WO2019240323A1 - Dna 단편 혼합물 및 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Dna 단편 혼합물 및 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pain caused by inflammation, including a matrix metalloprotease production inhibitor and a DNA fragment mixture, which can solve the problem of generating a matrix metalloprotease (MMP), which is caused when the DNA fragment mixture is used to prevent and treat arthritis.
  • MMP matrix metalloprotease
  • Arthritis refers to a disease caused by inflammatory changes in the joints caused by various causes such as bacteria or trauma.
  • the incidence of arthritis is estimated to be about 30% of the population over 60 years old. It is known to be a disease.
  • Korea has been reported to have the highest incidence of arthritis, over 50 years of age, to overcome diabetes and hypertension.
  • arthritis can be largely divided into non-inflammatory arthritis and inflammatory arthritis, and osteoarthritis as non-inflammatory arthritis, and rheumatoid arthritis as inflammatory arthritis are representative.
  • Degenerative arthritis causes degeneration such as aging in chondrocytes constituting joints, which inhibits the synthesis of type II collagen and proteoglycan, which are joint substances in chondrocytes, and at the same time, IL- Inflammatory cytokines such as 1 ⁇ (interlekin-1 ⁇ ) and tumor necrosis factor, the synthesis and activity of the matrix metalloproteinase (MMP), which degrades the joint matrix, is increased in joint cells It is a disease caused by destruction.
  • IL- Inflammatory cytokines such as 1 ⁇ (interlekin-1 ⁇ ) and tumor necrosis factor
  • MMP matrix metalloproteinase
  • the purpose of treating arthritis is to reduce the pain and inflammation of joints or to inhibit the activity of MMPs to prevent the deformation of the joints, and more fundamentally to identify the intracellular mechanism of action that causes arthritis, and to control its mechanism. There is.
  • the treatment of degenerative arthritis currently used clinically may be performed using drug treatments (painkillers, steroids, nonsteroidal anti-inflammatory drugs, etc.) or cartilage protective agents (hyaluronic acid, glucosamine, chondroitin, etc.) or surgical treatment (arthroscopic surgery). , Proximal tibial osteotomy, joint replacement, total knee arthroplasty, etc.).
  • cartilage protection agent only serves to protect joints by nourishing chondrocytes or alleviating shock.
  • these drugs also have side effects such as weight gain, high blood pressure, and peptic ulcer.
  • Korean Patent Publication No. 10-2013-0044195 article for cartilage regeneration comprising a mixture of DNA fragments isolated from fish testes
  • Korean Patent Publication No. 10-2017-0100236 arthritis comprising a DNA fragment mixture Health functional foods for the prevention or improvement of "is used in the prevention and treatment of arthritis by using the proliferation effect of chondrocytes, repair ability of damaged chondrocytes, cartilage regeneration effect and arthritis improvement effect of DNA fragment mixture obtained from fish testes have.
  • an object of the present invention is to provide a composition for preventing and treating arthritis, which solves the problem of causing matrix metalloproteinase (MMP) production by a mixture of DNA fragments.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • composition for preventing and treating arthritis comprising a DNA fragment mixture and a matrix metalloprotease production inhibitor.
  • the matrix metalloprotease production inhibitor is preferably glucosamine or a pharmaceutically acceptable salt.
  • the matrix metalloprotease production inhibitor is preferably Alliin or a pharmaceutically acceptable salt.
  • the matrix metalloprotease production inhibitor is preferably sodium butyrate (SB).
  • the matrix metalloprotease production inhibitor is preferably chondroitin sulfate (Chondroitin sulfate (CS)).
  • the present invention can inhibit the production of matrix metalloprotease by the DNA fragment mixture to prevent arthritis, which can be effectively used for the proliferation effect of chondrocytes, repair ability of damaged chondrocytes, cartilage regeneration effect and arthritis improvement effect without side effects and A therapeutic composition is provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of the DNA fragment mixture on the expression of (A) MMP-3 and (B) MMP-13 in SW-1353 cells stimulated with 10ng / ml IL- ⁇ .
  • Figure 2 is a micrograph showing the migration change of SW-1353 cells by treatment of different DNA fragment mixture concentration.
  • the gap distance is 500 ⁇ m.
  • Figure 3 is a graph and micrograph showing the effect of the DNA fragment mixture on the survival rate of SW-1353 cells.
  • Figure 4 is a graph showing the effect of glucosamine on the expression of MMP-3 and MMP-13 in 10ng / ml of IL- ⁇ stimulated SW-1353 cells.
  • the concentration of the sample is A-B: 0 ⁇ g / ml, C-D: 10 ⁇ g / ml, E-F: 100 ⁇ g / ml, G-H: 1000 ⁇ g / ml.
  • N-Acetyl-D-glucosamine NAG
  • concentration of the sample is A-B: 0 ⁇ g / ml
  • C-D 10 ⁇ g / ml
  • E-F 100 ⁇ g / ml
  • G-H 1000 ⁇ g / ml.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of Alliin on the expression of MMP-3 and MMP-13 in SW-1353 cells stimulated with 10ng / ml IL- ⁇ .
  • the concentration of the sample is A-B: 0 ⁇ g / ml, C-D: 10 ⁇ g / ml, E-F: 100 ⁇ g / ml, G-H: 1000 ⁇ g / ml.
  • Figure 8 is a graph showing the effect of chondroitin sulfate (CS) on the expression of MMP-3 and MMP-13 in 10ng / ml IL- ⁇ stimulated SW-1353 cells.
  • Samples are A-B: 0 ⁇ g / ml, C-D: 10 ⁇ g / ml, E-F: 100 ⁇ g / ml and G-H: 1000 ⁇ g / ml.
  • FIG. 9 is a photograph showing a 3D dynamic culture model of SW-1353 cells.
  • 10 is a photograph showing the morphology of SW-1353 cells in the 3D dynamic culture model. Scale bar unit is 500 ⁇ m.
  • FIG. 11 is a photograph showing the morphology of SW-1353 cells in different gel-cell matrices during 3D culture. Scale bar unit is 200 ⁇ m, Green (calcein AM): Live, Red (EthD-1): Dead, Blue (Hoechst): Nuclei.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of the DNA fragment mixture on the expression of (A) MMP-3 and (B) MMP-13 in IL- ⁇ stimulated SW-1353 cells in 3D 10% serum- and serum-free to be.
  • Figure 13 is a graph showing the effect of the DNA fragment mixture on the expression of (A) MMP-3 and (B) MMP-13 in IL- ⁇ stimulated SW-1353 cells in serum-free state.
  • FIG. 14 is a graph showing the effect of glucosamine on the expression of MMP-3 and MMP-13 in 10ng / ml IL- ⁇ stimulated 3D SW-1353 cells.
  • the concentration of the sample is A-B: 0 ⁇ g / ml, C-D: 10 ⁇ g / ml, E-F: 100 ⁇ g / ml, G-H: 1000 ⁇ g / ml.
  • N-Acetyl-D-glucosamine NAG
  • MMP-3 and MMP-13 10ng / ml IL- ⁇ stimulated 3D SW-1353 cells.
  • the concentration of the sample is A-B: 0 ⁇ g / ml
  • C-D 10 ⁇ g / ml
  • E-F 100 ⁇ g / ml
  • G-H 1000 ⁇ g / ml.
  • 16 is a graph showing the effect of Alliin on the expression of MMP-3 and MMP-13 in 10ng / ml IL- ⁇ stimulated 3D SW-1353 cells.
  • the concentration of the sample is A-B: 0 ⁇ g / ml, C-D: 10 ⁇ g / ml, E-F: 100 ⁇ g / ml, G-H: 1000 ⁇ g / ml.
  • Figure 17 is a graph showing the effect of sodium butyrate (SB) on the expression of MMP-3 and MMP-13 in 10ng / ml of IL- ⁇ stimulated 3D SW-1353 cells.
  • the concentration of the sample is A-B: 0 ⁇ g / ml, C-D: 10 ⁇ g / ml, E-F: 100 ⁇ g / ml, G-H: 1000 ⁇ g / ml.
  • Figure 18 is a graph showing the effect of chondroitin sulfate (CS) on the expression of MMP-3 and MMP-13 in 10ng / ml of IL- ⁇ stimulated 3D SW-1353 cells.
  • the concentration of the sample is A-B: 0 ⁇ g / ml, C-D: 10 ⁇ g / ml, E-F: 100 ⁇ g / ml, G-H: 1000 ⁇ g / ml.
  • the present invention maximizes the safety and efficiency prediction of the composition for preventing and treating arthritis through a 3D dynamic culture model for culturing cells three-dimensionally, it may be possible to confirm a more accurate human response than the 2D culture method.
  • DNA fragment mixture also called PDRN (polydeoxyribonucleotides) according to the present invention is prepared from semen to testis, such as fish, specifically trout, salmon, etc. are present in the form of fragments of reduced molecular weight, essential components of the cell By injecting a mixture of these into the wound and the like, medicines for the purpose of treating and improving wounds, arthritis treatment and improvement according to the cartilage regeneration effect, cosmetics for the purpose of improving wrinkles associated with functional foods or cellular activity, There are various uses such as food additives and biochemical test materials.
  • the DNA fragment mixture is used for the prevention and treatment of arthritis, and its basic use is known.
  • the basic effects and mechanisms known in the present invention can be used as they are in the present invention.
  • 2013-0044195 Composition for cartilage regeneration comprising a mixture of DNA fragments isolated from fish testes
  • the molecular weight, viscosity, etc. of the DNA fragment mixture used in the present invention are not particularly limited, and the production method is not particularly limited, and for example, a rainbow trout (sea trout is referred to as sea trout). Powder of purified water and sodium chloride was crushed with a grinder, and then distilled water was added to the ground powder, sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as SDS) was added thereto, followed by reaction at 100-105 ° C. for 4-5 hours to obtain molecular weight. After cooling to room temperature, centrifugation at 15,000rpm removes testicular debris, and filtered. The filtrate is slowly added to ethanol to prepare a white DNA fragment mixture, which is dehydrated using ethanol to anhydrous ethanol, filtered, It can be dried and used to improve purity.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • DNA fragment mixture glucosamine, N-Acetyl-D-glucosamine (NAG), Alliin, Sodium butyrate (SB) and Chondroitin sulfate (CS) as inhibitors of matrix metalloprotease production
  • NAG N-Acetyl-D-glucosamine
  • SB Sodium butyrate
  • CS Chondroitin sulfate
  • Human chondrosarcoma cell line SW-1353 (HTB-94, ATCC, Mansassas, VA, USA) was incubated in Dulbecco Modified Eagle's medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% antibiotic-antifungal. .
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • 1% antibiotic-antifungal 1% antibiotic-antifungal.
  • Cell culture incubator was maintained at 37 °C, 5% CO 2 .
  • cells were seeded in culture flasks at 1.2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 and trypsinized when reaching 80-90% confluence. Cells were passaged 9 times and used for the experiment.
  • SW-1353 cells were grown on 3D collagen hydrogel with or without DNA fragment mixture (polydeoxyribonucleotides (PDRN), 450 kDa, sterilized, BR Pharm Co, Wonju, South Korea).
  • SW-1353 cells were obtained from 2D culture and the cell number in the culture was measured. The cells were then spin down and cooled.
  • ECM extracellular matrix
  • SW-1353 cells were mixed with glucosamine (GLN), N-Acetyl-D-glucosamine (NAG), Alliin, Sodium butyrate (SB) and Chondroitin sulfate (CS) for 10 hours and DNA fragments for 10 hours. It was treated at 1000 ⁇ g / ml and stimulated with IL- ⁇ at a concentration of 10 ng / ml for analysis of expression of MMP.
  • IL- ⁇ was dissolved in DMEM medium without serum and used at a final concentration of 10 ng / ml. Cells were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 . Cell culture supernatants were harvested, centrifuged and stored at ⁇ 80 ° C. until testing. The amounts of MMP-3 and MMP-13 in the culture supernatant were measured according to the manufacturer's protocol using commercially available enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
  • 3D cultured SW-1353 cells were stained with calcein AM, ethidium homodimer 1 (EthD-1), Hoechst at room temperature for 30 minutes. Cells were then rinsed with PBS and cells on PBS were measured using a confocal laser scanning microscope (ZEISS, LSM 710). Images were obtained for each color using the ZEN software.
  • SW-1353 cells (5x10 3 cells / well) were incubated for 24 hours in 96-well plates. The culture was replaced with a mixture of DNA fragments of various concentrations without the addition of serum. After 24 hours, 10 ⁇ l of CCK-8 was added to each well. After incubation for 2 hours, cell viability was measured at 450 nm with a microplate reader (CLARIOstar, BMG, USA).
  • SW-1353 cells were cultured in a culture-insert dish for 24 hours to form a monolayer. Culture-inserts were removed. Cells were rinsed twice with culture to remove remaining cell debris. Subsequently, the monolayer cells were cultured in cultures containing no serum or in serum containing no mixture of DNA fragments of varying concentrations. Cells in the control group were only cultured in culture. Migration of the cells was measured by observing the image under a microscope (EVOS fl, AMG).
  • control SW-1353 cells were cultured in a no serum containing a DNA fragment mixture at concentrations of 0, 10, 100, and 1000 ⁇ g / ml.
  • the experimental group was incubated with the addition of 10-ng / ml IL- ⁇ at the same conditions as the control group.
  • SW-1353 cells were treated for 2 days at concentrations of 0, 10, 100 and 1000 ⁇ g / ml, and then cell migration after 0h, 24h and 48h was observed under a microscope.
  • the group treated with the DNA fragment mixture at a concentration of 1000 ⁇ g / ml compared to the control group without the DNA fragment mixture significantly reduced the movement of chondroma.
  • the DNA fragment mixture showed strong antiproliferative activity according to the concentration of the DNA fragment mixture compared to the control group.
  • the DNA fragment mixture was confirmed to induce the production of MMP-3 and MMP-13, and additionally, glucosamine (GLN) was added together with the DNA fragment mixture to inhibit the production of MMP-3 and The production of MMP-13 was tested.
  • glucosamine GLN
  • SW-1353 cells were treated with DNA fragment mixtures of 0, 10, 100, 1000 ⁇ g / ml and glucosamine (GLN) at 0, 0.1, 1, 10 mM concentrations, and IL of 10 ng / ml concentrations. After co-administration with - ⁇ , expression of MMP-3 and MMP-13 proteins was observed compared to the control group which received no treatment.
  • N-Acetyl-D-glucosamine NAG
  • the DNA fragment mixture was confirmed to induce the production of MMP-3 and MMP-13, and thus additionally inhibits the production of N-Acetyl-D-glucosamine (NAG) together with the DNA fragment mixture.
  • NAG N-Acetyl-D-glucosamine
  • SW-1353 cells were treated with DNA fragment mixtures of 0, 10, 100, and 1000 ⁇ g / ml and Alliin at 0, 0.1, 1, and 10 mM concentrations, and 10 ng / ml concentration. After co-administration of IL- ⁇ , expression of MMP-3 and MMP-13 proteins was observed compared to the control group which received no treatment.
  • SW-1353 cells were treated with DNA fragment mixtures of 0, 10, 100, and 1000 ⁇ g / ml, and sodium butyrate (SB) at 0, 0.1, 1, and 10 mM concentrations, respectively, at a concentration of 10 ng / ml.
  • SB sodium butyrate
  • the DNA fragment mixture was confirmed to induce the production of MMP-3 and MMP-13, MMP-3 by adding chondroitin sulfate (CS) together with the DNA fragment mixture to further suppress the production And the production of MMP-13.
  • CS chondroitin sulfate
  • FIG. 10 shows images of cells cultured according to the concentration of DNA fragment mixture during 48 hours of 3D dynamic culture.
  • Each gel-cell matrix contained a mixture of DNA fragments with different concentrations of 0 (contol), 10, 100, and 1000 ⁇ g / ml in the 4 mg / ml collagen matrix. After gelation for 45 min, the images of 24h and 48h were measured and showed that SW-1353 was well seeded on the gel.
  • FIG. 11 shows cell viability in the 3D dynamic culture situation of FIG. 10.
  • Cell viability measurements in 3D cultures were treated with DNA fragment mixture ECM at concentrations of 0 (contol), 10, 100, 1000 ⁇ g / ml in the presence or deletion of IL- ⁇ to reveal the effect of DNA fragment mixture on SW-1353 cell viability. After 24 hours. There was no particular cytotoxic effect on SW-1353 at a concentration of 10-1000 ⁇ g / ml with the DNA fragment mixture alone compared to the control group without any treatment. No cytotoxic effect was also seen in other concentrations of DNA fragment mixture ECM in the presence of IL- ⁇ (FIG. 11).
  • MMP-1 and MMP-13 expression under 10% serum conditions as shown in Figure 12 was shown to be similar to the results of MMP expression under the DNA fragment mixture conditions of 100, 1000 ⁇ g / ml concentration. Therefore, high concentrations of DNA fragment mixtures were found to activate MMPs and exacerbate arthritis treatment.
  • the expression level of MMP-13 for the DNA fragment mixture increased with the concentration of the DNA fragment mixture. Therefore, it was confirmed that the DNA fragment mixture may induce the production of MMPs and worsen the treatment of arthritis.
  • N-Acetyl-D-glucosamine NAG
  • the DNA fragment mixture was confirmed to induce the production of MMP-3 and MMP-13, and thus additionally inhibits the production of N-Acetyl-D-glucosamine (NAG) together with the DNA fragment mixture.
  • NAG N-Acetyl-D-glucosamine
  • SW-1353 cells were treated with DNA fragment mixtures of 0, 10, 100, 1000 ⁇ g / ml and N-Acetyl-D-glucosamine (NAG) at 0, 0.1, 1, 10 mM concentrations, as shown in FIG. 15. After 10ng / ml of IL- ⁇ was administered together, the expression of MMP-3 and MMP-13 protein was observed in comparison with the control group which received no treatment.
  • NAG N-Acetyl-D-glucosamine
  • SW-1353 cells were treated with DNA fragment mixtures of 0, 10, 100, and 1000 ⁇ g / ml and Alliin at 0, 0.1, 1, and 10 mM concentrations, and 10 ng / ml concentration. After co-administration of IL- ⁇ , expression of MMP-3 and MMP-13 proteins was observed compared to the control group which received no treatment.
  • SW-1353 cells were treated with DNA fragment mixtures with concentrations of 0, 10, 100, and 1000 ⁇ g / ml and sodium butyrate (SB) at 0, 0.1, 1, and 10 mM concentrations, and 10 ng / ml concentrations.
  • SB sodium butyrate
  • SW-1353 cells were treated with DNA fragment mixtures with concentrations of 0, 10, 100 and 1000 ⁇ g / ml and chondroitin sulfate (CS) at 0, 0.1, 1 and 10 mM concentrations, and 10 ng / ml concentrations.
  • CS chondroitin sulfate
  • a 3D in vitro cartilage model was established for drug screen studies associated with degenerative arthritis or rheumatoid arthritis, confirming that the DNA fragment mixture (PDRN) as a 3D matrix plays an important role in the efficacy of osteoarthritis treatment.
  • PDRN DNA fragment mixture
  • PDRN DNA fragment mixture
  • PDRN DNA fragment mixture
  • SB Sodium butyrate
  • CS Chondroitin sulfate
  • inhibitors of the production of DNA fragment mixtures (PDRN) and MMP such as glucosamine or its pharmaceutically acceptable salts, N-Acetyl-D-glucosamine (NAG), Alliin, Sodium butyrate (SB) and Chondroitin
  • glucosamine or its pharmaceutically acceptable salts such as N-Acetyl-D-glucosamine (NAG), Alliin, Sodium butyrate (SB) and Chondroitin
  • CS sulfate

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Abstract

본 발명은 관절염 예방 및 치료에 DNA 단편 혼합물을 사용할 때 유발되는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease; MMP)의 생성의 문제를 해결할 수 있는 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제와 DNA 단편 혼합물을 포함하여 염증으로 인한 통증을 억제하며, 연골 재생이 가능한 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, DNA 단편 혼합물에 의한 매트릭스 메탈로프로테아제 생성을 억제할 수 있어 부작용 없이 효율적으로 연골세포의 증식효과, 손상된 연골세포의 복구능, 연골 재생 효과 및 관절염 개선효과에 활용할 수 있는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

Description

DNA 단편 혼합물 및 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 관절염 예방 및 치료에 DNA 단편 혼합물을 사용할 때 유발되는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease; MMP)의 생성 문제를 해결할 수 있는 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제와 DNA 단편 혼합물을 포함하여 염증으로 인한 통증을 억제하며, 연골 재생이 가능한 관절염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
관절염이란 세균이나 외상과 같은 다양한 원인에 의해 관절 내에 염증성 변화로 유발되는 질환을 말하는 것으로서 관절염의 발생 빈도는 60세 이상 인구의 약 30% 정도로 추산되고 있고, 외국 통계에 따르면 심장질환 다음으로 자주 발생하고 있는 질병으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 최근 보건사회 연구원의 조사에 따르면 우리나라의 경우 50세 이후를 대상으로 당뇨병과 고혈압을 제치고 관절염이 가장 높은 발병율을 보이는 질병으로 보고된 바 있다.
따라서 많은 연구자들은 암이나 심혈관계 질환과 더불어 21세기의 인류의 삶의 질을 저해할 수 있는 가장 중요한 질환으로 관절염이 대두될 것으로 예상하고 있다.
한편, 관절염은 크게 비 염증성 관절염과 염증성 관절염으로 나눌 수 있는데, 비 염증성 관절염으로 골 관절염을, 염증성 관절염으로는 류마티스 관절염을 대표적으로 들 수 있다.
퇴행성 관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여 연골세포에서 관절의 기질물질들인 타입 2 콜라겐(type II collagen) 및 프로테오글리칸(proteoglycan) 등의 합성이 저해됨과 동시에 IL-1β(interlekin-1β) 및 종양괴사인자 등의 염증성 사이토카인(cytokine)이 생성됨에 따라 관절기질을 분해하는 매트릭스 메탈로프로테아제(matix metalloproteinase; MMP)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다.
따라서 관절염을 치료하기 위한 목적은 관절의 통증과 염증을 감소시키거나 MMP의 활성을 억제하여 관절의 변형을 방지할 뿐만 아니라 보다 근본적으로는 관절염을 유발하는 세포 내 작용 메커니즘을 밝히고, 그 기작을 제어하는 데 있다.
한편, 현재 임상적으로 사용되고 있는 퇴행성 관절염의 치료는 약물치료제(진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등)나 연골보호제(히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등)를 이용하거나, 수술적 처치(관절경 수술, 경골 근위부 절골술, 관절 부분 치환술, 슬관절 전치환술 등)에 의한다.
그러나 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지며, 연골보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이다. 더구나 이러한 약물들은 체중증가, 고혈압 유발, 소화성 궤양 유발 등의 부작용도 나타내고 있다.
이에, 대한민국 특허 공개 공보 제10-2013-0044195호 "어류 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 포함하는 연골 재생용 조성물" 및 대한민국 특허 공개 공보 제10-2017-0100236호 "DNA 단편 혼합물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품"을 보면 어류의 정소 등에서 얻어지는 DNA 단편 혼합물의 연골세포의 증식효과, 손상된 연골세포의 복구능, 연골 재생 효과 및 관절염 개선효과를 이용하여 관절염 예방 및 치료에 활용되고 있다.
그러나 DNA 단편 혼합물을 관절염 예방 및 치료에 사용되는 경우에 관절염 악영향을 끼칠 수 있는 매트릭스 메탈로프로테아제(matix metalloproteinase; MMP)의 생성을 유도하는 부작용이 있어 이 문제를 해결하지 않는 경우 DNA 단편 혼합물을 이용한 관절염 예방 및 치료의 효과는 반감될 수 밖에 없다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 DNA 단편 혼합물에 의한 매트릭스 메탈로프로테아제(matix metalloproteinase; MMP) 생성 유발 문제를 해결한 새로운 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여,
DNA 단편 혼합물과 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 관절염 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제는 글루코사민(glucosamine) 또는 약학적으로 허용 가능한 염인 것이 바람직하다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 관절염 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제는 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG) 또는 약학적으로 허용 가능한 염인 것이 바람직하다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 관절염 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제는 알리인(Alliin) 또는 약학적으로 허용 가능한 염인 것이 바람직하다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 관절염 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제는 소듐 부티레이트(Sodium butyrate(SB))인 것이 바람직하다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 관절염 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제는 콘드로이틴 황산염(Chondroitin sulfate(CS))인 것이 바람직하다.
본 발명은 DNA 단편 혼합물에 의한 매트릭스 메탈로프로테아제 생성을 억제할 수 있어 부작용 없이 효율적으로 연골세포의 증식효과, 손상된 연골세포의 복구능, 연골 재생 효과 및 관절염 개선효과에 활용될 수 있는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
도 1은 10ng/ml의 IL-β로 자극된 SW-1353 세포들의 (A)MMP-3와 (B)MMP-13의 발현에 DNA 단편 혼합물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 다른 농도의 DNA 단편 혼합물 처리에 따른 SW-1353 세포의 migration 변화를 나타낸 현미경 사진이다. Gap distance는 500μm이다.
도 3은 SW-1353 세포의 생존률에 DNA 단편 혼합물이 미치는 효과를 나타낸 그래프 및 현미경 사진이다. A 그래프의 값은 mean ± SE (n=3)이며, B 이미지의 Scale bar unit은 1000μm이다.
도 4는 10ng/ml의 IL-β로 자극된 SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 glucosamine이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 5는 10ng/ml의 IL-β로 자극된 SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 6은 10ng/ml의 IL-β로 자극된 SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 알리인(Alliin)이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 7은 10ng/ml의 IL-β로 자극된 SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 Sodium butyrate(SB)이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 8은 10ng/ml의 IL-β로 자극된 SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 Chondroitin sulfate(CS)이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 9는 SW-1353 세포들의 3D dynamic 배양 모델을 나타낸 사진이다. A: SW-1353세포들의 3D dynamic 배양을 위한 scheme, B: Top-view 이미지, C: Cross-section 이미지이며, B의 Scale bar unit은 500μm이며 C는 200μm이다.
도 10은 3D dynamic 배양 모델에서 SW-1353 세포들의 morphology를 나타낸 사진이다. Scale bar unit은 500μm이다.
도 11은 3D 배양동안 다른 gel-cell matrix에서의 SW-1353 세포들의 morphology를 나타낸 사진이다. Scale bar unit은 200μm이며, Green (calcein AM): Live, Red (EthD-1): Dead, Blue (Hoechst): Nuclei이다.
도 12는 3D 10% serum-과 serum-free 상태에서 IL-β로 자극된 SW-1353 세포들의 (A)MMP-3와 (B)MMP-13의 발현에 DNA 단편 혼합물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 serum-free 상태에서 IL-β로 자극된 SW-1353 세포들의 (A)MMP-3와 (B)MMP-13의 발현에 DNA 단편 혼합물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 10ng/ml의 IL-β로 자극된 3D SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 glucosamine이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 15는 10ng/ml의 IL-β로 자극된 3D SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 16은 10ng/ml의 IL-β로 자극된 3D SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 알리인(Alliin)이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 17은 10ng/ml의 IL-β로 자극된 3D SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 Sodium butyrate(SB)이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
도 18은 10ng/ml의 IL-β로 자극된 3D SW-1353 세포들에서 MMP-3와 MMP-13의 발현에 Chondroitin sulfate(CS)이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 시료의 농도는 A-B: 0㎍/ml, C-D:10㎍/ml, E-F:100㎍/ml, G-H:1000㎍/ml이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
2D, 3D 체외 인간 연골세포 model을 통하여 관절염 치료제로서 DNA 단편 혼합물에 의한 세포 내 작용 메커니즘을 밝히고자 시험을 진행하다가 DNA 단편 혼합물의 매트릭스 메탈로프로테아제(matix metalloproteinase; MMP), 특히 매트릭스 메탈로프로테아제(matix metalloproteinase; MMP)-13의 생성 문제를 발견하여 본 발명에 이르게 된 것이다.
따라서 본 발명은 DNA 단편 혼합물과 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포들을 입체적으로 배양하는 3D dynamic 배양 모델을 통해 관절염 예방 및 치료용 조성물의 안전과 효율성 예측을 극대함으로써, 2D 배양 방식보다 정확한 인체반응 확인이 가능할 수 있다.
본 발명에 따른 PDRN (polydeoxyribonucleotides)으로도 불리우는 DNA 단편 혼합물은 어류, 구체적으로 송어, 연어 등의 정액 내지 정소로부터 제조되어 분자량이 저감된 단편 형태의 상태로 혼합되어 존재하는 것으로서, 세포의 필수 구성성분들로서 이들의 혼합물을 상처부위 등에 주입함으로써 상처 부위의 치료 및 개선, 연골 재생 효과에 따른 관절염 치료 및 개선 등을 목적으로 하는 의약품, 건강기능성 식품이나 세포활성과 관련된 주름 개선 등을 목적으로 하는 화장품, 식품첨가물, 생화학 실험재료 등 활용되는 용도가 다양하다.
본 발명에서는 DNA 단편 혼합물을 관절염의 예방 및 치료용으로 사용하는 것으로 그 기본적인 용도는 이미 알려져 있는 것으로서 알려져 있는 기본적인 효과 및 메카니즘은 본 발명에서도 그대로 이용이 되며, 그 예로는 대한민국 특허 공개 공보 제10-2013-0044195호 "어류 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 포함하는 연골 재생용 조성물" 및 대한민국 특허 공개 공보 제10-2017-0100236호 "DNA 단편 혼합물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품", PCT 국제특허 WO 2010/049898 Al "INJECTABLE POLYDEOXYRIBONUCLEOTIDE COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTICULAR DISEASES, 공표 논문인 "Polydeoxyribonucleotide (PDRN) promotes human osteoblast proliferation: A new proposal for bone tissue repair(Life Sciences 73 (2003) 1973-1983) 및 "Protective effects of polydeoxyribonucleotides on cartilage degradation in experimental cultures(Cell Biochem Funct 2013; 31: 214-227) 등을 들 수 있다.
상기 본 발명에서 사용하는 DNA 단편 혼합물의 분자량, 점도 등은 특별한 제한이 없으며, 제조방법 역시 특별한 제한이 없으며, 제조방법의 일 예를 들면, 무지개송어(바다에서 양식된 송어로 바다송어라 칭함)의 정소를 정제수와 염화나트륨과 함께 분쇄기로 분쇄한 다음 분쇄된 정소에 증류수를 추가로 가하고, 소디움도데실설페이트(이하 SDS라 칭함)를 투입한 다음 100~105℃에서 4~5시간 동안 반응하여 분자량 저감을 한 실온까지 냉각하여 15,000rpm에서 원심분리하여 정소 찌꺼기를 제거하고 여과하고, 에탄올에 여과액을 서서히 첨가하면 흰색의 DNA 단편 혼합물이 제조되는데, 이를 에탄올 내지 무수에탄올을 이용하여 탈수, 여과, 건조하여 순도를 향상시켜 사용할 수 있다.
또한 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 것이라면 특별한 제한이 없으며, 그 예를 들면 글루코사민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, N-Acetyl-D-glucosamine(NAG), 알리인(Alliin), Sodium butyrate(SB) 및 Chondroitin sulfate(CS)을 들 수 있다.
이하 DNA 단편 혼합물, 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제로서 글루코사민(glucosamine), N-Acetyl-D-glucosamine(NAG), 알리인(Alliin), Sodium butyrate(SB) 및 Chondroitin sulfate(CS)에 대한 시험을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
<시험방법>
1. 세포배양
인간 연골육종 세포주 SW-1353(HTB-94, ATCC, Mansassas, VA, USA)는 10% 의 FBS(fetal bovine serum)와 1%의 항생제-항진균제가 첨가된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle's medium) 에서 배양하였다. 세포배양 incubator는 37℃, 5% CO2를 유지하였다. 세포배양 동안 세포는 1.2 x 104 cells/cm2으로 배양 플라스크에 씨드 되었으며, 80-90%의 밀집도(confluence)에 도달하면 트립신 처리하였다. 세포들은 9번 계대배양하여 실험에 사용하였다.
2. 3D 배양
SW-1353 세포들은 DNA 단편 혼합물(polydeoxyribonucleotides(PDRN), 450 kDa, sterilized, BR Pharm Co, Wonju, South Korea)이 첨가되거나 첨가되지 않은 3D 콜라겐 하이드로젤에서 성장시켰다. 2D 배양으로부터 SW-1353 세포들을 얻고, 배양액에서의 세포수를 측정하였다. 그 후 세포들은 spin down 시키고, 식혔다. 3D 연골세포에 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 첨가물로서 DNA 단편 혼합물을 사용하기 위해, 10mg/ml농도의 DNA 단편 혼합물을 10X PBS에 용해시키고, 10X PBS을 이용해 0㎍/ml, 10㎍/ml, 100㎍/ml, 1000㎍/ml의 농도로 희석시켰다. 다른 농도의 DNA 단편 혼합물이 포함된 10X PBS와 DMEM으로 4mg/ml의 농도로 희석된 rat tail 콜라겐 I 용액을 1:10의 비율로 섞은 후, NaOH로 pH를 7.0-7.4로 조절하였다. 그 후에 콜라겐 용액에 공기방울을 들어가는 것을 피하기 위해 세포들을 조심스럽게 섞어주었다. 이 용액을 3D gel-cell을 구축하기 위해 각 well에 2㎕씩 넣어주었다. Gel을 incubator(37℃, 5% CO2)에 45분 동안 넣고, 3D gel-cell matrix는 serum이 포함되지 않은 배양액에 48시간 동안 노출 시켰다. DNA 단편 혼합물 drug screen을 위해 SW-1353 세포가 충분히 성장한 후에, serum이 포함되지 않은 DNA 단편 혼합물을 배양액으로 처리되었다.
3. 알려진 criteria control으로의 DNA 단편 혼합물 모니터링
SW-1353 세포들은 24시간 동안 glucosamine(GLN), N-Acetyl-D-glucosamine(NAG), 알리인(Alliin), Sodium butyrate(SB) 및 Chondroitin sulfate(CS) 0.1-10mM과 DNA 단편 혼합물 10-1000㎍/ml로 처리되었으며, MMP의 발현 분석을 위해 10ng/ml 농도의 IL-β로 자극 시켰다.
4. MMP-3와 MMP-13의 분석
MMP 발현 평가를 위해, IL-β를 serum이 포함되지 않은 DMEM 배양액에 용해 시켜 최종 10ng/ml의 농도로 사용되었다. 세포들은 37℃, 5% CO2에서 배양되었다. 세포 배양 상등액을 채취하고, 원심분리한 후 실험할 때까지 -80℃에 보관되었다. 배양 상등액에 있는 MMP-3과 MMP-13의 양은 상업적으로 이용 가능한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assays)를 사용하여 제조사 protocol을 따라 측정하였다.
5. 3D 구조에서 세포들의 생체염색
3D 배양된 SW-1353 세포들을 calcein AM, ethidium homodimer 1 (EthD-1), Hoechst로 30분동안 상온에서 염색하였다. 그 후에 세포들을 PBS로 헹구고, PBS상의 세포들을 confocal laser scanning 현미경(ZEISS, LSM 710)을 이용하여 측정하였다. ZEN software를 이용하여 각 색깔별로 이미지를 얻었다.
6. 세포 생존율 측정
SW-1353 세포들(5x103cells/well)은 96-well plate에 24시간동안 배양 되었다. 배양액은 serum이 첨가되지 않은 다양한 농도의 DNA 단편 혼합물로 교체되었다. 24시간 후에, 10㎕의 CCK-8을 각 well에 첨가하였다. 2시간 동안 incubation한 후에 세포 생존율은 microplate reader(CLARIOstar, BMG, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
7. 세포층 migration 분석
체외 migration 분석은 ibidi Culture-insert를 사용하여 수행하였다. SW-1353 세포들이 Culture-insert dish에 24시간 동안 배양하여 monolayer가 되었을때, Culture-insert를 제거하였다. 남아 있는 세포 debris를 제거하기 위해 세포들을 배양액으로 2번 헹궈 냈다. 그 후에 monolayer 세포들은 serum이 포함되지 않은 배양액이나 serum이 포함되지 않고, 다양한 농도의 DNA 단편 혼합물이 포함된 배양액에서 배양되었다. control군에서의 세포들은 단지 배양액에서 배양되었다. 세포들의 migration은 현미경(EVOS fl, AMG)으로 이미지 관찰하여 측정하였다.
8. 통계분석
각 수치는 개개의 샘플로부터 얻었으며, 값은 적어도 3번의 실험결과로 평균± 표준오차로 표현 되었다.
<실험결과>
1. 2D 배양 모델
1.1 MMP의 발현에 DNA 단편 혼합물의 효과
도 1에서와 같이, 대조군 SW-1353 세포들은 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도로 DNA 단편 혼합물이 포함된 배양액(no serum)에서 배양하였다. 실험군은 대조군과 같은 조건에서 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 첨가하여 배양하였다.
그 결과, 도 1A와 같이 MMP-3의 발현 수치는 DNA 단편 혼합물의 농도에 상관없이 IL-β(10ng/ml)가 첨가된 실험군에서 증가함을 보였다. 그러나 도 1B와 같이 MMP-13의 발현수치는 DNA 단편 혼합물의 농도가 증가함에 따라 증가함을 보였다.
1.2 DNA 단편 혼합물 처리에 따른 SW-1353 세포의 migration 변화
도 2와 같이 SW-1353 세포들의 운동(migration)에 DNA 단편 혼합물의 역할을 확인하기 위해 2D 상처치료 assay로 DNA 단편 혼합물의 운동에 미치는 효과를 조사하였다. SW-1353 세포들은 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도로 2일동안 처리한 후, 0h, 24h, 48h후의 세포 migration을 현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, DNA 단편 혼합물을 포함하지 않는 control군과 비교하여 1000㎍/ml의 농도로 DNA 단편 혼합물이 처리된 군은 연골육종 세포들의 운동을 눈에 띄게 감소 시켰다.
1.3 SW-1353 세포의 생존율에 DNA 단편 혼합물이 미치는 효과
관절염의 가장 두드러진 변화는 연골 악화이다. 연골 보호 효과를 평가하기 위해 SW-1353 세포를 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도로 DNA 단편 혼합물으로 2일동안 처리하고, CCK-8 assay로 세포 증식을 평가하였다. 이는 또한 의약품과 독이 있는 재료의 세포독성 잠재력을 평가할 수 있다.
그 결과, 도 3에서와 같이 control군과 비교하여 10㎍/ml농도의 DNA 단편 혼합물 처리는 SW-1353세포의 성장이 억제되었으며, 100, 1000㎍/ml에서도 세포의 뚜렷한 증식의 효과는 없었다. 또한, 현미경 이미지로 살아 있는 세포를 관찰한 결과, 세포독성의 효과도 없음이 확인되었다.
따라서 DNA 단편 혼합물은 control그룹과 비교하여 DNA 단편 혼합물의 농도에 따라 강한 항증식 활성을 보여주었다.
1.4 MMP의 발현에 glucosamine(GLN)이 미치는 효과
상기 1.1에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 glucosamine(GLN)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 4와 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 glucosamine(GLN)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 glucosamine(GLN)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
1.5 MMP의 발현에 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)이 미치는 효과
상기 1.1에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 5와 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
1.6 MMP의 발현에 알리인(Alliin)이 미치는 효과
상기 1.1에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 알리인(Alliin)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 6과 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 알리인(Alliin)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 알리인(Alliin)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
1.7 MMP의 발현에 Sodium butyrate(SB)이 미치는 효과
상기 1.1에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 Sodium butyrate(SB)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 7과 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 Sodium butyrate(SB)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 Sodium butyrate(SB)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
1.8 MMP의 발현에 Chondroitin sulfate(CS)이 미치는 효과
상기 1.1에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 Chondroitin sulfate(CS)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 8과 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 Chondroitin sulfate(CS)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 Chondroitin sulfate(CS)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
2. 3D 배양 모델
2.1 SW-1353세포 network에 의한 3D 연골 구축
콜라겐에 기초한 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 포함하는 3D 연골 칩을 구축하기 위해 gel-cell matrix와 tunable-dynamic flow 관 사이가 분리되어진 마이크로플루이딕 플래폼의 3D 연골 체외 모델을 구축하였다(도 9A). tunable 관에는 세포 성장을 위한 배양액이 흐르며, 배양액은 평균 1.5㎕/hr의 유속으로 gel-cell matrix의 반대쪽으로 살포되도록 하였다. 또한, SW-1353 세포들은 콜라겐 matrix에 3D dynamic 배양되었다. 배양액에 노출된 며칠동안, SW-1353 세포들은 도 9B에서와 같이 섬유아세포(fibroblast)와 같은 mophology를 가졌음을 확인하였으며, 도 9C에서와 같이 SW-1353 연골육종의 3D 연골칩은 잘 구축되었음을 확인하였다.
2.2 3D dynamic 배양 모델에서 SW-1353 세포들의 morphology
도 10 이미지는 48시간의 3D dynamic 배양 과정 동안 DNA 단편 혼합물의 농도에 따라 배양된 세포의 이미지를 보여준 것이다. 각 gel-cell matrix는 4mg/ml 콜라겐 matrix에서 0(contol), 10, 100, 1000㎍/ml로 다른 농도의 DNA 단편 혼합물을 포함하였다. 45분동안 겔화한 후에, 24h, 48h 후의 이미지를 측정한 결과 SW-1353이 gel에 잘 seed 되었음을 보여주었다.
Serum이 포함되지 않은 배양액 100㎕를 각 관으로 투입하고, SW-1353 세포들은 다른 농도의 DNA 단편 혼합물이 첨가된 ECM gel matrix에서 3D dynamic 배양되었다. 배양액에 노출된 후에, 48시간동안 세포들의 뭉침이 관찰되지 않았으며, gel 면에 섬유아세포(fibroblast)와 같은 상이 형성되었다. 따라서 DNA 단편 혼합물은 gel에서 세포들이 배치되는데 아무런 영향을 끼치지 않음을 확인하였다.
2.3 3D dynamic 배양 모델에서 SW-1353 세포의 생존율에 DNA 단편 혼합물이 미치는 효과
도 11는 도 10의 3D dynamic 배양 상황에서의 세포 생존율을 보여준다. SW-1353 세포 생존율에 DNA 단편 혼합물의 영향을 밝히기 위해 3D 배양에서 세포 생존율 측정은 IL-β의 존재 또는 결실 하에서 0(contol), 10, 100, 1000㎍/ml 농도의 DNA 단편 혼합물 ECM으로 처리된 후에 24시간에 수행되었다. 아무것도 처리되지 않은 control 군과 비교하여 DNA 단편 혼합물 단독으로 10-1000㎍/ml 농도일때 SW-1353에 특별한 세포독성의 효과가 보이지 않았다. IL-β의 존재하에 다른 농도의 DNA 단편 혼합물 ECM에서 또한 어떠한 세포독성 효과가 보이지 않았다(도 11).
2.4 3D dynamic 배양 모델에서 MMP의 발현에 DNA 단편 혼합물의 효과
3D 세포 배양동안 10% serum이 포함되는 또는 serum이 포함되지 않은 배양액으로 배양하고, 배양된 3D 연골세포는 IL-β(10ng/ml)로 자극되었다.
그 결과, 도 12에서와 같이 10% serum 조건하에서 MMP-1과 MMP-13 발현은 100, 1000㎍/ml 농도의 DNA 단편 혼합물 조건에서 MMP 발현의 결과와 유사함을 나타내었다. 따라서 높은 농도의 DNA 단편 혼합물은 MMP를 활성시켜 관절염 치료를 악화시킬 수 있음이 확인되었다.
또한, Serum이 포함되지 않은 DNA 단편 혼합물과 IL-β로 24시간동안 처리한 후에 퇴행성 관절염 질병에 흔하게 포함되는 두가지 악화 마커(MMP-3과 MMP-13)를 분석하였다.
그 결과, 도 13에서와 같이, DNA 단편 혼합물에 대한 MMP-13의 발현 수치는 DNA 단편 혼합물의 농도에 따라 증가하였다. 따라서 DNA 단편 혼합물은 MMP의 생성을 유도하여 관절염 치료를 악화시킬 수 있음이 확인되었다.
2.5 MMP의 발현에 glucosamine(GLN)이 미치는 효과
상기 2.4에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 glucosamine(GLN)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 14와 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 glucosamine(GLN)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 glucosamine(GLN)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
2.6 MMP의 발현에 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)이 미치는 효과
상기 2.4에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 15와 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
2.7 MMP의 발현에 알리인(Alliin)이 미치는 효과
상기 2.4에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 알리인(Alliin)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 16과 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 알리인(Alliin)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 알리인(Alliin)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
2.8 MMP의 발현에 Sodium butyrate(SB)이 미치는 효과
상기 2.4에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 Sodium butyrate(SB)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 17과 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 Sodium butyrate(SB)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 Sodium butyrate(SB)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
2.9 MMP의 발현에 Chondroitin sulfate(CS)이 미치는 효과
상기 2.4에서의 실험에서 DNA 단편 혼합물은 MMP-3와 MMP-13의 생성을 유도하는 것으로 확인이 되어, 이에, 추가적으로 생성을 억제하는 Chondroitin sulfate(CS)을 DNA 단편 혼합물과 함께 첨가하여 MMP-3와 MMP-13의 생성에 대하여 실험하였다.
도 18과 같이 SW-1353 세포들에 0, 10, 100, 1000㎍/ml의 농도의 DNA 단편 혼합물과 0, 0.1, 1, 10mM농도의 Chondroitin sulfate(CS)을 처리하고, 10ng/ml 농도의 IL-β를 같이 투여한 후, 아무것도 처리되지 않은 control 그룹과 비교하여 MMP-3와 MMP-13 단백질의 발현을 보았다.
그 결과, DNA 단편 혼합물의 농도와 관계없이 10mM농도의 Chondroitin sulfate(CS)을 처리했을 때 MMP-3와 MMP-13의 단백질 발현이 감소됨을 보여주었다.
<결론>
퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염과 관계된 drug screen 연구를 위해 3D 체외 연골 모델을 구축하여, 3D matrix로서 DNA 단편 혼합물(PDRN)은 골관절염 치료 효험에 중요한 역할을 하는 것으로 확인하였다.
구체적으로 세포 운동 또한 PDRN에 의해서 상당히 억제되었으며, 이는 유의미하게 침입과 전이를 억제함으로써 관절염의 치료에 DNA 단편 혼합물(PDRN)의 효과를 확인한 것이다.
그러나 DNA 단편 혼합물(PDRN)은 MMP의 생성을 유도하여 관절염 치료를 부정적인 영향을 미칠 수 있는 문제점도 확인이 되었으나, 이는 MMP의 생성 억제제인 글루코사민, N-Acetyl-D-glucosamine(NAG), 알리인(Alliin), Sodium butyrate(SB) 및 Chondroitin sulfate(CS)으로 이루어진 군 중 어느 하나의 성분과 함께 사용하여 해결이 되는 것 또한 입증하였다.
따라서 DNA 단편 혼합물(PDRN)과 MMP의 생성 억제제, 예를 들어 글루코사민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, N-Acetyl-D-glucosamine(NAG), 알리인(Alliin), Sodium butyrate(SB) 및 Chondroitin sulfate(CS)으로 이루어진 군 중 어느 하나를 활성 성분으로 함께 포함하는 것에 의해 DNA 단편 혼합물(PDRN)의 MMP의 생성 유도를 억제하면서 관절염의 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있는 조성물을 본 발명에서는 제공할 수 있다.

Claims (6)

  1. DNA 단편 혼합물과 MMP 생성 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 MMP 생성 억제제는 글루코사민(glucosamine) 또는 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 MMP 생성 억제제는 N-Acetyl-D-glucosamine(NAG) 또는 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 MMP 생성 억제제는 알리인(Alliin) 또는 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제는 소듐 부티레이트(Sodium butyrate(SB))인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 생성 억제제는 콘드로이틴 황산염(Chondroitin sulfate(CS))인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
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