DE2213240C3 - Medium zur Vermehrung von Mycoplasmen - Google Patents
Medium zur Vermehrung von MycoplasmenInfo
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Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Medium zur Vermehrung von Mycoplasmen. Die inaktivierten Mycoplasmen
dienen zur Herstellung von Vaccinen zur Prophylaxe atypischer Pneumonien und auch anderer
Affetlionen des Respirationstraktes sowie zur Herstellung
von Reagenzien für serologische Untersuchungen.
Es sind bereits Medien zur Vermehrung von Mycoplasmen beschrieben worden. Sie enthalten jedoch
tierische Bestandteile, wie Kälberserumfraktionen, Hühnerei-Allantoisnüssigkeit oder Eidotter-Chloroform-Extrakt
und besitzen dadurch den Nachteil, daß sie beim Impfling anaphylaktische Reaktionen hervorrufen
können.
Es ist auch schon versucht worden, Mycoplasmen in Zellkulturen unter Verwendung von Zellkulturmedien
zu züchten. Die Mycoplasmen adsorbieren jedoch Zellbestandteile, die anaphylaktogen wirken
können. Außerdem ist die Handhabung von Zellkulturen umständlich, zeitraubend und aufwendig. Ein
Nachteil ist auch, daß in der Zellkultur nur niedrige Ausbeuten an Mycoplasmen erzielt werden.
Es winde nun ein Medium zur Vennehrung von Mycoplasmen gefunden, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß es pro Liter 3,0 bis 3000 mg Glutamin oder 3,0 bis 3000 mg Glutaminsäure, 0,1 bis 400 mg Valin;
0,1 bis SOg Glukose oder Mannose, Fruktose, Xylose, Maltose, Stärke, Dextrin oder Glycogen, 40 bis 160
ml Hefeextrakt bzw. dessen Dialysat, 5,0 bis 20,0 g Natriumchlorid, 0,1 bis 3,0 g Kaliumchlorid und
0,01 mg bis 10 g Lecithin enthält und daß der pH-Wert des Nährmediums mit 0,1 bis 1,0 normaler Natriumhydroxidlösung
auf 6,5 bis 8,2 eingestellt worden ist.
In vorteilhafter Ausgestaltung enthält das Nährmedium zusätzlich 0,01 mg bis 10,0 g Cholesterin und
0,01 mg bis 10,0 g Ergosterin pro Liter. Von Vorteil ist es auch, wenn das Nährmedium 1,0 bis 600 mg
Leucin, 2,0 bis 200 mg Isoleucin, 1,0 bis 100 mg Methionin
und 0,1 bis 100 mg Cystin pro Liter enthält. Die Erfindung betrifft schließlich auch die Verwendung
des erfindungsgemäßen Nährmediums zur Vermehrung von Mycoplasmen.
Das erfindungsgemäße Medium wird besonders zur Vennehrung von Mycoplasma pueumoniae (M. pneumoniae)
verwendet. Es ist aber auch zur Vermehrung
to anderer Mycoplasmen geeignet, z. B. M. fermentans,
M. mycoides, M. laidlawii, M. hominis I, M. orale I, M. orale II, M. flora und M. salivarium.
Der Hefeextrakt kann auf bekannte Weise aus frischer Bäckerhefe gewonnen werden oder es können
is hierfür auch im Handel erhältliche, als Trockensubstanzvorliegende
Präparate in entsprechend niedrigerer Konzentration verwendet werden.
An Stelle der obengenannten Aminosäuren kann auch eines der im Handel erhältlichen Gewebekul-
ao turmedien verwendet werden, wie Eagle's Basalmedium.TCM
199, Leibovitz Medium L 15 oder Parkers Medium CMRL 1066. Diesen Medien müssen noch
4 g Kohlenhydrate, am besten Glukose pro Liter Lösung zugegeben werden, da die darin bereits enthaltenen
etwa 1 g/Liter Kohlenhydrate für den erf indungsgemäBen
Zweck nicht ausreichen. Der in den Gewebekulturmedien vorhandene Gehalt an Salzen
macht einen besonderen Zusatz von Natrium- oder Kaliumchlorid zu darauf aufgebauten Medien zur
Die Konzentration der Mycoplasmen wird gemessen durch den Nachweis ihrer Vermehrung. Die zu
untersuchende Lösung wird in einer Verdünnungsreihe auf Agar enthaltendes Nährmedium gegeben
und bei 37° C bebrütet. Die Zahl der nach 7 Tagen entstandenen Kolonien entspricht der Zahl der in der
Lösung enthaltenen infektiösen Einheiten.
Die erhaltenen infektiösen Einheiten können am besten mit Formaldehyd inaktiviert und auf bekannte
Weise, z. B. mittels Aluminiumhydroxid zu einer Vaccine aufgearbeitet werden.
Sie können auch als Reagenz zur Bestimmung von Antikörpern verwendet werden. Ein solches Reagenz
hat den Vorteil, daß es keine unspezifischen Reaktionen zeigt, da es keine tierischen Antigene aus dem
Nährmedium enthält.
Aus den folgenden Bestandteilen wird ein Liter einer wäßrigen Lösung hergestellt:
Anorganische Salze:
Aminosäuren:
Aminosäuren:
6,8 g Natriumchlorid
0,4 g Kaliumchlorid
20 mg Cystin
600 mg Glutamin
600 mg Glutaminsäure
40 mg Isoleucin
60 mg Leucin
20 mg Methionin
40 mg Valin
5000 mg Glukose
Zu dieser Lösung werden 0,2 ml folgender Emulsion gegeben: 100 ml einer 0,9%igen Natriumchlorid-6j
lösung, die mit Phosphatpuffer (Sörensen) auf pH 7,2 eingestellt wurde, und 10 g Lecithin und 1 g Cholesterin
enthält, werden bei 20° C mechanisch gerührt, bis eine Fm ulsion entstanden ist. Diese Emulsion wird
im Autoklaven 60 Minuten bei 120° C sterilisiert. Die dabei entstandene Verklumpung wird durch nochmaliges
mechanisches Rühren beseitigt.
Sodann werden dem Ansatz 40 ml Hefeextrakt zugegeben. Dieser wird wie folgt hergestellt:
1 kg frische, im Handel erhältliche Bäckerhefe wird in einem Liter Aqua dest. suspendiert, auf 80° C erhitzt
und 30Minuten auf 80° C gehalten, zentrifugiert und der Überstand gewonnen und sterilfiltriert.
Sodann wird mit 1 normalem Natriumhydroxid der pH-Wert des Mediums auf 7,6 eingestellt.
Die auf die beschriebene Weise gewonnene Lösung dient als Nähnnedium für Mycoplasma pneumoniae.
Sie wird mit 1 ml einer Suspension von Mycoplasma pneumoniae—entsprechend etwa 109 infektiösen Einheiten
pro Liter - infiziert und 3 Tage bei 37° C gehalten. Dabei vermehren sich die M)r=oplasmen und
besitzen nach 3 Tagen eine Konzentration von etwa 1012 infektiösen Einheiten pro ml. Während der Vermehrung
der Mycoplasmen wird der pH-Wert auf 7,6 ao gehalten, indem alle sechs Stunden der pH-Wert kontrolliert
und erforderlichenfalls durch Zugabe von 1 normalem Natriumhydroxid nachgestellt wird.
1000 ml einer so hergestellten und etwa 10'2 Einheiten
pro ml enthaltenden Mycoplasma pneumoniae-Suspension werden mit 1 ml einer 35%igen
Formaldehydlösung versetzt und 2 Stunden bei 37° C gehalten. Danach wird auf 4° C abgekühlt und nach
12 Stunden bei 4 ° C zwei Stunden bei 53 000 g zentrifugiert.
Der Überstand wird verworfen. Das Sediment - etwa 2 ml - wird in 20 ml 0,9%igem Phosphat-gepuffertem
Natriumchlorid aufgenommen und mit Aluminiumhydroxid bis zu einer Konzentration von
0,1 % vermischt. Diese Suspension stellt die Vaccine dar und wird an Meerschweinchen getestet.
Dazu werden 10 Meerschweinchen zweimal im Abstand von 10 Tagen mit je 1 ml der Vaccine immunisiert.
10 Tage nach der 2. Injektion werden von den Meerschweinchen Seren gewonnen und auf die Fähigkeit
getestet, Mycoplasma pneumoniae zu neutralisieren. Es wurde festgestellt, daß 1 ml Meerschweinchen-Serum
108 infektiöse Einheiten Mycoplasma pneumoniae neutralisiert.
45
Zu 11 Eagle's Medium wird 0,2 ml der gemäß Beispiel
1 hergestellten Emulsion, 40 ml Hefeextrakt und 4 g Glukose gegeben. Anschließend wird mit Mycoplasma
pneumoniae infiziert und 3 Tage bei 37° C gehalten. Dabei wird ein Titer von 1013 Einheiten pro
ml erzielt.
Zu 920 ml Eagle's Medium werden 0,2 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Emulsion und 4 g GIukose
gegeben. Hierzu gibt man 80 ml Hefeextrakt-Dialysat, das wie folgt hergestellt wird:
100 ml Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden 24 Stunden bei 4° C gegen 1 1 Aqua dest.
dialysiert. Das Außendialysat (1!), das nur die dialysablen,
niedermolekularen Bestandteile enthält, wird im Rotationsverdampfer bei 10" C auf ein Zehntel
seines Volumens konzentriert. GewünschtenfaUs kann das Außendialysat auch lyophil getrocknet werden.
Das so erhaltene Gemisch wird anschließend mit Mycoplasma pneumoniae infiziert und 3 Tage bei
37° C gehalten. Dabei wird ein Titer von 10" infektiösen Einheiten/ml erzielt.
100 mi des Mediums gemäß Beispiel 1, jedoch mit
folgender Aminosäurenzusammensetzung .
600 mg Glutaminsäure/Liter
40 mg Isoleucin/Liter
20 mg Methionin/Liter
60 mg Leucin/Liter
40 mg Valin/Liter
40 mg Isoleucin/Liter
20 mg Methionin/Liter
60 mg Leucin/Liter
40 mg Valin/Liter
werden mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Dabei werden 1013 infektiöse Einheiten/ml erhalten.
100 ml des Mediums gemäß Beispiel 1, jedoch mit folgender Aminosäurenzusammensetzung
600 mg Glutamin/Liter
40 mg Isoleucin/Liter
20 mg Methionin/Liter
60 mg Leucin/Liter
40 mg Valin/Liter
40 mg Isoleucin/Liter
20 mg Methionin/Liter
60 mg Leucin/Liter
40 mg Valin/Liter
werden mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Damit werden 109 infektiöse Einheiten/ml erzielt.
Zu 1 Liter Eagle's Medium, das zusätzlich 4 g Glukose und 40 ml Hefeextrakt enthält, wird 0,2 ml einer
Emulsion gegeben, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, aber außer 10 g Lecithin und 1 g Cholesterin
noch 1 g Ergosterin je 100 ml enthält. Dieses Medium wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Nach einer
Bebrütungsdauer von 3 Tagen bei 37° C enthält die Kultur 10R Einheiten.
Zu 1 Liter Eagle's Medium, das zusätzlich 4 g Glukose und 40 ml Hefeextrakt enthält, wird 0,2 ml einer
Emulsion gegeben, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, aber nur 10 g Lecithin je 100 ml enthält. Dieses
Medium wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Nach einer Bebrütungsdauer von 3 Tagen bei 37° C
enthält die Kultur 109 Einheiten.
Claims (4)
1. Nährmedium zur Vennehrung von Mycoplasmen,
dadurch gekennzeichnet, daß es pro Liter 3,0 bis 3000 mg Glutamin oder 3,0 bis
3000 mg Glutaminsäure, 0,1 bis 400 mg VaUn; 0,1 bisSOg Glukose oder Mannose, Fruktose, Xylose,
Maltose, Stärke, Dextrin, Glycogen, 40 bis 160 ml Hefeextrakt bzw. dessen Dialysat, 5,0 bis
20,0 g Natriumchlorid, 0,1 bis 3,0 g Kaliumchlorid und 0,01 mg bis 10 g Lecithin enthält und daß
der pH-Wert des Nährmediums mit 0,1 bis 1,0 normaler Natrnnnhydroxidlösung auf 6,5 bis 8,2
eingestellt worden ist.
2. Nährmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich 0,01 mg bis 10,0 g
Cholesterin und 0,01 mg bis 10,0 g Ergosterin pro Liter enthält.
3. Nähnnedhim nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es zusätzlich 1,0 bis 600 mg Leucin, 2,0 bis 200 mg Isoleucin, 1,0 bis 100 mg
Methionin und 0,1 bis 100 mg Cystin pro Liter enthält.
4. Verwendung des Nährmediums nach Anspruch 1—3 zur Vermehrung von Mycoplasmen.
Priority Applications (14)
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| NL7303504A NL7303504A (de) | 1972-03-18 | 1973-03-13 | |
| US340699A US3883395A (en) | 1972-03-18 | 1973-03-13 | Medium for the cultivation of mycoplasms |
| GB1243173A GB1391896A (en) | 1972-03-18 | 1973-03-15 | Medium for the cultivation of mycoplasma |
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| AR247087A AR197028A1 (es) | 1972-03-18 | 1973-03-16 | Procedimiento para la proliferacion de microplasma y medio nutritivo apto para emplearse en el mismo |
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