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Verfahren zur Gewinnung oder Reinigung von therapeutisch wirksamen Präparaten.
Oberflächenaktive Stoffe sind von Natur aus in vielen Ausgangsstoffen, die zur Gewinnung pharmazeutischer Präparate dienen, vorhanden und in den meisten Fällen für die pharmakologisehe Wirksamkeit dieser Präparate von besonderer Bedeutung. Anderseits kommen oberflächenaktive Stoffe auch als unerwünschte Nebenbestandteile in solchen Ausgangsstoffen und in pharmazeutischen Präparaten vor, indem sie beispielsweise eine Giftwirkung besitzen, wie dies beim Saponin in Digitalispräparaten der Fall ist.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es nun, in einfacher Weise einerseits in Flüssigkeiten, die von Natur aus therapeutisch wirksame oberflächenaktive Stoffe enthalten, diese Bestandteile anzureichern, anderseits Nebenbestandteile, die der therapeutischen Verwendung solcher Flüssigkeiten hinderlich sind, oder eine solche ganz ausschliessen, ohne wesentliche Schädigung der wirksamen Bestandteile zu entfernen.
Das Verfahren gemäss der Erfindung zur Gewinnung und Reinigung von therapeutisch wirksamen Präparaten besteht im Wesen darin, dass von Natur aus oberflächenaktive Stoffe enthaltende Flüssigkeiten, wie Drogenauszüge, Presssäfte oder Extrakte aus tierischen Organen, oder Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blutserum, in Fraktionen verschiedener Konzentration an oberflächenaktiven Stoffen zerlegt werden, indem man die Flüssigkeiten, mindestens zum Teil, zu Schaum dispergiert und den Schaum, allenfalls fraktioniert, absondert. Wenn die Stoffe, die in den Schaum übergegangen sind, gewonnen werden sollen, wird dieser in die flüssige Phase zurückgeführt.
Wenn die Flüssigkeiten unter den Arbeitsbedingungen zur Schaumbildung nicht befähigt sind, werden ihnen unschädliche Schaumbildner zugesetzt, wie gallensaure Salze, Serum u. dgl., doch ist in der Regel der Zusatz solcher Stoffe nicht erforderlich.
Als zur Bildung eines Schaumes geeignetes gasförmiges Medium kann man in den meisten Fällen Luft (allenfalls nach vorgängiger Reinigung und Sterilisierung) verwenden. Ferner kann man Stickstoff oder andere indifferente Gase zur Schaumbildung benutzen. Um den gesondert aufgefangenen Schaum in die flüssige Phase zurückzuführen, kann man die zur Zerstörung von Schaum üblichen Mittel verwenden. Beispielsweise fällt der Schaum beim Zusatz von wenigen Tropfen Octanol (Octylalkohol) oder Äther zusammen. Ist der Zusatz von solchen Stoffen unerwünscht, so kann der Schaum durch Zentrifugieren verflüssigt werden.
Nach der einfachsten Ausführungsform des Verfahrens geht man in der Weise vor, dass man die Flüssigkeit durch ein eingeblasenes Gas zu einem Anteil, der durch Vorversuche festgestellt wird, in Schaum überführt, den gebildeten Schaum von der zurückbleibenden Flüssigkeit (Restlösung) abtrennt und verflüssigt. In der Regel wird der Schaum in Fraktionen aufgefangen, wobei man einen Anteil, der die oberflächenaktiven Stoffe in höchster Konzentration enthält, als erste Fraktion absondert, während in den weiteren Fraktionen die Konzentration an diesen Stoffen in der Regel mehr und mehr abnimmt, so dass bei Verschäumung der ganzen Ausgangslösung sich Endfraktionen ergeben würden, deren Konzentration an oberflächenaktiven Stoffen geringer ist als die der Ausgangslösung. Man kann diesen Arbeitsvorgang als"fraktionierte Verschäumung"bezeichnen.
Der Wirkungsgrad der Verschäumung, d. h. der Grad der Adsorption der jeweils vorhandenen oberflächenaktiven Stoffe an den Schaum, hängt, abgesehen von der Natur des Ausgangsstoffes, von einer Mehrzahl von Faktoren ab, die sieh auch untereinander beeinflussen. Es ist daher, um das Optimum
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der Wirkung zu erzielen, jeweils erforderlich, durch einige Vorversuche die zweckmässigsten Bedingungen festzustellen. Als Faktoren, welche den Wirkungsgrad der Verschäumung beeinflussen, sind vor allem die folgenden zu beachten und zweckentsprechend zu regeln :
Die Wasserstoff-Ionen-Konzentration der zu verschäumende Lösung (pH-Wert) ; bei manchen aktiven Stoffen, den sogenannten bedingt oberflächlichen Stoffen, wechselt die Aktivität mit dem pH-Wert.
Das Verhältnis der in der Lösung vorhandenen Mengen oberflächenaktiver und inaktiver Stoffe zueinander.
Die Leitfähigkeit der zu verschäumenden Lösung ; häufig wird die Adsorption von Stoffen an einen Schaum durch Elektrolytzusatz herabgesetzt, bei stärkeren Konzentrationen gehemmt.
Die Temperatur (im allgemeinen ist die Adsorption an den Schaum bei tieferen Temperaturen grösser als bei höheren).
Die Grösse der adsorbierenden Oberfläche, also die Grösse und Zahl der Blasen, mit deren Hilfe die Flüssigkeit in Schaumform übergeführt wird.
Die Geschwindigkeit, mit welcher die Flüssigkeit verschäumt wird. Die Adsorption der meisten oberflächenaktiven Stoffe an den Schaum bzw. an die die Flüssigkeit durchperlenden Gasblasen ist offensichtlich ein nicht allzu schnell verlaufender Vorgang, so dass die Verschäumung sich in der Regel um so wirkungsvoller erweist, je langsamer sie vor sich geht. Um eine langsame Verschäumung zu erzielen, kann man beispielsweise durch Verlängerung des Weges, den die aufsteigenden Blasen zurückzulegen haben, eine längere Berührung der Blasen mit der Flüssigkeit und hiedurch eine erhöhte Adsorption der oberflächenaktiven Stoffe erzielen. Ein längeres Verweilen der Blasen in der Flüssigkeit kann auch durch verschiedene andere Massnahmen erreicht werden, z.
B. durch ein Rührwerk, das den Aufstieg der Blasen auf dem kürzesten Weg verhindert, so dass die Adsorption an den Oberflächen der Blasen erhöht wird. Eine Verlangsamung der Verschäumung kann auch dadurch wirksam erreicht werden, dass es den schon an der Oberfläche der Flüssigkeit liegenden Schaumblasen ermöglicht wird, noch längere Zeit an der Oberfläche der Flüssigkeit zu ruhen, bevor sie durch neu von unten kommende Blasen von der Oberfläche abgehoben werden und so auf den unter ihnen liegenden Schaumblasen zu liegen kommen, wo sie keine oder geringere Möglichkeit der Adsorption von Substanzen aus der Flüssigkeit haben.
Ein solches längeres Aufruhen der Blasen auf der Flüssigkeitsoberfläche kann sowohl durch ein langsames Einleiten des Gases als auch durch Vergrösserung der Oberfläche der Flüssigkeit im Verhältnis zur Zahl und zum Umfang der in der Zeiteinheit durch die Flüssigkeit perlenden Blasen erreicht werden.
Die "fraktionierte Verschäumung" ist insbesondere bei der Verarbeitung von Flüssigkeiten, die mehrere obsrflächenaktive Stoffe von verschiedener Aktivität aufweisen, von grosser Wichtigkeit, weil stets die oberflächenaktivsten Stoffe zuerst in den Schaum übergehen und die weniger aktiven Stoffe verdrängen, so dass die Stoffe höchster Aktivität vornehmlich in der ersten bzw. in den ersten Fraktionen sieh vorfinden. Erst wenn der aktivste Stoff aus der Flüssigkeit durch Verschäumung in weitgehendem Mass entfernt ist, beginnt der Übergang der weiteren oberflächenaktiven Stoffe in den Schaum, beispielsweise in der dritten Fraktion und den folgenden Fraktionen.
Ein-Beispiel einer solchen Verdrängung und Trennung durch fraktionierte Verschäumung ist die Verschäumung von Hämoglobin und Serum. Eine nicht allzu konzentrierte Hämoglobinlösung gibt, bei pH 6-5 varschäumt, eine eindeutige Anreicherung des Hämoglobins (durch die kolorimetrische Methode nach Sahli quantitativ bestimmt), in den ersten Sehaumfraktionen. Wird jedoch gleichartiges Hämoglobin in gleicher Verdünnung mit ungefähr gleicher Menge Serum vermischt und dann unter denselben Bedingungen verschäumt, so ist in der ersten und zweiten Fraktion (wobei jede Fraktion etwa 2 Vol. % der verschäumten Ausgangsmenge beträgt) weniger Hämoglobin pro Volumseinheit enthalten als in der Ausgangslösung.
Dieses Ergebnis ist darauf zurückzuführen, dass im Serum Stoffe vorhanden sind, die an den Schaum stärker adsorbiert werden als Hämoglobin und das Hämoglobin von diesem verdrängen. Von der dritten Fraktion an findet dann eine Anreicherung von Hämoglobin in etwa dem gleichen Ausmass im Schaum statt wie in der ersten Fraktion, bei der Verschäumung von Hämoglobin allein. In dieser Weise können zwei Anteile des Gemisches in verschiedenen Fraktionen relativ angereichert werden, was bei genauer Einhaltung der jeweils optimalen Bedingungen einer vollkommenen Trennung sehr nahe kommen kann.
Das Verfahren gemäss der Erfindung kann zur Verarbeitung von mannigfache Ausgangsmaterialien, von denen nur beispielsweise Serum, Harn, Presssäfte oder Extrakte aus Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse usw., ferner aus den zur Gewinnung von Hormonen geeigneten Drüsen, und weiter pflanzliche Auszüge, die pharmakologisch wirkende Stoffe enthalten, wie Digitalisauszüge, Mutterkorn, genannt seien. Die auf übliche Weise gewonnenen Säfte und Extrakte können vor ihrer Verschäumung gewünschtenfalls mit Verdünnungsmitteln oder Lösungsmitteln versetzt werden. Man kann ferner auch schon allenfalls vorbehandelte, z. B. gereinigte, aus den Ausgangsstoffen gewonnene Trockenpräparate nach Wiederauflösung der Behandlung nach dem vorliegenden Verfahren unterwerfen.
Die Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung ist in sehr einfachen Apparaturen möglich.
Die Zeichnung stellt zwei Vorrichtungen dar, welche für das Verfahren geeignet sind.
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Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur Verschäumung von Flüssigkeiten im Schnitt. Fig. 2 eine etwas abgeänderte Ausführungsform gleichfalls im Schnitt. Die Flüssigkeit, die verschäumt werden soll, wird in das Gefäss a gebracht, in welches es durch die Öffnung e eingefüllt wird, während das Gefäss mit den beiden Öffnungen e und g nach aufwärts gelagert ist. Hierauf wird die Öffnung e mittels einer in ihren Glasschliff passenden Kapillare b verschlossen. Die Kapillare ist nach oben durch ein Gaszuleitungsrohr c verlängert, so dass die beim Stehen des Gefässes a durch Kommunikation in der Kapillare aufsteigende Flüssigkeit nicht ausfliesst.
Nach unten reicht die Kapillare bis knapp zum Boden des Gefässes a und trägt an ihrem Ende den kurzen Ansatz einer dickwandigen Kapillare mit verkleinertem Lumen (sogenannte Thermometerkapillare). Die Kapillaren-zu jedem Apparat gehört ein Satz verschiedener, Kapillaren, die je nach dem zu verschäumende Material ausgewechselt werden könnensind so gebaut, dass auch höhere Drucke angelegt werden können. Hierauf wird an den oberen winkelig abgebogenen Fortsatz des Gefässes a ein weiteres Gefäss d mittels der Glasschliffverbindung angesetzt.
Nach Verbindung der Kapillare mit der Gasquelle wird zufolge des Durchperlers des Gases an der Oberfläche der im Gefäss a befindlichen Flüssigkeit Schaum gebildet und durch den immer sich erneuernden Schaum langsam in das Gefäss d übergeführt, wo er (je nach Material) von selbst zusammenfällt oder zum Zusammenfallen gebracht wird. Es sind eine Mehrzahl Gefässe d vorhanden, die, ohne dass die Verschäumung hiezu unterbrochen werden müsste. ausgewechselt werden können.
Bei der Vorrichtung nach Fig. 2 weist das Gefäss a, obgleich von annähernd gleichem Volumen wie das in Fig. 1 dargestellte, einen verlängerten Weg für dieGasblasen auf und ermöglicht durch die schüsselförmige Ausweitung am oberen Ende eine Vergrösserung der Flüssigkeitsoberfläche, auf welcher die Schaum-
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Ausführungsbeispiele :
Beispiel1 : Anreicherung von atmungssteigernden und die Hubhohe des Herzens vermehrenden Stoffen des Blutserums.
Das völlig klare, frische, zentrifugierte Serum eines Kaninchen wird mit physiologischer Kochsalzlösung stark verdünnt (3 cm3 Serum auf 100 cm3 Flüssigkeit) und in einer Vorrichtung gemäss Fig. 1 der Zeichnung unter Durchleiten von Stickstoff (der durch Pyrogallol von den 02-Resten befreit wurde) verschäumt. Die aufgefangenen Shaumfraktionen, die jedesmal mengenmässig 2% der Ausgangsmenge betragen, werden nach Zerstörung des Schaumes im Vakuum über Phosphorpentoxyd so lange eingeengt, bis das Volumen erhalten wird, welches dem unverdünnten S3rumgehalt der Ausgangslösung entspricht.
Die aus den einzelnen Schaumfraktionen erhaltenen Lösungen werden dann durch eine Pergamenthülse gegen sehr häufig gewechselt physiologische Kochsalzlösung 36 Stunden lang dialysiert (bei 3 C), um blutisotone Lösungen zu erhalten.
Die Lösungen werden sodann an einem wie üblich zur Blutdruck-und Atmungsregistrierung präparierten Kaninchen (Narkose : Urethan) geprüft. Die aus der ersten Schaumfraktion erhaltene Lösung zeigt eine eindeutige Wirkung auf die Atmung, deren einzelne Züge auf das Dreifache vertieft werden, ferner eine Wirkung auf die Hubhöhe, die bei einfachem Hg-Manometer sich als doppelt erhöht erweist. Beide Wirkungen klingen bald ab, die Herzkontraktionen bleiben jedoch noch längere Zeit deutlich gegenüber der Kontraktionsgrösse vor der Injektion erhöht, während die Atmungswirkung nach kurzer Zeit zur Norm absinkt. Die Injektion findet wie üblich mittels eingebundener Kanüle in die Jugularvene statt.
Die Registrierung des Blutdruckes ergibt keine Schwankungen durch Injektion der Lösung. Die aus der zweiten Schaumfraktion gewonnene Lösung hat eine eben noch erkennbare Wirkung auf die Atmung, die dritte und die folgenden Lösungen sind wirkungslos, ebenso wie die Ausgangslösung und die Restlösung.
Eine weitere Prüfung der erhaltenen Fraktionen ergibt ferner, dass in den ersten Fraktionen eine die Leukozyten lähmende Substanz angereichert ist. Die nach den obigen Angaben durch Fraktionierung des Schaumes gesondert gewonnenen und blutisoton gemachten Lösungen werden mit gleichen Mengen eines frisch entnommenen Gemisches von Kaninchen-Leukozyten und einer Aufschwemmung von chinesische Tusche oder Karmin versetzt und dann auf einige Stunden bei 370 C inkubiert. Jede Stunde wird von den Röhrchen ein Abstich auf einen Objektträger gemacht und die Zahl der phagozytierenden Zellen gezählt, also der Leukozyten (Phagozyten), die innerhalb ihrer Zelle chinesische Tusche oder Karmin aufweisen.
Die Zahl der phagozytierenden Zellen ist bei Zusatz der aus der ersten Schaumfraktion des Serums gewonnenen Flüssigkeit viel geringer (bis zu 50%) als bei Zusatz von Normalserum. Bei Zusatz der Restlösung, d. h. also derjenigen Serumlösung, aus der die Schaumfraktionen entnommen wurden, ist die Zahl jedoch etwas grösser als bei Normalserum (bis zu 20%).
Beispiel 2 : Als Beispiel zur Anreicherung von Antikörpern aus spezifischen Immunsera wird der Fall der Anreicherung der Hämolysine aus Kaninchenserum beschrieben. Ein inaktiviertes, Menschen-Erythrozyten-lösendes Serum vom Kaninchen wird mit destilliertem Wasser sehr stark verdünnt (2 cm3 oder 3 cm3 auf 100 cm3 Wasser). Die verdünnte Lösung wird bei einem pH-Wert von 7-8 bis 8-3, der durch entsprechenden Zusatz von 100/n NaOH eingestellt wird, fraktioniert verschäumt.
Die ersten drei Fraktionen von je 2% des Ausgangsvolumens werden getrennt aufgefangen und durch 100/n Säure auf den pH-Wert der Ausgangslösung zurückgeführt und im Vakuum bei tiefer
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Temperatur zur Trocknung gebracht ; der Rückstand wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und bei 30 C 24 Stunden lang gegen häufig gewechselt physiologische Kochsalzlösung dialysiert. Die so isoton gewordene Flüssigkeit wird auf den Gehalt (Titer) an Hämolysin wie üblich geprüft.
Die aus der ersten Fraktion gewonnene Lösung zeigt bei einer Verdünnung von 1 : 800 noch deutlich eine hämolytische Wirkung, die auch bei der zweiten und dritten Fraktion sogar in gesteigertem Masse noch vorhanden sein kann. Die Ausgangslösung hingegen zeigt nur bis zu einer Verdünnung von 1 : 400 eine hämolytische Wirkung, während die Restlösung eine deutliche verminderte hämolytische Wirkung besitzt.
Beispiel 3 : Ein Digitalispräparat, welches noch unerwünschte Beimengungen von Saponin enthält, was durch die hämolytische Wirkung des Saponins festgestellt werden kann, wird von diesem in der folgenden Weise befreit (entgiftet). Das ungereinigte Digitalispräparat wird in 20% igem Alkohol im Verhältnis von 1 g Trockenpräparat zu 300 em3 Lösung gelöst und verschäumt. Die erste, 5% des Ausgangsvolumens umfassende S3haumfraktion enthält fast die gesamte Menge des vorhandenen Saponins, bei gleichzeitiger Anreicherung an Digitalis.
Die Restlösung ist praktisch saponinfrei, der Verlust an Digitalis durch Übergang in die S3haumfraktion zusammen mit dem Saponin beträgt nur 5%.
Während die Ausgangslösung einen hämolytische Titer von 1 : 1200 hatte, wirkt die Restlösung bei einer Verdünnung von 1 : 100 nicht mehr hämolytisch.
PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung oder Reinigung von therapeutisch wirksamen Präparaten, dadurch gekennzeichnet, dass von Natur aus oberflächenaktive Stoffe enthaltende Flüssigkeiten, wie Drogenauszüge, Presssäfte oder Extrakte aus tierischen Organen oder Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blutserum, in Fraktionen von verschiedener Konzentration an oberflächenaktiven Stoffen zerlegt werden, indem man die Flüssigkeit, mindestens zum Teil, zu S3haum dispergiert und den S3haum, allenfalls fraktioniert, absondert.