WO2020106099A1 - 엑소좀 및 이의 다양한 용도 - Google Patents

엑소좀 및 이의 다양한 용도

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WO2020106099A1
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glucosamine
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exosomes
exosome
inflammatory
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최은욱
박병순
강석우
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    • G01N2400/38—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence, e.g. gluco- or galactomannans, Konjac gum, Locust bean gum or Guar gum
    • G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides

Definitions

  • the present invention relates to novel exosomes and various uses of the same.
  • Extracellular vesicles are also referred to as cell membrane-derived vesicles, ectomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like.
  • the exosome is a endoplasmic reticulum of several tens to hundreds of nanometers made of a double phospholipid membrane having the same structure as a cell membrane, and contains protein, mRNA, miRNA, and the like called exosome cargo.
  • Exosomal cargoes contain a wide range of signaling factors, which are known to be cell type specific and differently regulated according to the secretory cell environment.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior including target cell activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis. Is known.
  • IBD Inflammatory Bowel Disease
  • Ulcerative colitis is characterized by inflammation of the colonic mucosa from the rectum to the proximal part of the large intestine, mucus-stained bloody stools, diarrhea in several to dozens of times, and in severe cases with fever.
  • Crohn's disease can occur in the entire gastrointestinal tract from the oral cavity to the anus, usually due to abdominal pain, diarrhea, general weakness, weight loss or anal pain, and in severe cases, intestinal stenosis, perforation, abscess, fistula, etc. In some cases, repeated surgery is necessary.
  • Enteritis is inflammation of the mesentery. It is classified into viral, bacterial, fungal, parasitic, addictive and fodder depending on the cause, and categorical, hemorrhagic, purulent, necrotic, and diphtheriad according to pathological findings.
  • the symptoms of inflammatory bowel disease are not limited to the gastrointestinal tract, and may be a systemic disease. Due to damage to the intestinal tissue, it can cause severe food allergies and irritability, and can cause immune diseases, as well as patients with inflammatory bowel disease, such as joints, kidneys, mouth, eyes, mouth ulcers, and uveitis. It has related extra-intestinal manifestations that affect the organs.
  • therapeutic agents used to treat inflammatory bowel disease are related to symptoms rather than direct treatment, and in order to maintain these conditions as long as possible, mainly immunosuppressive agents, aminosalicylic acid preparations, adrenal cortical steroid drugs, etc. are used. Patients have reported various side effects such as nausea, heartburn, headache, dizziness, anemia and skin rash.
  • One object of the present invention is to provide a novel exosome having an anti-inflammatory effect.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for various uses using the exosomes described above.
  • an exosome containing glucosamine, a glucosamine derivative or a salt thereof it relates to an exosome containing glucosamine, a glucosamine derivative or a salt thereof.
  • exosome in the present invention refers to a small vesicle of the membrane structure secreted from various cells.
  • the diameter of the exosomes is approximately 30-100 nm, and refers to vesicles that are released into the extracellular environment by fusion of polycysts and plasma membranes.
  • the exosomes include glucosamine, glucosamine derivatives, or salts thereof.
  • the glucosamine (C6H13ON5) is a kind of hexamine, and is also called chitosamine as a representative natural amino sugar.
  • the derivative of the glucosamine is one in which the hydrogen of one or more hydroxy groups of the glucosamine is substituted with an acyl group or an alkyl group, for example, an acyl group having 2 to 18 carbon atoms or a straight or branched chain alkyl having 1 to 5 carbon atoms, Acetyl, propionyl, butyryl, pentanoyl, hexanoyl, heptanoyl, octanoyl, nonanoyl, decanoyl (decanoyl), undecanoyl, lauryl, tridecanoyl, myristyl, pentadecanoyl, palmitoyl, margaryl or stearyl It is an acyl group such as an aryl (stearyl) group, or methyl, ethyl, ethyl, propy
  • salt forms of the glucosamine or its derivatives in the present invention are also included within the scope of the present invention.
  • the salt is a salt with an organic or inorganic acid such as hydrochloride, bromate, sulfate, phosphate, acetate, citrate, fumarate, lactate, maleate, succinate, and tartrate of glucosamine or its derivatives, sodium salt, potassium salt Salts or ammonium salts with alkali metals, such as trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, etc. It may be a salt such as an organic base, but is not limited thereto.
  • the exosome may include glucosamine, a glucosamine derivative or a salt thereof, in the form of a glycoprotein, glycolipid, or polysaccharide containing the same.
  • the glucosamine, glucosamine derivative or a salt thereof is 0 to 20% by weight, 0 to 19% by weight, 0 to 18% by weight, 0 to 17% by weight, 0 to 16% by weight in the exosome , More than 0 15% by weight, more than 0 14% by weight, more than 0 13% by weight, more than 0 12% by weight, more than 0 11% by weight, less than 0 10% by weight, more than 0 9% by weight, 0 to 8% by weight, 0 to 7% by weight, 0 to 6% by weight, 0 to 5% by weight, 0.1 to 10% by weight, 0.1 to 9% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 7% by weight %, 0.1 to 6% by weight, or 0.1 to 5% by weight, but is not limited thereto.
  • the exosome is derived from a cell, wherein the cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • the prokaryotic cells may be bacterial cells, wherein the bacteria may be Gram negative or Gram positive bacteria.
  • the eukaryotic cells may be plant cells, animal cells, or fungal cells.
  • the exosome is, for example, Lactobacillus (Lactobacillus) genus, Leuconostoc genus, Pediococcus genus, Lactococcus genus, Streptococcus Genus, Aerococcus genus, Carnobacterium genus, Enterococcus genus, Oenococcus genus, Bifidobacterium genus, Sporolactobacillus genus, The genus Tetragenococcus, the genus Vagococcus, the genus Weisella, the genus Propionibacterium, the genus Pediococcus, the genus Staphylococcus, the phytoestococcus (Peptostrepococcus), Bacillus, Micrococcus, Listeria, Escherichia, Debaromyces, Candida, Saccharomyces Saccharomyces genus, Pichia genus,
  • the exosome is Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifido Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Enterococcus fascium ( Enterococcus Faecium, Enterococcus Faecalis, Lactobacillus acidopilus, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kefiranofaxiens, Lactobacillus kelacanos Lactobacillus kefiri, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus delbrukii), Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gas
  • the present invention relates to a cell culture or cell culture solution comprising the exosome of the present invention.
  • culture means a product obtained by culturing the cell in a known liquid medium or solid medium, and is a concept in which cells are included.
  • culture medium used in the present invention means a product obtained by culturing the cells in a known liquid medium or solid medium, and is a concept in which the cells are not included. That is, in the present invention, the culture medium may be a liquid product in which predetermined cells are cultured in a medium and then the cells are removed through filtration or centrifugation.
  • the present invention relates to a composition for promoting the proliferation of stem cells containing exosomes.
  • the exosome containing glucosamine of the present invention has a very excellent stem cell proliferation promoting ability, it is possible to promote the proliferation of stem cells in serum-free medium instead of animal serum.
  • stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into two or more different types of cells while having self-replicating ability as undifferentiated cells.
  • the stem cells of the present invention may be autologous or allogeneic stem cells, and may be from any type of animal, including human and non-human mammals, and the stem cells are not limited to those derived from adults or embryos. Does not.
  • the stem cells of the present invention include embryonic stem cells or adult stem cells, and are preferably adult stem cells.
  • the adult stem cells may be mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells, multipotent stem cells or amniotic epithelial cells, preferably mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, and placenta, but are not limited thereto.
  • the adult stem cell refers to an undifferentiated cell having a multipotency derived from a mammal, including a human, preferably a human adult cell, for example, bone marrow, blood, brain, skin, fat (ie , Adipose tissue or adipocytes), umbilical cord blood, umbilical cord Barton Jelly (Wharton's jelly) and may be derived from various adult cells.
  • a human preferably a human adult cell, for example, bone marrow, blood, brain, skin, fat (ie , Adipose tissue or adipocytes), umbilical cord blood, umbilical cord Barton Jelly (Wharton's jelly) and may be derived from various adult cells.
  • the "adult stem cell” includes mesenchymal stem cells derived from adult cells.
  • adipose-derived stem cells that do not require an invasive procedure can be preferably used because they can be obtained by using adipose tissue that is usually discarded during a commonly performed liposuction process.
  • Adipose-derived stem cells are disclosed in known methods (eg, International Patent Publications WO2000 / 53795 and WO2005 / 042730) from adipose tissue or adipocytes of mammals, including humans, preferably humans, It can be obtained through processes such as liposuction and sedimentation, enzyme treatment such as collagenase, and removal of suspended cells such as red blood cells by centrifugation.
  • the adipose tissue includes brown or white tissue derived from subcutaneous, retinal, visceral, mammary gonads or other adipose tissue sites, and can be readily obtained from conventional liposuction.
  • a culture medium composition for culturing stem cells comprising exosomes provided in the present invention.
  • the culture medium may be used without limitation as long as it is a medium well known to those skilled in the art.
  • the medium may be artificially synthesized and may be used as a commercially produced medium.
  • commercially produced media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), and MEF are examples, but are not limited thereto.
  • the present invention relates to an anti-inflammatory composition
  • an anti-inflammatory composition comprising the exosome provided as an active ingredient.
  • inflammation is a phenomenon that appears as a series of defense purposes to minimize the reaction and restore the damaged area to its original state when cells or tissues are damaged by any cause, nerve and blood vessels, lymphatic vessels, fluid response, It causes cellular reactions, resulting in pain, swelling, redness, fever, etc., causing dysfunction.
  • causes of inflammation include physical factors such as trauma, frostbite, burns, radioactivity, chemical factors such as acids, and immunological factors caused by antibody reactions, and also caused by blood vessel or hormone imbalance. do.
  • Cells damaged by external stimulation secrete various biological mediators such as pro-inflammatory cytokines and chemokine, interleukine, and interferon, resulting in vasodilation and increased permeability.
  • Antibodies, complements, plasma, and phagocytic cells flock to the site of inflammation. This phenomenon causes erythema.
  • anti-inflammatory composition refers to a drug that acts to reduce inflammation, eliminate biological reactions and symptoms in order to eliminate inflammation.
  • the exosome provided by the present invention inhibits the expression or activity of the inflammatory cytokine (cytokine), has an excellent anti-inflammatory effect, and is excellent in safety to the human body.
  • cytokine inflammatory cytokine
  • the anti-inflammatory composition can be used to prevent, ameliorate or treat inflammatory diseases.
  • inflammatory diseases are caused by various inflammatory cytokines.
  • IL-2 Interleukin-2
  • IL-1 ⁇ Interleukin-1beta
  • IL-6 Interleukin-6
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor-alpha
  • IL-2 or IL-10 is graft versus host disease (Graft- Versus-Host Disease) (Curr Pharm Des. 2004; 10 (11): 1195-205, Anti-cytokine therapy for the treatment of graft-versus-host disease. (REVIEW); Blood. 2002 Oct 1; 100 (7): 2650-8, Cytokine and chemokine profiles in autologous graft-versus-host disease (GVHD): interleukin 10 and interferon gamma may be critical mediators for the development of autologous GVHD] Related. From the above results, it can be seen that the inflammatory cytokines and the like are important therapeutic target molecules in the inflammatory disease, and if the secretion of the inflammatory cytokines can be reduced, the inflammatory disease can be treated.
  • GVHD autologous graft-versus-host disease
  • inflammatory disease may be defined as any condition specified by a local or systemic bio-defensive response to infection of an external infectious agent, such as external physical and chemical irritation or bacteria, fungi, viruses, and various allergens. These reactions activate various inflammatory mediators and enzymes associated with immune cells (eg iNOS, COX-2, etc.), secretion of inflammatory mediators (eg, NO, TNF- ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ , PGE2 secretion) , Accompanied by a series of complex physiological reactions such as invasion of body fluids, cell migration, tissue destruction, etc., manifested externally by symptoms such as erythema, pain, edema, fever, deterioration or loss of certain functions of the body.
  • the inflammatory disease may be acute, chronic, ulcerative, allergic or necrotic, so as long as any disease is included in the definition of such inflammatory disease, it is acute, chronic, ulcerative, allergic, or Necrotic or not.
  • the inflammatory diseases include atopy, psoriasis, dermatitis, allergies, arthritis, rhinitis, otitis media, pharyngitis, tonsillitis, cystitis, nephritis, pelvicitis, inflammatory bowel disease, ankylosing spondylitis, systemic lupus erythematosus (systemic lupus erythematodes, SLE) ), Atherosclerosis, asthma, arteriosclerosis, edema, rheumatoid arthritis, delayed allergy (type IV allergy), transplant rejection, graft versus host disease, autoimmune encephalomyelitis, multiple sclerosis, arthritis, cystic fibrosis, diabetic retinopathy, Rhinitis, ischemic-reperfusion injury, vascular restenosis, glomerulonephritis, gastrointestinal allergy, but is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory composition of the present invention may also be provided as a pharmaceutical composition, food composition or cosmetic composition.
  • the present invention may be a method of preventing or treating an inflammatory disease, comprising administering an exosome containing glucosamine, a glucosamine derivative or a salt thereof as an active ingredient to a subject having an inflammatory disease.
  • the present invention may be to practice the use of a pharmaceutical composition for anti-inflammatory.
  • the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating intestinal diseases comprising an exosome as an active ingredient.
  • the bowel disease is inflammatory bowel disease (inflammatory bowel disease; IBD), irritable bowel syndrome (IBS), traveler's diarrhea, constipation, acute diarrhea, enteritis, gastroenteritis, abdominal pain or abdominal distension, normal And diseases caused by impaired barrier function.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • IBS irritable bowel syndrome
  • IBD inflammatory bowel disease
  • Ulcerative colitis only affects the large intestine. Inflammation and ulcers in ulcerative colitis are limited to the innermost two of the four layers of the large intestine, the mucosal and submucosal layers. In Crohn's disease, inflammation and ulcers can extend through all layers of the barrier in both the small and large intestine.
  • IBS irritable bowel syndrome
  • IBS includes constipation, diarrhea or alternating IBS of diarrhea and constipation (also known as the abbreviations IBS-C, IBS-D and IBS-A).
  • the exosome provided by the present invention can effectively prevent, ameliorate, or treat the above intestinal diseases by inhibiting the expression of interleukin-2 (Interelukin-2, IL-2). It is already well known in the art to treat intestinal diseases when inhibiting the expression of interleukin-2 (Caprioli et al., J Clin Cell Immunol 2013, 4: 4).
  • composition for preventing, improving or treating intestinal diseases of the present invention may also be provided as a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the present invention may be a method of preventing or treating bowel disease, comprising administering to a subject having bowel disease an exosome containing glucosamine, glucosamine derivative or salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention may be to practice the use of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bowel disease.
  • the present invention relates to a food composition for improving bowel function or promoting bowel movement, comprising the exosome as an active ingredient.
  • the exosomes prevent inflammatory bowel disease (IBD), irritable bowel syndrome (IBS), traveler's diarrhea, constipation, acute diarrhea, enteritis, gastroenteritis, abdominal pain or bloating, It can be improved or treated to maintain the normal barrier function of the intestine, prevent, ameliorate or treat the damage, as well as promote normal bowel movements.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • IBS irritable bowel syndrome
  • traveler's diarrhea constipation
  • acute diarrhea enteritis
  • gastroenteritis gastroenteritis
  • abdominal pain or bloating It can be improved or treated to maintain the normal barrier function of the intestine, prevent, ameliorate or treat the damage, as well as promote normal bowel movements.
  • composition for improving skin comprising the exosome provided by the present invention as an active ingredient.
  • skin improvement refers to a treatment, amelioration, relief of skin damage caused by an intrinsic factor or an exogenous factor of skin, or an effect thereof, and more specifically, skin whitening. , Wrinkle improvement, elasticity enhancement, skin regeneration, skin moisturizing, anti-aging, skin irritation relief, acne prevention or improvement, and / or atopic prevention or improvement effect, but is not limited thereto.
  • the exosome containing glucosamine of the present invention has a very excellent stem cell proliferation promoting ability, when applied to the human body, it is possible to improve the skin condition by promoting or activating the proliferation of adult stem cells present in the skin.
  • Adult stem cells present in the skin are, for example, stem cells present in the base layer of the interfollicular epidermis between the hair follicles and hair follicles, stem cells present in the hair follicle, or fat-derived stems present in the subcutaneous fat layer. Cells.
  • composition for skin improvement of the present invention may also be provided as a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, or a food composition.
  • the exosome may be very useful as a composition for fillers for cosmetic or therapeutic purposes, and more specifically, a composition for filler injection, due to the skin condition improving activity.
  • Composition for filling or replacement, filling wrinkle, remodeling of the face or composition for increasing lip volume, rehydration of skin by mesotherapy ( rehydration) may be useful as a composition for use in treatment.
  • composition for preventing, improving or treating a wound comprising the exosome provided by the present invention as an active ingredient.
  • composition according to the present invention has an effect of promoting cell proliferation in keratinocytes, fibroblasts and skin stem cells, which play an important role in wound healing.
  • composition for preventing, improving or treating wounds of the present invention may also be provided as a pharmaceutical composition, a cosmetic composition, or a food composition.
  • the present invention may be a method for preventing or treating a wound, comprising administering an exosome containing glucosamine, a glucosamine derivative or a salt thereof as an active ingredient to a subject having a wound.
  • the present invention may be to practice the use of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of wounds.
  • composition for preventing, improving or treating hair loss comprising the exosome provided by the present invention as an active ingredient.
  • hair loss refers to a state in which hair is defective at a site where hair should normally be present, and generally means that the hair of the scalp falls out. Unlike virgin hair, which has no color and thin hair, it can cause cosmetic problems when it is missing.
  • the hair loss can be clinically divided into two types of scar formation and not, and the hair loss (scarring) in which the scar is formed does not regenerate the hair while the hair follicle is destroyed, but the scar is not formed. Hair loss (non-scarring) causes the hair follicles to retain, so the hair regenerates after the symptoms disappear.
  • the alopecia is alopecia areata, alopecia totalis, alopecia universalis, androgenetic alopecia, telogen effluvium, anagen effluvium, or It may be chemotherapy-induced alopecia, but is not limited thereto.
  • the exosome containing glucosamine of the present invention can significantly promote the proliferation of dermal papilla cells (DPC) and increase the expression level of hair growth or hair growth-related markers to effectively prevent, improve or treat hair loss.
  • DPC dermal papilla cells
  • composition for preventing, improving or treating hair loss of the present invention may also be provided as a pharmaceutical composition, a cosmetic composition, or a food composition.
  • the present invention may be a method for preventing or treating hair loss, comprising administering exosomes containing glucosamine, a glucosamine derivative, or a salt thereof as an active ingredient to a subject having hair loss.
  • the present invention may be to practice the use of a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss.
  • prevention may include, without limitation, any action that blocks or suppresses or delays the symptoms of various diseases using the composition of the present invention.
  • treatment may include without limitation any symptoms that improve or benefit symptoms of various diseases using the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that it is in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be characterized for humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these, but may be used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions, respectively, according to a conventional method.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavoring agents, etc. when administered orally, and in the case of injections, buffers, preservatives, painless Agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, when administered orally, tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc. may be prepared, and in the case of injection, unit dosage ampoules or multiple dosages may be prepared. have.
  • Others can be formulated as solutions, suspensions, tablets, capsules, and sustained release preparations.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives, etc. may be further included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited to these, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical , Sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intra-articular, intra-synovial, intrasternal, epidural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, diet, administration time, route of administration, rate of discharge, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound used. It may vary, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, weight, disease severity, dosage form, administration route and duration, but can be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg / day It can be administered in kg or 0.001 to 50 mg / kg. The administration may be administered once a day, or may be divided into several times. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • the cosmetic composition in the present invention includes lotion, nutrient lotion, nutrient essence, massage cream, beauty bath water additive, body lotion, body milk, bath oil, baby oil, baby powder, shower gel, shower cream, sunscreen lotion, sunscreen cream, Suntan cream, skin lotion, skin cream, sunscreen cosmetics, cleansing milk, hair loss agent ⁇ for cosmetics ⁇ , face and body lotion, face and body cream, skin whitening cream, hand lotion, hair lotion, cosmetic cream, jasmine oil, Bath soap, water soap, beauty soap, shampoo, hand cleaner (hand cleaner), medicinal soap (non-medical use), cream soap, facial wash, whole body cleaner, scalp cleaner, hair rinse, cosmetic soap, tooth whitening gel, toothpaste, etc. It can be produced in the form.
  • the composition of the present invention may further include a solvent or a suitable carrier, excipient or diluent, which is commonly used in the preparation of cosmetic compositions.
  • the type of the solvent that can be further added to the cosmetic composition of the present invention is not particularly limited, for example, water, saline, DMSO, or a combination thereof can be used, and as carrier, excipient or diluent, purified water, oil, wax , Fatty acids, fatty acid alcohols, fatty acid esters, surfactants, humectants, thickeners, antioxidants, viscosity stabilizers, chelating agents, buffers, lower alcohols, and the like.
  • whitening agents, moisturizers, vitamins, sunscreens, perfumes, dyes, antibiotics, antibacterial agents, and antifungal agents may be included as necessary.
  • Hydrogenated vegetable oil, castor oil, cottonseed oil, olive oil, palm oil, jojoba oil, avocado oil may be used as the oil, and waxes include beeswax, mellow, carnauba, candelilla, montan, ceresin, liquid paraffin, and lanolin. Can be used.
  • fatty acid stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, and oleic acid
  • fatty acid alcohol cetyl alcohol, octyl dodecanol, oleyl alcohol, panthenol, lanolin alcohol, stearyl alcohol, hexadecanol
  • fatty acid ester isopropyl myristate, isopropyl palmitate, and butyl stearate can be used.
  • surfactant cationic surfactants, anionic surfactants and nonionic surfactants known in the art can be used, and surfactants derived from natural products are preferred, if possible.
  • it may include a hygroscopic agent, a thickener, an antioxidant, etc., which are widely known in the cosmetic field, and their types and amounts are as known in the art.
  • the food composition of the present invention may be prepared in the form of various foods, for example, beverages, gum, tea, vitamin complexes, powders, granules, tablets, capsules, cookies, rice cakes, breads, and the like. Since the food composition of the present invention is composed of plant extracts having little toxicity and side effects, it can be safely used even for a long period of time for prevention purposes.
  • the amount may be added at a rate of 0.1 to 50% of the total weight.
  • the food composition when the food composition is prepared in the form of a beverage, there are no particular limitations other than containing the food composition in an indicated ratio, and it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates, etc., as additional components, like a conventional beverage. That is, as natural carbohydrates, monosaccharides such as glucose, disaccharides such as fructose, sucrose, etc., and common sugars such as polysaccharides, dextrins, cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol are included. can do.
  • monosaccharides such as glucose
  • disaccharides such as fructose, sucrose, etc.
  • common sugars such as polysaccharides, dextrins, cyclodextrins
  • sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol
  • flavoring agent examples include natural flavoring agents (taumatine, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizine, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.).
  • compositions of the present invention include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, and protective colloidal thickeners , pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents
  • coloring agents such as, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, and protective colloidal thickeners , pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • ingredients can be used independently or in combination.
  • the proportion of these additives is not so critical, but is generally selected from 0.1 to about 50 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, a pharmaceutical composition for preventing or treating intestinal disease, a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss, or a pharmaceutical composition for preventing or treating wounds, but is not limited thereto. no.
  • the cosmetic composition may be for skin improvement, but is not limited thereto.
  • the cells may be prokaryotic or eukaryotic cells.
  • the prokaryotic cells may be bacterial cells, wherein the bacteria may be Gram negative or Gram positive bacteria.
  • the eukaryotic cells may be plant cells, animal cells, or fungal cells.
  • the cells are, for example, genus Lactobacillus, genus Leuconostoc, genus Pediococcus, genus Lactococcus, genus Streptococcus , Genus Aerococcus, genus Carnobacterium, genus Enterococcus, genus Oenococcus, genus Bifidobacterium, genus Sporolactobacillus, tetra Genus Tetragenococcus, Genus Vagococcus, Genus Weisella, Genus Propionibacterium, Genus Pediococcus, Staphylococcus, Staphylococcus, Peptostrococcus Genus Peptostrepococcus, genus Bacillus, genus Microrococcus, genus Listeria, genus Escherichia, genus Debaromyces, genus Candida, Saccharomyces (Saccharomyces) gen
  • the cells are Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Enterococcus fascium Faecium, Enterococcus Faecalis, Lactobacillus acidopilus, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kefiranofaxiens, Lactobacillus kefiranofaciens (Lactobacillus kefiri), Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus ), Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gas
  • the method for measuring the expression level of the glucosamine, glucosamine derivative or salt thereof is not particularly limited, for example, chromatography (eg, high performance liquid chromatography, thin layer chromatography (TLC)), mass spectrometry, hex It may be performed using a sosamin assay (hexosamine assay), but is not limited thereto.
  • glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof in the exosomes isolated as above are present, or the glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof are more than 0 to 20% by weight, more than 0 to 19% by weight, 0 to 18% by weight, 0 to 17% by weight, 0 to 16% by weight, 0 to 15% by weight, 0 to 14% by weight, 0 to 13% by weight, 0 to 12% by weight, 0 More than 11 wt% or less, more than 0 10 wt% or less, more than 0 9 wt% or less, more than 0 8 wt% or less, more than 0 7 wt% or less, more than 0 6 wt% or less, more than 0 5 wt% or less, 0.1 to When contained in an amount of 10% by weight, 0.1 to 9% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 7% by weight, 0.1 to 6% by
  • the inflammatory diseases include atopy, psoriasis, dermatitis, allergy, arthritis, rhinitis, otitis media, pharyngitis, tonsillitis, cystitis, nephritis, pelvicitis, inflammatory bowel disease, ankylosing spondylitis, systemic lupus erythematodes (SLE), Atherosclerosis, asthma, arteriosclerosis, edema, rheumatoid arthritis, delayed allergy (type IV allergy), transplant rejection, graft versus host disease, autoimmune encephalomyelitis, multiple sclerosis, arthritis, cystic fibrosis, diabetic retinopathy, rhinitis, Ischemic-reperfusion injury, vascular restenosis, glomerulonephritis, gastrointestinal allergy, etc. may be included, but is not limited thereto.
  • It relates to a screening method for the prevention or treatment of intestinal diseases, comprising the step of measuring the expression level of glucosamine, glucosamine derivative or a salt thereof in the exosome.
  • the method for measuring the expression level of the cell and the expression level of glucosamine, glucosamine derivative or salt thereof overlaps with that described in the screening method of the anti-inflammatory agent, and detailed description thereof will be omitted below.
  • glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof in the exosomes isolated as above are present, or the glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof are more than 0 to 20% by weight, more than 0 to 19% by weight, 0 to 18% by weight, 0 to 17% by weight, 0 to 16% by weight, 0 to 15% by weight, 0 to 14% by weight, 0 to 13% by weight, 0 to 12% by weight, 0 More than 11 wt% or less, more than 0 10 wt% or less, more than 0 9 wt% or less, more than 0 8 wt% or less, more than 0 7 wt% or less, more than 0 6 wt% or less, more than 0 5 wt% or less, 0.1 to When contained in an amount of 10% by weight, 0.1 to 9% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 7% by weight, 0.1 to 6% by
  • the bowel disease is inflammatory bowel disease (inflammatory bowel disease; IBD), irritable bowel syndrome (IBS), traveler's diarrhea, constipation, acute diarrhea, enteritis, gastroenteritis, abdominal pain or abdominal distension, normal And diseases caused by impaired barrier function.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • IBS irritable bowel syndrome
  • traveler's diarrhea, constipation, acute diarrhea, enteritis, gastroenteritis, abdominal pain or abdominal distension normal And diseases caused by impaired barrier function.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • IBS irritable bowel syndrome
  • the method for measuring the expression level of the cell and the expression level of glucosamine, glucosamine derivative or salt thereof overlaps with that described in the screening method of the anti-inflammatory agent, and detailed description thereof will be omitted below.
  • glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof in the exosomes isolated as above are present, or the glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof are more than 0 to 20% by weight, more than 0 to 19% by weight, 0 to 18% by weight, 0 to 17% by weight, 0 to 16% by weight, 0 to 15% by weight, 0 to 14% by weight, 0 to 13% by weight, 0 to 12% by weight, 0 More than 11 wt% or less, more than 0 10 wt% or less, more than 0 9 wt% or less, more than 0 8 wt% or less, more than 0 7 wt% or less, more than 0 6 wt% or less, more than 0 5 wt% or less, 0.1 to When included in an amount of 10% by weight, 0.1 to 9% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 7% by weight, 0.1 to 6% by
  • the method for measuring the expression level of the cell and the expression level of glucosamine, glucosamine derivative or salt thereof overlaps with that described in the screening method of the anti-inflammatory agent, and detailed description thereof will be omitted below.
  • glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof in the exosomes isolated as above are present, or the glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof are more than 0 to 20% by weight, more than 0 to 19% by weight, 0 to 18% by weight, 0 to 17% by weight, 0 to 16% by weight, 0 to 15% by weight, 0 to 14% by weight, 0 to 13% by weight, 0 to 12% by weight, 0 More than 11 wt% or less, more than 0 10 wt% or less, more than 0 9 wt% or less, more than 0 8 wt% or less, more than 0 7 wt% or less, more than 0 6 wt% or less, more than 0 5 wt% or less, 0.1 to When included in an amount of 10% by weight, 0.1 to 9% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 7% by weight, 0.1 to 6% by
  • (2) comprising the step of measuring the expression level of glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof in the exosomes, relates to a method of screening for the prevention or treatment of hair loss.
  • the method for measuring the expression level of the cell and the expression level of glucosamine, glucosamine derivative or salt thereof overlaps with that described in the screening method of the anti-inflammatory agent, and detailed description thereof will be omitted below.
  • glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof in the exosomes isolated as above are present, or the glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof are more than 0 to 20% by weight, more than 0 to 19% by weight, 0 to 18% by weight, 0 to 17% by weight, 0 to 16% by weight, 0 to 15% by weight, 0 to 14% by weight, 0 to 13% by weight, 0 to 12% by weight, 0 More than 11 wt% or less, more than 0 10 wt% or less, more than 0 9 wt% or less, more than 0 8 wt% or less, more than 0 7 wt% or less, more than 0 6 wt% or less, more than 0 5 wt% or less, 0.1 to When contained in an amount of 10% by weight, 0.1 to 9% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 7% by weight, 0.1 to 6% by
  • exosomes containing glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof provided in the present invention have excellent anti-inflammatory effects, and thus can effectively prevent, improve or treat various inflammatory diseases.
  • treatment of intestinal diseases, skin improvement, wound treatment or hair loss The therapeutic effect is also excellent.
  • IL-2 inflammatory cytokines
  • Figure 2 is treated with Jurkat cells in Experimental Example 2, the control medium of Lactobacillus kefirgranum, exosomes containing glucosamine separated from the control medium, or the control medium inflammatory after removing the exosomes from the control medium.
  • the results of measuring changes in the expression level of cytokines (IL-2) are shown graphically.
  • FIG. 3 is a graph showing the result of measuring the change in expression level of inflammatory cytokines (IL-2) compared to controls after treating exosomes containing glucosamine, liposomes containing glucosamine or glucosamine in Jurkat cells in Experimental Example 3 It is shown.
  • IL-2 inflammatory cytokines
  • 4A to 4D show cross-sectional photographs after H & E staining of colon tissues of mice after treating exosomes containing glucosamine in the colitis mouse model in Experimental Example 4.
  • Figure 5 shows the score evaluated by observing the length and appearance of the large intestine after treating exosomes containing glucosamine in the colitis mouse model in Experimental Example 4.
  • Figure 6 shows the results of evaluating the homeostasis of feces after treating exosomes containing glucosamine in the colitis mouse model in Experimental Example 4.
  • Figure 8 shows the results of measuring the change in body weight of mice after treating exosomes containing glucosamine in the colitis mouse model in Experimental Example 4.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the change in cell proliferation rate after treating exosomes containing glucosamine in skin fibroblasts (HDF) in Experimental Example 5 by concentration.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the change in cell proliferation rate after treating exosomes containing glucosamine in fat-derived stem cells (ASC) in Experimental Example 6 by concentration.
  • the present invention relates to exosomes comprising glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof.
  • MRS medium 10 g of Proteose peptone, 10 g of Beef extract, 5 g of
  • Staphylococcus aureus Listeria monocytogens and Escherichia coli are LB medium (Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 5g, Distilled water 1L, pH 6.8 ⁇ 7.2 ) And incubated at 30 ° C at 0 rpm.
  • the culture solution for each strain thus obtained was centrifuged at 4 ° C for 10 minutes at 300 g, the supernatant was centrifuged at 1,200 g at 4 ° C for 20 minutes, and then the supernatant was taken at 10,000 g for 4 minutes at 4 ° C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was taken and centrifuged at 110 ° C for 1 hour and 10 minutes at 110,000 g using an ultracentrifuge, and then the supernatant was removed to suspend the precipitate with PBS to obtain exosomes.
  • the content of glucosamine in the exosomes separated from each strain was measured by a hexosamine assay. Specifically, the content of hexamine was measured by the 3-methyl-2-benzothia-zolinone hydrazone hydrochloride (MBTH) method (Frederik et al., 2000). That is, 1M HCl solution is added to the cap tube containing 100 ⁇ l of the sample in an amount of 100 ⁇ l, heated for 2 hours in a Reacti-thermometer at 110 ° C., cooled, and 400 ⁇ l of 2.5% sodium nitrate ( sodium nitrite) was added and left at room temperature for 15 minutes.
  • MTH 3-methyl-2-benzothia-zolinone hydrazone hydrochloride
  • each exosome prepared in Example 1 was treated with an amount of 100 ⁇ l / well, cultured for 24 hours, and acted as a cause of inflammatory bowel disease
  • the expression level of IL-2, a cytokine related to the proliferation and differentiation of T cells was measured by ELISA, and the change in expression level of IL-2 compared to the untreated control was measured, and the results are shown in Table 2 and FIG. It is shown in 1.
  • a positive control P11
  • cyclosporin A which is used as a therapeutic agent for inflammatory bowel disease, was treated with the same amount as the exosome.
  • the exosome containing glucosamine according to the present invention can be used as an anti-inflammatory agent.
  • Experimental Example 1 In order to demonstrate whether the anti-inflammatory effect of Experimental Example 1 is an effect of exosomes containing glucosamine, a culture medium (P2-W) of Lactobacillus kefirgranum of Example 1 and the culture medium The exosomes (P2-V) containing glucosamine separated from the culture medium (P2-R) from which the exosomes were removed were treated to Jurkat cells in the same manner as in Experimental Example 1, and the expression level of IL-2 was increased. Measurements and the results are shown in Table 3 and FIG. 2 below.
  • the IL-2 expression level was significantly reduced when the exosomes containing glucosamine (P2-V) or the culture solution (P2-W) containing them were treated according to the present invention.
  • the degree of reduction of the expression level of IL-2 was more excellent than that of the culture medium.
  • the IL-2 expression reduction effect was insignificant when the culture solution (P2-R) from which the exosomes were removed was treated.
  • the exosome containing glucosamine according to the present invention can be used as an anti-inflammatory agent.
  • the exosome containing glucosamine according to the present invention can be used as an anti-inflammatory agent.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • a solution in which 2.5 g of a TNBS (2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) solution was mixed with 50% ethanol was injected into the large intestine through the anus using a 1 ml syringe with a round end. It was administered by ml each and held vertically for 30 seconds to cause inflammation.
  • 0.1 ml of physiological saline was orally administered to the normal group.
  • exosomes (P2) containing glucosamine obtained in Example 1 were administered orally at a dose of 600 ⁇ g / mari (30 mg / kg) once a day for 10 days from the next day, and the mice were carbon dioxide the day after sample administration was completed. After suffocation with euthanasia, the large intestine was removed from the cecum to the area immediately before the anus. However, as a positive control, prednisolone (P12), a treatment for colitis, was administered orally in an amount of 2 mg / kg.
  • FIGS. 4A to 4D After H & E staining of the extracted colon tissue, cross-sectional photographs are shown in FIGS. 4A to 4D, and the length and appearance of the colon were observed to score according to the criteria in Table 5 below (Hollenbach et al., 2005 criteria for colitis) The results are shown in Figure 5.
  • DAI disease activity index
  • the exosome containing glucosamine according to the present invention can be used as a therapeutic agent for bowel disease.
  • Adipocyte derived stem cells were cultured in DMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum and 1% penicillin / streptomycin at 37 ° C and 5% CO2 conditions, and the medium was cultured every 3 days. I changed it. After culturing the cells for 24 hours, the cells were treated under the conditions shown in Table 10, and further cultured for 24 hours. After removing the treated material from each cell and dispensing the CCK-8 solution, the cells were incubated for 2 hours at 37 ° C in a CO2 incubator, and absorbance was measured at 450 nm, and the results are shown in Tables 11 and 11 below.
  • fat-derived stem cells when treated with exosomes according to the present invention significantly increased cell proliferation rate in a concentration-dependent manner, and the degree of increase was treated with fetal bovine serum (FBS). It was confirmed that it was about the same level as the one.
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells After dispensing serum media with 10,000 cells / well of papillary cells (Dermal papilla cells, DPC) in a 96-well microplate, the cells were incubated overnight at 37 ° C in a CO2 incubator. After incubation, the papillary cells were treated as shown in Table 12 below, and further cultured for 24 hours. After removing the treated material to each cell and dispensing the CCK-8 solution, the cells were incubated for 2 hours in a CO2 incubator at 37 ° C, and absorbance was measured at 450 nm, and the results are shown in Table 13 below.
  • the exosome containing glucosamine according to the present invention can be used as a treatment for hair loss.
  • the present invention relates to novel exosomes and various uses of the same.

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Abstract

본 발명은 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 신규한 엑소좀에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 엑소좀은 항염증 효과가 뛰어나 다양한 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있고, 그 외에도 장 질환의 치료, 피부 개선, 상처 치료 또는 탈모 치료 효과가 뛰어나다.

Description

엑소좀 및 이의 다양한 용도
본 발명은 신규한 엑소좀과 이를 이용한 다양한 용도에 관한 것이다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)"라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
염증성 장 질환(IBD; Inflammatory Bowel Disease)이란 장관 내 비정상적인 만성 염증이 호전과 재발을 반복하는 질환으로 흔히 궤양성 대장염과 크론병이 대표적이다. 아직까지 염증성 장 질환의 명확한 발병기전은 밝혀져 있지 않지만, 유전적, 면역학적 이상 및 스트레스나 약물 등과 같은 환경적 요인 등이 관련 있을 것으로 알려져 있다.
궤양성 대장염(ulcerative colitis)은 직장에서 대장의 근위부로 이어지는 대장 점막의 염증을 특징으로 하며 점액이 섞인 혈변이 나오고, 설사가 수회에서 수십 회에 이르는 경우도 있으며 심한 경우에는 발열을 동반하기도 한다.
크론병(Crohn's disease)은 구강에서 항문까지 위장관 전체에서 발생할 수 있으며 대개 복통, 설사, 전신 무력감, 체중 감소나 항문 통증, 심한 경우에는 장관 협착, 천공, 농양, 누공 등으로 인해 삶의 질이 저하되고 경우에 따라서 반복적인 수술이 필요하다.
장염(enteritis)은 장점막의 염증. 원인에 따라 바이러스성, 세균성, 진균성, 기생충성, 중독성 및 사료성 등으로 구분되며, 병리학적 소견에 따라 카탈성, 출혈성, 화농성, 괴사성 및 디프테리아성 등으로 구분된다.
또한, 염증성 장 질환의 증상은 위장관에 한정되지 않고, 전신 질환이 될 수 있다. 장 조직의 손상으로 인하여, 심각한 식품 알레르기 및 과민을 일으킬 수 있으며, 면역 질환을 발생시킬 수 있을 뿐 아니라, 염증성 장 질환을 앓고 있는 환자는 관절, 신장, 입, 눈, 구강 궤양 및 포도막염과 같은 여러 장기에 영향을 미치는 관련 장외증상(Extra-intestinal manifestations)을 가지고 있다.
현재 염증성 장 질환을 치료하기 위해 사용되는 치료제는 직접적인 치료보다 증상을 관해함으로써, 이러한 상태를 가능한 한 장기간 유지하기 위하여, 주로 면역 억제제, 아미노살리실산 제제, 부신피질 스테로이드제 등이 사용되고 있으며, 이에 따른 일부의 환자에서 구역질, 속쓰림, 두통, 어지러움, 빈혈 및 피부발진 등의 다양한 부작용이 보고되고 있다.
이에, 상기와 같은 문제를 해소하고자, 새로운 염증성 장 질환 치료제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나(한국등록특허 10-1145751) 아직 미비한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 항염증 효과가 있는 신규 엑소좀을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 엑소좀을 이용한 다양한 용도의 조성물을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다.
본 발명에서 상기 엑소좀은 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함한다.
본 발명에서 상기 글루코사민(C6H13ON5)은 헥소사민의 일종이며, 대표적인 천연 아미노당으로 키토사민이라고도 한다.
본 발명에서 글루코사민의 유도체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 글루코사민의 유도체란 상기 글루코사민의 하나 이상의 하이드록시기의 수소가 아실(acyl)기 또는 알킬기로 치환된 것으로, 예를 들면 탄소수가 2 내지 18인 아실기 또는 1 내지 5인 직쇄 또는 측쇄 알킬로서, 아세틸(acetyl), 프로피오닐(propionyl), 부티릴(butyryl), 펜타노일(pentanoyl), 헥사노일(hexanoyl), 헵타노일(heptanoyl), 옥타노일(octanoyl), 노나노일(nonanoyl), 데카노일(decanoyl), 운데카노일(undecanoyl), 라우릴(lauryl), 트리데카노일(tridecanoyl), 미리스틸(myristyl), 펜타데카노일(pentadecanoyl), 팔미토일(palmitoyl), 마가릴(margaryl) 또는 스테아릴(stearyl)기 등의 아실기이거나, 또는 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 프로필(propyl), 부틸(butyl), 펜틸(pentyl), 이소프로필(isopropyl), 이소부틸(isobutyl) 또는 세크부틸(secbutyl) 기 등의 알킬기로 치환된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 글루코사민 또는 그 유도체의 염 형태 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 염이란 글루코사민 또는 그 유도체의 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 아세트산염, 시트르산염, 푸마르산염, 락트산염, 말레산염, 숙신산염, 타르타르산염 등의 유기 또는 무기산과의 염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속과의 염 또는 암모늄염, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에타올아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실아민 등의 유기 염기 등의 염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 엑소좀은 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을, 이를 포함하는 당단백질, 당지질 또는 다당류의 형태로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염은 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 엑소좀은 세포로부터 유래된 것으로, 이때 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명에서 상기 원핵 세포는 박테리아 세포일 수 있고, 이때 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 진핵 세포는 식물 세포, 동물 세포, 또는 곰팡이 세포일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 엑소좀은 예를 들면, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 에어로코커스(Aerococcus) 속, 카르노박테리움(Carnobacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 오에노코커스(Oenococcus) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속, 테트라제노코커스(Tetragenococcus) 속, 바고코커스(Vagococcus) 속, 바이셀라(Weisella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 펩토스트레포코커스(Peptostrepococcus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 미크로코커스(Micrococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 데바로마이세스(Debaromyces) 속, 칸디다(Candida) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속, 뮤코(Mucor) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속 및 멜리소코커스(Melissococcus) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 엑소좀은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인팬티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 애니몰리스(Bifidobacterium animalis), 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus Faecium), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus Faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidopilus), 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum), 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키이(Lactobacillus delbrukii), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파르시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 김치(Lactobacillus kimchi), 락토바실러스 컨푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 스트렙토코쿠스 패시움(Streptococcus faecium), 스트렙토코쿠스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 아가락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 바이셀라 컨푸사(Weissella confusa), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 바이셀라 김치(Weissella kimchii), 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 바이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 할로필러스(Pediococcus halophilus), 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus), 스타필로코커스 자일로서스(Staphylococcus xylosus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 테트라제노코커스 할로필러스(Tetragenococcus halophilus), 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) 및 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 엑소좀을 포함하는 세포 배양물 또는 세포 배양액에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양물"이란 상기 세포를 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 세포가 포함되는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양액"이란 상기 세포를 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 상기 세포가 포함되지 않는 개념이다. 즉, 본 발명에서 배양액은 소정의 세포를 배지에서 배양시킨 후 여과 또는 원심분리 등을 통해 균체를 제거한 액상의 산물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 포함하는 줄기세포의 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 매우 우수한 줄기세포 증식 촉진능을 갖기 때문에, 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 용어, "줄기세포(stem cell)"란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.
본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.
상기 성체 줄기세포로서, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있어, 침습적 시술이 필요 없는 지방 유래 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 상기 지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 조직을 포함하며, 통상의 지방흡입술로부터 손쉽게 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 포함하는 줄기세포의 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 배양용 배지는 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 배지라면 제한없이 사용될 수 있다. 상기 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), MEF을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "염증"은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화 하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어 목적으로 나타나는 현상으로, 신경 및 혈관, 림프관, 체액 반응, 세포 반응을 일으켜 결과적으로 통증, 부종, 발적, 발열 등을 일으켜 기능장애를 유발한다. 염증을 유발하는 원인으로 외상, 동상, 화상, 방사능 등에 의한 물리적 요인과 산 (acid)과 같은 화학물질에 의한 화학적 요인 및 항체 반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며, 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해서도 발생된다. 외부 자극으로 손상된 세포들은 염증 유발 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine) 류 및 케모카인 (chemokine), 인터루킨 (interleukine), 인터페론 (interferon) 등의 다양한 생물학적 매개 물질을 분비하여 혈관 확장이 일어나고 투과성이 높아짐에 따라 항체, 보체, 혈장(plasma), 식균 세포들이 염증 부위로 몰려들게 된다. 이러한 현상이 홍반의 원인이 된다.
본 발명에서 용어, "항염증용 조성물(항염증제)"란 염증을 소실시키기 위해 염증원의 제거, 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 약물을 의미한다.
본 발명에서 제공하는 엑소좀은 염증성 사이토카인(cytokine)의 발현 또는 활성을 억제하여 항염증 효과가 뛰어나며, 인체에 안전성이 우수하다.
본 발명에서 상기 항염증용 조성물은 염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.
일반적으로 염증성 질환 등은 다양한 염증성 사이토카인에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. IL-2 (Interleukin-2), IL-1β(Interleukin-1beta), IL-6, TNF-α (Tumor necrosis factor-alpha)는 골반염 [Clin Chem Lab Med. 2008;46(11):1609-1616, Significant elevation of a Th2 cytokine, interleukin-10, in pelvic inflammatory disease; Clin Chem Lab Med. 2008;46(7):997-1003, Plasma interleukin-1beta, -6, -8 and tumor necrosis factor-alpha as highly informative markers of pelvic inflammatory disease], IL-2 또는 IL-8 (Interleukin-8)은 건선 [Iranian J Publ Health, Vol. 36, No.2, 2007, pp.87-91, Th1/Th2 Cytokines in Psoriasis (REVIEW); Clin Exp Immunol. 1995 Feb;99(2):148-54, IL-8/IL-8 receptor expression in psoriasis and the response to systemic tacrolimus (FK506) therapy], IL-2 또는 IL-10은 이식편대 숙주 질환 (Graft-Versus-Host Disease) [Curr Pharm Des. 2004;10(11):1195-205, Anti-cytokine therapy for the treatment of graft-versus-host disease. (REVIEW); Blood. 2002 Oct 1;100(7):2650-8, Cytokine and chemokine profiles in autologous graft-versus-host disease (GVHD): interleukin 10 and interferon gamma may be critical mediators for the development of autologous GVHD] 등 염증성 질환과 밀접한 관련이 있다. 이상의 결과로 볼 때 상기 염증성 사이토카인 등은 염증성 질환에 있어서 중요한 치료적 표적 분자임을 알 수 있으며, 이와 같은 염증성 사이토카인의 분비를 감소시킬 수 있으면 상기 염증성 질환을 치료할 수 있다.
본 발명에서 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역 세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다.
구체적으로 본 발명에서 상기 염증성 질환에는 아토피, 건선, 피부염, 알레르기, 관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 방광염, 신장염, 골반염, 염증성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematodes, SLE), 죽상 동맥경화, 천식, 동맥경화, 부종, 류마티스 관절염, 지연성 알레르기 (IV형 알레르기), 이식거부, 이식편대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 관절염, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 비염, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 사구체신염, 위장관 알레르기 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항염증용 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로도 제공될 수 있다.
또한 본 발명은 염증성 질환을 가지는 대상에 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효성분으로 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법일 수 있다.
또한 본 발명은 항염증용 약학적 조성물의 용도롤 실시하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 장 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 여행자 설사, 변비, 급성 설사, 장염, 위장관염, 복통 또는 복부 팽만과 같은 장의 정상적인 장벽 기능 손상에 의해 야기되는 질환을 포함한다.
본 발명에서 용어, "염증성 장 질환(IBD)"은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염을 포함하며, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는 질환 군을 지칭한다. 궤양성 결장염은 단지 대장에만 영향을 미친다. 궤양성 결장염에서의 염증 및 궤양은 대장의 4개 층 중 가장 안쪽에 있는 2개의 층인 점막층 및 점막하층에 제한된다. 크론병에서 염증 및 궤양은 소장 및 대장 둘 다에서 장벽의 모든 층을 통해 확장할 수 있다.
본 발명에서 용어, "과민성 대장 증후군(IBS)"은 기질적 원인이 없이 장기간 반복되는 복부팽만감 등의 복부 불편감 및 복통과 더불어 설사, 변비 등의 배변 습관의 변화를 동반하는 만성 질환이며 그 증상이 정신적인 요인이나 스트레스를 유발하는 사회 환경에 의해서 악화되기도 한다. 우세하는 장 운동 장애 증상의 형태에 따라, IBS에는 변비, 설사 또는 설사와 변비의 교대형 IBS(약어 IBS-C, IBS-D 및 IBS-A 로 알려져 있기도 하다)이 포함된다.
본 발명에서 제공하는 엑소좀은 인터루킨-2(Interelukin-2, IL-2)의 발현을 억제시켜 상기한 장 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 인터루킨-2의 발현을 억제하는 경우 장 질환을 치료할 수 있는 것은 이미 당해 분야에서 널리 알려져 있다(Caprioli et al., J Clin Cell Immunol 2013, 4:4).
본 발명의 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물로도 제공될 수 있다.
또한 본 발명은 장 질환을 가지는 대상에 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효성분으로 투여하는 단계를 포함하는, 장 질환의 예방 또는 치료 방법일 수 있다.
또한 본 발명은 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 용도롤 실시하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 장 기능 개선 또는 배변 촉진용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 엑소좀은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 여행자 설사, 변비, 급성 설사, 장염, 위장관염, 복통 또는 복부 팽만 등을 예방, 개선 또는 치료하여 장의 정상적인 장벽 기능을 유지하거나, 그 손상을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라 정상적인 배변을 촉진할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "피부 개선"은 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미하는 것으로, 보다 상세하게는 피부 미백, 주름 개선, 탄력 증진, 피부 재생, 피부 보습, 노화 방지, 피부 자극 완화, 여드름 예방 또는 개선, 및/또는 아토피 예방 또는 개선 효과를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 매우 우수한 줄기세포 증식 촉진능을 갖기 때문에 이를 인체에 적용하는 경우 피부에 존재하는 성체 줄기세포의 증식을 촉진하거나 활성화시킴으로써 피부 상태를 개선시킬 수 있다. 피부에 존재하는 성체 줄기세포는 예를 들어, 모낭과 모낭사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다.
본 발명의 피부 개선용 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물로도 제공될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 상기 피부 상태 개선 활성으로 인해 미용 또는 치료적 목적의 필러용 조성물, 보다 상세하게는 필러 주사용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 구체적인 예시로서 생물학적 조직의 필링(filling) 또는 대체를 위한 조성물, 주름의 필링(filling wrinkle), 안면의 리모델링(remodeling of the face) 또는 입술 용적(lip volume)의 증가를 위한 조성물, 메조테라피(mesotherapy)에 의한 피부의 재수화(rehydration) 치료에 사용하기 위한 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 상처의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 하는 케라티노사이트, 섬유아세포와 피부 줄기세포에서 세포의 증식을 촉진하는 효과를 갖는다.
본 발명의 상처의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로도 제공될 수 있다.
또한 본 발명은 상처를 가지는 대상에 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효성분으로 투여하는 단계를 포함하는, 상처의 예방 또는 치료 방법일 수 있다.
또한 본 발명은 상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 용도롤 실시하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 탈모의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "탈모"는 정상적으로 모발이 존재해야 하는 부위에 모발이 결손된 상태를 의미하며, 일반적으로 두피의 성모가 빠지는 것을 의미한다. 성모는 색이 없고 굵기가 가는 연모와는 달리 결손 시 미용상의 문제를 일으킬 수 있다.
본 발명에서 상기 탈모는 임상적으로 흉터가 형성되는 것과 그렇지 않은 두 종류로 구분될 수 있으며, 흉터가 형성되는 탈모(반흔성)는 모낭이 파괴되므로 모발이 재생되지 않는 반면, 흉터가 형성되지 않는 탈모(비반흔성)는 모낭이 유지되므로 증상 부위가 사라진 후에 모발이 재생된다.
본 발명에서 상기 탈모는 원형 탈모(alopecia areata), 전두 탈모(alopecia totalis), 범발성 탈모(alopecia universalis), 남성형 탈모(androgenic alopecia), 휴지기 탈모(telogen effluvium), 성장기 탈모(anagen effluvium), 또는 화학치료-유발 탈모(chemotherapy-induced alopecia)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 모유두 세포(dermal papilla cells; DPC)의 증식을 현저히 촉진시키고, 발모 또는 육모 관련 마커의 발현 수준을 높여 탈모를 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 탈모의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로도 제공될 수 있다.
또한 본 발명은 탈모를 가지는 대상에 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효성분으로 투여하는 단계를 포함하는, 탈모의 예방 또는 치료 방법일 수 있다.
또한 본 발명은 탈모의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 용도롤 실시하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물을 이용하여 각종 질환의 증상을 차단하거나, 질환 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, "치료"는 본 발명의 조성물을 이용하여 각종 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용 목욕물 첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.
그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 엑소좀이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물 또는 화장료 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 약학적 조성물은 항염증용 약학적 조성물, 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 탈모의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 피부 개선용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항염증용 약학적 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포는 이때 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명에서 상기 원핵 세포는 박테리아 세포일 수 있고, 이때 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 진핵 세포는 식물 세포, 동물 세포, 또는 곰팡이 세포일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 세포는 예를 들면, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 에어로코커스(Aerococcus) 속, 카르노박테리움(Carnobacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 오에노코커스(Oenococcus) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속, 테트라제노코커스(Tetragenococcus) 속, 바고코커스(Vagococcus) 속, 바이셀라(Weisella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 펩토스트레포코커스(Peptostrepococcus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 미크로코커스(Micrococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 데바로마이세스(Debaromyces) 속, 칸디다(Candida) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속, 뮤코(Mucor) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속 및 멜리소코커스(Melissococcus) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 세포는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인팬티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 애니몰리스(Bifidobacterium animalis), 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus Faecium), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus Faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidopilus), 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum), 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키이(Lactobacillus delbrukii), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파르시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 김치(Lactobacillus kimchi), 락토바실러스 컨푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 스트렙토코쿠스 패시움(Streptococcus faecium), 스트렙토코쿠스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 아가락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 바이셀라 컨푸사(Weissella confusa), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 바이셀라 김치(Weissella kimchii), 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 바이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 할로필러스(Pediococcus halophilus), 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus), 스타필로코커스 자일로서스(Staphylococcus xylosus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 테트라제노코커스 할로필러스(Tetragenococcus halophilus), 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) 및 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면, 크로마토그래피(예, 고성능 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피(TLC) 등), 질량 분석기, 헥소사민 분석(hexosamine assay) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 항염증제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환에는 아토피, 건선, 피부염, 알레르기, 관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 방광염, 신장염, 골반염, 염증성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematodes, SLE), 죽상 동맥경화, 천식, 동맥경화, 부종, 류마티스 관절염, 지연성 알레르기 (IV형 알레르기), 이식거부, 이식편대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 관절염, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 비염, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 사구체신염, 위장관 알레르기 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 장 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포의 정의와, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 항염증제의 스크리닝 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 장 질환의 예방 또는 치료제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 장 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 여행자 설사, 변비, 급성 설사, 장염, 위장관염, 복통 또는 복부 팽만과 같은 장의 정상적인 장벽 기능 손상에 의해 야기되는 질환을 포함한다. 여기서, 상기 염증성 장 질환(IBD)은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 또는 회장 낭염을 포함하고, 상기 과민성 대장 증후군(IBS)은 변비, 설사 또는 설사와 변비의 교대형 IBS(약어 IBS-C, IBS-D 및 IBS-A 로 알려져 있기도 하다)이 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 피부 개선제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포의 정의와, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 항염증제의 스크리닝 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 피부 개선제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 상처 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포의 정의와, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 항염증제의 스크리닝 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 상처 치료제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 탈모의 예방 도는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포의 정의와, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 항염증제의 스크리닝 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 탈모의 예방 또는 치료제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀은 항염증 효과가 뛰어나 다양한 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있고, 그 외에도 장 질환의 치료, 피부 개선, 상처 치료 또는 탈모 치료 효과 또한 우수하다.
도 1은 실험예 1에서 Jurkat 세포에 각 미생물 균주로부터 분리된 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 컨트롤 대비 염증성 사이토카인(IL-2)의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 2에서 Jurkat 세포에, 락토바실러스 케피르그라넘의 조정 배지, 상기 조정 배지로부터 분리된 글루코사민을 포함하는 엑소좀, 또는 상기 엑소좀이 제거된 조정 배지를 처리한 뒤 컨트롤 대비 염증성 사이토카인(IL-2)의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 3에서 Jurkat 세포에 글루코사민을 포함하는 엑소좀, 글루코사민을 포함하는 리포좀 또는 글루코사민을 처리한 뒤 컨트롤 대비 염증성 사이토카인(IL-2)의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4d는 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 마우스의 대장 조직을 H&E 염색한 후 그 단면 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 대장의 길이와 외관을 관찰하여 평가한 점수를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 대변의 항상성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 대변 내 출혈 정도를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 마우스의 몸무게 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 5에서 각질형성세포(HaCaT)에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 농도별로 처리한 뒤 세포 증식률의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 5에서 피부섬유아세포(HDF)에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 농도별로 처리한 뒤 세포 증식률의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 6에서 지방 유래 줄기세포(ASC)에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 농도별로 처리한 뒤 세포 증식률의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] 엑조솜 내 글루코사민 확인
1. 엑소좀의 분리
락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum), 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 테트라제노코커스 할로필러스(Tetragenococcus halophilus) 및 비피도박테리움 애니몰리스(Bifidobacterium animalis)는의 균주를 MRS 배지(프로테오스 펩톤(Proteose peptone) 10g, 육 추출물(Beef extract) 10g, 효모 추출물(Yeast extract) 5g, D-글루코스(D-glucose) 20g, 트윈 80(Tween 80) 1 ml, K2HPO4 2g, 소디움 아세테이트(Sodium acetate) 5g, 디암모늄 하이드로젠시트레이트(Diammonium hydrogencitrate) 2g, MgSO4·7H2O 0.2g, Mn SO4H2O 0.2g, 증류수(Distilled water) 1L, pH 6.2-6.5)에 접종한 뒤, 30℃에서 0rpm으로 정치 배양하였다. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens) 및 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)는 LB 배지(Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 5g, Distilled water 1L, pH 6.8~7.2)에 접종하고, 30℃에서 0rpm으로 정치 배양하였다.
이렇게 얻어진 각 균주별 배양액을 300g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 1,200g에서 4℃에서 20분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 취하여 10,000g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 초원심분리기를 이용해 110,000g로 4℃에서 1시간 10분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 제거하여 침전물(pellet)을 PBS로 현탁하여 엑소좀을 수득하였다.
2. 글루코사민(glucosamine) 함량 측정
상기와 같이 각 균주로부터 분리된 엑소좀 내 글루코사민의 함량을 헥소사민 분석법(Hexosamine assay)으로 측정하였다. 구체적으로는, 헥소사민의 함량은 3-메틸-2-벤조티아-졸리논 하이드라존 하이드로클로라이드(MBTH) 법으로 측정하였다(Frederik et al., 2000). 즉 100 ㎕의 상기 시료를 포함하는 캡 튜브(cap tube)에 1M HCl 용액을 100 ㎕의 양으로 첨가하여 110℃의 Reacti-thermometer에서 2시간 가열 후 냉각하고, 400 ㎕의 2.5% 소디움 니트레이트(sodium nitrite)를 첨가한 후 실온에서 15분 방치하였다. 4M 암모늄 설파믹산(ammonium sulfamate) 200 ㎕를 혼합 용액에 가하고 실온에서 5분 동안 방치한 다음 0.25% MBTH 200 ㎕를 가하고 37℃의 수조(water bath)에서 30분 동안 항온처리 하였다. 1.0% 염화제2철(ferric chloride) 200 ㎕를 가하고 37℃의 수조에서 5분 동안 항온한 후 냉각하여 650 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 헥소사민의 함량은 D-글루코사민으로 작성한 표준곡선에 따라 구하였고, 각 엑소좀 내 글루코사민의 함량 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
구분 글루코사민 함량(중량%)
P1 컨트롤(Control) -
P2 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum) 2.61
P3 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 2.50
P4 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 2.76
P5 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 1.85
P6 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens) 0.75
P7 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 실질적 미검출
P8 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 실질적 미검출
P9 테트라제노코커스 할로필러스(Tetragenococcus halophilus) 실질적 미검출
P10 비피도박테리움 애니몰리스(Bifidobacterium animalis) 2.74
P11 사이클로스포린 A(Cyclosporin A) -
표 1에서 보는 바와 같이, P2 내지 P6 및 P10의 엑소좀에서는 글루코사민이 존재하는 것으로 측정되었지만, P7 내지 P9의 엑소좀에서는 글루코사민이 실질적으로 검출되지 않았다.
[실험예 1] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 항염증 효과 확인(1)
Jurkat 세포를 96웰 플레이트의 각 웰당 4x104 세포/웰로 접종한 뒤, 상기 실시예 1에서 준비한 각 엑소좀을 100μl/웰의 양으로 처리하고, 24시간 동안 배양한 뒤, 염증성 장 질환의 원인으로 작용하는 T 세포의 증식 및 분화와 관계하는 사이토카인인 IL-2의 발현 수준을 ELISA로 측정한 뒤, 무처리한 컨트롤 대비 IL-2의 발현 수준의 변화를 측정하여 그 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다. 단, 양성 대조군(P11)으로는 염증성 장 질환의 치료제로 사용되고 있는 사이클로스포린 A(Cyclosporin A)를 상기 엑소좀과 동일한 양으로 처리하였다.
구분 IL-2 (%)
P1 100
P2 48
P3 61
P4 57
P5 50
P6 67
P7 106
P8 106
P9 98
P10 48
P11 71
상기 표 2 및 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따라 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2~P6 및 P10)을 처리한 경우 IL-2의 발현 수준이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 염증성 장 질환의 치료제로 사용되는 사이클로스포린 A를 처리한 경우보다도 우수한 결과를 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 항염증제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 2] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 항염증 효과 확인(2)
상기 실험예 1의 항염증 효과가 글루코사민을 포함하는 엑소좀만의 효과인지를 입증하기 위하여, 상기 실시예 1의 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)의 배양액(P2-W)과, 상기 배양액으로부터 분리된 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2-V)과, 상기 엑소좀이 제거된 배양액(P2-R)을 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 Jurkat 세포에 처리한 뒤 IL-2의 발현 수준을 측정하여 그 결과를 하기 표 3 및 도 2에 나타내었다.
구분 IL-2(%)
P1 컨트롤(Control) 100
P2-W 락토바실러스 케피르그라넘의 조정 배지 62
P2-V 락토바실러스 케피르그라넘 유래 글루코사민을 포함하는 엑소좀 53
P2-R 엑소좀이 제거된 락토바실러스 케피르그라넘 조정 배지 88
상기 표 3 및 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따라 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2-V) 또는 이를 포함하는 배양액(P2-W)을 처리한 경우 IL-2의 발현 수준이 현저히 감소하였고, 특히 상기 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2-V)의 경우 IL-2의 발현 수준의 감소 정도가 배양액 대비 더욱 뛰어난 것을 볼 수 있었다. 그런데, 상기 엑소좀을 제거한 배양액(P2-R)을 처리한 경우 IL-2 발현 감소 효과가 미미한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 항염증제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 3] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 항염증 효과 확인(3)
상기 실험예 1 및 2의 항염증 효과가 단순 글루코사민에 의한 것이 아니라, 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 효과인지를 입증하기 위하여, 상기 실시예 1의 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)의 배양액으로부터 분리된 글루코사민을 포함하는 엑소좀과, 글루코사민을 포함하는 리포좀(리포펙타민 2000) 및 글루코사민 자체를 상기 실험예 1과 같이 Jurkat 세포에 4㎍/ml의 용량으로 처리한 뒤 IL-2의 발현 수준을 측정하여 그 결과를 하기 표 4 및 도 3에 나타내었다.
구분 IL-2(%)
P1 컨트롤(Control) 100
P2 락토바실러스 케피르그라넘 유래 글루코사민을 포함하는 엑소좀 62
L1 글루코사민을 포함하는 리포좀 89
G1 글루코사민 94
상기 표 4 및 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따라 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 처리한 경우 IL-2의 발현 수준이 현저히 감소하였지만, 글루코사민을 포함하는 리포좀(L1)이나 글루코사민(G1)을 직접 처리한 경우 IL-2 발현 감소 효과가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 항염증제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 4] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 장 질환 치료 효과 확인
BALB/c 마우스에 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 대장염을 유발하였다. 구체적으로 마우스를 에테르로 마취한 후 TNBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구 투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 10일간 상기 실시예 1에서 얻어진 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 600㎍/마리(30mg/kg)의 용량으로 경구 투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 마우스를 이산화탄소로 질식시켜 안락사시킨 후 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다. 단, 양성 대조군으로는 대장염 치료제인 프레드니솔론(P12)을 2mg/kg의 양으로 경구 투여하였다.
(1) 조직 외관 평가
적출한 대장 조직을 H&E 염색한 후 그 단면 사진을 도 4a 내지 도 4d에 나타내었고, 상기 대장의 길이와 외관을 관찰하여 하기 표 5의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겨 그 결과를 도 5에 나타내었다.
외관 점수(Macroscopic Score) 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
도 4b에서 보는 바와 같이 대장염 마우스 모델의 대장에서는 심각한 상피 괴사, 출혈, 염증 세포의 침윤, 부종 및 궤양 등이 관찰되었으나, 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀(도 4c, P2)을 투여한 경우 프레드니솔론(도 4d, P12)을 투여한 경우와 동등 또는 그 이상의 수준으로 대장염의 증상들이 현저히 완화된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5에서 보는 바와 같이, 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 투여한 경우 대장 내 출혈이 감소하였고, 이러한 치료 효과는 양성 대조군으로 프레드니솔론을 2mg/kg의 많은 양으로 투여한 경우와 동등한 수준 인 것을 확인할 수 있었다.
(2) DAI 평가
DAI (disease activity index)는 급성 대장염을 유발하는 TNBS로 인한 증상을 점수화하는 방법으로, 본 발명에 따른 엑소좀을 제공하는 시기부터 시작하여 제공하는 동안 매일 같은 시각에 대변(stool)의 농도 및 색을 체크하여 측정하였다. 대변 항상성(consistency) 및 출혈 정도(bleeding)와 마우스의 몸무게를 측정하여 그 결과를 각각 도 6 내지 8에 나타내었다. 단, DAI의 평가 기준은 하기 표 6과 같다.
Stool consistency Stool bleeding
0 Formed 0 Normal color
2 Loose stool 2 fecal occult blood test positive
4 Diarrhea 4 Gross bleeding
도 6 내지 8에서 보는 바와 같이 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 투여한 경우, 양성 대조군으로 프레드니솔론(P12)을 투여한 경우와 동등 이상의 수준으로 DAI 값을 낮춰 배변 활동을 개선하는 것을 확인할 수 있었고, 마우스의 체중에는 큰 변화를 보이지 않았다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 장 질환의 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 5] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 피부세포 증식 촉진 효과
각질형성세포(human keratinocyte cell line, HaCaT) 및 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF) 3,000개를 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 접종한 뒤, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 엑소좀, EGF 또는 FBS를 처리하였다. 48 시간 후 세포 생존율의 변화를 측정하여 그 결과를 하기 표 8 및 9과, 도 9 및 10에 나타내었다.
구분 처리군 농도
P1 음성 대조군 -
P2(L) P2 엑소좀 1x10^8/ml
P2(M) P2 엑소좀 1x10^9/ml
P2(H) P2 엑소좀 1x10^10/ml
E1 EGF 500 ng/ml
구분 HaCaT 증식률(%)
P1 93.84
P2(L) 107.25
P2(M) 114.20
P2(H) 116.68
E1 160.38
구분 HDF 증식률(%)
P1 97.18
P2(L) 101.39
P2(M) 120.95
P2(H) 134.62
E1 143.04
상기 표 8 및 9와 도 9 및 10에서 보는 바와 같이, 각질형성세포(HaCaT) 및 피부섬유아세포(HDF)에 본 발명에 따른 엑소좀을 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 증식률이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 줄기세포의 증식 촉진 효과
인간 지방 유래 줄기세포(Adipocyte derived stem cells, ADC)를 10% 우태아혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배지(Invitrogen) 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였으며, 3일마다 배지를 갈아주었다. 세포를 24시간 배양한 후에 하기 표 10에 나타낸 조건으로 처리한 뒤 24시간 동안 추가로 배양하였다. 각 세포에 처리된 물질을 제거하고 CCK-8 용액을 분주하여 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 11 및 도 11에 나타내었다.
구분 처리군 농도
CONT 음성 대조군 -
P2(L) P2 엑소좀 1x10^(n-1)/ml
P2(M) P2 엑소좀 1x10^(n)/ml
P2(H) P2 엑소좀 1x10^(n+1)/ml
F1 FBS 배지 내 10중량%
구분 ASC 증식률(%)
P1 99.61
P2(L) 136.54
P2(M) 140.91
P2(H) 174.44
E1 186.10
상기 표 11과 도 11에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포(ASC) 본 발명에 따른 엑소좀을 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 증식률이 현저히 증가하였으며, 그 증가 정도가 소태아 혈청(FBS)를 처리한 것과 동등한 수준 정도인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 7] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 모유두 세포의 증식 촉진 효과
96 well의 마이크로플레이트에 모유두 세포(Dermal papilla cells, DPC) 10,000 cells/well와 혈청 배지를 분주한 후 37℃, CO2 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후 상기 모유두 세포에 하기 표 12에 나타낸로 처리한 뒤 24시간 동안 추가로 배양하였다. 각 세포에 처리된 물질을 제거하고 CCK-8 용액을 분주하여 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
구분 처리군 농도
P1 음성 대조군 -
P2(M) P2 엑소좀 1x10^(n)/ml
P2(H) P2 엑소좀 1x10^(n+1)/ml
M1 미녹시딜 10 μM
구분 DPC 증식률(%)
P1 97.98
P2(M) 108.86
P2(H) 126.75
M1 118.97
상기 표 13에서 보는 바와 같이, 모유두 세포(DPC)에 본 발명에 따른 엑소좀을 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 증식률이 현저히 증가하였으며, 그 증가 정도는, 발모 치료제로 흔히 사용되고 있는 미녹시딜을 처리한 경우보다 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 탈모 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 신규한 엑소좀과 이를 이용한 다양한 용도에 관한 것이다.

Claims (30)

  1. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 유래된 것인, 엑소좀.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 에어로코커스(Aerococcus) 속, 카르노박테리움(Carnobacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 오에노코커스(Oenococcus) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속, 테트라제노코커스(Tetragenococcus) 속, 바고코커스(Vagococcus) 속, 바이셀라(Weisella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 펩토스트레포코커스(Peptostrepococcus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 미크로코커스(Micrococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 데바로마이세스(Debaromyces) 속, 칸디다(Candida) 속, 피치아(Pichia) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속, 뮤코(Mucor) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속 및 멜리소코커스(Melissococcus) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것인, 엑소좀.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 글루코사민 유도체는 글루코사민의 하나 이상의 하이드록시기의 수소가 아실(acyl)기 또는 알킬기로 치환된 것인, 엑소좀.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염은 0 초과 20 중량% 이하의 양으로 포함되는, 엑소좀.
  6. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 포함하는 세포 배양물.
  7. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 포함하는 세포 배양액.
  8. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 포함하는 줄기세포의 증식 촉진용 조성물.
  9. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 포함하는 줄기세포의 배양용 배지 조성물.
  10. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 포함하는 항염증용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 것인, 항염증용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 아토피, 건선, 피부염, 알레르기, 관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 방광염, 신장염, 골반염, 염증성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematodes, SLE), 죽상 동맥경화, 천식, 동맥경화, 부종, 류마티스 관절염, 지연성 알레르기 (IV형 알레르기), 이식거부, 이식편대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 관절염, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 비염, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 사구체신염 또는 위장관 알레르기인, 항염증용 약학적 조성물.
  13. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 장 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 여행자 설사, 변비, 급성 설사, 장염, 위장관염, 복통 또는 복부 팽만인, 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 염증성 장 질환은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 또는 회장 낭염인, 약학적 조성물.
  16. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 장 기능 개선 또는 배변 촉진용 식품 조성물.
  17. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 탈모의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 피부 개선은 피부 미백, 주름 개선, 탄력 증진, 피부 재생, 피부 보습, 노화 방지, 피부 자극 완화, 여드름 예방 또는 개선, 또는 아토피 예방 또는 개선인, 피부 개선용 화장료 조성물.
  20. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    (2) 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물 또는 화장료 조성물의 스크리닝 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 항염증용 약학적 조성물, 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 탈모의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 피부개선용 화장료 조성물로 판단하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법. 엑소좀을 항염증제로 판단하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  23. 염증성 질환을 가지는 대상에 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효성분으로 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  24. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항염증용 약학적 조성물의 용도.
  25. 장 질환을 가지는 대상에 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효성분으로 투여하는 단계를 포함하는, 장 질환의 예방 또는 치료 방법.
  26. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 용도.
  27. 탈모를 가지는 대상에 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효성분으로 투여하는 단계를 포함하는, 탈모의 예방 또는 치료 방법.
  28. 탈모의 예방 또는 치료를 위한 제17항의 탈모의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 용도.
  29. 상처를 가지는 대상에 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효성분으로 투여하는 단계를 포함하는, 상처의 예방 또는 치료 방법.
  30. 상처의 예방 또는 치료를 위한 제20항의 약학적 조성물의 용도.
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