AT333437B

AT333437B - Verfahren zur herstellung von phosphatidkomplexen mit erhohtem phosphatidylathanolamingehalt aus tierischem material

Info

Publication number: AT333437B
Application number: AT97474*#A
Authority: AT
Inventors: Aloisia Dr Graf
Original assignee: Etapharm Chem Pharm Lab Ges M
Priority date: 1974-02-07
Filing date: 1974-02-07
Publication date: 1976-11-25
Also published as: ATA97474A

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Phosphatidkomplexe der einzelnen tierischen Organe weisen eine für das jeweilige Organ spezifische Zusammensetzung auf, sowohl im Verhältnis der einzelnen Phosphatide zueinander als auch im Fettsäuremuster. Durch geeignete Extraktionsmethoden gelingt es, die Gesamtlipide unverändert zu isolieren, aus welchen dann die Phosphatide in ihrer nativen Zusammensetzung gewonnen werden können. 



   Ziel der Erfindung ist es, Phosphatidkomplexe herzustellen, deren Gehalt an Phosphatidyläthanolamin 
 EMI1.1 
 Methoden beschrieben, die man in vier Gruppen einteilen kann : a) Fällung der Phosphatide mit Aoeton aus einer   Äther- oder   Petrolätherlösung des Gesamtextrak- tes. b) Trennung der Phosphatide von den andern Lipiden durch Dialyse. e) Auftrennung des Lipidgemisches durch Verteilung zwischen nicht miteinander mischbaren Lösungs- mitteln. d) Chromatographische Verfahren. 



   Die Gruppe d) hat in den letzten Jahren die weiteste Verbreitung erfahren ; auch die der Erfindung zu- grundeliegende Methode gehört dazu. 



   In der Lipidchemie ist vor allem die   Säulenchromatographie   über Kieselgel für präparative Trennungen von Bedeutung ; für die analytische Charakterisierung eines Extraktes zieht man hauptsächlich dünnschichtchromatographische Verfahren heran. Daneben wird in geringerem Ausmass auch die   Papierchromatographie   angewendet. In letzter Zeit wurde von Loev und Goodman ein chromatographisches Verfahren-die Trocken-   säulenchromatographie-entwickelt   (vgl. Chemistry and Industry [1967], S. 2026 bis 2032), das die Vorteile der   Säulen- und Dünnschichtchromatographie   in sich vereinigt : Arbeiten im präparativen Massstab, geringer Lösungsmittel- und Zeitbedarf. 



   Im gegenständlichen Falle wurde nun eine Methode gefunden, die es ermöglicht, mittels der Trocken-   säulenchromatographie   an einer vorbehandelten Kieselgelsäule aus einem Gesamtlipidextrakt zuerst die Neutralfette und Glyceride abzutrennen und danach ein Phosphatidgemisch mit einem erhöhten Gehalt an Phosphatidyläthanolamin zu isolieren.

   Das   erfindungsgemässe Verfahren   ist somit dadurch gekennzeichnet, dass man einen Gesamtlipidextrakt mittels der   Trockensäulenchromatographie   in einem zweistufigen Verfahren eluiert, wobei in der ersten Stufe an einer, mit einem Lösungsmittelgemisch für die zweite Stufe vorbehandelten Kieselgelsäule mittels eines mindestens dichlorierten niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffes die Neutralfette und Glyceride abgetrennt werden, wonach in der zweiten Stufe mit einer solchen Menge eines Gemisches aus mindestens dichloriertem niederen aliphatischen Kohlenwasserstoff, einwertigem niederaliphatischem Alkohol und Wasser behandelt wird, dass die Phosphatide mit einem gegenüber dem nativen Komplex erhöhten Gehalt an Phosphatidyläthanolamin isoliert werden. 



   Das für die Isolierung der Phosphatide angewendete Verfahren und insbesondere dessen zweite Stufe bietet wesentliche Vorteile gegenüber den in der Literatur beschriebenen Arbeitsweisen. Nach den bekannten Methoden werden die Phosphatide an Kieselgel durch steigende Mengen Methanol oder eines andern stark po-   laren Lösungsmittels   in Chloroform fraktioniert. Man kann dafür entweder einzelne, aufeinander folgende, in ihrer Zusammensetzung stufenweise voneinander verschiedene Gemische der beiden Komponenten wählen, 
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 "gradient elution" bedienen.telgemisch in der   zweiten Verfahrensstufe können Methanol oder Äthanol eingesetzt werden. Die qualitative   und quantitative Zusammensetzung des Lösungsmittelgemisches kann im Rahmen der Erfindung variiert werden, was an Hand der tieferstehenden Beispiele demonstriert wird. 



   Die allgemeine Anwendungsmöglichkeit des Verfahrens auf Gesamtlipidextrakte tierischen Ursprungs wird nachfolgend, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken, an Hand von Extrakten aus vier verschiedenen tierischen Organen näher beschrieben. Natürlich können auch Lipidextrakte aus anderem tierischen Material, wie Gehirn, Nebennierenrinde, Schilddrüse, Ovarien usw., dem   erfindungsgemässen Verfahren   unterworfen werden. 



   Für die Wahl der Ansatzmenge an Gesamtlipidextrakt besteht keine spezielle Einschränkung ; es genügt also, auf die allgemein für chromatographische Methoden geltenden Bedingungen, wie Grösse der Säule und 

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 Elutionsgeschwindigkeit, Bedacht zu nehmen. 



   Die praktische Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann zweckmässig in folgender Weise vorgenommen werden. 
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 stimmten Lösungsmittelgemisch, vorteilhaft in einem Verhältnis von etwa 0, 5 bis 2 ml   Lösungsmittel auf  
5 g Kieselgel, versetzt, gut durchgemischt und etwa 1 h in einem verschlossenen Gefäss stehen gelassen. 



  Darauf wird das so vorbehandelte Kieselgel in ein passendes   Chromatographierohr gleichmässig eingefüllt. Das   Verhältnis von Durchmesser zu Höhe der Kieselgelsäule soll etwa 1 : 10 betragen. Während des Füllens ist der Ablaufhahn   geöffnet ;   am Boden des Rohres befindet sich ein Wattepfropfen. Ein Teil des vorbehandelten Kieselgels   (z. B.   5 bis 10% der Gesamtmenge) wird für die im Folgenden beschriebene Aufbringung des Lipidextraktes zurückbehalten. 



   Der Gesamtlipidextrakt wird, gegebenenfalls nach einer Vorreinigung, in chloriertem Kohlenwasserstoff, z. B. 1 g Extrakt in 2 ml Chloroform, gelöst und mit dem Rest des vorbehandelten Kieselgels versetzt und gut durchgemischt, wobei ein Verhältnis von 1 g Lipide zu 1 bis 2 g vorbehandeltem Kieselgel günstig ist. Aus dem so erhaltenen Gemisch wird das Lösungsmittel im Stickstoffstrom bei Raumtemperatur oder bei   400 C   Wasserbadtemperatur entfernt, so dass eine krümelige Masse, bestehend aus Kieselgel und Lipiden, entsteht. Diese Masse wird nun auf die vorbereitete Säule gebracht und leicht zusammengedrückt. Als Abschluss wird noch 1 bis 2 cm hoch gewaschener Seesand in die Säule gefüllt. 



   Mit reinem   chloriertem Kohlenwasserstoff (z. B. Chloroform) werden   die Neutralfette und Glyceride heruntergewaschen, während die Phosphatide am Start bleiben. Die Lösungsmittelmenge wird auf das Kieselgel bezogen, sie beträgt   z. B.   je 10 g Kieselgel etwa 60 bis 75 ml ; die Elutionsgeschwindigkeit wird vorteilhaft mit 2, 5 bis 10   ml/min   gewählt. 



   Nach Trockenlaufen der Säule wird das für die zweite Verfahrensstufe dienende Lösungsmittelgemisch   (z. B. Chloroform-Methanol-Wasser) für   die Fraktionierung der Phosphatide aufgebracht. Die Durchflussgeschwindigkeit wird zweckmässig so eingestellt, dass die Lösungsmittelfront nach 1 bis 1, 5 h das untere Säulenende erreicht hat. Die bis zu diesem Zeitpunkt gesammelte Flüssigkeitsmenge ist noch ein Teil der 1. Fraktion, also der reine chlorierte Kohlenwasserstoff, und wird mit dem Hauptanteil vereinigt. Bei Fortsetzung der Elution werden nun die Phosphatide entsprechend ihrer chromatographischen Auftrennung an der Säule gewonnen. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt hiebei vorteilhaft etwa 1 bis 3 ml/min. Der erste Teil des so erhaltenen, noch farblosen Eluates stellt eine Zwischenfraktion (Fraktion 2) dar, die einen Teil von Cardiolipin enthält.

   Die Hauptmenge des Eluates (Fraktion 3), die mit beginnender leichter   Gelfärbung   abgenommen wird, enthält das gewünschte Phosphatidgemisch mit erhöhtem Phosphatidyläthanolgehalt. 



   Beispiel l : Netzhauptlipide
1 g Gesamtlipidextrakt aus Schweinenetzhäuten
40 g Kieselgel für die   Trockensäulenchromatographie   
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> I <SEP> CHOIS
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> n <SEP> CHCIs-&num;N3 <SEP> OH-Hz <SEP> 0 <SEP> 75 <SEP> : <SEP> 22 <SEP> : <SEP> 3
<tb> Fraktion <SEP> 1 <SEP> 265 <SEP> ml
<tb> Fraktion <SEP> 2 <SEP> 14 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Fraktion <SEP> 3 <SEP> 25 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Ausbeute <SEP> (Fraktion <SEP> 3) <SEP> 234 <SEP> mg <SEP> Phosphatide, <SEP> d. <SEP> s. <SEP> 23, <SEP> 4% <SEP> 
<tb> 
 
Analysenwerte für die isolierten Phosphatide :
Der Phosphatidyläthanolamingehalt beträgt im nativen Phosphatidkomplex etwa   30% ;   in dem als Fraktion 3 isolierten Komplex 50 bis 60%.

   Ebenso ist eine Erhöhung des Gehaltes an   Dokosahexaensíl. ure (C22 : 6)   zu verzeichnen. Ursprünglich ist diese mit etwa 10% in den Fettsäuren der Glycerophosphatide vertreten, nach der Anreicherung von Phosphatidyläthanolamin sind 16 bis 21% nachweisbar. Der Gehalt an Arachidonsäure (C20 : 4) stieg von 8 auf 10% an. 



     Beispiel 2 :   Netzhauptlipide
10 g Gesamtlipidextrakt aus Schweinenetzhäuten
200 g Kieselgel für die Trockensäulenchromatographie 
 EMI2.3 
 
<tb> 
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> I <SEP> CHCIs
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> II <SEP> CHCl3-CH3-OH-H2 <SEP> 0 <SEP> 65 <SEP> : <SEP> 25 <SEP> : <SEP> 4
<tb> Fraktion <SEP> 1 <SEP> 1560 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Fraktion <SEP> 2 <SEP> 13 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Fraktion <SEP> 3 <SEP> 84 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Ausbeute <SEP> (Fraktion <SEP> 3) <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> Phosphatide, <SEP> d. <SEP> s. <SEP> 20% <SEP> 
<tb> 
 Analyse : Die gefundenen Werte entsprachen jenen von Beispiel l. 

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    Beispiel 3 : Herzlipide   
20 g Gesamtlipidextrakt aus Kälberherzen 200 g Kieselgel für die   Trockensäulenehromatographie   
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> I <SEP> CHClg
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> n <SEP> CHClg-CHg <SEP> OH-H2 <SEP> 0 <SEP> 65 <SEP> : <SEP> 25 <SEP> : <SEP> 4
<tb> Fraktion <SEP> 1 <SEP> 1530 <SEP> ml
<tb> Fraktion <SEP> 2 <SEP> 22 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Fraktion <SEP> 3 <SEP> 74 <SEP> ml
<tb> Ausbeute <SEP> (Fraktion <SEP> 3) <SEP> 4, <SEP> 16 <SEP> g <SEP> Phosphatide, <SEP> d. <SEP> s. <SEP> 20, <SEP> 8% <SEP> 
<tb> 
 
Analysenwerte für die isolierten Phosphatide :
Der Phosphatidyläthanolamingehalt beträgt 55% gegenüber 25% im nativen Phosphatidkomplex. Die Arachidonsäuremenge ist von 10 auf 22% angestiegen.

   Bei diesem Organ muss im Hinblick auf die spätere therapeutische Verwendung des Phosphatidpräparates ein Teil des Cardiolipins abgetrennt werden ; dies ist in Fraktion 2 enthalten. 



     Beispiel 4 :   Lipide aus Nierenrinde
1 g Gesamtlipidextrakt aus Nierenrinde, Schwein
40 g Kieselgel für die   Trockensäulenehromatographie   
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> I <SEP> CCl4
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> II <SEP> CCl4-C2H5OH-H2O <SEP> 65 <SEP> :65:4
<tb> Fraktion <SEP> 1 <SEP> 210 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Fraktion <SEP> 2 <SEP> 50 <SEP> ml
<tb> Fraktion <SEP> 3 <SEP> 250 <SEP> ml
<tb> Ausbeute <SEP> (Fraktion <SEP> 3) <SEP> 326 <SEP> mg <SEP> Phosphatide, <SEP> d. <SEP> s. <SEP> 33% <SEP> 
<tb> 
 
 EMI3.3 
 ten. 



   Beispiel 5 : Testeslipide
1 g Gesamtlipidextrakt aus Kälbertests
40 g Kieselgel für die Trockensäulenchromatographie 
 EMI3.4 
 
<tb> 
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> I <SEP> CC14
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> n <SEP> CCl4 <SEP> - <SEP> CHgOH-H2O <SEP> 26 <SEP> : <SEP> 39 <SEP> : <SEP> 3
<tb> Fraktion <SEP> 1 <SEP> 263 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Fraktion <SEP> 2 <SEP> 42 <SEP> ml
<tb> Fraktion <SEP> 3 <SEP> 80 <SEP> ml
<tb> Ausbeute <SEP> (Fraktion <SEP> 3) <SEP> 406 <SEP> mg <SEP> Phosphatide, <SEP> d. <SEP> s. <SEP> 40% <SEP> 
<tb> 
 
Analysenwerte:Der Phosphatidyläthanolamingehalt steigt von 21 auf   60%.   Der Anteil der beiden Fettsäuren   C20 : 4 und C22 :   6 erhöht sich von 12 auf 14 bzw. von 6 auf 8%. 



   Beispiel 6 : Netzhautlipide
1 g Gesamtextrakt aus Schweinenetzhäuten
40 g Kieselgel für die Trockensäulenchromatographie 
 EMI3.5 
 
<tb> 
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> I <SEP> CH2 <SEP> Cl2
<tb> Lösungsmittel <SEP> für <SEP> Stufe <SEP> II <SEP> CH2 <SEP> Cl2-CH3OH-H2O <SEP> 25:25: <SEP> 2
<tb> Fraktion <SEP> 1 <SEP> 202 <SEP> ml
<tb> Fraktion <SEP> 2 <SEP> 50 <SEP> ml
<tb> Fraktion <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> 
<tb> Ausbeute <SEP> (Fraktion <SEP> 3) <SEP> 351 <SEP> mg <SEP> Phosphatide, <SEP> d. <SEP> s. <SEP> 35% <SEP> 
<tb> 
 Analysenwerte : Die ermittelten Werte entsprechen Beispiel 1. 

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung von Phosphatidkomplexen mit erhöhtem Phosphatidyläthanolamingehalt aus EMI3.6 Material, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Gesamtlipidextrakt mittels der Trok-kensäulenchromatographie in einem zweistufigen Verfahren eluiert, wobei in der ersten Stufe an einer, mit einem Losungsmittelgemisch für die zweite Stufe vorbehandelten Kieselgelsäule mittels eines mindestens di- <Desc/Clms Page number 4> chlorierten niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffes die Neutralfette und Glyceride abgetrennt werden, wonach in der zweiten Stufe mit einer solchen Menge eines Gemisches aus mindestens dichloriertem niederem aliphatischemKohlenwasserstoff, einwertigem niederaliphatischem Alkohol und Wasser behandelt wird,

dass Phosphatide mit einem gegenüber dem nativen Komplex erhöhten Gehalt an Phosphatidyläthanolamin isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass als mindestens dichlorierter Kohlenwasserstoff für die Behandlung in der ersten bzw. zweiten Trennstufe Dichlormethan, Chloroform oder Tetrachlormethan eingesetzt wird. EMI4.1 dadurch gekennzeichnet, dassalseinwertigerniederali-phatischer Alkohol Methanol oder Äthanol eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorbehandlung des Kieselgels durch Vermischen mit dem für die zweite Trennstufe dienenden Lösungsmittelgemisch in einem Verhältnis von etwa 0, 5 bis 2 ml Lösungsmittel auf 5 g Kieselgel und mindestens einstündige Stehenlassen vorgenommen wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Gesamtlipidextrakt in dem mindestens dichloriertenKohlenwasserstoff gelöst, mit einem kleinen Anteil von vorbehandeltem Kieselgel vermischt, vom Lösungsmittel befreit und als krümelartige Masse auf die vorbereitete Säule aufgebracht wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution mit dem mindestens dichlorierten Kohlenwasserstoff in der ersten Verfahrensstufe mit einer Geschwindigkeit von 2, 5 bis 10 ml/min vorgenommen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution mit dem Lösungsmittelgemisch in der zweiten Verfahrensstufe mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 3 ml/min vorgenommen wird.