WO2020045886A1 - 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 함유하는 세포증식 촉진용 조성물 - Google Patents

에리스로포이에틴 유래 펩티드를 함유하는 세포증식 촉진용 조성물 Download PDF

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WO2020045886A1
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anemia
erythropoietin
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김소연
유승준
조봉기
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재단법인 대구경북과학기술원
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]

Definitions

  • composition for promoting cell proliferation comprising an erythropoietin-derived peptide as an active ingredient.
  • the human body is constantly exposed to harmful stimuli and responds to the protection of the body.
  • stimuli such as hypoxia, infection, and mechanical stimuli
  • defense mechanisms in response to these stimuli exist from the cellular unit.
  • cytokines secreted as defense mechanisms in response to stimuli serve to protect individuals while killing abnormal cells or preventing normal cells from being exposed to stimuli.
  • Erythropoietin is a glycoprotein with a molecular weight of about 30,000. It is a blood-forming cytokine that promotes the differentiation of cells that make red blood cells and increases the number of red blood cells, thereby improving the prevention of anemia.
  • the protein begins by conjugating to receptors on erythrocyte progenitor cells, causing an increase in calcium ions, an increase in DNA biosynthesis, and hemoglobin production stimulation. Therefore, erythropoietin can be used as an agent to treat anemia such as anemia in kidney disease, anemia in premature infants, anemia caused by hypothyroidism, anemia caused by malnutrition, anemia caused by chronic renal failure, and anemia caused by surgery. Can be.
  • Erythropoietin artificially produced through cell culture or synthesis has a good activity in cytoprotective and cell proliferation, but has a relatively short half-life.
  • polysaccharide darbopoetin alfa
  • polyethylene glycol Metal polyethylene glycol-epoetin beta
  • erythropoietin variants with increased half-life has been used as anemia treatment.
  • these drugs also have difficulty in drug delivery in some tissues, such as brain tissue, where tissue and vascular barriers exist.
  • small peptides have been developed artificially manufactured with a part of erythropoietin such as EPOtris, EPObis, and MK-X.However, they have a tissue protective effect without cell proliferation effect. There is a problem in that there is a limit as a therapeutic agent for anemia and other diseases that require an effective but proliferating effect.
  • One aspect is to provide a peptide described by any one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 26-28.
  • Another aspect is to provide a composition for promoting cell proliferation or differentiation comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a composition for improving hematopoietic function comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating anemia disease comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a health functional food composition for the prevention or improvement of anemia disease comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 28 as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating hematopoietic disorders comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a health functional food composition for the prevention or improvement of hematopoietic disorders comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient.
  • Another aspect relates to a method of treating anemia disease comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a composition comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-28.
  • Another aspect relates to a method of treating a hematopoietic disorder comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a composition comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-28.
  • Another aspect is to provide the use of a composition comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 for the manufacture of a medicament for the treatment of anemia disease.
  • compositions comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 for the manufacture of a medicament for the treatment of hematopoietic disorders.
  • the peptide may be derived from an erythropoietin protein sequence.
  • the peptide may bind to the erythropoietin receptor. For example, it may bind to a target region (site 1) or a target region (site 2) of the receptor.
  • compositions for promoting cell proliferation or differentiation comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for promoting cell proliferation or differentiation comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20 to 22 and 27 as an active ingredient.
  • the peptide may be derived from an erythropoietin protein sequence, and the peptide may be derived from an erythropoietin binding site.
  • the peptides are characterized by having a binding affinity of 0.1 ⁇ M to 1 nM for the erythropoietin receptor.
  • the peptide according to one embodiment can modulate the effect of cell proliferation by forming a weak bond with target region 2 of the erythropoietin receptor.
  • the peptide may form an alpha helix structure and may have cytoprotective activity.
  • the peptide may promote the proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells, adipocytes, pancreatic cells, muscle cells, blood vessel cells or skin cells.
  • hematopoietic stem cell is also referred to as hematopoietic stem cell, and means a cell that performs the hematopoietic action through autologous proliferation and differentiation.
  • Hematopoietic stem cells mature through the progenitor cells, which are intermediate processes of various blood cells, into final cells, and in various blood such as red blood cells, platelets, neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, T cells, B cells, natural killer cells, or dendritic cells. Since differentiation into cells, the development of red blood cells or lymphocyte cells may be promoted by differentiation of the hematopoietic stem cells.
  • the composition according to one aspect may be used as a therapeutic agent for anemia by promoting the proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells.
  • cell proliferation or differentiation may be induced in tissues such as adipose tissue, pancreas, muscle, and vascular skin that express erythropoietin receptors, and thus require cell proliferation effects such as obesity and diabetes, muscle regeneration, blood vessel regeneration, and skin regeneration. It can be used for the prevention or treatment of a disease.
  • compositions for improving hematopoietic function comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient. Specific details of the peptide are as described above.
  • the composition can improve hematopoietic function to treat or alleviate anemia, erythrocytosis or hematopoiesis, enhance the overall hematopoietic activity of the body, as well as promote physical strength by promoting muscle, blood vessel and skin regeneration and inhibiting obesity And can help you stay healthy.
  • compositions for preventing or treating anemia disease comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient.
  • administering a pharmaceutically effective amount of the composition to an individual in need thereof, contacting the cells in vitro , or in vivo to the experimental animal comprising the steps of Provide a method of prevention or treatment.
  • Specific details of the peptide are as described above.
  • anemia refers to a state in which the number of red blood cells or hemoglobin in the red blood cells is lower than normal, and the rate at which red blood cells are produced by producing little or no healthy red blood cells or by losing or destroying too many red blood cells. It means you can't keep up.
  • the composition may promote the proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells, thereby promoting the development of red blood cells or lymphocytes, and may be used for the prevention or treatment of anemia diseases.
  • the anemia diseases include, for example, acute or chronic anemia, anemia caused by kidney disease, anemia caused by renal failure, anemia caused by blood diseases, radiotherapy-induced anemia, chemotherapy-induced anemia, anemia by surgical procedures, and infection.
  • the composition according to one embodiment may include any one or more peptides selected from the group consisting of 0.001% to 80% by weight of SEQ ID NOs: 1 to 28 based on the total weight of the composition.
  • the dosage of the composition is 0.01 mg to 10,000 mg, 0.1 mg to 1000 mg, 1 mg to 100 mg, 0.01 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.01 mg to 10 mg, or 0.01 mg to 1 mg Can be.
  • the dosage may be variously prescribed by factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient. These factors can be taken into account to properly adjust the dosage.
  • the number of administrations may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or two or more sites of administration.
  • the same dosages as humans per kilogram are used or the above dosages are converted into volume ratios (e.g., average values) of organs (heart, etc.) between the target animal and humans.
  • One dose may be administered.
  • Possible routes of administration include oral, sublingual, parenteral (eg, subcutaneous, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intradural, or intravenous), rectal, topical (including transdermal), inhalation, and injection, or implantable devices. Or insertion of a substance.
  • the animal to be treated according to one embodiment include humans and mammals for other purposes. Specific examples include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, and the like. Included.
  • compositions according to one embodiment may comprise a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include sterile water, saline, conventional buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (such as ascorbic acid), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives.
  • this may include combining organic materials such as biopolymers, inorganic materials such as hydroxyapatite, specifically collagen matrix, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers, and chemical derivatives thereof.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment is formulated in a formulation suitable for injection, the peptide may be dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier or frozen in a dissolved solution.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment may be suspended according to the method of administration or formulation thereof, and as necessary, suspending agents, dissolution aids, stabilizers, isotonic agents, preservatives, adsorption agents, surfactants, diluents, excipients, pH adjusters, analgesics, Buffers, reducing agents, antioxidants and the like may be included as appropriate.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995.
  • a pharmaceutical composition according to one embodiment is in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which may be readily implemented by one of ordinary skill in the art. It may be prepared by or incorporated into a multi-dose container. The formulations can then be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oil or aqueous media or in the form of powders, granules, tablets or capsules.
  • Another aspect provides a health functional food composition for preventing or ameliorating anemia disease comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient. Specific details of the peptide are as described above.
  • the health food composition may be used with other food or food ingredients in addition to the peptide, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixed amount of the active ingredient can be determined suitably according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present disclosure may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw material.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hematopoietic disorders comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient.
  • administering a pharmaceutically effective amount of the composition to a subject in need thereof, contacting cells in vitro , or in vivo to an experimental animal Provide a method of prevention or treatment.
  • Another aspect provides a health functional food composition for preventing or ameliorating hematopoietic disorders comprising any one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 28 as an active ingredient. Specific details of the peptide are as described above.
  • hematopoietic disorder refers to a condition in which hematopoiesis is defective and blood cell production is not normally performed, and hematopoietic disorder may cause various antagonists.
  • the disease is aplastic anemia, malignant lymphoma or leukemia, chronic liver disorders, renal failure, severe infections, myeloid thrombocytopenia, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), thrombocytopenia, lymphopenia, neutropenia, mononucleosis , Granulocytopenia, myelodysplastic syndrome or myeloid proliferative disease.
  • the erythropoietin-derived peptide promotes the proliferation or differentiation of cells, has a cytoprotective effect on damaged cells, and exhibits a hematopoietic effect, thereby treating various diseases causing anemia and hematopoietic disorders. Or for prevention.
  • the peptide may induce cell proliferation or differentiation in tissues such as adipose tissue, pancreas, muscle, vascular skin, and the like that express erythropoietin receptors, such as obesity and diabetes, muscle regeneration, blood vessel regeneration, and skin regeneration. It can be used for the prevention or treatment of a disease in need of a proliferative effect.
  • the composition according to one aspect includes a peptide derived from an erythropoietin protein sequence, and has a simple structure compared to conventional natural human erythropoietin, which facilitates passage of a tissue-blood barrier and excellent cell protective activity. And, there is no side effect of cell proliferation, and can improve hematopoietic function, and can be used for the treatment or prevention of anemia disease. In addition, it can be used as a substitute for erythropoietin, which is economical due to low production cost and is easy to transport to biological tissues, and has a cell proliferation effect.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an erythropoietin-derived peptide and its variants according to one embodiment.
  • Figure 2a ⁇ 2c is a graph confirming the binding strength through the SPR technique to determine whether the erythropoietin-derived peptide can act on the erythropoietin receptor.
  • 3a to 3d are photographs confirming secondary alpha helix formation of erythropoietin-derived peptides (ML1, ML1-C1, ML1-C2, ML1-C3, ML1-H1, ML1-H2, and ML1-H3).
  • 4A to 4D are graphs confirming a cell protective effect in cells in which free radicals are increased by hydrogen peroxide through erythropoietin-derived peptide treatment.
  • FIG. 5 is a graph confirming the cytoprotective effect of (a) differentiated PC12 cells and (b) human SH-SY5Y cells of some sequence modified peptides (ML1-L2, ML1-K2 and ML1-R2) of erythropoietin derived ML1 peptide to be.
  • FIG. 6 is a graph confirming the cell proliferation rate of some sequence modified peptides (ML1-L2, ML1-K2 and ML1-R2) of erythropoietin-derived ML1 peptide.
  • FIG. 7 is a graph confirming the cell proliferation rate of the erythropoietin-derived peptide and some sequence modified peptides.
  • EPO erythropoietin receptor
  • FIG. 9 is a graph confirming the cellular protective and proliferative effects of erythropoietin-derived peptides and some sequence modified peptides.
  • MLP erythropoietin-derived peptides
  • 11A to 11D are graphs confirming the hematopoietic effect by in vivo administration of erythropoietin-derived peptides (MLP, MLP-C, MLP-H).
  • 12A to 12B show the results of confirming the activation regulation effect of erythropoietin-derived peptides (MLP-C, MLP-H) and erythropoietin (EPO) on the erythropoietin receptor.
  • MLP-C erythropoietin-derived peptides
  • EPO erythropoietin
  • the erythropoietin-derived peptide of the present invention was synthesized into monomers according to a conventionally known solid phase peptide synthesis technique (Peptron, Daejeon, Korea).
  • an erythropoietin-derived peptide capable of binding to important amino acid sequences (Arg103, Ser104, Leu105, Leu108, and Arg110) in the sequence of the target region (site 2) of the natural erythropoietin receptor was synthesized, and the specific properties of each of the peptides were confirmed. It was.
  • a liquid chromatography / mass selective detector HP 1100 series was used. Purity was measured by high performance liquid chromatography (SHIMADZU prominence HPLC) analysis (> 95% purity). Erythropoietin derived peptides are shown in Table 1 below.
  • the binding model of erythropoietin and its receptor was based on a known binding structure (Protein Data Bank ID: 1EER) for the experiment of sequence change. Based on the known amino acid properties, the amino acid of the erythropoietin-derived peptide was substituted. According to the polarity of the amino acid side chain, it is classified into 4 types (1 nonpolar or hydrophobic, 2 neutral, 3 negative charge, 4 positive charge). Using the information of nonpolar (hydrophobic), neutral, negative or positively charged amino acids, the existing amino acid sequence was substituted to induce changes in each property.
  • peptides were additionally prepared by removing two amino acids from both ends of the terminal except for the core region to complement efficiency and stability as shown in Table 8 below.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Ka Kd KD ML1 1.311 x 10 3 8.5 x 10 -3 6.46077 ⁇ M ML2 1.6 x 10 4.4 x 10 -3 273 ⁇ M ML3 2.05 x 10 2 3 x 10 -3 14.6341 ⁇ M ML4 2.2 x 10 2 2.2 x 10 -3 10 ⁇ M ML5 3.04 x 10 2 0.1 x 10 -3 0.32894 ⁇ M ML6 5.0 x 10 4.5 x 10 -2 900 ⁇ M ML7 3.00 x 10 2 0.2 x 10 -2 6.666 ⁇ M ML8 1.8 x 10 2 0.8 x 10 -1 444.44 ⁇ M ML1-1 5.55 x 10 3 5.9 x 10 -3 1.06 ⁇ M ML2-1 3.1 x 10 2 4.1 x 10 -3 14.3 ⁇ M ML3-1 3.08 x 10 3 1.3 x 10 -2 4.31 ⁇ M ML4-1 4.10 x 10 2 1.20
  • the peptide according to one embodiment is derived from an erythropoietin binding site, and it can be seen that binding affinity for the erythropoietin receptor exists.
  • MTS assay CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, Wis., USA
  • PC12 cells were seeded in 96 well plates (5 ⁇ 10 4 cells per well) and induced free radical increase with 150 ⁇ M hydrogen peroxide (H 2 O 2 ).
  • 25 ng / ml of NGF (nerve growth factor) was added as a positive control, and the erythropoietin compound 1 IU / ml, the peptide of Example 1 were 0.25, 1, 2 or 4 pM, respectively, of the peptides of Examples 2 and 3.
  • Example 4 In order to confirm whether the erythropoietin-derived peptide prepared in Example 4 exhibits a cellular protective effect, the activity of mitochondria was confirmed in a stress situation in which free radicals were increased with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ).
  • PC12 cells or human SH-SY5Y cells were seeded in 96 well plates (5 ⁇ 10 4 cells per well) and induced active oxygen increase with 150 ⁇ M hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). Then, 25 ng / ml of NGF (nerve growth factor) was added as a positive control, and 1, IU / ml of erythropoietin compound 1, 0.1, 1, 50 pM or 0.5 nM of the peptide of Example 4 were added.
  • NGF nerve growth factor
  • TMRM tetramethylrhodamine methyl ester
  • MTS analysis CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI, USA
  • PC12 cells were seeded in 96 well plates (5 ⁇ 10 4 cells per well), and as a negative control, 1 pM of scrambled peptide (Scr), erythropoietin compound 0.5, 1 or 10 IU / ml, peptide 1, 10 pM of Example 4, After addition of 0.5 nM, 20 ⁇ l of MTS solution was added to each well and left for 3 hours. Initial cell count (0 h) and after 48 h the cell counts were measured. Intracellular soluble formazan produced by cell reduction was determined by recording the absorbance of each 96 well plate using VERSA MAX at a wavelength of 490 nm.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • PC12 cell line with 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, UT, USA), 100 unit / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin (Hyclone, UT, USA)
  • the culture medium (Hyclone, USA) and RPMI1640 culture medium (Hyclone, UT, USA) was incubated at 37 °C in a culture incubator supplied with 5% CO2.
  • PC12 cell lines were aliquoted into 96-well culture plates at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / ml and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 conditions for 24 hours.
  • the peptides prepared in Examples 1 to 3 were prepared and treated at a concentration of 10 ng / ml and cultured for 24 hours. Thereafter, 20 ⁇ l of MTT (3- [4,5-dimethyl-thiazol] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) reagent at a concentration of 5 mg / ml was added thereto and reacted for 2 hours. After the reaction, 200 ⁇ l of DMSO (dimethyl sulfoxide, Duksan, Gyeonggi-do, Korea) was added to dissolve all of the formazan (formazan) and then 570 nm using a microplate reader (Molecular Devices, CA, USA). Absorbance was measured at.
  • MTT 3- [4,5-dimethyl-thiazol] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide
  • Example 3 The cell protection and proliferation effects of the seven peptides prepared in Example 3 (ML1, ML1-C1, ML1-C2, ML1-C3, ML1-H1, ML1-H2, ML1-H3) were statistically compared with EPO. .
  • FIG. 4 and FIG. 7 were corrected and quantified based on the effect by EPO, and clustering was performed through a K-means clustering algorithm.
  • ML1-C1, ML1-C2 and ML1-C3 clustered to have a similar effect to EPO in terms of cell protection and effect.
  • ML1, ML1-H1, ML1-H2, ML1-H3 did not show a big difference in terms of cell protective effect, but the EPO group, but a big difference in cell proliferation effect.
  • the hematopoietic activity of the peptides MLP, MLP-C and MLP-H prepared in Example 5 was measured in vivo.
  • hematocrit which is the volume of red blood cells in the blood
  • MLP-C mean hematopoietic hemoglobin concentration
  • MCH mean hemoglobin hemoglobin
  • Example 5 the degree of activation of the erythropoietin receptors by MLP-C and MLP-H was compared with that of natural erythropoietin.
  • a DNA cell plasmid capable of expressing the erythropoietin receptor fusion of the green fluorescent protein was introduced into the HEK293 cell line, and a stable cell line stably expressing the erythropoietin fusion of the green fluorescent protein was prepared.
  • EPO EPO
  • MLP-C MLP-H
  • sampling was performed at 0, 30, 60, and 90 minutes, followed by Western blotting, and the activity of erythropoietin receptor was confirmed by the degree of phosphorylation of ERK1 / 2. It was.
  • the erythropoietin-derived peptide may regulate the activation of the erythropoietin receptor. Therefore, it can be used as a therapeutic agent for diseases such as anemia requiring cell proliferation effect.

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Abstract

에리스로포이에틴 유래 펩티드를 유효성분으로 포함하는 세포증식 촉진용 조성물에 관한 것으로, 종래의 천연 인간 에리스로포이에틴에 비해 간단한 구조를 가지므로 조직-혈관방어막(tissue-blood barrier)의 통과가 용이하고 세포 보호 활성이 우수하고, 세포 증식 부작용이 없으며, 조혈 기능을 개선할 수 있는바, 빈혈 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.

Description

에리스로포이에틴 유래 펩티드를 함유하는 세포증식 촉진용 조성물
본 출원은 2018년 8월 27일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0100580호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드를 유효성분으로 포함하는 세포증식 촉진용 조성물에 관한 것이다.
살아가는 동안 인체는 인체에 유해한 자극에 끊임없이 노출되고 그 노출에 반응하여 자신의 몸을 보호하게 된다. 유해한 자극에는 저산소증, 감염, 기계적인 자극 등 다양한 자극이 있으며, 이러한 자극에 반응하는 방어 기전은 세포 단위에서부터 존재한다. 자극에 반응하여 나타나는 방어 기전으로써 분비되는 다양한 사이토카인들은 자극에 노출되어 이상이 생긴 세포를 사멸시키거나 정상세포의 사멸을 방지하면서 개체를 보호하는 역할을 한다.
에리스로포이에틴은 분자량이 약 30,000인 당단백질로서 적혈구를 만드는 세포의 분화를 촉진하고 적혈구의 수를 늘려 빈혈의 예방 개선에 효과가 있는 혈액조성 사이토카인이다. 이 단백질은 적혈구 전구세포의 수용체에 접합함으로써 작용을 시작하며 세포 내에 칼슘이온의 증가, DNA 생합성의 증가 및 헤모글로빈 생성자극 등을 유발시킨다. 따라서, 에리스로포이에틴을 신장병 환자의 빈혈, 미성숙아의 빈혈, 갑상선기능 항진결손(hypothyroidism)에 의한 빈혈, 영양실조에 의한 빈혈, 만성신부전에 의한 빈혈, 수술에 따른 빈혈 등, 빈혈을 치료하는 약제로 사용될 수 있다.
세포 배양 또는 합성을 통해 인공 제작된 에리스로포이에틴은 세포보호효과와 세포증식효과에 있어 좋은 활성을 가지지만, 비교적 짧은 반감기를 가지고 있다. 이를 개선하기 위한 다당체화(darbopoetin alfa), 폴리에틸렌글리콜화(Methoxy polyethylene glycol-epoetin beta)를 통해 반감기가 증가된 에리스토포이에틴 변형체가 개발되어 빈혈치료제로 사용되어 왔다. 그러나 이러한 약물들도 뇌조직과 같이 조직·혈관간장벽이 존재하는 일부 조직에서는 약물 전달에 어려움이 있다. 이러한 단점을 보안할 수 있는 대안으로 EPOtris, EPObis, MK-X와 같은 에리스로포이에틴의 일부분을 인공적으로 제작한 크기가 작은 펩티드들이 개발되어왔지만, 이들은 세포증식 효과 없이 조직보호효과만 가지고 있어 신경질환 등에는 효과적이나 세포증식 효과를 요구하는 빈혈이나 다른 질환의 치료제로서는 한계를 가진다는 문제점이 있다.
일 양상은 서열번호 26 내지 28로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 기재되는 펩티드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 세포증식 또는 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 빈혈 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 빈혈 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈장애의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 빈혈 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조혈장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상은 빈혈 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위하여 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
다른 양상은 조혈장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위하여 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 26 내지 28로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 기재되는 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 에리스로포이에틴 단백질 서열로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 펩티드는 에리스로포이에틴 수용체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 수용체의 타겟 지역(site 1) 또는 타겟 지역(site 2)에 결합할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 세포증식 또는 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 또한, 서열번호 20 내지 22 및 27로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 세포증식 또는 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 상기 펩티드는 에리스로포이에틴 단백질 서열로부터 유래된 것일 수 있으며, 상기 펩티드는 에리스로포이에틴 결합 사이트에서 유래된 것일 수 있다. 상기 펩티드는 에리스로포이에틴 수용체에 대하여 0.1 μM 내지 1 nM의 결합친화도를 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 에리스로포이에틴 수용체에는 2개의 타겟 지역이 있으며, 이를 통해서 에리스로포이에틴과 결합체를 이루는데, 2개의 결합 타겟 지역 중 타겟 지역 1(site 1)는 강한 결합을 이루고(KD= ~1 nM) 타겟 지역 2(site 2)는 약한 결합(KD= ~1 μM)을 이루는 것으로 알려져 있다. 일 구체예에 따른 펩티드는 에리스로포이에틴 수용체의 타겟 지역 2와 약한 결합을 형성함으로써 세포증식의 효과를 조절할 수 있다.
상기 펩티드는 알파 헬릭스 구조를 형성할 수 있으며, 세포보호 활성을 가질 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 조혈모세포, 지방세포, 췌장세포, 근육세포, 혈관세포 또는 피부세포의 증식 또는 분화를 촉진할 수 있다.
본 명세서 내 용어, "조혈모세포"란 조혈줄기세포로도 일컬어지며 자가 증식 및 분화를 통해 상기 조혈작용을 수행하는 세포를 의미한다. 조혈모세포는 각종 혈구의 중간 과정인 전구세포를 거쳐 최종 세포로 성숙하게 되며, 적혈구, 혈소판, 중성구, 호산구, 호염구, 단핵구, T 세포, B세포, 자연살상세포 또는 가지돌기 세포 등의 다양한 혈액 내 세포로 분화하므로, 상기 조혈모세포의 분화에 의하여 적혈구 또는 림프구 세포의 발달이 촉진될 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은 조혈모세포의 증식 또는 분화를 촉진함으로써 빈혈의 치료제로 이용될 수 있다. 또한, 에리스로포이에틴 수용체를 발현하는 지방조직, 췌장, 근육, 혈관 피부 등과 같은 조직에서 세포 증식 또는 분화를 유도할 수 있는바, 비만 및 당뇨, 근육 재생, 혈관 재생, 피부 재생 등과 같이 세포증식 효과를 필요로 하는 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈 기능 개선용 조성물을 제공한다. 상기 펩티드의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 조성물은 조혈 기능을 개선하여 빈혈, 적혈구 감소증 또는 조혈을 치료 또는 완화할 수 있으며 신체의 전반적인 조혈 활성을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 근육, 혈관 및 피부 재생을 촉진하고 비만을 억제함으로써 체력을 증진시키고 건강을 유지하는데 도움을 줄 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 빈혈 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 상기 조성물의 약제학적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하거나, 인 비트로(in vitro) 상에서 세포에 접촉시키거나, 인 비보(in vivo) 상에서 실험동물에 투여하는 단계를 포함하는 빈혈 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 펩티드의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 명세서 내 용어, "빈혈"은 적혈구의 숫자나 적혈구 내의 혈색소가 정상치보다 낮아지는 상태를 의미하는 것으로, 건강한 적혈구를 거의 생산해 내지 못하거나 너무 많은 적혈구가 손실 또는 파괴되어 적혈구가 만들어지는 속도가 이를 따라가지 못하는 상황을 의미한다.
상기 조성물은 조혈줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진시킴으로써, 적혈구 또는 림프구 세포의 발달을 촉진시킬 수 있는바, 빈혈 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 상기 빈혈 질환은 예를 들면, 급성 또는 만성 빈혈, 신장 질환에 의한 빈혈, 신부전에 의한 빈혈, 혈액 질환에 의한 빈혈, 방사선요법-유발 빈혈, 화학요법-유발 빈혈, 수술 과정에 의한 빈혈, 감염에 의한 빈혈, 영양결핍성 빈혈, 비정상적인 적혈구생성, 조산의 초기 빈혈 또는 이들의 혼합 질환일 수 있다.
일 구체예 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%의 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 조성물의 투여 용량은 0.01㎎ 내지 10,000㎎, 0.1㎎ 내지 1000㎎, 1㎎ 내지 100㎎, 0.01㎎ 내지 1000㎎, 0.01㎎ 내지 100㎎, 0.01㎎ 내지 10㎎, 또는 0.01㎎ 내지 1㎎일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, ㎏당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 흡입, 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 상기 펩티드가 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 빈혈 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다. 상기 펩티드의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 건강식품 조성물은 상기 펩티드 이외에 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 조성물의 약제학적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하거나, 인 비트로(in vitro) 상에서 세포에 접촉시키거나, 인 비보(in vivo) 상에서 실험동물에 투여하는 단계를 포함하는 조혈장애의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
다른 양상은 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈장애의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다. 상기 펩티드의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 명세서 내 용어 "조혈장애"는 조혈작용에 결함이 생겨 혈구 생성이 정상적으로 이루어지지 못하는 상태를 의미하며 조혈장애는 다양한 길환을 야기할 수 있다. 구체적으로, 상기 질환은 재생 불량성 빈혈, 악성 림프종 또는 백혈병, 만성 간 장애, 신부전, 중증 감염증, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 혈소판 무력증, 림프구감소증, 호중구감소증, 단핵구감소증, 과립구감소증, 골수 형성이상 증후군 또는 골수 증식성 질환일 수 있다.
상기한 바와 같이, 일 양상에 따른 에리스로포이에틴 유래 펩티드는 세포의 증식 또는 분화를 촉진하고, 손상된 세포에 대하여 세포 보호 효과를 가질 뿐만 아니라 조혈 효과를 나타냄으로써 빈혈 질환, 조혈장애를 야기하는 다양한 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 펩티드는 에리스로포이에틴 수용체를 발현하는 지방조직, 췌장, 근육, 혈관 피부 등과 같은 조직에서 세포 증식 또는 분화를 유도할 수 있는바, 비만 및 당뇨, 근육 재생, 혈관 재생, 피부 재생 등과 같이 세포증식 효과를 필요로 하는 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
일 양상에 따른 조성물은 에리스로포이에틴 단백질 서열로부터 유래된 펩티드를 포함하는 것으로서, 종래의 천연 인간 에리스로포이에틴에 비해 간단한 구조를 가지므로 조직-혈관방어막(tissue-blood barrier)의 통과가 용이하고 세포 보호 활성이 우수하고, 세포 증식 부작용이 없으며, 조혈 기능을 개선할 수 있는바, 빈혈 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 생산비용이 적게 들어 경제적이므로 생체 조직으로의 수송이 용이하면서 세포증식 효과가 있는 에리스로포이에틴의 대체 물질로 활용될 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 에리스로포이에틴 유래 펩티드 및 그의 변형체를 나타내는 모식도이다.
도 2a~2c는 에리스로포이에틴 유래 펩티드가 에리스로포이에틴 수용체에 작용할 수 있는지 알아보기 위해 SPR 기법을 통해 결합 강도를 확인한 그래프이다.
[규칙 제91조에 의한 정정 28.10.2019]　
도 3a~3d는 에리스로포이에틴 유래 펩티드(ML1, ML1-C1, ML1-C2, ML1-C3, ML1-H1, ML1-H2 및 ML1-H3)의 2차 알파 헬릭스 형성을 확인한 사진이다.
도 4a~4d는 에리스로포이에틴 유래 펩티드 처리를 통해 과산화수소에 의해 활성 산소가 증가된 세포에서 세포 보호 효과를 확인한 그래프이다.
도 5는 에리스로포이에틴 유래 ML1 펩티드의 일부 서열 변형 펩티드(ML1-L2, ML1-K2 및 ML1-R2)의 (a) 분화된 PC12 세포 및 (b) 인간 SH-SY5Y 세포에서의 세포 보호 효과를 확인한 그래프이다.
도 6은 에리스로포이에틴 유래 ML1 펩티드의 일부 서열 변형 펩티드(ML1-L2, ML1-K2 및 ML1-R2)의 세포증식률을 확인한 그래프이다.
도 7은 에리스로포이에틴 유래 펩티드 및 일부 서열 변형 펩티드의 세포 증식률을 확인한 그래프이다.
도 8은 일 구체예의 에리스로포이에틴 수용체(EPOR) 및 에리스로포이에틴(EPO)의 결합체 구조 및 결합 타겟 지역을 도시한 그림이다.
도 9는 에리스로포이에틴 유래 펩티드 및 일부 서열 변형 펩티드의 세포 보호 및 증식 효과를 확인한 그래프이다.
도 10은 에리스로포이에틴 유래 펩티드(MLP, MLP-C, MLP-H)의 생체 내 투여에 의해 몸무게에 미치는 효과를 확인한 그래프이다.
도 11a~11d는 에리스로포이에틴 유래 펩티드(MLP, MLP-C, MLP-H)의 생체 내 투여에 의한 조혈 효과를 확인한 그래프이다.
도 12a~12b는 에리스로포이에틴 유래 펩티드(MLP-C, MLP-H) 및 에리스로포이에틴(EPO)의 에리스로포이에틴 수용체에 대한 활성화 조절 효과를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 에리스로포이에틴 유래 펩티드의 합성
본 발명의 에리스로포이에틴 유래 펩티드는 종래 공지된 고상 합성(Solid Phase Peptide Synthesis)기술에 따라 단량체로 합성하였다(Peptron, Daejeon, Korea).
구체적으로, 천연 에리스로포이에틴 수용체의 타겟 지역(site 2)의 서열 중 중요한 아미노산 서열(Arg103, Ser104, Leu105, Leu108 및 Arg110)에 결합할 수 있는 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 합성하였으며, 상기 펩티드 각각의 구체적인 특성을 확인하였다. 상기 합성된 펩티드의 농도를 측정하기 위해 액체크로마토그래피/질량 선택 검출기(liquid chromatography/mass selective detector)(HP 1100 series)를 이용하였다. 순도의 측정은 고성능 액체크로마토그래피(SHIMADZU prominence HPLC) 분석에 의해 수행되었다(> 95% purity). 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 하기 표 1에 나타냈다.
펩티드 이름 서열 서열번호 펩티드 이름 서열 서열번호
ML1 LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALG 1 ML1-1 LQLHV L K R VSGL L S H T M LL K ALG 9
ML2 LHVDKAVSGLRSLTTLLRAL 2 ML2-1 R HV Q KA E SGLRSLT K LLR E L 10
ML3 TKVNFYAWKR 3 ML3-1 TRVN YQ AWKR 11
ML4 DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAI 4 ML4-1 K KAVSGL KT LT HI LRALGAQKEAI 12
ML5 SGLRSLTTLLRALG 5 ML5-1 A GLRS RAH L R RAL A 13
ML6 SGLRSLTTLLRALGAQKEAI 6 ML6-1 K GLRSL IS LLRALGAQKEAI 14
ML7 WEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRAL 7 ML7-1 D EAL D L E VDKA AT GLR T LTTL I RAL 15
ML8 DKAVSGLRSLTTLLRAL 8 ML8-1 N KAV A GLRSLT VN 16
에리스로포이에틴 유래 펩티드 ML1-1, ML2-1, ML3-1, ML4-1, ML5-1, ML6-1, ML7-1 및 ML8-1에 대해서 소수성(hydrophodicity), 전하(Charge) 및 등전점(isoelectric point, pI)을 계산하였으며, 하기 표 2에 나타냈다.
펩티드 이름 소수성(Hydrophobicity) Charge(pH 7) pI 타겟지역
ML1-1 8.25 3.4 11.2 2
ML2-1 -4.45 3.2 10.94 2
ML3-1 -10.07 2.9 10.94 1
ML4-1 5 6.1 11.41 2
ML5-1 -4.15 4.1 12.48 2
ML6-1 8.85 2.9 10.94 2
ML7-1 2.05 -2.1 4.59 2
ML8-1 5.7 1.9 11.12 2
실시예 2. 일부 서열을 이용한 에리스로포이에틴 유래 펩티드(1)
시퀀스의 변화 실험을 위해 에리스로포이에틴과 그 수용체의 결합 모형은 이미 알려진 결합 구조(Protein Data Bank ID: 1EER)를 바탕으로 하였다. 알려진 아미노산의 특성을 바탕으로 에리스로포이에틴 유래 펩티드의 아미노산을 치환 하였다. 아미노산 곁사슬의 극성에 따라 4종(① 비극성 혹은 소수성, ② 중성, ③ 음전하, ④ 양전하)으로 분류된다. 이렇게 비극성(소수성), 중성, 음전하, 또는 양전하를 띄는 아미노산의 정보를 이용하여, 기존의 아미노산 서열을 치환하여 각 특성의 변화를 유도하였다.
ML1 펩티드의 일부 서열을 변화시킨 펩티드 및 이들의 특징을 하기 표 3 및 표 4에 나타냈다.
펩티드 이름 서열 서열번호
ML1 LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALG 1
ML1-H1 LQLHV L KAVSGLL T HTTLLKALG 17
ML1-H2 LQLHV L KAVSGLL T LT MIR RALG 18
ML1-H3 LQLHV L KAV A GLR T L AMIR RAL A 19
펩티드 이름 잔기 수 분자량 흡광계수 등전점 순 전하(pH 7) 예측 용해도
ML1 23 2461.9 g/mol 0 M-1cm-1 pH 11.23 2.1 물에 대한 용해도 낮음
ML1-H1 23 2426.94 g/mol 0 M-1cm-1 pH 10.73 2.2 물에 대한 용해도 낮음
ML1-H2 23 2504.09 g/mol 0 M-1cm-1 pH 12.13 3.1 물에 대한 용해도 낮음
ML1-H3 23 2515.12 g/mol 0 M-1cm-1 pH 12.41 4.1 물에 대한 용해도 낮음
실시예 3. 일부 서열을 이용한 에리스로포이에틴 유래 펩티드(2)
상기 실시예 2와 동일한 ML1 기본 서열을 이용하여 펩티드의 일부 아미노산을 치환하였다. 이때, 기존의 에리스로포이에틴과 그 수용체의 결합 모형을 바탕으로 치환된 아미노산이 기존의 결합 형태(단백질 간 거리 또는 단백질 구조)를 해치지 않도록 하였다. 도 8은 아미노산 서열 치환의 예시를 나타낸 것으로, 알라닌(Ala)을 아르기닌(Arg)으로 치환하는 경우 기존의 결합을 방해하게 되므로 세린(Ser)으로 치환해야 결합 방해를 없앨 수 있다.
ML1 펩티드의 전하를 변화시킨 펩티드 및 이들의 특징을 하기 표 5 및 표 6에 나타냈다.
펩티드 이름 서열 서열번호
ML1-C1 L D L E VDKAVSGLRSLTTLLRALG 20
ML1 LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALG 1
ML1-C2 LQ R HVDK R VSGLRSLTTLLRALG 21
ML1-C3 LQ R HV K K R V K GL K SLTTLLRALG 22
펩티드 이름 잔기 수 분자량 흡광계수 등전점 순 전하(pH 7) 예측 용해도
ML1-C1 23 2440.83 g/mol 0 M-1cm-1 pH 6.96 0 물에 대한 용해도 높음
ML1 23 2461.9 g/mol 0 M-1cm-1 pH 11.23 2.1 물에 대한 용해도 낮음
ML1-C2 23 2590.04 g/mol 0 M-1cm-1 pH 12.12 4.1 물에 대한 용해도 높음
ML1-C3 23 2616.21 g/mol 0 M-1cm-1 pH 12.45 7.1 물에 대한 용해도 높음
실시예 4. 일부 서열을 이용한 에리스로포이에틴 유래 펩티드(3)
상기 ML1 기본 서열 중 일부 "LHVDKAVSGLRSLTTL"를 이용하여 다음의 표 7과 같이 양 말단의 아미노산을 변화시킨 펩티드를 제작하였다.
펩티드 이름 서열 서열번호
ML1-L2 L HVDKAVSGLRSLTT L 23
ML1-K2 K HVDKAVSGLRSLTT K 24
ML1-R2 R HVDKAVSGLRSLTT R 25
실시예 5. 생체 내 활용을 위한 에리스로포이에틴 유래 펩티드(4)
상기 ML1, ML1-C3, ML1-H2의 서열을 이용하여 다음의 표 8과 같이 효율성과 안정성을 보완하기 위해 핵심 부위를 제외한 양 말단의 아미노산을 2개씩을 제거한 펩티드를 추가 제작하였다.
추가 제작된 MLP, MLP-C, MLP-H 펩티드의 서열 및 이들의 특징을 하기 표 8 및 표 9에 나타냈다.
펩티드 이름 서열 서열번호
MLP LHVDKAVSGLRSLTTLLRA 26
MLP-C R HV K K R V K GL K SLTTLLRA 27
MLP-H LHV L KAVSGL LT LT MIR RA 28
펩티드 이름 잔기 수 분자량 흡광계수 등전점 순 전하(pH 7) 예측 용해도
MLP 19 2050.41 g/mol 0 M-1cm-1 pH 11.23 2.1 물에 대한 용해도 높음
MLP-C 19 2204.71 g/mol 0 M-1cm-1 pH 12.45 7.1 물에 대한 용해도 높음
MLP-H 19 2590.04 g/mol 0 M-1cm-1 pH 12.13 3.1 물에 대한 용해도 낮음
[실험예]
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 에리스로포이에틴 수용체(EPOR)에 대한 결합 친화도(Binding affinity) 확인
상기 실시예 1 내지 3에서 제작한 에리스로포이에틴 유래 펩티드가 타겟 지역을 가지는 에리스로포이에틴 수용체에 결합하여 작용할 수 있는지 확인하고자 SPR(Surface plasmon resonance) 기법을 이용하여 결합 강도를 확인하였다. SPR 기법은 광학적 원리를 이용하여 특정한 표지 없이 실시간으로 생체분자(biomolecules) 사이의 상호작용을 측정하는 것으로 두 분자 간의 친화력과 동역학(kinetics), 즉 Ka (association rate) 및 Kd (dissociation rate)를 분석하는 시스템이다.
구체적으로, 실시간 SPR 분석은 Reichert SPR Biosensor SR 7500C 장비(Reichert Inc., NY, USA)를 사용하여 수행하였다. 수용체 마우스 EPOR 키메라 단백질(Soluble mouse EPOR chimera protein)(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)은 제조사의 메뉴얼에 따라 아민 커플링 키트(BR-1000-50, GE Healthcare, USA)를 이용한 아민 커플링 절차에 의해 카르복시 메틸화된 덱스트란 메트릭스가 코팅된 칩(BR-1005-39, Pharmacia Biosensor AB) 상에 공유결합시켰다. 본 발명의 5, 2.5 및 1.25 μM의 각각의 펩티드 샘플 및 혼합된(scrambled) 펩티드는 5 ㎕/minute의 유속으로 흘렸으며 실험을 독립적으로 2회 반복 수행하였다. 신호의 정상화(normalize)를 위해 DMSO를 5 ㎕/minute으로 흘렸고, 각각의 결합 사이클 이후, 센서 칩은 25 mM의 아세트산을 20 ㎕/minute로 주입함으로써 재생하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 일 구체예의 에리스로포이에틴 유래 펩티드 농도에 따라 결과값이 증가함으로 타겟 지역을 가지는 에리스로포이에틴 수용체에 결합함으로써 작용이 가능함을 확인하였다. 또한, 표 10 및 11에 나타난 바와 같이, 일 구체예의 에리스로포이에틴 유래 펩티드는 기존에 알려진 결합 친화도(~1 uM)와 유사하게 나타남을 확인하였다.
　 Ka Kd KD
ML1 1.311 x 103 8.5 x 10-3 6.46077 μM
ML2 1.6 x 10 4.4 x 10-3 273 μM
ML3 2.05 x 102 3 x 10-3 14.6341 μM
ML4 2.2 x 102 2.2 x 10-3 10 μM
ML5 3.04 x 102 0.1 x 10-3 0.32894 μM
ML6 5.0 x 10 4.5 x 10-2 900 μM
ML7 3.00 x 102 0.2 x 10-2 6.666 μM
ML8 1.8 x 102 0.8 x 10-1 444.44 μM
ML1-1 5.55 x 103 5.9 x 10-3 1.06 μM
ML2-1 3.1 x 102 4.1 x 10-3 14.3 μM
ML3-1 3.08 x 103 1.3 x 10-2 4.31 μM
ML4-1 4.10 x 102 1.20 x 102 39.34 mM
ML5-1 4.42 x 102 3.46 x 10-2 78.28 μM
ML6-1 1.9 x 102 3 x 10-2 157.8 μM
ML7-1 2.26 x 102 1.44 x 10-2 63.70 μM
ML8-1 6.4 x 10 1.5 x 10-1 2.37 mM
　 Km Ka Kd KD
ML1 1.26E+05 1310.8 8.47E-03 6.46077 μM
ML1-H1 4.79E+05 1.01E+03 7.94E-03 7.84542 μM
ML1-H2 1.00E+10 3434.3 1.05E-03 306.977 nM
ML1-H3 1.00E+10 4157.6 4.77E-03 1.14651 μM
ML1-C1 9.23E+05 1745.7 0.2617 149.921 μM
ML1-C2 4.58E+05 1.59E+03 0.01876 11.7609 μM
ML1-C3 1.46E+05 1104.9 0.01086 9.82836 μM
즉, 일 구체예에 따른 펩티드는 에리스로포이에틴 결합 사이트(binding site)에서 유래된 것으로서, 에리스로포이에틴 수용체에 대한 결합 친화도가 존재하는 것을 확인할 수 있다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 2차 알파 헬릭스 형성 확인
상기 실시예 2~3에서 합성한 에리스로포이에틴 유래 펩티드가 천연 에리스로포이에틴과 같이 안정된 알파 헬릭스(나선)를 형성하는지 알아보았다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2~3에서 합성한 에리스로포이에틴 유래 펩티드는 천연 에리스로포이에틴과 같은 안정된 2차 알파 헬릭스를 형성하는 것을 확인하였다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 세포보호 효과 확인(1)
상기 실시예 1 내지 3에서 제작한 에리스로포이에틴 유래 펩티드가 세포 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위해 과산화수소(H2O2)로 활성 산소 증가를 유도한 스트레스 상황에서 세포 생존력(cell viability)을 확인하였다.
구체적으로, 세포 생존력을 평가하기 위해, MTS 분석(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI, USA)을 사용하였다. PC12 세포를 96 웰 플레이트(웰 당 5x104 세포)에 접종하였고, 150 μM 과산화수소(H2O2)로 활성 산소 증가를 유도하였다. 이후, 양성 대조군으로써 NGF(nerve growth factor)를 25 ng/㎖ 첨가하였고, 에리스로포이에틴 화합물 1 IU/ml, 실시예 1의 펩티드를 각각 0.25, 1, 2 또는 4 pM, 실시예 2 및 3의 펩티드의 경우는 0.25, 1, 2, 10 또는 100 pM, 실시예 4의 펩티드의 경우는 0.1, 1, 50 pM 또는 0.5 nM을 첨가한 후, MTS 용액 20 ㎕를 각 웰에 첨가하여 3시간 두었다. 초기 세포수(0 시간) 및 48시간 후 세포수를 측정하였다. 세포 감소에 의해 생성된 세포 내 용해성 포르마잔은 490 nm의 파장에서 VERSA MAX를 이용하여 각 96 웰 플레이트의 흡광도를 기록함으로써 결정되었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 에리스로포이에틴 유래 펩티드는 활성 산소 증가로 인한 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 것을 확인하였다. 이는 천연 에리스로포이에틴 화합물 처리에 의한 세포 보호 효과와 비슷한 결과인 것을 확인할 수 있다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 세포 보호 효과 확인(2)
상기 실시예 4에서 제작한 에리스로포이에틴 유래 펩티드가 세포 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위해 과산화수소(H2O2)로 활성 산소 증가를 유도한 스트레스 상황에서 미토콘드리아의 활성(activity)을 확인하였다.
구체적으로, PC12 세포 또는 인간 SH-SY5Y 세포를 96 웰 플레이트(웰 당 5x104 세포)에 접종하였고, 150 μM 과산화수소(H2O2)로 활성 산소 증가를 유도하였다. 이후, 양성 대조군으로써 NGF(nerve growth factor)를 25 ng/㎖ 첨가하였고, 에리스로포이에틴 화합물 1 IU/㎖, 실시예 4의 펩티드 0.1, 1, 50 pM 또는 0.5 nM을 첨가하였다.
미토콘드리아의 활성이 억제되면 미토콘드라아 막전위의 이상으로 인한 미토콘드리아 팽윤, 활성산소종, 또는 자유 라디칼 등에 의한 산화적 스트레스로 인한 기능이상, 유전적 요인으로 인한 기능이상 및 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함으로 인한 기능이상이 발생한다. 따라서 미토콘드리아 막 전위를 측정함으로 활성 측정을 할 수 있게 된다. 미토콘드리아에 TMRM(tetramethylrhodamine methyl ester) 염색을 하였으며, 미토콘드리아의 막 전압에 비례하여 TMRM 염색 수준이 증가하므로 microplate reader(excitation, 485 ㎚; emission, 535 ㎚)를 통해 TMRM 염색수준을 측정함으로써 세포 내 미토콘드리아의 막 전압을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 에리스로포이에틴 유래 펩티드는 활성 산소 증가로 인한 미토콘드리아 활성 저해를 억제하는 것을 확인하였다. 이는 천연 에리스로포이에틴 화합물 처리에 의한 효과와 비슷한 결과인 것을 확인할 수 있다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 세포 증식 억제 효과 확인
상기 실시예 4에서 제작한 3개의 펩티드(ML1-L2, ML1-K2 및 ML1-R2)의 세포 증식과 같은 부작용을 확인하였다.
구체적으로, 세포 증식 정도를 확인하기 위해, MTS 분석(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI, USA)을 사용하였다. PC12 세포를 96 웰 플레이트(웰 당 5x104 세포)에 접종하였고, 음성 대조군으로써 Scr(scrambled peptide)를 1 pM, 에리스로포이에틴 화합물 0.5, 1 또는 10 IU/ml, 실시예 4의 펩티드 1, 10 pM, 0.5 nM을 첨가한 후, MTS 용액 20 ㎕를 각 웰에 첨가하여 3시간 두었다. 초기 세포수(0 시간) 및 48시간 후 세포수를 측정하였다. 세포 감소에 의해 생성된 세포 내 용해성 포르마잔은 490 nm의 파장에서 VERSA MAX를 이용하여 각 96 웰 플레이트의 흡광도를 기록함으로써 결정되었다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 같이 펩티드 모두 세포증식률이 대조군과 유사하였으며, 세포증식 부작용이 없는 것을 확인하였다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 세포 증식 억제 및 증강 효과 확인
상기 실시예 1 내지 3에서 제작한 펩티드의 세포 증식과 같은 부작용을 확인하기 위하여, 세포 생존율을 MTT assay 법에 따라 평가하였다.
구체적으로, PC12 세포주를 10% 우태아 혈청 (FBS, Hyclone, UT, USA)과 100 unit/ml 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Hyclone, UT, USA)을 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양액 (Hyclone, USA)과 RPMI1640 배양액 (Hyclone, UT, USA)으로 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 37℃조건으로 배양하였다. PC12 세포주를 5Х104 cells/㎖의 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 이후, 상기 세포에 실시예 1 내지 3에서 제작한 펩티드를 10 ng/㎖의 농도로 제조하여 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT(3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 시약을 20 ㎕씩 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 200 ㎕의 DMSO (dimethyl sulfoxide, Duksan, Gyeonggi-do, Korea)를 첨가하여 형성된 포마젠 (formazan)을 모두 녹인 뒤 마이크로플레이트 리더기 (microplate reader, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 펩티드 대부분의 세포증식률이 대조군과 유사하였으나, ML1-C2 및 ML1-C3의 경우, 천연 에리스로포이에틴과 비슷한 수준의 세포 증식 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 펩티드는 천연 에리스로포이에틴과 유사한 세포 증식 효과를 가짐으로써 대체 물질로 활용될 수 있다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 세포 보호 및 증식 효과 비교
상기 실시예 3에서 제작한 7개의 펩티드(ML1, ML1-C1, ML1-C2, ML1-C3, ML1-H1, ML1-H2, ML1-H3)의 세포 보호 및 증식 효과를 EPO와 통계적으로 비교하였다.
구체적으로, 도 4와 도 7에서의 효과를 EPO에 의한 효과를 기준으로 보정하여 정량화한 후, K평균 알고리즘(K-means clustering algorithm)을 통해 클러스터링을 수행하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, ML1-C1, ML1-C2와 ML1-C3는 세포 보호 및 효과 면에서 EPO와 비슷한 효과를 가진 것으로 클러스터링 되었다. 반면, ML1, ML1-H1, ML1-H2, ML1-H3은 세포 보호 효과면에서는 EPO 그룹들과 큰 차이를 보이지 않으나, 세포 증식 효과 면에서는 큰 차이를 보이는 것으로 분석되었다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 in vivo 조혈 효과 확인
상기 실시예 5에서 제작한 펩티드 MLP, MLP-C, MLP-H의 생쥐 생체 내에서 조혈 활성을 측정하였다.
구체적으로, 제작한 펩티드 또는 음성 대조군으로써 Scr(scrambled peptide)를 0 ㎍/㎏, 1 ㎍/㎏, 100 ㎍/㎏을 14일 동안 매일 반복적으로 생쥐에 복강 주사를 통해 투여하였다. 이후, 체중 검사 및 혈액 검사를 수행하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 모든 펩티드는 생쥐에 대하여 유의적인 체중 변화를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 11a에 나타난 바와 같이 MLP-C를 처리한 생쥐에서만 혈액 중 적혈구가 차지하고 있는 용적의 비중인 헤마토크릿(hematocrit)이 투여 용량에 따라 유의미하게 증가하였으며, 도 11c에 나타난 바와 같이, 100 ㎍/㎏를 투여한 생쥐의 경우, 적혈구 수와 혈색소(헤모글로빈)의 함량, 평균적혈구혈색소농도(MCHC) 평균적혈구혈색소(MCH)가 유의미하게 증가됨을 확인할 수 있었다. 반면, 도 11d에 나타난 바와 같이, 혈소판 수치는 크게 변화하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 펩티드는 생체 내에서 조혈작용을 유도할 수 있는바, 조혈 기능을 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 조혈장애의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
에리스로포이에틴 유래 펩티드의 에리스로포이에틴 수용체(EPOR)에 대한 활성화 조절 확인
상기 실시예 5에서 제작한 펩티드 중 MLP-C, MLP-H에 의한 에리스로포이에틴 수용체의 활성화 정도를 천연 에리스로포이에틴과 비교하였다.
구체적으로, 녹색형광단백질을 퓨전(fusion)한 에리스로포이에틴 수용체를 발현할 수 있는 DNA 플라스미드를 HEK293 세포주에 유전자 도입하고 녹색형광단백질을 퓨전한 에리스로포이에틴을 안정적으로 발현하는 stable 세포주를 제작하였다. 양성 대조군으로서 EPO, MLP-C 또는 MLP-H를 처리한 후 0분, 30분, 60분, 90분에 샘플링하여 웨스턴블랏을 수행한 후 에리스로포이에틴 수용체의 활성도를 ERK1/2의 인산화 정도를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, EPO와 MLP-C는 30분에 최대 활성을 나타내고 이후 감소하는 반면, MLP-H는 30분 이후에도 활성화가 지속되었음을 확인하였다. 즉, MLP-C는 에리스로포이에틴 수용체에 대하여 짧지만 강한 활성화를 나타내는 반면, MLP-H는 약하지만 장시간 동안의 활성화를 나타내는 바, 일 양상에 따른 에리스로포이에틴 유래 펩티드는 에리스로포이에틴 수용체의 활성화를 조절할 수 있다. 따라서, 세포 증식 효과를 필요로 하는 빈혈 등과 같은 질환의 치료제로 이용될 수 있다.

Claims (19)

  1. 서열번호 26 내지 28로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 서열로 기재되는 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드는 에리스로포이에틴(erythropoietin) 단백질 서열로부터 유래된 것인 펩티드.
  3. 서열번호 1 내지 25로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 세포증식 또는 분화 촉진용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 펩티드는 에리스로포이에틴 수용체에 결합하는 것인 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 펩티드는 알파 헬릭스 구조를 형성하는 것인 조성물.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 펩티드는 세포보호 활성을 갖는 것인 조성물.
  7. 청구항 3에 있어서, 상기 세포는 조혈모세포, 지방세포, 췌장세포, 근육세포, 혈관세포 또는 피부세포인 것인 조성물.
  8. 서열번호 1 내지 25로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈 기능 개선용 조성물.
  9. 서열번호 1 내지 25로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 빈혈 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 조성물은 조혈줄기세포의 증식을 촉진시키는 것인 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 급성 또는 만성 빈혈, 신장 질환에 의한 빈혈, 신부전에 의한 빈혈, 혈액 질환에 의한 빈혈, 방사선요법-유발 빈혈, 화학요법-유발 빈혈, 수술 과정에 의한 빈혈, 감염에 의한 빈혈, 영양결핍성 빈혈, 비정상적인 적혈구생성, 조산의 초기 빈혈 및 이들의 혼합 질환로 구성된 군에서 선택된 것인 조성물.
  12. 서열번호 1 내지 25로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 빈혈 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
  13. 서열번호 1 내지 25로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 조혈장애는 재생 불량성 빈혈, 악성 림프종 또는 백혈병, 만성 간 장애, 신부전, 중증 감염증, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 혈소판 무력증, 림프구감소증, 호중구감소증, 단핵구감소증, 과립구감소증, 골수 형성이상 증후군 및 골수 증식성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
  15. 서열번호 1 내지 25로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조혈장애의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
  16. 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 빈혈 질환을 치료하는 방법.
  17. 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조혈장애를 치료하는 방법.
  18. 빈혈 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위하여 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물의 용도.
  19. 조혈장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위하여 서열번호 1 내지 28로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물의 용도.
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