dadurch den Nachteil, dass sie beim Impfling anaphylaktische Reaktionen hervorrufen können. 



   Es ist auch schon versucht worden, Mycoplasmen in Zellkulturen unter Verwendung von Zellkulturmedien zu züchten. Die Mycoplasmen adsorbieren jedoch Zellbestandteile, die anaphylaktogen wirken können. 



  Ausserdem ist die Handhabung von Zellkulturen umständlich, zeitraubend und aufwendig. Ein Nachteil ist auch, dass in der Zellkultur nur niedrige Ausbeuten an Mycoplasmen erzielt werden. 



   Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Reagens'für die Bestimmung von Antikörpern gefunden, bei dem ein Reagens erhalten wird, das keine unspezifische Reaktionen zeigt, weil es keine aus dem Nährmedium stammenden tierischen Antigene enthält. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Reagens für die Bestimmung von Antikörpern besteht in seinem Wesen darin, dass man als Medium zur Vermehrung der Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, mit einem Gehalt an Aminosäuren, Kohlenhydraten, Hefeextrakt, anorganischen Salzen und Lecithin sowie gegebenenfalls Cholesterin ein solches verwendet, das frei von tierischen Bestandteilen ist, gewünschtenfalls Ergosterin enthält und in dem der Hefeextrakt vorzugsweise als Dialysat vorliegt. 



   Obgleich im Rahmen des erfindungsgemässen Reagens-Herstellungsverfahrens insbesondere eine Vermehrung von Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae) erfolgt, kann aber auch eine Vermehrung anderer Mycoplasmen vorgenommen werden, z. B. M. fermentans, N. mycoides, M. laidlawii, M. hominis I, M. orale I, M. orale II, M. flora und M. salivarium. 



   Von den als wesentlicher Bestandteil des obigen Mediums für die erfindungsgemässe Reagens-Herstellung angegebenen Aminosäuren sind zu nennen : Glutamin oder Glutaminsäure und Valin, ferner in Kombination mit diesen andere Aminosäuren, vorzugsweise Leucin, Isoleucin, Methionin oder Cystin, u. zw. in den Konzentrationen (mg/l) :

   
 EMI1.1 
 
<tb> 
<tb> Glutamin <SEP> 3, <SEP> 0-3000, <SEP> vorzugsweise <SEP> 600 <SEP> mg/1
<tb> Glutaminsäure <SEP> 3, <SEP> 0-3000, <SEP> vorzugsweise <SEP> 600 <SEP> mg/1
<tb> Valin <SEP> 0, <SEP> 1- <SEP> 400, <SEP> vorzugsweise <SEP> 40 <SEP> mg/1
<tb> Leucin <SEP> 1, <SEP> 0- <SEP> 600, <SEP> vorzugsweise <SEP> 60 <SEP> mg/1
<tb> Isoleucin <SEP> 2, <SEP> 0-200, <SEP> vorzugsweise <SEP> 40 <SEP> mg/1
<tb> Methionin <SEP> 1, <SEP> 0-100, <SEP> vorzugsweise <SEP> 20 <SEP> mg/1
<tb> Cystin <SEP> 0, <SEP> 1-100, <SEP> vorzugsweise <SEP> 20 <SEP> mg/1.
<tb> 
 



   Als weiterer Bestandteil des beim   erfindungsgemässen   Verfahren angewendeten Mediums sind Kohlenhydrate erforderlich. In Frage kommt in erster Linie Glukose, aber auch Mannose, Fruktose, Xylose, Maltose, Stärke, Dextrin oder Glykogen, u. zw. in den Konzentrationen   0, 1-50 g/l,   vorzugsweise 5 g/l. 



   Der Hefeextrakt kann auf bekannte Weise aus frischer Bäckerhefe gewonnen werden, oder es können hiefür auch im Handel erhältliche, als Trockensubstanz vorliegende Präparate in entsprechend niedrigerer Konzentration verwendet werden. Die Konzentration des Hefeextraktes   bzw.-dialysats   im Medium soll etwa 40 bis 160 ml, vorzugsweise 80 ml/l Vermehrungsmedium betragen. 



   Natriumchlorid und Kaliumchlorid werden in den folgenden Konzentrationen verwendet : 
 EMI1.2 
 
<tb> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5, <SEP> 0-20, <SEP> 0, <SEP> vorzugsweise <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> g/l <SEP> 
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 0, <SEP> 1- <SEP> 3, <SEP> 0, <SEP> vorzugsweise <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> g/l. <SEP> 
<tb> 
 



   Lecithin wird in der Konzentration von 0, 01 mg/1 bis 10 g/l, vorzugsweise 20 mg/l, und Cholesterin und Ergosterin werden in den Konzentrationen   0, 01 mg/l   bis 10, 0 g/l, vorzugsweise 2   mg ! l,   verwendet. 



   An Stelle der oben genannten Aminosäuren kann auch eines der im Handel erhältlichen Gewebekulturmedien verwendet werden, wie Eagle's Basalmedium (siehe H. EAGLE, J. Exp. Med., 102,   S. 595 ;   [1955]),   TCM199,   Leibovitz Medium L 15*) oder Parkers Medium CMRL 1066**).-Diesen Medien müssen *) The American Journal of Hygiene, 78 [1963],   S. 173 ff. ;     **) "Proceedings   of the Society for experimental biology and medicine", Januar 1950, S. 1-2. 

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 noch 4 g Kohlehydrate, vorzugsweise Glukose/l Lösung, zugegeben werden, da die darin bereits enthaltenen etwa 1 g/l Kohlehydrate für die Verwendung im Rahmen des   erfindungsgemässen   Verfahrens nicht ausreichen. 



   Der   Pervert   des im Rahmens des   erfindungsgemässen   Verfahrens zur Reagens'-Herstellung verwendeten Mediums wird auf 6, 5 bis 8, 2, vorzugsweise auf 7, 6, eingestellt. Dazu wird 0,1 bis 1,0n-Natriumhydroxidlösung verwendet. Die günstigste Temperatur bei der Vermehrung von Mycoplasmen beträgt 25 bis 39 C, vorzugsweise 35 bis 37 C. 



   Die Konzentration der Mycoplasmen wird gemessen durch den Nachweis ihrer Vermehrung. Die zu untersuchende Lösung wird in einer Verdünnungsreihe auf Agar enthaltendes Nährmedium gegeben und bei   37 C   bebrütet. Die Zahl der nach 7 Tagen entstandenen Kolonien entspricht der Zahl der in der Lösung enthaltenen infektiösen Einheiten. 



   Die erhaltenen infektiösen Einheiten können vorzugsweise mit Formaldehyd inaktiviert und auf bekannte Weise zu einem Reagens für die Antikörperbestimmung aufgearbeitet werden. 



     Beispiel l :   Aus den folgenden Bestandteilen wird 11 einer wässerigen Lösung hergestellt : 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> Anorganische <SEP> Salze <SEP> : <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> g <SEP> Natriumchlorid
<tb> 0, <SEP> 4 <SEP> g <SEP> Kaliumchlorid
<tb> Aminosäuren <SEP> : <SEP> 20 <SEP> mg <SEP> Cystin <SEP> 
<tb> 600 <SEP> mg <SEP> Glutamin
<tb> 600 <SEP> mg <SEP> Glutaminsäure
<tb> 40 <SEP> mg <SEP> Isoleucin
<tb> 60 <SEP> mg <SEP> Leucin
<tb> 20 <SEP> mg <SEP> Methionin
<tb> 40 <SEP> mg <SEP> Valin
<tb> Kohlehydrate <SEP> : <SEP> 5000 <SEP> mg <SEP> Glukose.
<tb> 
 Zu dieser Lösung werden 0,2 ml folgender Emulsion gegeben: 100 ml einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, 
 EMI2.2 
 beseitigt. 



   Sodann werden dem Ansatz 40 ml Hefeextrakt zugegeben. Dieser wird wie folgt hergestellt : 1 kg frische, im Handel erhältliche Bäckerhefe wird in einem Liter Aqua   dest.   suspendiert, auf   800C   erhitzt und 30 min auf   80 C   gehalten, zentrifugiert und der überstand gewonnen und sterilfiltriert. 



   Sodann wird mit 1n-Natriumhydroxid der pH-Wert des Mediums auf 7, 6 eingestellt. 



   Die auf die beschriebene Weise gewonnene Lösung dient als Nährmedium für Mycoplasma pneumoniae. Sie wird mit 1 ml einer Suspension von Mycoplasma pneumoniae-entsprechend etwa 109 infektiösen   Einheiten/l-nfiziert   und 3 Tage bei   370C   gehalten. Dabei vermehren sich die Mycoplasmen und besitzen nach 3 Tagen eine Konzentration von etwa 1012 infektiösen Einheiten/ml. Während der Vermehrung der Mycoplasmen wird der pH-Wert auf 7, 6 gehalten, indem alle 6 h der pH-Wert kontrolliert und erforderlichenfalls durch Zugabe von 1n-Natriumhydroxid nachgestellt wird. 



   1000 ml einer so hergestellten und etwa 1012 Einheiten pro ml enthaltenden Mycoplasma pneumoniae-Suspension werden mit 1 ml einer 35%igen Formaldehydlösung versetzt und 2 h bei   370C   gehalten. Danach wird auf   40C   abgekühlt und nach 12 h bei 4 C 2 h bei 53000 g zentrifugiert. Der überstand wird 
 EMI2.3 
 Hefeextrakt und 4 g Glukose gegeben. Anschliessend wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert und 3 Tage bei   370C   gehalten. Dabei wird ein Titer von 1013 Einheiten/ml erzielt. Die Herstellung des Reagens'aus dieser Mycoplasma pneumoniae-Suspension erfolgt in der bei Beispiel 1 angegebenen Weise. 
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 Aussendialysat (11), das nur die dialysablen, niedermolekularen Bestandteile enthält, wird im Rotationsverdampfer bei   100C   auf 1/10 seines Volumens konzentriert.

   Gewünschtenfalls kann das Aussendialysat auch lyophil getrocknet werden. 



   Das so erhaltene Gemisch wird anschliessend mit Mycoplasma pneumoniae infiziert und 3 Tage bei   370C   gehalten. Dabei wird ein Titer von 1011 infektiösen   Einheiten/ml   erzielt. Die Herstellung des Reagens aus dieser Mycoplasma pneumoniae-Suspension erfolgt in der bei Beispiel 1 angegebenen Weise. 



     Beispiel 4 :   100 ml des Mediums gemäss Beispiel   1,   jedoch mit folgender Aminosäurenzusammensetzung : 

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 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> 600 <SEP> mg <SEP> Glutaminsäure/
<tb> 40 <SEP> mg <SEP> Isoleucinfl <SEP> 
<tb> 20 <SEP> mg <SEP> Methionin
<tb> 60 <SEP> mg <SEP> Leucin/l <SEP> 
<tb> 40 <SEP> mg <SEP> Valin/1 <SEP> 
<tb> 
 werden mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Dabei werden 1013   infektiöse Einheiten/ml   erhalten. Die Herstellung des Reagens'aus dieser Mycoplasma pneumoniae-Suspension erfolgt in der bei Beispiel 1 angegebenen Weise. 



     Beispiel 5 : 100 ml   des Mediums gemäss Beispiel 1, jedoch mit folgender Aminosäurenzusammensetzung : 
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> 600 <SEP> mg <SEP> Glutamin/l
<tb> 40 <SEP> mg <SEP> Isoleucin/l <SEP> 
<tb> 20 <SEP> mg <SEP> Methionin/1
<tb> 60 <SEP> mg <SEP> Leucin/1 <SEP> 
<tb> 40 <SEP> mg <SEP> Valin/1 <SEP> 
<tb> 
 werden mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Dabei werden 109 infektiöse Einheiten/ml erzielt. Die Herstellung des Reagens'aus dieser Mycoplasma pneumoniae-Suspension erfolgt in der bei Beispiel 1 angegebenen Weise. 



     Beispiel 6 :   Zu 11 Eagle's Medium, das zusätzlich 4 g Glukose und 40 ml Hefeextrakt enthält, werden 0, 2 ml einer Emulsion gegeben, die wie im Beispiel 1 hergestellt wurde, aber ausser 10 g Lecithin und 1 g Cholesterin noch 1 g Ergosterin/100 ml enthält. Dieses Medium wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Nach einer Bebrütungsdauer von 3 Tagen bei   37 C   enthält die Kultur 1015 Einheiten. Die Herstellung des Reagens' aus dieser Mycoplasma pneumoniae-Suspension erfolgt in der bei Beispiel 1 angegebenen Weise. 



     Beispiel 7 :   Zu 11 Eagle's Medium, das zusätzlich 4 g Glukose und 40 ml Hefeextrakt enthält, werden   0, 2 ml   einer Emulsion gegeben, die wie im Beispiel 1 hergestellt wurde, aber nur 10 g   Lecithin/100   ml enthält. Dieses Medium wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Nach einer Bebrätungsdauer von 3 Tagen bei   370C   enthält die Kultur 109 Einheiten. Die Herstellung des Reagens'aus dieser Mycoplasma pneumoniae-Suspension erfolgt in der bei Beispiel 1 angegebenen Weise.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung eines Reagens'für die Bestimmung von Antikörpern, bei dem Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, in einem Medium mit einem Gehalt an Aminosäuren, Kohlehydraten, Hefeextrakt, anorganischen Salzen und Lecithin sowie gegebenenfalls Cholesterin, vermehrt und sodann unter Inaktivierung mittels an sich bekannter Inaktivierungsmittel, beispielsweise Formaldehyd, zu einem Reagens EMI3.3 Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, ein solches verwendet, das frei von tierischen Bestandteilen ist, gewünschtenfalls Ergosterin enthält und in dem der Hefeextrakt vorzugsweise als Dialysat vorliegt.