DE2213240A1

DE2213240A1 - Medium zur vermehrung von mycoplasmen

Info

Publication number: DE2213240A1
Application number: DE2213240A
Authority: DE
Inventors: Rudolf Dr Mauler; Edgar Dr Reichert
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1972-03-18
Filing date: 1972-03-18
Publication date: 1973-09-20
Also published as: FI51952B; IT1034034B; NL7303504A; AT328617B; ATA128575A; CA998632A; BE796991A; SE7509136L; FI51952C; GB1391896A; DE2213240B2; ATA235873A; FR2176808B1; AR197028A1; US3883395A; FR2176808A1; AT328086B

Description

BERRINGVffiRKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg / Lahn

Aktenzeichen: Hoe 72/b 003

Datum: 15. März 1972 Dr. Li/Fo

Medium zur Vermehrung von MyCoplasmen

Gegenstand der Erfindung ist ein Medium zur Vermehrung von Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, dem Erreger infektiöser Erkrankungen der Ateniwege. Die inaktivierten Mycoplaamen dienen zur Herstellung von Vaccinen zur Prophylaxe atypischer Pneumonien und auch anderer Affektionen des Respirationstraktes sowie zur Herstellung von Reagenzien füj/'jerologische Untersuchungen.

Es sind bereits Medien zur Vermehrung von Myocplasmen beschrieben worden. Sie enthalten jedoch tierische Bestandteile, wie Kälberserumfraktionen, Hühnerei-Allantoisflüssigkeit oder Eidotter-Chloroform-Extrakt und besitzen dadurch den Nachteil, dass sie beim Impfling anaphylaktische Reaktionen hervorrufen können.

Es ist auch schon versucht worden, Mycoplasmen in Zellkulturen unter Verwendung von Zellkulturmedien zu züchten. Die Mycoplasmen adsorbieren jedoch Zellbestandteile, die anaphylaktogen wirken können. Ausserdem ist die Handhabung von

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Zellkulturen umständlich, zeitraubend und aufwendig. Ein Nachteil ist auch, dass in der Zellkultur nur niedrige Ausbeuten an Mycoplasmen erzielt v/erden.

Es wurde nun ein Medium zur Vermehrung von Mycoplasmen gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es Aminosäuren, Kohlenhydrate, Hefeextrakt, vorzugsweise dessen Dialysat, Natriumchlorid und Kaliumchlorid, sowie Lecithin, dieses vorzugsweise in Kombination mit Cholesterin und/oder Ergosterin, enthält.

Das erfindungsgemässe Medium wird inbesondere zur Vermehrung von Kycoplasnia pneumoniae (M. pneumoniae) verwendet. Es ist aber auch zur Vermehrung anderer Mycoplasmen geeignet, z.B. M. fermentans, M. mycoides, M. laidlav/ii, M. hominis I, M. orale I, M. orale II, M. flora und M. salivarium.

Von den Aminosäuren sind als wesentliche Bestandteile des Mediums zu nennen:

Glutamin oder Glutaminsäure und Valin, ferner in Kombination mit diesen, andere Aminosäuren, vorzugsweise Leucin, Isoleucin, Methionin oder Cystin, und zwar in den Konzentrationen (mg/l):

Glutamin	3,0 -	3000,	vor zugsv/ei se	600 mg/l
Glutaminsäure	3,0 -	3000,	Il	600 mg/l
Valin	0,1 -	400,	ti	40 mg/l
Leucin	1,0 -	600,	Il	60 mg/l
Isoleucin	2,0 -	200,	Il	40 mg/l
Methionin	1,0 -	100,	ti	20 mg/l
Cystin	0,1 -	100,	Il *	20 mg/l

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Als weiterer Bestandteil des erfindungsgemass vorgeschlagenen Mediums sind Kohlenhydrate erforderlich. In Frage kommt in erster Linie Glukose, aber auch Mannose, Fruktose, Xylose, Maltose, Stärke, Dextrin oder Glycogen, und zwar in den Konzentrationen 0,1 - 50 g/l, vorzugsweise 5 g/l.

Der Hefeextrakt kann auf bekannte Weise aus-frischer Bäckerhefe gewonnen werden oder es können hierfür auch im Handel erhältliche, als Trockensubstanz vorliegende Präparate in entsprechend nied__rigerer Konzentration verwendet werden. Die. Konzentration des Hefeextrakts bzw. -dialysats im Medium soll etwa40 - 160 ml, vorzugsweise 80 ml pro Liter Vermehrungsmedium betragen.

Natriumchlorid und Kaliumchlorid werden in den folgenden Konzentrationen verwendet.

Natriumchlorid Kaliumchlorid

Lecithin wird in der Konzentration von 0,01 mg/l - 10 g/l, vorzugsweise 20 mg/l, und Cholesterin und Ergosterin werden in den Konzentrationen 0,01 mg/l - 10,0 g/l, vorzugsweise 2 mg/l, verwendet.

Anstelle der oben genannten Aminosäuren kann auch eines der im Handel erhältlichen Gewebekulturmedien verwendet werden, wie Eagle's Basalmedium,TCM 199, Leiboviiz Medium L 15 oder Parkers Medium CMRL 1066. Diesen Medien müssen noch 4 g Kohlenhydrate, vorzugsweise Glukose pro Liter Lösung zugegeben v/erden, da die darin bereits enthaltenen etwa 1 g/Liter

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5,	0 -	20,	0	vorzugsweise	6,	8	g/l
0,	1 -	3,	0	Il	0,	4	g/l

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nicht Kohlenhydrate für den erfindungsgemässen Zweck/ausreichen. Der in den Gewebekulturmedien vorhandene Gehalt an Salzen macht einen besonderen Zusatz von Natrium- oder Kaliumchlorid zu darauf aufgebauten Medien zur Vermehrung von Mycoplasmen entbehrlich.

Der pHr-Wert des neuen Mediums wird auf pH 6,5 - 8,2, vorzugsweise auf pH 7,6, eingestellt. Dazu wird 0,1 - 3,0 normale Natriumhydroxidlösung verwendet. Die günstigste Temperatur bei der Vermehrung von Mycoplasmen beträgt 25 - 39⁰C, vorzugsweise 35 - 37⁰C.

Die Konzentration der Mycoplasmen wird gemessen durch den Nachweis ihrer Vermehrung. Die zu untersuchende Lösung wird in einer Verdünnungsreihe auf Agar enthaltendes Nährmedium gegeben und bei 37⁰C bebrütet. Die Zahl der nach 7 Tagen entstandenen Kolonien entspricht der Zahl der in der Lösung enthaltenen infektiösen Einheiten.

Die erfindungsgemäss erhaltenen infektiösen Einheiten können vorzugsweise mit Formaldehyd inaktiviert und auf bekannte Weise, z.B. mittels Aluminiumhydroxid zu einer Vaccine aufgearbeitet werden.

Sie können auch als Reagenz zur Bestimmung von Antikörpern verwendet werden. Ein solches Reagenz hat den Vorteil, dass es keine unspezifischen Reaktionen zeigt, da es keine tierischen Antigene aus dem Nährmedium enthält.* _v

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Beispiel 1

Aus den folgenden Bestandteilen wird ein Liter einer wässrigen Lösung hergestellt:

Anorganische Salze: 6,8 g Natriumchlorid

0,4 g Kaliumchlorid Aminosäuren: 20 mg Cystin

600 mg Glutamin

600 mg Glutaminsäure

40 mg Isoleucin • 6o mg Leucin 20 mg Methionin 40 mg Valin Kohlenhydrate: 5000 mg Glukose

Zu dieser Lösung werden 0,2· ml folgender Emulsion gegeben: 100 ml einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, die mit Phosphatpuffer (Sörensen) auf pH 7,2 eingestellt wurde, und 10 g Lecithin und 1 g Cholesterin enthält, werden bei 20⁰C mechanisch gerührt, bis eine Emulsion entstanden ist. Diese Emulsion wird im Autoklaven 60 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Die dabei entstandene -Verklumpung wird durch nochmaliges mechanisches Rühren beseitigt.

Sodann werden dem Ansatz 40 ml Hefeextrakt zugegeben. Dieser wird wie folgt hergestellt: ·

1· kg frische, im Handel erhältliche Bäckerhefe wird in einem Liter Aqua dest. suspendiert, auf 8O⁰C erhitzt und 30 Minuten auf 80⁰C gehalten, zentrifugiert und der Überstand gewonnen

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und sterilfiltriert.

Sodann wird mit 1 normalem Natriumhydroxid der pH-Wert des Mediums auf 7,6 eingestellt.

Die auf die beschriebene Weise gewonnene Lösung dient als Nährmedium für Mycoplasma pneumoniae. Sie wird mit 1 ml einer Suspension von Mycoplasma pneumoniae - entsprechend etwa 109 infektiösen Einheiten pro Liter - infiziert und 3 Tage bei 37°C gehalten. Dabei vermehren sich die Mycoplasmen und besitzen nach 3 Tagen eine Konzentration von etwa

10 infektiösen Einheiten pro ml. Während der Vermehrung der Mycoplasmen wird der pH-Wert auf 7,6 gehalten, indem alle sechs Stunden der pH-Wert kontrolliert und erforderlichenfalls durch Zugabe von 1 normalem Natriumhydroxid nachgestellt wird.

12 1000 ml einer so hergestellten und etwa 10 Einheiten pro ml enthaltenden Mycoplasma pneumoniae-Suspension werden mit 1 ml einer 35%igen FormaldehyJLösung versetzt und 2 Stunden bei 37°C gehalten. Danach wird auf 4°C abgekühlt und nach 12 Stunden bei 4⁰C zwei Stunden bei 53 ooo g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Das Sediment - etwa 2 ml - wird in 20 ml 0,9%igem Phosphat-gepuffertem Natriumchlorid aufgenommen und mit Aluminiumhydroxid bis zu einer Konzentration von 0,1 % vermischt. Diese Suspension stellt die Vaccine dar und wird an Meerschweinchen getestet»

Dazu werden 10 Meerschweinchen 2 mal im Abstand von 10 Tagen mit je 1 ml der Vaccine immunisiert. 10 Tage nach der 2. Injektion werden von den Meerschweinchen Seren gewonnen

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und auf die Fähigkeit getestet, Mycoplasma pneumoniae zu

neutralisieren. Es wurde festgestellt, dass 1 ml Meeres
schweinchen-Serum 10 infektiöse Einheiten Mycoplasma pneumoniae neutralisiert.

Beispiel 2

Zu 1 1 Eagle's Medium wird 0,2 ml der gemäss Beispiel 1 hergestellten Emulsion, 40 ml Hefeextrakt und 4 g Glukose gegeben. Anschliessend wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert und 3 Tage bei 37°C gehalten. Dabei wird ein Titer von 10 ^ Einheiten pro ml erzielt.

Beispiel 3

Zu 920 ml Eagle's Medium werden 0,2 ml der gemäss Beispiel 1 hergestellten Emulsion und 4 g Glukose gegeben. Hierzu gibt man 80 ml Hefeextrakt-Dialysat, das wie folgt hergestellt wird:

100 ml Hefeextrakt, hergestellt gemäss Beispiel 1, werden Stunden bei 4⁰C gegen 1 1 Aqua dest. dialysiert. Das Ausseiidialysat (11), das nur die dialysablβ}, niedermolekularen Bestandteile enthält, wird im Rotationsverdampfer bei 10⁰C auf ein Zehntel seines Volumens konzentriert. Gewünschtenfalls kann das Aussendialysat auch lyophil getrocknet werden.

Das so erhaltene Gemisch wird anschliessend mit Mycoplasma pneumoniae infiziert und 3 Tage bei 37⁰C gehalten. Dabei wird ein Titer von 10 infektiösen Einheiten/ml erzielt.

.Beispiel 4

100 ml des Mediums gemäss Beispiel 1, jedoch mit folgender Aminosäurenzusammensetzung

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600 mg Glutaminsäure 40 mg Isoleucin 20 mg Methionin 60 mg Leucin 40 mg Valin

/ Liter

werden mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Dabei v/erden 10 infektiöse Einheiten/ml erhalten.

Beispiel 5

600 mg Glutamin / Liter

40 mg Isoleucin / "

20 mg Methionin / "

60 mg Leucin / "

40 mg Valin / "

werden mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Damit werden 10 infektiöse Einheiten/ml erzielt.

Beispiel 6

Zu 1 Liter Eagle's Medium, das zusätzlich 4 g Glukose und 40 ml Hefeextrakt enthält, wird 0,2 ml einer Emulsion gegeben, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, aber ausser 10 g Lecithin und 1 g Cholesterin noch 1 g Ergosterin je 100 ml enthält. Dieses Medium wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Nach einer Bebrütungsdauer von 3 Tagen bei 37 C enthält die Kultur 10¹^ Einheiten.

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Beispiel 7

Zu 1 Liter Eagle's Medium, das zusätzlich 4 g Glukose und 40 ml Hefeextrakt enthält, wird 0,2 ml einer Emulsion gegeben, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, aber nur 10 g Lecithin je 100 ml enthält. Dieses Medium wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Nach einer Bebrütungsdauer von 3 Tagen bei 37⁰C enthält die Kultur 10⁹ Einheiten.

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Claims

Ma 144 τ 10 - Patentansprüche

1. Medium zur Vermehrung von Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, dadurch gekennzeichnet, dass es Aminosäuren, Kohlenhydrate, Hefeextrakt, vorzugsweise dessen Dialysat, anorganische Salze und Lecithin enthält.

2. Medium gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Lecithin im Kombination mit Cholesterin und/oder Ergosterin enthält.

3. Verfahren zur Vermehrung von Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nährmedium gemäss Ansprüchen 1 bis 2 verwendet wird.

4. Verfahren zur Herstellung einer Vaccine, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, in einem Nährmedium gemäss Ansprüchen 1-2 vermehrt und das Medium sodann in an sich bekannter V/eise zu einer Vaccine aufarbeitet.

5. Verfahren zur Herstellung eines Reagenz für serologische Untersuchungen, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae, in einem Nährmedium gemäss Ansprüchen 1-2 vermehrt und das Nährmedium. in an sich bekannter Weise aufarbeitet.

6. Verwendung eines Nährmediums, das Aminosäuren, Kohlehydrate Hefeextrakt, vorzugsweise dessen Dialysat, anorganische Salze und Lecithin sowie gewünschtenfalls Cholesterin und/oder Ergosterin enthält zur Vermehrung von Mycoplasmen, vorzugsweise Mycoplasma pneumoniae.

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