DE19753176C2

DE19753176C2 - Nicht rekombinante Subunitvakzine

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Publication number: DE19753176C2
Application number: DE19753176A
Authority: DE
Inventors: Gerald-F Gerlach; Ralph Goethe
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2000-04-27
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: DE19753176A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft nicht rekombinante Subunitvakzine aus Zelloberflächenproteinen erhältlich durch Kultivierung einer gramnegativen Bakterienkultur und anschließende Anreicherung protektiver Antigene unter Verwendung von Detergenzien, Verfahren zu deren Herstellung, diese enthaltende Impfstoffe sowie einen diagnostischer Test.

Aus AU-B-61356/90 und EP-A2-0 037 931 sind nicht rekombinante Subunitvakzine bekannt, welche virale Oberflächenproteine enthalten. Die protektiven viralen Antigene werden nach Kultivierung der Viren und Behandlung mit Detergenzien zur Anreicherung gewonnen. Die Anwendung dieser Verfahren auf Bakterien ist dabei nicht beschrieben. In AU-A-34351/95 wird ferner die Behandlung mit Detergenzien für die Gewinnung einer nicht rekombinanten Subunitvakzine gegen Protozoen offenbart. US-A-4,845,036 beschreibt ferner die Aufspaltung von Bakterientoxinen für die Verwendung als Subunitvakzine durch Detergenz-Behandlung. Zusätzlich wird in DD-A3- 242 716 ferner offenbart, daß die Verwendung von Sulfobetainen auch für die Herstellung von gereinigten Biopräparaten aus viralen, mikrobiellen, tierischen und pflanzlichen Systemen möglich ist. Auf die speziellen Probleme, welche bei Bakterien, insbesondere gramnegativen Bakterien auftreten, wird im Stand der Technik nicht eingegangen. Eine technische Lehre zur Herstellung nicht rekombinanten Subunitvakzine aus gramnegativen Bakterien ist dem Stand der Technik nicht entnehmbar.

Die äußere Membrane stellt die außen liegende kontinuierliche Struktur der Oberfläche von gramnegativen Bakterien dar und ist somit für die Wechselwirkung der Bakterien mit dem Immunsystem der Wirte von großer Bedeutung. An der äußeren Oberfläche der äußeren Membrane sind in unterschiedlichem Maße Zelloberflächenproteine vorhanden, welche die Immunantwort des Wirts in wesentlichen beeinflussen.

Es werden daher zur Herstellung von Impfstoffen Fragmente der äußeren Membrane verwendet, welche die gewünschte Immunantwort im Wirt hervorrufen. Dazu werden beispielsweise die äußeren Membranen von Bakterien isoliert, gereinigt und als Impfstoffe verwendet. Verfahren zur Isolierung äußerer Membranen sind beispielsweise beschrieben von H. Nikaido (Methods in Enzymology, 235, S. 225-234).

Es ist ferner bekannt, daß die Virulenz von Bakterien in großem Maße von den Bedingungen bestimmt wird, unter denen sich die Bakterien entwickeln können. J. J. Mekalanos (J. Bacteriol., 174, S. 1-7) beschreibt Umweltbedingungen, unter denen die Ausbildung der Virulenzfaktoren von Bakterien kontrollierbar sind. Die Bakterien bilden dabei u. a. auf der äußeren Membrane vermehrt bestimmte Proteine, wie beispielsweise Lipoproteine aus, welche als OMP (Outer Membrane Proteine) bezeichnet werden.

Ein besonders wichtiger Keim aus der Reihe der gramnegativen Bakterien ist Actinobacillus pleuropneumoniae. Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp.) gehört in die Familie der Pasteurellaceae und ist der obligat pathogene Erreger der infektiösen Pleuropneumonie des Schweines, einer hoch kontagiösen Atemwegserkrankung mit oft dramatischem Verlauf. A.pp. ist weltweit verbreitet und führt in der Schweineproduktion zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten (NICOLET, J. in LEMAN, A. D. et al. (ed.), Disease of swine, Iowa State Press, Ames., 401-408 (1992)). Weltweit sind 12 Serotypen von A.pp. anhand ihrer kapsulären Polysaccharide unterscheidbar (PERRY, M. et al., Serodiagn. Immunother. Infect. Dis. 4: 299-308 (1990)). In Deutschland sind vor allem die Serotypen 2, 3, 7 und 9 von Bedeutung, aber in letzter Zeit traten vermehrt auch Infektionen mit den Serotypen 5 und 6 auf.

Rekonvaleszente Schweine (Schweine, die eine A.pp. Infektion überleben) sind im allgemeinen gegen erneute Erkrankungen geschützt, können aber den Erreger noch über längere Zeit (Wochen bis Monate) ausscheiden. Die ausgebildete Immunantwort schützt diese Tiere serotypübergreifend in Bezug auf das Auftreten einer klinischen Erkrankung bei Infektionen mit A.pp. (NIELSEN, R., Nord. Vet. Med. 31, 407-413 (1979), NIELSEN, R., Nord. Vet. Med. 36, 221-234 (1984)); eine Neubesiedlung der Schleimhäute und damit die mögliche Ausscheidung anderer Serotypen wird jedoch nicht verhindert.

Geimpfte Schweine, die eine inaktivierte Ganzzellvakzine durch intramuskuläre Applikation erhalten, bilden vorwiegend Antikörper, die gegen kapsuläre Polysaccharide gerichtet sind; der induzierte Impfschutz beschränkt sich auf den A.pp.-Serotyp, der als Grundlage der Vakzine verwendet wurde. Eine Kreuzprotektion gegen andere A.pp.- Serotypen wird nicht erreicht. Dieser Gegensatz zwischen Infektion und Impfung mit inaktivierten Ganzzellvakzinen zeigt, daß während der Infektion Antigene von A.pp. exprimiert werden, die zu einer serotypübergreifenden protektiven Immunität gegen A.pp. beitragen (FENWICK, B. u. HENRY, S., J. Am. Vet. Med. Assoc., 204, 1334-1340 (1994)).

Die nach herkömmlichen Methoden hergestellten bekannten Impfstoffe weisen den Nachteil auf, daß ein hoher Anteil an Fremdproteinen aufwendige Reinigungsoperationen erfordern. Weiterhin führen die Endotoxine in herkömmlichen Impfstoffen zu den bekannten Nebenwirkungen, so daß deren Gehalt in Impfstoffen gering sein muß.

Die Entfernung der Endotoxine bereitet in vielen Fällen Probleme, da herkömmliche Impfstoffe häufig kolloidale Lösungen sind oder aber partikuläre Bestandteile enthalten.

Daher ist man bei der Impfstoffherstellung auf Adjuvantien angewiesen, welche in der Lage sind, die Endotoxine zu binden. Hier kommt in erster Linie Aluminiumhydroxid zur Anwendung, obwohl dieses Adjuvans in vielen Fällen nur eine geringe Wirksamkeit hat. Das hochpotente Emulsigen kann daher in vielen Fällen nicht angewendet werden.

Ein in der Praxis sehr großer Nachteil der herkömmlichen Impfstoffe ist es, daß in der serologischen Diagnostik eine Impfung nicht von einer Infektion mit dem Krankheitserreger zu unterscheiden ist. Bei der heutigen Situation der Massentierhaltung wird jedoch auch aus Gründen des Verbraucherschutzes ein Nachweis gefordert, daß die Tiere des Bestandes zwar geimpft, aber nicht infiziert waren. Mit herkömmlichen Impfstoffen ist dieser Nachweis nicht oder nur schwer zu führen.

Ein Ausweg hieraus ist die Herstellung von rekombinanten Subunitvakzinen. Diese haben jedoch den Nachteil, daß die Herstellung sehr kompliziert und äußerst kostenintensiv ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vakzine zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik überwindet.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine nicht rekombinante Subunitvakzine enthaltend Zelloberflächenproteine erhältlich durch Kultivierung einer gramnegativen Bakterienkultur und anschließende Anreicherung protektiver Antigene unter Verwendung von Detergenzien zur Verfügung gestellt wird.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die Kultivierung der Bakterienkultur unter Streßbedingungen durchführt. Bevorzugt ist ferner, daß die Streßbedingungen Mineralstoffmangel und/oder Nährstoffmangel sind.

Vorteilhaft ist es, wenn man der Bakterienkultur Mineralstoffe komplexierende Stoffe zusetzt. Es ist insbesondere bevorzugt, daß man der Bakterienkultur Eisen komplexierende Stoffe zusetzt. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, daß man der Bakterienkultur Komplexbildner ausgewählt aus chelatisierenden Ionenaustauscherharzen, 2,2'-Dipyridyl, Desferrioxamin, Alkali- und/oder Erdalkalisalze von Diethylamin pentaessigsäure, Ethylendiaminotetraessigsäure oder Nitrilotriessigsäure zusetzt.

Erfindungsgemäß geeignete chelatisierende Ionenaustauscherharze sind beispielsweise Harze auf einer Styrol-Divinylbenzol-Copolymer Basis, welche Iminodiessigsäure-Reste tragen.

Insbesondere bevorzugt ist es ferner, daß man der Bakterienkultur Trinatrium-Calcium- Diethylaminopentaessigsäure oder deren Salze zusetzt.

Bevorzugt ist es weiterhin, daß man der Bakterienkultur ein oder mehrere Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Aldohexosen, Ketohexosen, Aldopentosen und/oder Ketopentosen zusetzt.

Bevorzugterweise kann man erfindungsgemäß der Bakterienkultur Serum und/oder Lungenlavage vom natürlichen Wirt des Bakteriums zusetzen.

Es ist ferner bevorzugt, daß man die Kultivierung der Bakterienkultur oberhalb der für diesen Keim gebräuchlichen Kultivierungstemperatur durchführt.

Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, daß man zur Anreicherung der protektiven Antigene Detergenzien ausgewählt aus Cholsäure, Cholinsäure, Deoxycholsäure, Deoxycholinsäure, deren Konjugate mit Glycin oder Taurin oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze sowie nicht- ionischen Detergenzien, anionischen Detergenzien und/oder zwitterionischen Detergenzien verwendet.

Besonders bevorzugt ist es, daß man zur Anreicherung Natriumlaurylsulfat, Natrium-N-laurylsarcosinat, Alkybenzylsulfonate, quaternäre Ammoniumsalze, wie Cetyltrimethylammoniumbromid, Cholsäure, Deoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure und andere Gallensäuren und deren Salze, Lithiumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, 3-[N-(3-Cholanamidopropyl)- dimethylammonio]-1-propansulfonat CHAPS), 3-[N-(3- Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propansulfonat (CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3- ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 12), N- Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 14), Tergitol®, Brij® 35, Brij® 58, Genapol® X-080, Nonidet® P40, Synperonic® PE/F 68, Synperonic® PE/F 127, Thesit®, Triton® X-100, Triton® X- 114, Tween® 20, Tween® 48, Tween® 80, Decanoyl-N- methylglucamid (MEGA 10), Deoxy BIGCHAP, n- Dodecylglycosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methyl glucamid (MEGA 8), n-Octylglucosid, Sucrosemonolaurat und/oder dergleichen sowie deren Mischungen verwendet.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Bakterien sind beispielsweise Neisseriaceae, wie beispielsweise Moraxella bovis, Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae und Pasteurellaceae, wie beispielsweise Actinobacillus actinomycetecomitans, Actinobacillus equuli, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus Agnii, Haemophilus avium, Haemophilus influenzae, Haemophilus paragallinarum, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Bakterienkultur aus Actinobacillus pleuropneumoniae.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen nicht rekombinanten Subunitvakzine zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer nicht rekombinanten Subunitvakzine enthaltend Zelloberflächenproteine erhältlich durch Kultivierung einer gramnegativen Bakterienkultur und anschließende Anreicherung protektiver Antigene unter Verwendung von Detergenzien.

Besonders bevorzugt ist es, daß man zur Anreicherung Natriumlaurylsulfat, Natrium-N-laurylsarcosinat, Alkybenzylsulfonate, quaternäre Ammoniumsalze, wie Cetyltrimethylammoniumbromid, Cholsäure, Deoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure und andere Gallensäuren und deren Salze, Lithiumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, 3-[N-(3-Cholanamidopropyl) - dimethylammonio]-1-propansulfonat CHAPS), 3-[N-(3- Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propansulfonat (CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3- ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 12), N- Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 14), Tergitol®, Brij® 35, Brij® 58, Genapol® X-080, Nonidet® P40, Synperonic® PE/F 68, Synperonic® PE/F 127, Thesit®, Triton® X-100, Triton® X- 114, Tween® 20, Tween® 48, Tween® 80, Decanoyl-N- methylglucamid (MEGA 10), Deoxy BIGCHAP, n- Dodecylglycosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methyl glucamid (MEGA 8), n-Octylglucosid, Sucrosemonolaurat und/oder dergleichen sowie deren Mischungen verwendet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff, enthaltend nicht rekombinante Subunitvakzine enthaltend Zelloberflächenproteine erhältlich durch Kultivierung einer Bakterienkultur und anschließende Anreicherung protektiver Antigene unter Verwendung von Detergenzien, zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Trägerstoffen, Lösemitteln und/oder Adjuvantien. In den erfindungsgemäßen Impfstoffen sind somit die Subunitantigene, welche aus der erfindungsgemäßen Subunitvakzine gewonnen werden, enthalten.

Es ist bekannt, daß die Wachstumsbedingungen in vitro kultivierter pathogener gramnegativer Bakterien einen bedeutenden Einfluß auf die Expression protektiver Antigene haben. So bewirkt ein Eisenmangel während des Wachstums von Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp.) die Induktion mindestens eines zusätzlichen protektiven Antigens auf der äußeren Membran (DENEER, H. G. u. POTTER, A. A., Infect. Immun. 57, 798-804 (1989), ROSSI- CAMPOS, A. et al., Vaccine 10, 512-518 (1992)). Dieser Eisenmangel wird bei A.pp. nach dem Stand der Technik ausschließlich durch Substanzen wie Dipyridil, EDTA oder EDDA induziert; diese Substanzen scheiden aber aufgrund ihrer Giftigkeit für die Benutzung bei der Impfstoffherstellung (Dipyridil) bzw. zu geringer Selektivität für Fe³⁺-Ionen (EDTA, EDDA) aus. Auch andere Substanzen wie zum Beispiel Maltose können bei einigen A.pp.-Serotypen zumindest ein weiteres OMP (Cuter Membrane Proteine) induzieren (DENEER, H. G. u. POTTER, A. A., Microb. Pathog. 6, 425-432 (1989)).

Lipoproteine der äußeren Membranen von A.pp. besitzen ein hohes immunogenes Potential und sind teilweise durch Änderungen der Wachstumsbedingungen induzierbar, z. B. das transferrinbindende Protein TfbA (DENEER, H. G. u. A. A. POTTER, Infect. Immun. 57, 798-804 (1989), ROSSI-CAMPOS, A. et al., Vaccine 10, 512-518 (1992), GERLACH, G. F. et al., Infect. Immun. 60, 892-898 (1992), GERLACH, G. F. et al., Infect. Immun. 61, 565-572 (1993)).

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich mehrere der beschriebenen protektiven Antigene insbesondere von A.pp., welche Lipoproteine der äußeren Membran sind, als solche mit Detergenzien aus den Bakterien extrahieren lassen, ohne eine Bakterienlyse zu verursachen. Durch diese Extraktion wird die Freisetzung einer Vielzahl weiterer, für die Induktion einer protektiven Immunantwort nicht relevanter oder sogar störender Proteine (Fremdproteine) vermieden.

Diese Extraktion protektiver Antigene zur Herstellung einer nicht rekombinanten Subunitvakzine ist bisher nicht beschrieben worden. Die Verwendung einer derartigen Präparation als Vakzine eröffnet zusätzlich die Möglichkeit einer potentiellen Unterscheidung von geimpften und infizierten Tieren (Markervakzine).

Die erfindungsgemäße Subunitvakzine weist den Vorteil auf, daß die Herstellung mit einem einfachen Extraktionsverfahren mittels eines Detergens erfolgen kann. Diese Extraktion ist ein einstufiger Schritt und stellt somit ein einfaches und kostengünstiges Verfahren dar. Ferner ist der Anteil an Fremdproteinen im Vergleich zu Ganzzellysaten und auf anderen Wegen hergestellten Impfstoffen äußerst gering.

Die erfindungsgemäße Subunitvakzine weist den Vorteil auf, eine Subunitvakzine zu sein, welche nicht mit rekombinanten Methoden hergestellt wird. Da die herkömmlichen und technisch einfach durchführbaren Kultivierungsmethoden angewendet werden, ist die Herstellung der erfindungsgemäßen Subunitvakzine sehr wirtschaftlich. Prinzipiell können im wesentlichen die dem Fachmann bekannten Methoden der Herstellung von Kulturen wie sie bei der Herstellung von Ganzzellysaten angewendet werden, gebraucht werden.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Subunitvakzine ist es, daß der Anteil an Fremdproteinen und Membranbestandteilen und somit Endotoxinen sehr gering ist. Durch das Herstellungsverfahren werden nämlich spezifisch im wesentlichen nur die protektiven Antigene aus der Membran herausgelöst. Die Membrane selbst und auch die Bakterienzelle bleiben dabei unbeschädigt. Dabei ist die erfindungsgemäße Subunitvakzine hoch immunogen. Die Immunantwort ist wesentlich spezifischer, da weniger Fremdproteine in der Vakzine enthalten sind.

Die erfindungsgemäße Subunitvakzine hat ferner den Vorteil, daß die immunogenen Proteine im wesentlichen in Lösung vorliegen. Die Reinigung von Lösungen ist besser möglich, als die Reinigung der Suspensionen herkömmlicher Impfstoffe. Dadurch ist auch die Entfernung von Resten an Endotoxinen aus der erfindungsgemäßen Subunitvakzine leichter möglich.

Auch können bei der erfindungsgemäßen Subunitvakzine die optimalen Adjuvantien verwendete werden. Die Auswahl, welche bei den herkömmlichen Impfstoffen durch die erforderliche Eigenschaft der Endotoxinbindung eingeschränkt war, entfällt bei den erfindungsgemäßen Subunitvakzinen.

Die erfindungsgemäße Subunitvakzine hat ferner den Vorteil, als Markervakzine geeignet zu sein. Mit einem ELISA ist es möglich, eine Infektion mit einem Wildstamm von einer Impfung mit der erfindungsgemäßen Subunitvakzine zu unterscheiden. Der mit einem Wildstamm infizierte Organismus weist nämlich zusätzliche Antikörper auf, welche keine Entsprechung in der erfindungsgemäßen Subunitvakzine haben. Somit ist es möglich, geimpfte von infizierten Organismen zu unterscheiden.

Die erfindungsgemäße Detergensextraktion erreicht eine möglichst vollständige Extraktion immunogener Proteine aus der äußeren Membran, wobei die Bakterienzellen weitgehend intakt bleiben. Die Struktur der äußeren Membran wird durch das Detergens gelockert, eine Ruptur und Bildung von Protein-Detergensmizellen aber weitgehend, wegen der damit verbundenen Erhöhung des LPS- Gehaltes (Endotxin) in den Extrakten, vermieden. Nach der allgemeinen Kinetik von Detergenzien sind für die Extraktion von Proteinen an der Oberfläche von Membranen niedrige Detergenskonzentrationen notwendig (HELENIUS, A. et al. Methods Enzymol. 56, 734-749 (1979)). Die äußere Membran von Enterobakterien und anderer gramnegativer Bakterien ist gegenüber einer Extraktion mit nicht- ionischen und schwach ionischen Detergenzien relativ widerstandsfähig (SCHNAITMAN, C. A. J. Bacteriol. 104, 890-910 (1970); FILIP, C. et al. J. Bacteriol. 115, 717- 722 (1977)).

Besonders geeignet sind Detergenzien, welche bereits in geringer Konzentration in der Lage sind, an der äußeren Membran der Bakterien verankerte immunogene Proteinstrukturen zu extrahieren. Zudem ist eine solche Detergensextraktion direkt in der Flüssigkultur möglich und ist somit auch für Fermenter anwendbar, um im wirtschaftlichem Maße Impfstoffe herstellen zu können.

Erfindungsgemäß verwendete Detergenzien können anionisch, zwitterionisch oder nichtionisch sein. Geeignete Detergenzien sind beispielsweise Natriumlaurylsulfat, Natrium-N-laurylsarcosinat, Alkybenzylsulfonate, quaternäre Ammoniumsalze, wie Cetyltrimethylammoniumbromid, Cholsäure, Deoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure und andere Gallensäuren und deren Salze, Lithiumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, 3-[N-(3-Cholanamidopropyl)- dimethylammonio]-1-propansulfonat CHAPS), 3-[N-(3- Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propansulfonat (CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3- ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 12), N- Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 14), Tergitol®, Brij® 35, Brij® 58, Genapol® X-080, Nonidet® P40, Synperonic® PE/F 68, Synperonic® PE/F 127, Thesit®, Triton® X-100, Triton® X- 114, Tween® 20, Tween® 48, Tween® 80, Decanoyl-N- methylglucamid (MEGA 10), Deoxy BIGCHAP, n- Dodecylglycosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methyl glucamid (MEGA 8), n-Octylglucosid, Sucrosemonolaurat und dergleichen sowie deren Mischungen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe erfolgt in an sich bekannter Weise. Dazu wird eine erfindungsgemäße nicht rekombinante Subunitvakzine zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Trägerstoffen, Lösemitteln und/oder Adjuvantien gemischt und sterilisiert. Die Verfahren sind dem Fachmann bekannt.

Unter Verwendung der erfindungsgemäßen nicht rekombianten Subunitvakzine ist auch ein diagnostischer Test in Form eines ELISA herstellbar. Dieser ELISA wird in an sich bekannter Weise hergestellt. Als Nachweisantikörper wird beispielsweise biotinyliertes Anti-Schweine-Konjugat (Ziege-Anti-Schwein-IgG, schwere und leichte Kette) verwendet. Als Enzymkonjugat zur Sichtbarmachung wird beispielsweise SA-PO (Streptavidin-Peroxidase) verwendet. Die Herstellung der ELISA-Platten und deren Auswertung und Messung sind dem Fachmann bekannt.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Allgemeines Verfahren zur Kultivierung und Extraktion

A.pp.-Flüssigkulturen (PPLO-Medium + IsoVitaleX) wurden bei 37°C und 180 rpm im Schüttelinkubator angezüchtet. Bei einer OD₆₆₀ = 0,2 wurde zur Erzeugung eines Eisenmangels der Eisenchelator 2,2'-Dipyridil (SIGMA, D7505) in einer Endkonzentration von 100 µM zum Wachstumsmedium hinzugegeben und die Kultur unter den oben genannten Bedingungen für weitere zwei Stunden inkubiert. Die erreichte OD₆₆₀ schwankte je nach A.pp.- Stamm zwischen 0,4 und 0,6. Die Reinheit wurde durch Ausstrich eines Aliquots aus der Kultur auf PPLO- und Luria-Agar kontrolliert.

Anschließend wurden die Bakterien schonend abzentrifugiert, das Wachstumsmedium abgegossen und das Bakterienpellet in 10 ml Aqua dest. resuspendiert. Aliquots von 200 µl wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C eingefroren.

Die Detergensextraktion der OMP erfolgte in 1,5 ml Reaktionsgefäßen. Hierzu wurden die Aliquots, falls notwendig, so verdünnt, daß pro Extraktionsansatz ca. 10 mg Bakterien (Naßgewicht) eingesetzt werden konnten. Die Bedingungen für die Detergensextraktion wird in den jeweiligen Beispielen beschrieben. Nach Zugabe des Extraktionspuffers wurden die Ansätze kurz mittels Vortex-Schüttler gemischt und im Wasserbad bei unten beschriebenen Temperaturen für 15 Minuten inkubiert. Anschließend nach erneutem Mischen der Ansätze wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation sedimentiert, die Überstände mit den extrahierten Proteinen abpipettiert. Die Bakterienzellpellets wurden in 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl resuspendiert und durch "hot-cold-lysis" oder mittels "bead beater" weiter aufgeschlossen.

Von jedem A.pp.-Stamm wurde zusätzlich mit Hilfe des "bead beater" ein Ganzzellysat hergestellt.

Die Proteinkonzentration wurde mittels des BCA-Protein- Assay (Fa. PIERCE) oder BIORAD-DC-Protein-Assay (Fa. BIORAD) bestimmt, wobei letzterer weniger sensitiv, aber unempfindlicher gegenüber Detergenzien ist.

Die gewonnenen Proteinextrakt wurden durch SDS-PAGE (4% PAG-Sammelgel, 10% PAG-Trenngel) aufgetrennt. Zur Beurteilung der Proteinprofile erfolgten teilweise eine Coomassie- oder Silberfärbung der Gele. Weitere Parameter wurden durch Immunoblotting mit spezifischen Antikörpern bestimmt. Spezielle Proteine wurden in Western-Blots, teilweise nach Titration und Dot-Blotting immunodetektiert. In einigen Fällen erfolgte vor der SDS- PAGE ein Einengen der Detergensextrakte durch TCA- Fällung.

In einem Mikrotiterplatten-Assay wurden über den Umsatz von p-Nitrophenylphosphat die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) in den Detergensextraktionen bestimmt.

Die Messung des quantitativen Extraktionserfolges erfolgte durch Bestimmung der Proteinkonzentration der Detergensextraktionen, teilweise auch semiquantitativ nach SDS-PAGE und Coomassie- oder Silberfärbung. Zur Beurteilung des qualitativen Extraktionserfolges wurden Immunoblots mit Antikörpern gegen die transferrinbindenden Proteine TfbA und TfbB von A.pp. durchgeführt. TfbA ist ein ca. 60 kDa großes Lipoprotein, das unter Eisenmangelbedingungen verstärkt von A.pp. auf der Oberfläche der äußeren Membran exprimiert wird (GERLACH, G. F. et al., Infect. Immun. 60, 892-898 (1992)). Es repräsentiert eines der gewünschten OMP in den Detergensextrakten.

Das ebenfalls durch Eisenmangel induzierbare TfbB-Protein von ca. 100 kDa ist dagegen ein integrales Protein der äußeren Membran (WILKE, M., Diss. med. vet. Hannover (1996)). Der Nachweis von TfbB in den Detergensextrakten ist daher ein Zeichen für eine partielle bzw. vollständige Solubilisierung der äußeren Membran. In den Immunoblots zum Nachweis der oben genannten Proteine wurden laboreigene Kaninchensera gegen rekombinantes TfbA bzw. TfbB (GERLACH, G. F. et al., Infect. Immun. 60, 892-898 (1992), WILKE, M., Diss. med. vet. Hannover(1996)) verwendet. Der Nachweis von alkalischer Phosphatase(AP)-Aktivität in den Detergensextrakten wurde als ein Parameter für die Ruptur der äußeren Membran (Freisetzung des Periplasmas) eingesetzt.

Immunoblots mit Serum von SPF-Schweinen bzw. rekonvaleszenten Schweinen geben Auskunft über das Verhältnis antigener Strukturen in den Detergensextrakten im Vergleich zu denen in Ganzzellysaten.

Beispiel 2 Extraktion mit Tergitol®

Mit dem nicht-ionischen Detergens Tergitol^R (NP 40, SIGMA) in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂-Puffer wurden an dem A.pp.-Feldisolat C7812 (Serotyp 2) Vorversuche für die allgemeine Durchführbarkeit des Verfahrens und die Applizierbarkeit der oben genannten Parameter unternommen. Hierbei wurden NP 40-Konzentrationen von 0,1-3% untersucht. Als Extraktionstemperaturen wurden 4°C, 37°C und 42°C gewählt. In den Versuchen wurden die extrahierten Proteine mit einer TCA-Fällung angereichert. Schon eine Konzentration von 0,1% NP 40 erhöhte deutlich den Proteingehalt in den Detergensextrakten im Vergleich zu Extrakten, die mit detergensfreiem Puffer hergestellt wurden. Zudem steigern höhere Temperaturen den Extraktionserfolg. Die Intaktheit der Bakterienzellen zeigte sich dadurch, daß sich nach der oben genannten Extraktion durch Zentrifugation sedimentierte Bakterienpartikel einfach und klumpenfrei in TBS-Puffer resuspendieren ließen.

Beispiel 3 Extraktion mit den Natriumsalzen der Cholin- und Desoxycholinsäure

Weitere Versuche wurden mit dem A.pp.-Stamm DM 322/5 (Serotyp 2/IMPFSTOFFWERK DESSAU-TORNAU) durchgeführt.

Dieser Stamm zeichnet sich durch gutes, klumpenfreies Wachstum in der Flüssigkultur aus.

Es wurden die Salze der Cholin- (SIGMA, C1254) und der Deoxycholinsäure (DIFCO, 750637) verwendet. Die Detergensextraktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

In 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA, 100 mM NaCl- Puffer wurden Extraktionsansätze in einem Volumen von 200 ml mit Detergenskonzentrationen von 0,05% bis 2% bei 37°C extrahiert.

Eine Erhöhung der Konzentration der Detergenzien bewirkt einen deutlichen Anstieg der Proteingehalte in den Detergensextrakten im Vergleich zu Extrakten, die mit detergensfreiem Puffer hergestellt wurden. TfbA- und TfbB-Antigene wurden mit den entsprechenden Antikörpern in Protein-Dot-Blots und Western-Blots nach SDS- Gelelektrophorese sowohl in Detergensextrakten als auch den Bakterienzellpellets nach Extraktion immunodetektiert. Ab einer Konzentration von 1% Cholsäure und 0,1% Deoxycholsäure erhöht sich deutlich der Anteil von TfbA in den Detergensextrakten. Bei einer Konzentration von 0,25% Deoxychol- bzw. 1% Cholsäure ist zudem eine deutliche Erhöhung der TfbB-Menge in den Detergensextrakten detektierbar. Die Erhöhung der detektierbaren TfbB-Proteine korreliert mit einer Zunahme der Aktivität der alkalischen Phosphatase in den Detergensextraktionen. Hier erfolgt bei einer Deoxycholinsäurekonzentration von 0,25% und Cholinsäurekonzentration von 1% ein abrupter Anstieg des Umsatzes von p-Nitrophenylphosphat durch die erhöhte AP- Konzentration. Im Gegensatz hierzu scheinen die Bakterienzellpelletextrakte an TfbA, TfbB und AP- Aktivität mit steigender Detergenskonzentration zu verarmen (Fig. 1).

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Detergensextraktion von A.pp.-DM 322/5 mit Na-Salzen von Cholin- und Deoxycholinsäure. Dargestellt sind die untersuchten Parameter für die Detergensextrakte (A und C) sowie die Extrakte der Bakterienzellpellets (B und D). Über den Diagrammen ist die Auswertung eines Immunoblots (Protein- Dot-Blot) der jeweiligen Extrakte mit α-TfbA (TfbA) und α-TfbB (TfbB). Die Säulen geben die Aktivität der AP gemessen an der Extinktion (OD₄₁₀) der Gelbfärbung bei Umsatz von p-Nitrophenylphosphat durch die AP der Extrakte. Die jeweilige Proteinkonzentration der Extrakte sowie der tendenzielle Verlauf der Proteinkonzentrationen (mg/ml) bei steigender Detergenskonzentration (Grade) sind dargestellt.

Immunoblots der Detergensextrakte und eine Ganzzellpräparation von DM 322/5 mit Serum von einem SPF- Schwein und dem Rekonvaleszentenserum C2142 gegen A.pp.- Serotyp 2 (Titer: 1 : 80) zeigen zudem eine deutliche Zunahme der immunogenen Strukturen in den Detergensextraktpräparationen bei steigender Detergenskonzentration. Einige Banden immunogener Proteine treten verstärkt schon bei niedrigen Detergenskonzentration auf.

Die Ergebnisse zeigen, daß schon geringe Detergensmengen in der Lage sind, auf der äußeren Membran verankerte Proteine zu extrahieren. Bei zu hoher Detergenskon zentration erfolgt zumindest bei Cholin- und Deoxycholinsäure eine Lyse und/oder Ruptur der äußeren Membran, und damit eine Erhöhung von TfbB sowie der AP- Aktivität.

Beispiel 4 Kultivierung in Gegenwart des Eisenchelators Na₃CaDTPA

Der für die Expression einiger immunogener Strukturen bei A.pp. notwendige Eisenmangel in Kulturmedium wurde durch eine Zugabe des Eisenchelators Na₃CaDTPA in das Wachstumsmedium induziert. Die Toxizität des Eisenchelators Na₃CaDTPA (Trinatrium-Calcium- Diethylaminopentaessigsäure, FLUKA 32325) ist gering. Na₃CaDTPA findet in der Humanmedizin Anwendung als Antidot in der Therapie der akuten Eisenintoxikation.

Für die Prüfung der Wirksamkeit von Na₃CaDTPA wurde der A.pp.-Stamm DM 322/5, wie unter Beispiel 1 beschrieben, kultiviert. Na₃CaDTPA wurde in den Endkonzentrationen von 50 µM, 100 µM, 150 µM und 200 µM zugegeben. Ein Vergleich der OD₆₆₀ bei Zugabe des Chelators und 2 Stunden nach Zugabe des Chelators zeigten im Vergleich zum unbehandelten Ansatz eine geringfügige Verringerung der Wachstumsrate. Immunoblots von Ganzzellysaten der Na₃CaDTPA behandelten Ansätze mit den Antikörpern gegen TfbA und TfbB zeigten eine deutlich höhere Expression von TfbA und eine Induktion und Steigerung der Expression von TfbB bei steigender Na₃CaDTPA-Konzentration.

Die Ergebnisse zeigen, daß ein durch Na₃CaDTPA erzeugter Eisenmangel immunogene Strukturen induziert. Na₃CaDTPA ist aufgrund seiner geringen Toxizität für die Impfstoffherstellung geeignet.

Beispiel 5 Verwendung des Eisenchelators Desferrioxamin

Der für die Expression einiger immunogener Strukturen bei A.pp. notwendige Eisenmangel in Kulturmedium wurde mit Desferrioxamin erzeugt.

Für die Prüfung der Wirksamkeit von Desferrioxamin wurde der A.pp.-Stamm DM 322/5, bis zu einer OD₆₆₀ von 0,2 in Schüttelkolben mit Schikanen kultiviert. Aus der Schüttelkultur wurden 5 Ansätze zu je 4 ml hergestellt und Desferrioxamin in den Endkonzentrationen von 50 µM, 100 µM, 150 µM und 200 µM zugegeben. Ein Vergleich der OD₆₆₀ bei Zugabe des Chelators und 2 Stunden nach Zugabe des Chelators zeigten im Vergleich zum unbehandelten Ansatz keine Verringerung der Wachstumsrate. Immunoblots von Ganzzellysaten der mit Desferrioxamin behandelten Ansätze mit den Antikörpern gegen TfbA und TfbB zeigten eine deutlich höhere Expression von TfbA und eine Induktion und Steigerung der Expression von TfbB (Fig. 2).

Fig. 2 stellt Immunoblots von mit TCA präzipitierten A.pp.-Flüssigkulturen ohne (-) und mit Zugabe von Desferrioxamin in den angegebenen Konzentrationen mit Kaninchenhyperimmunseren gegen TfbA (A) und TfbB (B) dar. Die Position der spezifischen Banden sind jeweils mit Pfeilen gekennzeichnet. Molekulargewichtsstandard in kDa.

Die Ergebnisse zeigen, daß Desferrioxamin schon in einer Konzentration von 50 µM einen absoluten Eisenmangel und die absolute Induktion immunogener Strukturen auszulösen vermag.

Beispiel 6 OMP-Detergensextraktion in A.pp.-Flüssigkulturen

PPLO-Medium wurde mit einem Mediumzusatz bestehend aus 10 g/l Glutamin, 1 g/l NAD, 26 g/l L-Cystein-HCl, 1 g/l L- Cystin sowie 200 g/l Glucose gelöst in Aqua dest. angereichert (1 l PPLO mit 10 ml des Mediumzusatzes).

Die A.pp.-Stämme DM 322/5 (Serotyp 2) und 811/051 (Serotyp 9) (IMPFSTOFFWERK DESSAU-TORNAU) (gutes, klumpenfreies Wachstum in der Flüssigkultur), wurden in Flüssigkulturen bis zu einer OD₆₆₀ = 0,3 im Schüttelinkubator kultiviert. Na₃CaDTPA wurde in einer Endkonzentration von 150 mM hinzugegeben, und die Kulturen bis zu einer OD₆₆₀ = 0,75 für 811/051 und OD₆₆₀ = 0,64 für DM 322/5 weiterkultiviert. Es folgte die Zugabe eines Pufferkonzentrates für unterschiedliche Detergensendkonzentrationen (Cholinsäure 0,5%-1,25%, Deoxycholinsäure 0,05%-0,125% für 811/051; Deoxycholinsäure 0,05%-0,125%, Tergitol^R 0,05%-0,125% für DM 322 / 5). PPLO-Medium enthält 5 g/l NaCl (= 85 mM). Durch die Pufferzugabe wurde das Kulturmedium ca. 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl. Extrahiert wurde bei 37°C für 30 Minuten unter Schütteln bei 120 rpm. Die Bakteriensuspension wurde anschließend zentrifugiert und die Überstände steril filtriert. Bei der folgenden Untersuchung dieser Detergensextrakte wurde als weiterer Parameter durch Immunoblots mit einem Antikörper gegen ein A.pp. RTX-Toxin der Gehalt an RTX-Toxin in den Überständen detektiert.

Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE der Detergensextrakte zeigt einen deutlichen Anstieg der Proteinkonzentration mit zunehmender Detergenskonzentration von Cholin, und Deoxycholinsäure. Immunoblots zeigen einen Anstieg der TfbA-Konzentration bei Detergensextraktion im Vergleich zur einfachen Pufferextraktion ohne Detergens. Zudem war in allen Detergensextrakten RTX-Toxin nachweisbar. Allerdings scheinen höhere Konzentrationen von Cholin- oder Deoxycholinsäure den detektierbaren RTX-Toxinanteil zu verringern.

Beispiel 6 Vergleich des immunogenen Potentials von Ganzzellysaten und Detergenspräparationen der A.pp.-Serotypen 2 und 9

Zum Nachweis des immunogenen Potentials der Detergensextrakte wurden gleiche Volumina von A.pp.- Flüssigkulturen der Serotypen 2 und 9, die mit und ohne Eisenmangelinduktion bis zu gleichen OD₆₆₀-Extinktionen kultiviert worden waren, sowie ihre Detergensextraktionen und Überstände mit TCA präzipitiert. Die Proteinpellets wurden in gleichen Volumina SDS-Spaltpuffers resuspendiert und mittels SDS-PAGE nach Größe aufgetrennt.

In Fig. 3 sind die Proteinprofile von Ganzzellysaten von A.pp.-Flüssigkulturen der Serotypen 2 und 9 nach Kultivierung mit und ohne Eisenmangelinduktion sowie ihrer Detergensextraktionen und Kulturüberstände im Immunoblot mit Rekonvaleszentenserum gegen A.pp.-Serotyp 2 (Fig. 3: A) und in der Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE (Fig. 3: B) dargestellt.

Fig. 3 zeigt die Proteinprofile der A.pp.-Serotypen 2 (S2) und 9 (S9). A: Westernblot nach dem "Screening" mit einem Rekonvaleszentenserum eines mit A.pp.-Serotyp 2 infizierten Schweins; B: SDS-Gel derselben Proben nach Coomassie-Färbung. 1: Ganzzellysate vor Eisenmangelinduktion, 2: Ganzzellysate nach Eisenmangelinduktion, 3: Detergensextraktpräparationen, 4: Kulturüberstände. Der Pfeil kennzeichnet eine durch Eisenmangel induzierbare Proteinbande. Links neben den Abbildungen sind jeweils die Positionen des Molekulargewichtsstandard in kDa dargestellt.

Im Immunoblot mit dem Rekonvaleszentenserum zeigen sich durch den Vergleich der Bandenmuster der Ganzzellysate von A.pp.-Flüssigkulturen, die ohne (Spur 1) und mit (Spur 2) Eisenmangelinduktion kultiviert worden waren, deutliche Unterschiede in den Proteinprofilen bei beiden A.pp.-Serotypen. Beispielhaft ist eine durch Eisenmangel induzierbare Bande bei ca. 65-70 kDa mit einem Pfeil gekennzeichnet. In den Kulturüberstände nach Detergensextraktion der gleichen eisenmangelinduzierten A.pp.-Kulturen (Spur 3) werden vom Rekonvaleszentenserum deutlich antigene Strukturen erkannt, die teilweise in ihrer Proteinmenge denen der Ganzzellysate gleichen, obwohl die Detergensextraktionen gegenüber den Ganzzellysaten (Spur 2) eine geringere Gesamtproteinkonzentration aufweisen (siehe Coomassie- Färbung in Fig. 3 B). Im Vergleich hierzu ist im Immunoblot das Proteinprofil der Kulturüberstände eisenmangelinduzierter A.pp.-Kulturen (Spur 4) qualitativ und quantitativ schwächer ausgeprägt.

Die Ergebnisse verdeutlichen, daß sich durch eine Detergensextraktion von A.pp.-Flüssigkulturen der Anteil antigener Strukturen in den Kulturüberständen qualitativ und quantitativ erhöht und sich dadurch das immunogene Potentials der Detergensextrakte wesentlich an das von Gesamtzellen annähert.

Beispiel 7 Immunisierung von Schweinen mit einer Detergensextraktionsvakzine von A.pp.-Flüssigkulturen Impfstoffherstellung:

Für den Impfstoff wurden die 0,075% Deoxycholinextraktion vom A.pp.-Stamm 811/051 (Serotyp 9) und die 0,05% Deoxycholinextraktion vom A.pp.-Stamm DM 322/5 (Serotyp 2) verwendet. Beide Präparationen weisen einen erhöhten Anteil an TfbA im Vergleich zur detergensfreien Extraktion auf. Zudem sind bei diesen niedrigen Detergensextraktionen noch RTX-Toxine gut im Immunoblot nachweisbar. Die LPS-Gehalte waren für die Präparation von A.pp. 811/051 1,2 × 10⁵ IE/ml sowie 6 × 10⁵ IE/ml für die DM 322/5 Präparation. Zur Sterilkontrolle wurden je 100 µl der Flüssigkulturen auf PPLO + IsoVitaleX-Agar und Luria-Agar ausgespatelt. Beide Kontrollen waren negativ.

Durch SDS-PAGE (4% PAG-Sammelgel; 10% PAG-Trenngel) wurden die Proteinkonzentrationen der beiden Detergensextraktpräparationen semiquantitativ bestimmt. Zur Impfstoffherstellung wurden die Extraktpräparationen von 811/051 und DM 322/5 im Verhältnis 1 : 2 eingesetzt. Mit den Detergensextraktpräparationen wurden drei Impfstofformen hergestellt. Als Adjuvans diente Emulsigen Plus (MVP LABORATORIES, Ralston, Nebrak., USA). Für eine 1 ml Impfstoffdosis/Tier wurden die Impfstoffe wie folgt gemischt:

Impfstoff A:

- 1 : 10 verdünnte Detergensextrakte 811/051 und DM 322/5 im Verhältnis 1 : 2
- 0,05% Formaldehyd
- 20% Emulsigen Plus

Impfstoff B:

- unverdünnte Detergensextrakte (vgl. Impfstoff A)
- 0,05% Formaldehyd
- 20% Emulsigen Plus

Impfstoff C:

- unverdünnte Detergensextrakte (vgl. Impfstoff A)
- 20% Emulsigen Plus

Versuchsverlauf:

Der Immunisierungsversuch wurde in Anlehnung an die vorläufige Monographie "Vaccinum Actinobacillosis (Actinobacillus pleuropneumoniae) inactivatum ad suem" durchgeführt.

20 Schweine im Alter von 5 Wochen (Firma PIG) wurden verwendet. Nach den Eingangsuntersuchungen wurden die Tiere in 2 Gruppen zu 4 Tieren und 1 Gruppe zu 12 Tieren eingeteilt. Nach dem Einstallen wurden die Schweine mit 30 mg Flubendazol (BELA-PHRAM)/kg Futter über 5 Tage entwurmt.

5 Tage vor der 1. Immunisierung wurde den Tieren Blut entnommen (Blutung-0) und mit der Komplementbindungs reaktion (KBR) mit einem Mischantigen die A.pp.-Serotypen 2, 3, 7 und 9 untersucht. Alle Seren der Tiere waren in der KBR serologisch A.pp.-negativ.

Im Alter von ca. 8 Wochen, 3 Wochen nach dem Einstallen, erfolgte die 1. Immunisierung der Schweine, 21 Tage danach die 2. Immunisierung jeweils mit /ml der oben beschriebenen Vakzinen durch i. m. Injektion in den Nacken. Einen Tag (Tag: -1) vor der Immunisierung sowie an den beiden der Immunisierung folgenden Tagen (Tag: +1; Tag: +2) wurde bei den Tieren rektal die Körpertemperatur gemessen und das Allgemeinbefinden beurteilt. Am Tag der Immunisierung (Tag: 0) wurde vor sowie 2, 4 und 8 Stunden nach der Immunisierung die rektale Körpertemperatur bestimmt. Um eine zusätzliche Aufregung der Schweine durch die für die Tiere bisher unbekannte Messung zu vermeiden, wurde am Tag der 1. Immunisierung auf die Messung vor der Immunisierung verzichtet. Hier wurde die Messung des Vortages zugrunde gelegt.

Die 2. Blutentnahme (Blutung-1) erfolgte 2 Tage vor der 2. Immunisierung, die 3. Blutentnahme (Blutung-2) erfolgte 21 Tage nach der 2. Immunisierung. Die Seren der Blutungen 1 und 2 wurden in der KBR mit Misch- und Einzelantigenen gegen die A.pp.-Serotypen 2, 3, 7 und 9 untersucht. Zudem wurden die Seren der Blutung 0, 1 und 2 mit einem laboreigenen A.pp.-RTX II-Toxin- (APXII)-ELISA untersucht. Weiterhin erfolgte eine Beurteilung der Antikörperantwort auf die im Versuch eingesetzten Antigene durch einen ELISA und Immunoblotting.

Ergebnisse und Auswertung: Körpertemperatur und Allgemeinbefinden der Schweine

Die Mittelwerte für die rektale Körpertemperatur der Schweine aus den einzelnen Versuchsgruppen sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Am Tag der Impfstoffapplikation war ein deutlicher Anstieg der Körpertemperatur bei den Schweinen aller Impfstoffgruppen festzustellen. Vor allem am Tag der 2. Immunisierung betrug bei einigen Tieren die Abweichung von der mittleren Normaltemperatur vor der Impfung über 2°C. Die erhöhte Körpertemperatur am Tag der Impfung war begleitet von starker Mattigkeit, sehr ruhigem Verhalten und Inappetenz der Tiere. Bei den 4 Schweinen der Impfstoffgruppe A waren diese Erscheinungen allerdings nicht so deutlich ausgeprägt.

Alle durch die Immunisierung verursachten klinischen Erscheinungen waren am Tag nach der Immunisierung wieder verschwunden. An der Injektionsstelle waren adspektorisch und palpatorisch keine Auffälligkeiten zu bemerken.

Komplementbindungsreaktion (KBR)

Die Ergebnisse von den Untersuchungen der Seren in der KBR sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Nach der 1.

Immunisierung waren alle Seren, bis auf zwei Ausnahmen, in der KBR mit dem Mischantigen der A.pp.-Serotypen 2, 3, 7 und 9 positiv. In der Einzelantigenbestimmung wiesen einige Tiere geringe Antikörperaktivität gegen die A.pp.- Antigene vor. Nach der 2. Immunisierung war bei allen Tieren eine Antikörperaktivität gegen A.pp.-Antigen in der KBR mit Misch- und Einzelantigen feststellbar. Titer ab 1 : 10 gelten in der KBR als A.pp.-positiv. Auffallend war allerdings, daß positive Antikörpertiter in der KBR vorwiegend gegen das im Impfstoff nicht eingesetzte Antigen vom A.pp.-Serotyp 3 nachweisbar waren. Weiterhin fehlte vollständig eine Immunantwort gegen das Antigen vom A.pp.-Serotyp 9.

Eine nochmalig durchgeführte Serotypisieung der beiden A.pp.-Stämme, die zur Impfstoffherstellung dienten, ergab eine nur zweifelhafte Zuordnung des Stammes 811/051.

In der KBR haben nur 50% der Schweine in der Impfstoffgruppe A (verdünnter Impfstoff) einen positiven Titer nach der 2. Immunisierung. Sonst zeigt die KBR keine deutlichen Unterschiede zwischen den Impfstoffgruppen.

Tabelle 2:

Komplementbindungsreaktion

APX II-ELISA

In dem APX II-ELISA, der in der A.pp.-Diagnostik eingesetzt wird, waren alle Seren aus dem Immunisierungsversuch negativ, auch die nach der 2. Immunisierung gewonnenen.

Die Schweine scheinen eine nur geringe Antiköperantwort gegen die im Impfstoff vorhandenen RTX-Toxine von A.pp. (Synonym, APX) auszubilden. Das APX II-Toxin wird allen A.pp.-Serotypen mit Ausnahme des Serotyps 10 exprimiert. Das Fehlen einer nachweisbaren Immunantwort gegen APX II- Toxin könnte als Möglichkeit genutzt werden über den APX II-ELISA geimpfte von natürlich infizierten Tieren zu unterscheiden.

ELISA mit Antigenen der Detergensextrakte in den Impfstoffen

Zur Beurteilung der Immunantwort der Schweine gegen die in den Impfstoffen vorhandenen Antigene, wurde ein spezieller ELISA entwickelt. Hierzu wurden Maxisorp® Mikrotiterplatten (Nung) mit 100 µl der Detergensextrakte der A.pp.-Stämmen DM 322/5 und 811/051 (Verdünnung 1 : 100 mit 50 mM Carbonatpuffer pH 9,6) für 16 Std. bei Raumtemperatur (RT) beschichtet. Nach 3maligem Waschen mit 100 µl 150 mM phosphatgepufferter Saline + 0,05% Tween 20 (PBS + T)/Well wurde für 1 Std. mit 100 µl Blockpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,005% Gelatine) bei RT inkubiert und die Platten erneut mit PBS-T gewaschen.

1. Antikörper: Als erster Antikörper wurden die Schweineseren in Zweierverdünnungsreihen (Anfangsverdünnung: 1 : 100) eingesetzt. Als Positivkontrollen dienten die Seren von rekonvaleszenten Schweinen aus Infektionsversuchen mit dem A.pp.-Stämmen DM2142 (Serotyp2) und F4714 (Serotyp 9). Die Inkubation dieser Seren erfolgte wiederum bei RT für 1 Std. Nach der Inkubation wurden die Platten dreimal gewaschen.
2. Antikörper: Als zweiter Antikörper fand biotinyliertes Anti-Schweine-Konjugat (Ziege-Anti-Schwein-IgG, schwere und leichte Kette, Fa. Dianova, Hamburg; Verdünnung: 1 : 5000) Verwendung. Die Inkubation und der Waschgang erfolgten unter den schon erwähnten Bedingungen.
Enzymkonjugat: Jedes Well wurde mit 100 µl SA-PO (Streptavidin-Peroxidase, Fa. Dianova, Hamburg;
Verdünnung: 1 : 40.000) gefüllt und wie vorher inkubiert.
Substrat: Nach den letzten Waschschritten wurden 100 µl gebrauchsfertige Substratlösung je Well einpipettiert und unter Schütteln bei 37°C inkubiert.
Auswertung: 10 min nach Zugabe des Substrates erfolgte eine bichromatische Messung der Extinktionen bei 410 nm gegen 490 nm Referenzwellenlänge mittels Photometers.

ELISA-Datenauswertung

Die Datenauswertung erfolgte durch ein PC-gestütztes Auswertungsprogramm nach der Referenzstandard-Methode. Als Referenzstandard wurde das Rekonvaleszentenserum F4714 (Serotyp 9) genommen. Die Ergebnisse für die einzelnen Impfstoffgruppen sind in Fig. 4 graphisch dargestellt. Die Tiere aller drei Impfstoffgruppen zeigen eine deutliche Antikörperbildung gegen die im ELISA verwendeten Antigene von beiden Detergensextraktionen. Die Ergebnisse der ELISA-Titer-Messung spiegeln allerdings nur die Antiköperantwort auf das Antigengemisch in den Detergenzextrakten wieder. Dennoch stellt die Höhe der Antikörpertiter im ELISA eine positive Tendenz für eine protektive Wirkung der Impfstoffe dar.

Fig. 4 zeigt ELISA mit Antigenen der Detergensextrakte in den Impfstoffen. Dargestellt sind die Auswertungen der ELISAs mit Antigenen der Detergensextrakte von DM322/5 (A, C, E) und der Detergensextrakte von 811/051 (B, D, F). Gezeigt sind der Median (+), das Minimum () und das Maximum (▲) der gemittelten, logarithmierten ELISA-Units (log EU) für die Immunseren der Impfstoffgruppe A (A, B), B (C, D) und C (E; F).

Nachweis von Antikörpern gegen TfbA

Für die qualitative Bewertung des Immunisierungserfolges wurden die Immunseren der Schweine mit dem Multiscreen Block (BIORAD) auf Antikörperbildung gegen TfbA untersucht. Hierzu wurde rekombinantes TfbA von A.pp.- Serotyp 7 mittels SDS-PAGE (12,5 µg TfbA/Gel) aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembranen elektrotransferiert. Anschließend erfolgte das Immunoscreening mit den Immunseren in einer Verdünnung von 1 : 100 mit 3 M Harnstoff-TBS-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) unter Nutzung der oben genannten Apparatur. Der Zusatz von Harnstoff diente der Hemmung von unspezifischer Immunglobulinbindung an die Proteine auf den Nitrocellulosemembranen, die sich durch den erhöhten Immunglobulinspiegel nach Immunisierungen zwangsläufig ergibt. Die spezifische Antikörperbindung wird durch diese "stringenten" Bedingungen deutlicher. Als Positivkontrollen dienten anti-TfbA-Hyperimmunserum vom Kaninchen (Verdünnung 1 : 500) und wiederum die Seren von rekonvaleszenten Schweinen aus Infektionsversuchen mit dem A.pp.-Stämmen DM2142 (Serotyp2) und F4714 (Serotyp 9) (Verdünnung 1 : 200). Das Ergebnis dieses Immunoscreenings ist in Fig. 5 dargestellt.

Fig. 5 zeigt die Immunoblots mit Immunseren. Dargestellt sind Westernblots mit rekombinantem TfbA vom A.pp.- Serotyp 7 nach dem "Screening" mit den Immunseren.

Positivkontrollen sind anti-TfbA-Hyperimmunserum vom Kaninchen (anti-TfbA) und die Seren von rekonvaleszenten Schweinen aus Infektionsversuchen mit dem A.pp.-Stämmen DM2142 (Serotyp 2) und F4714 (Serotyp 9). Für die Schweine der einzelnen Impfstoffgruppen (T) sind in der 1. Spur von links das Serum der Blutung-0, in der 2. Spur der Blutung-1 und in der 3. Spur der Blutung-2 aufgetragen worden. Die Position der TfbA-spezifischen Bande wird jeweils durch den Pfeil gekennzeichnet. Links neben den Westernblots sind jeweils die Positionen des Molekulargewichtsstandard durch Balken gekoppelt mit dem Wert des Molekulargewichtes in kDa dargestellt.

Alle Tiere wiesen teilweise schon nach der ersten Immunisierung eine mehr oder minder starke Immunantwort gegen das TfbA Antigen auf. Bei 6 Tieren der Impfstoffgruppe B (50%) war diese sehr deutlich. Nur je ein Tier der anderen beiden Impfstoffgruppen zeigte eine deutlichere Immunantwort gegen TfbA.

Weitere quantitative Untersuchungen

Die Immunseren wurden zusätzlich im Immunoblot gegen die Antigene der Detergensextrakte der Impfstoffe sowie der Ganzzellysate der A.pp.-Stämme, die zur Extraktpräparation dienten, eingesetzt. Neben der in den Immunoblots gut erkennbaren Antikörperantwort gegen die Antigene, war im Immunoblot gegen das Impfstoffantigen zusätzlich feststellbar, daß die mit Impfstoff C (nicht formalinaktiviert) immunisierten Schweinen im Vergleich zu den mit den anderen Impfstoffen immunisierten Tieren eine stärkere Reaktion mit LPS aufweisen.

Beispiel 8 Detergensextraktion aus E.coli

Zum Nachweis der universellen Anwendbarkeit der Detergensextraktionsmethode auf andere gramnegative Bakterien wurde ein E.coli-Modell gewählt. Dabei wurde auf einen E.coli-Stamm HB 101 zurückgegriffen, der mit dem Expressionsvektor pTF205/E1 transformiert worden war, in dem das TfbA-Gen von A.pp.-Serotyp 7 unter Kontrolle des tac-Promotors kloniert wurde. Nach einer Induktion mit IPTG (Isopropylthiogalaktosid), wird das rekombinante TfbA auf der äußeren Membran der E.coli-Transformanten überexprimiert. Als Kontrolle diente ein HB101-Stamm, der mit dem Expressionsvektor pGH 433 ohne TfbA-Gen transformiert wurde.

E.coli-Transformanten wurden in Luria-Medium ergänzt mit Ampicillin (100 µg/ml) über Nacht bei 37°C im Schüttelinkubator kultiviert. Je 4% dieser 'Über Nacht- Kulturen' werden erneut in Luria-Medium und Ampicillin inokuliert und bei 37°C im Schüttelinkubator weiterkultiviert. Bei einer OD₆₆₀ = 0,4 wurden die Kulturen geteilt und jeweils einmal ohne IPTG und einmal mit ITPG (Endkonzentration 10 µM) weiterkultiviert. Aus einem Aliquot dieser Kulturen wurde mittels "bead beater" ein Ganzzellysat sowie aus einem weiteren durch Zentrifugation der Kulturüberstand gewonnen. Anschließend wurde die IPTG-induzierte HB101 pTF205/E1-Kultur in Schikanekolben zu gleichem Volumen aufgeteilt und wie in Beispiel 3 beschrieben, mit dem Detergens Deoxycholinsäure in Konzentrationen von 0,05%, 0,1% und 0,2% extrahiert.

In Fig. 6 ist der Immunoblot von Proteinpräparationen der E.coli-Transformanten pGH433 und pTF205/E1 mit Kaninchenhyperimmunserum gegen rekombinantes TfbA (A) gezeigt. Aufgetragen wurden Ganzzellysate ohne IPTG Induktion (Spur 1) sowie mit IPTG-Induktion (Spur 2), Tris-NaCl-Pufferextrahierte (Spur 4) sowie mit Deoxycholinsäure extrahierte IPTG-induzierte E. coli Kulturen (Spur 5: 0,05%, Spur 6: 0,1%, Spur 6: 0,2% Deoxycholinsäure). In B ist das Coomassie-gefärbte Gel nach SDS-Gelelektrophorese der gleichen Proben gezeigt. In Spur M wurde ein Molekulargewichtmarker aufgetragen. Die Markerbanden sind von oben 108 kDa, 80 kDa, 50 kDa, 34 kDa, 27 kDa und 17 kDa.

In Fig. 6 sind je 12 µl Aliquote der Ganzzellysate der pGH433-Transformanten und der pTF205/E1-Transformanten mit und ohne IPTG-Induktion sowie die Detergensextrakte von den IPTG induzierten pTF205/E1-Transformanten im Immunoblot nach SDS-PAGE mit Kaninchenhyperimmunserum gegen rekombinantes TfbA von APP-Serotyp 7(A) und im Coomassie-gefärbten Gel (B) dargestellt.

Im Vergleich hierzu erkennt man in Fig. 3 A deutlich die Expression des TfbA und seine Überexpression bei IPTG- Induktion in den pTF2057E1-Transformanten (vgl. Spur 1 und 3 von pGH433 mit 1 und 3 von pTF205/E1). Durch den Vergleich der Proteinanteile der Ganzzellysate in der Kultur mit denen der Überstände wird deutlich, daß der überwiegende Anteil von TfbA an die E.coli- Bakterienzellen gebunden ist (Spur 1+2, Spur 3+4 von pTF205/E1). In Spur 5-8 von pTF205/E1 ist der Extraktionserfolg durch die Detergensextraktion mit steigender Detergensmenge dargestellt.

Claims

1. Nicht rekombinante Subunitvakzine enthaltend Zelloberflächenproteine erhältlich durch Kultivierung einer gramnegativen Bakterienkultur und anschließende Anreicherung protektiver Antigene unter Verwendung von Detergenzien.

2. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung der Bakterienkultur unter Streßbedingungen durchführt.

3. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Streßbedingungen Mineralstoffmangel und/oder Nährstoffmangel sind.

4. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Mineralstoffe komplexierende Stoffe zusetzt.

5. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Eisen komplexierende Stoffe zusetzt.

6. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Komplexbildner ausgewählt aus chelatisierenden Ionenaustauscherharzen, 2,2'- Dipyridyl, Desferrioxamin, Alkali- und/oder Erdalkalisalze von Diethylaminpentaessigsäure, Ethylendiaminotetraessigsäure oder Nitrilotriessigsäure zusetzt.

7. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Trinatrium-Calcium- Diethylaminopentaessigsäure oder deren Salze zusetzt.

8. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur ein oder mehrere Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Aldohexosen, Ketohexosen, Aldopentosen und/oder Ketopentosen zusetzt.

9. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Serum und/oder Lungenlavage vom natürlichen Wirt des Bakteriums zusetzt.

10. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung der Bakterienkultur oberhalb der für diesen Keim gebräuchlichen Kultivierungstemperatur durchführt.

11. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Anreicherung der protektiven Antigene Detergenzien ausgewählt aus Cholsäure, Cholinsäure, Deoxycholsäure, Deoxycholinsäure, deren Konjugate mit Glycin oder Taurin oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze sowie nicht-ionischen Detergenzien, anionischen Detergenzien und/oder zwitterionischen Detergenzien verwendet.

12. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienkultur aus Neisseriaceae, nämlich Moraxella bovis, Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae oder Pasteurellaceae, wie Actinobacillus actinomycetecomitans, Actinobacillus equuli, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus Agnii, Haemophilus avium, Haemophilus influenzae, Haemophilus paragallinarum, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida besteht.

13. Verfahren zur Herstellung nicht rekombinanter Subunitvakzine enthaltend Zelloberflächenproteine gemäß Anspruch 1, in dem man eine gramnegative Bakterienkultur kultiviert und anschließend protektive Antigene unter Verwendung von Detergenzien anreichert.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterienkultur unter Streßbedingungen kultiviert.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Streßbedingungen Mineralstoffmangel und/oder Nährstoffmangel sind.

16. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Mineralstoffe komplexierende Stoffe zusetzt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Eisen komplexierende Stoffe zusetzt.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Komplexbildner ausgewählt aus chelatisierenden Ionenaustauscherharzen, 2,2'-Dipyridyl, Desferrioxamin, Alkali- und/oder Erdalkalisalze von Diethylaminpentaessigsäure, Ethylendiamino tetraessigsäure oder Nitrilotriessigsäure zusetzt.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Trinatrium-Calcium-Diethylaminopentaessigsäure oder deren Salze zusetzt.

20. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur ein oder mehrere Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Aldohexosen, Ketohexosen, Aldopentosen und/oder Ketopentosen zusetzt.

21. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Serum und/oder Lungenlavage vom natürlichen Wirt des Bakteriums zusetzt.

22. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung der Bakterienkultur oberhalb der für diesen Keim gebräuchlichen Kultivierungstemperatur durchführt.

23. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Anreicherung der protektiven Antigene Detergenzien ausgewählt aus Cholsäure, Cholinsäure, Deoxycholsäure, Deoxycholinsäure, deren Konjugate mit Glycin oder Taurin oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze sowie nicht-ionischen Detergenzien, anionischen Detergenzien und/oder zwitterionischen Detergenzien verwendet.

24. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Bakterienkultur aus Neisseriaceae, nämlich Moraxella bovis, Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, oder Pasteurellaceae, wie Actinobacillus actinomycetecomitans, Actinobacillus equuli, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus Agnii, Haemophilus avium, Haemophilus influenzae, Haemophilus paragallinarum, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, verwendet.

25. Impfstoff, enthaltend nicht rekombinante Subunitantigene gemäß Anspruch 1 zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Trägerstoffen, Lösungsmitteln und/oder Adjuvantien.