DE2213240B2 - Medium zur vermehrung von mycoplasmen - Google Patents

Medium zur vermehrung von mycoplasmen

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Medium zur Vermehrung von Mycoplasmen. Die inaktivierten Mycoplasmen dienen zur Herstellung von Vaccinen zur Prophylaxe atypischer Pneumonien und auch anderer Affektionen des Respirationstraktes sowie zur Herstellung von Reagenzien für serologische Untersuchungen.
Es sind bereits Medien zur Vermehrung von Mycoplasmen beschrieben worden. Sie enthalten jedoch tierische Bestandteile, wie Kälberserumfraktionen, Hühnerei-Allantoisflüssigkeit oder Eidotter-Chloroform-Extrakt und besitzen dadurch den Nachteil, daß sie beim Impfling anaphylaktische Reaktionen hervorrufen können.
Es ist auch schon versucht worden, Mycoplasmen in Zellkulturen unter Verwendung von Zellkulturmedien zu züchten. Die Mycoplasmen adsorbieren jedoch Zellbestandteile, die anaphylaktogen wirken können. Außerdem ist die Handhabung von Zellkulturen umständlich, zeitraubend und aufwendig. Ein Nachteil ist auch, daß in der Zellkultur nur niedrige Ausbeuten an Mycoplasmen erzielt werden.
Es wurde nun ein Medium zur Vermehrung von Mycoplasmen gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es pro Liter 3,0 bis 3000 mg Glutamin oder 3,0 bis 3000 mg Glutaminsäure, 0,1 bis 400 mg Valin; 0,1 bis 50 g Glukose oder Mannose, Fruktose, Xylose, Maltose, Stärke, Dextrin oder Glycogen, 40 bis 160 ml Hefeextrakt bzw. dessen Dialysat, 5,0 bis 20,0 g Natriumchlorid, 0,1 bis 3,0 g kaliumchlorid und 0,01 mg his 10 g Lecithin enthält und daß der pH-Wert des Nährmediums mit 0,1 bis 1,0 normaler Natriumhydroxidlösung auf 6,5 bis 8,2 eingestellt worden ist.
In vorteilhafter Ausgestaltung enthält das Nährmedium zusätzlich 0,01 mg bis 10,0 g Cholesterin und 0,01 mg bis 10,0 g Ergosterin pro Liter. Von Vorteil ist es auch, wenn das Nährmedium 1,0 bis 600 mg Leucin, 2,0 bis 200 mg Isoleucin, 1,0 bis 100 mg Methionin und 0,1 bis 100 mg Cystin pro Liter enthält. Die Erfindung betrifft schließlich auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Nährmediums zur Vermehrung von Mycoplasmen.
Das erfindungsgemäße Medium wird besonders zur Vermehrung von Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae) verwendet. Es ist aber auch zur Vermehrung ίο anderer Mycoplasmen geeignet, z. B. M. fermentans, M. mycoides, M. laidlawii, M. hominis I, M. orale I, M. orale II, M. flora und M. salivarium.
Der Hefeextrakt kann auf bekannte Weise aus frischer Bäckerhefe gewonnen werden oder es können
hierfür auch im Handel erhältliche, als Trockensubstanzvorliegende Präparate in entsprechend niedrigerer Konzentration verwendet werden.
An Stelle der obengenannten Aminosäuren kann auch eines der im Handel erhältlichen Gewebekulturmedien verwendet werden, wie Eagle's Basalmedium.TCM 199, Leibovitz Medium L 15 oder Parkers Medium CMRL 1066. Diesen Medien müssen noch 4 g Kohlenhydrate, am besten Glukose pro Liter Lösung zugegeben werden, da die darin bereits enthalte-
nen etwa 1 g/Liter Kohlenhydrate für den erfindungsgemäßen Zweck nicht ausreichen. Der in den Gewebekulturmedien vorhandene Gehalt an Salzen macht einen besonderen Zusatz von Natrium- oder Kaliumchlorid zu darauf aufgebauten Medien zur Vermehrung von Mycoplasmen entbehrlich.
Die Konzentration der Mycoplasmen wird gemessen durch den Nachweis ihrer Vermehrung. Die zu untersuchende Lösung wird in einer Verdünnungsreihe auf Agar enthaltendes Nährmedium gegeben und bei 37° C bebrütet. Die Zahl der nach 7 Tagen entstandenen Kolonien entspricht der Zahl der in der Lösung enthaltenen infektiösen Einheiten.
Die erhaltenen infektiösen Einheiten können am besten mit Formaldehyd inaktiviert und auf bekannte
+o Weise, z. B. mittels Aluminiumhydroxid zu einer Vaccine aufgearbeitet werden.
Sie können auch als Reagenz zur Bestimmung von Antikörpern verwendet werden. Ein solches Reagenz hat den Vorteil, daß es keine unspezifischen Reaktionen zeigt, da es keine tierischen Antigene aus dem Nährmedium enthält.
Beispiel 1
Aus den folgenden Bestandteilen wird ein Liter einer wäßrigen Lösung hergestellt:
Anorganische Salze:
Aminosäuren:
Kohlenhydrate:
6,8 g
0,4 g
20 mg
600 mg
600 mg
40 mg
60 mg
20 mg
40 mg
5000 mg
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Cystin
Glutamin
Glutaminsäure
Isoleucin
Leucin
Methionin
Valin
Glukose
Zu dieser Lösung werden 0,2 ml folgender Emulsion gegeben: 100 ml einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, die mit Phosphatpuffer (Sörensen) auf pH 7,2 eingestellt wurde, und 10 g Lecithin und 1 g Cholesterin enthält, werden bei 20° C mechanisch gerührt, bis eine Emulsion entstanden ist. Diese Emulsion wird
im Autoklaven 60 Minuten bei 120° C sterilisiert. Die dabei entstandene Verklumpung wird durch nochmaliges mechanisches Rühren beseitigt.
Sodann werden dem Ansatz 40 ml Hefeextrakt zugegeben. Dieser wird wie folgt hergestellt:
1 kg frische, im Handel erhältliche Bäckerhefe wird in einem Liter Aqua dest. suspendiert, auf 80° C erhitzt und 30 Minuten auf 80° C gehalten, zentrifugiert und der Überstand gewonnen und sterilfiltriert.
Sodann wird mit 1 normalem Natriumhydroxid der pH-Wert des Mediums auf 7,6 eingestellt.
Die auf die beschriebene Weise gewonnene Lösung dient als Nährmedium für Mycoplasma pneumoniae. Sie wird mit 1 ml einer Suspension von Mycoplasma pneumoniae - entsprechend etwa 109 infektiösen Einheiten pro Liter - infiziert und 3 Tage bei 37° C gehalten. Dabei vermehren sich die Mycoplasmen und besitzen nach 3 Tagen eine Konzentration von etwa 10'2 infektiösen Einheiten pro ml. Während der Vermehrung der Mycoplasmen wird der pH-Wert auf 7,6 ao gehalten, indem alle sechs Stunden der pH-Wert kontrolliert und erforderlichenfalls durch Zugabe von 1 normalem Natriumhydroxid nachgestellt wird.
1000 ml einer so hergestellten und etwa 1012 Einheiten pro ml enthaltenden Mycoplasma pneumoniae-Suspension werden mit 1 ml einer 35%igen Formaldehydlösung versetzt und 2 Stunden bei 37° C gehalten. Danach wird auf 4° C abgekühlt und nach 12 Stunden bei 4° C zwei Stunden bei 53 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Das Sediment - etwa 2 ml - wird in 20 ml 0,9%igem Phosphat-gepuffertem Natriumchlorid aufgenommen und mit Aluminiumhydroxid bis zu einer Konzentration von 0,1% vermischt. Diese Suspension stellt die Vaccine dar und wird an Meerschweinchen getestet.
Dazu werden 10 Meerschweinchen zweimal im Abstand von 10 Tagen mit je 1 ml der Vaccine immunisiert. 10 Tage nach der 2. Injektion werden von den Meerschweinchen Seren gewonnen und auf die Fähigkeit getestet, Mycoplasma pneumoniae zu neutralisieren. Es wurde festgestellt, daß 1 ml Meerschweinchen-Serum 108 infektiöse Einheiten Mycoplasma pneumoniae neutralisiert.
Beispiel 2
45
Zu 1 1 Eagle's Medium wird 0,2 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Emulsion, 40 ml Hefeextrakt und 4 g Glukose gegeben. Anschließend wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert und 3 Tage bei 37° C gehalten. Dabei wird ein Titer von 10" Einheiten pro ml erzielt.
Beispiel 3
Zu 920 ml Eagle's Medium werden 0,2 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Emulsion und 4 g GIukose gegeben. Hierzu gibt man 80 ml Hefeextrakt-Dialvsat, das wie folgt hergestellt wird:
100 ml Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden 24 Stunden bei 4° C gegen 1 1 Aqua dest. dialysiert. Das Außendialysat (11), das nur die dialysablen, niedermolekularen Bestandteile enthält, wird im Rotationsverdampfer bei 10° C auf ein Zehntel seines Volumens konzentriert. Gewünschtenfalls kann das Außendialysat auch lyophil getrocknet werden.
Das so erhaltene Gemisch wird anschließend mit Mycoplasma pneumoniae infiziert und 3 Tage bei 37° C gehalten. Dabei wird ein Titer von 10" infektiösen Einheiten/ml erzielt.
Beispiel 4
100 ml des Mediums gemäß Beispiel 1, jedoch mit folgender Aminosäurenzusammensetzung
600 mg Glutaminsäure/Liter
40 mg Isoleucin/Liter
20 mg Methionin/Liter
60 mg Leucin/Liter
40 mg Valin/Liter
werden mit Mycoplasma pneumoniae infizier?. Dabei werden 10" infektiöse Einheiten/ml erhalten.
Beispiel 5
100 ml des Mediums gemäß Beispiel 1, jedoch mit folgender Aminosäurenzusammensetzung
600 mg Glutamin/Liter
40 mg Isoleucin/Liter
20 mg Methionin/Liter
60 mg Leucin/Liter
40 mg Valin/Liter
werden mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Damit werden 10g infektiöse Einheiten/ml erzielt.
Beispiel 6
Zu 1 Liter Eagle's Medium, das zusätzlich 4 g Glukose und 40 ml Hefeextrakt enthält, wird 0,2 ml einer Emulsion gegeben, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, aber außer 10 g Lecithin und 1 g Cholesterin noch 1 g Ergosterin je 100 ml enthält. Dieses Medium wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Nach einer Bebrütungsdauer von 3 Tagen bei 37° C enthält die Kultur 1015 Einheiten.
Beispiel 7
Zu 1 Liter Eagle's Medium, das zusätzlich 4 g Glukose und 40 ml Hefeextrakt enthält, wird 0,2 ml einer Emulsion gegeben, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, aber nur 10 g Lecithin je 100 ml enthält. Dieses Medium wird mit Mycoplasma pneumoniae infiziert. Nach einer Bebrütungsdauer von 3 Tagen bei 37° C enthält die Kultur 101* Einheiten.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Nährmedium zur Vermehrung von Mycoplasmen, dadurch gekennzeichnet, daß es pro Liter 3,0 bis 3000 mg Glutamin oder 3,0 bis 3000 mg Glutaminsäure, 0,1 bis 400 mg Valin; 0,1 bis 50 g Glukose oder Mannose, Fruktose, Xylose, Maltose, Stärke, Dextrin, Glycogen, 40 bis 160 ml Hefeextrakt bzw. dessen Dialysat, 5,0 bis 20,0 g Natriumchlorid, 0,1 bis 3,0 g Kaliumchlorid und 0,01 mg bis 10 g Lecithin enthält und daß der pH-Wert des Nährmediums mit 0,1 bis 1,0 normaler Natriumhydroxidlösung auf 6,5 bis 8,2 eingestellt worden ist.
2. Nährmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich 0,01 mg bis 10,0 g Cholesterin und 0,01 mg bis 10,0 g Ergosterin pro Liter enthält.
3. Nährmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich 1,0 bis 600 mg Leucin, 2,0 bis 200 mg Isoleucin, 1,0 bis 100 mg Methionin und 0,1 bis 100 mg Cystin pro Liter enthält.
4. Verwendung des Nährmediums nach Anspruch 1-3 zur Vermehrung von Mycoplasmen.
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