CN111278444A - 含有dna片段混合物及基质金属蛋白酶生成抑制剂的用于预防及治疗关节炎的组合物 - Google Patents
含有dna片段混合物及基质金属蛋白酶生成抑制剂的用于预防及治疗关节炎的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于预防及治疗关节炎的组合物，该用于预防及治疗关节炎的组合物含有可解决使用DNA片段混合物预防及治疗关节炎时诱发基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease；MMP)生成的问题的基质金属蛋白酶生成抑制剂与DNA片段混合物而抑制基于炎症的疼痛并且可让软骨再生，其能抑制DNA片段混合物所导致的基质金属蛋白酶的生成而能够不发生副作用并且有效地应用于软骨细胞的增殖效果、损伤的软骨细胞的修复能力、软骨再生效果及关节炎改善效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于预防及治疗关节炎的组合物，该用于预防及治疗关节炎的组合物含有能可解决使用DNA片段混合物预防及治疗关节炎时诱发基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotease；MMP)生成的问题的基质金属蛋白酶生成抑制剂与DNA片段混合物，从而抑制基于炎症的疼痛并且可让软骨再生。
背景技术
关节炎指的是细菌或外伤之类的各种原因导致关节内部炎症性变化而诱发的疾病，关于关节炎的发生频度方面，60岁以上人口的大约30％左右患有关节炎，根据国外统计，关节炎是除了心脏病以外最常发生的疾病。不仅如此，根据保健社会研究院的最新调查报告得知，韩国50岁以后的人口中关节炎超过糖尿病和高血压成为了发病率最高的疾病。
因此，很多研究者预测关节炎将会和癌或心血关系疾病一起成为21世纪影响人类生活品质的最重要疾病。
另一方面，关节炎主要分为非炎症性关节炎和炎症性关节炎，非炎症性关节炎以骨关节炎为代表，炎症性关节炎则以类风湿性关节炎为代表。
退行性关节炎指的是下列疾病，亦即，构成关节的软骨细胞(chondrocytes)发生老化之类的退行而使得软骨细胞中关节基质物质II型胶原蛋白(type II collagen)及蛋白聚糖(proteoglycan)等的合成遭到阻碍，与此同时，生成IL-1β(interlekin-1β)及肿瘤坏死因子之类的炎症性细胞因子(cytokine)而使得分解关节基质的基质金属蛋白酶(matix metalloproteinase；MMP)的合成及活性在关节细胞上增加，从而使得关节组织被破坏而诱发的疾病。
因此，治疗关节炎时的目的不仅是减轻关节的疼痛与炎症或者抑制MMP的活性地预防关节变形，更跟本的目的是找出诱发关节炎的细胞内作用机制并且控制该机制。
另一方面，目前临床上治疗退行性关节炎时使用药物治疗剂(镇痛剂、类固醇剂、非类固醇系抗炎药等)或软骨保护剂(透明质酸、氨基葡萄糖、软骨素等)或者进行手术处理(关节镜手术、胫骨高位截骨术、关节部分置换术、全膝关节置换术等)。
然而，药物治疗剂只能非特异性地缓和疼痛或炎症反应本身，软骨保护剂仅仅是为软骨细胞供应营养或缓和冲击地保护关节。而且这些药物会出现体重增加、诱发高血压、诱发消化性溃疡之类的副作用。
为此，大韩民国专利公开公报第10-2013-0044195号“含有从鱼类精巢分离出来的DNA片段混合物的软骨再生用组合物”及大韩民国专利公开公报第10-2017-0100236号“含有DNA片段混合物的用于预防或改善关节炎的健康功能食品”揭示了下列技术，利用取自鱼类精巢等处的DNA片段混合物的软骨细胞增殖效果、损伤的软骨细胞的修复能力、软骨再生效果及关节炎改善效果应用于关节炎的预防及治疗。
先前技术文献
专利文献
专利文献1:大韩民国专利公开公报第10-2013-0044195号
专利文献2:大韩民国专利公开公报第10-2017-0100236号
发明内容
但是,把DNA片段混合物适用于关节炎的预防及治疗时，会诱导对关节炎造成恶劣影响的基质金属蛋白酶(matix metalloproteinase；MMP)的生成，不解决该问题的话，利用DNA片段混合物预防及治疗关节炎的效果也会减少过半。
因此，本发明要解决的课题是提供一种新的用于预防及治疗关节炎的组合物，其解决DNA片段混合物诱发基质金属蛋白酶生成的问题。
为了解决上述技术课题，
本发明提供一种用于预防及治疗关节炎的组合物，其含有DNA片段混合物与基质金属蛋白酶生成抑制剂。
根据如前所述的本发明用于预防及治疗关节炎的组合物，优选地，上述基质金属蛋白酶生成抑制剂是氨基葡萄糖(glucosamine)或它的药学上允许的盐。
根据如前所述的本发明用于预防及治疗关节炎的组合物，优选地，上述基质金属蛋白酶生成抑制剂是N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-glucosamine；NAG)或它的药学上允许的盐。
根据如前所述的本发明用于预防及治疗关节炎的组合物，优选地，上述基质金属蛋白酶生成抑制剂是蒜氨酸(Alliin)或它的药学上允许的盐。
根据如前所述的本发明用于预防及治疗关节炎的组合物，优选地，上述基质金属蛋白酶生成抑制剂是丁酸钠(Sodium butyrate(SB))。
根据如前所述的本发明用于预防及治疗关节炎的组合物，优选地，上述基质金属蛋白酶生成抑制剂是硫酸软骨素(Chondroitin sulfate(CS))。
本发明的用于预防及治疗关节炎的组合物能抑制DNA片段混合物所导致的基质金属蛋白酶的生成，因此能不发生副作用地、有效地应用于软骨细胞的增殖效果、损伤的软骨细胞的修复能力、软骨再生效果及关节炎改善效果。
附图说明
图1是示出DNA片段混合物对于在10ng/ml的IL-β刺激的SW-1353细胞的(A)MMP-3和(B)MMP-13的表达上所造成的效果的图表。
图2是示出处理不同浓度的DNA片段混合物所导致的SW-1353细胞的运动变化的显微镜照片。Gap distance是500μm。
图3是示出DNA片段混合物对于SW-1353细胞的生存率所造成的效果的图表及显微镜照片。A图表的值是mean±SE(n＝3)，B图像的比例尺单位(Scale bar unit)是1000μm。
图4是示出氨基葡萄糖对于在10ng/ml的IL-β刺激的SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图5是示出N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)对于在10ng/ml的IL-β刺激的SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图6是示出蒜氨酸(Alliin)对于在10ng/ml的IL-β刺激的SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图7是示出丁酸钠(SB)对于在10ng/ml的IL-β刺激的SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图8是示出硫酸软骨素(CS)对于在10ng/ml的IL-β刺激的SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图9是示出SW-1353细胞的3D动态(3D dynamic)培养模型的照片。A：用于SW-1353细胞的3D动态培养的scheme，B：Top-view图像，C：Cross-section图像，B的比例尺单位是500μm，C是200μm。
图10是示出3D动态培养模型中SW-1353细胞的形态(morphology)的照片。比例尺单位是500μm。
图11是示出3D培养期间其它胶细胞基质(gel-cell matrix)中SW-1353细胞的形态的照片。比例尺单位是200μm，Green(calcein AM)：Live,Red(EthD-1)：Dead,Blue(Hoechst)：Nuclei。
图12是示出DNA片段混合物对于在3D 10％血清-与无血清(serum-free)状态下被IL-β刺激的SW-1353细胞的(A)MMP-3和(B)MMP-13的表达所造成的效果的图表。
图13是示出DNA片段混合物对于在无血清状态下被IL-β刺激的SW-1353细胞的(A)MMP-3和(B)MMP-13的表达所造成的效果的图表。
图14是示出氨基葡萄糖对于在10ng/ml的IL-β刺激的3D SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图15是示出N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)对于在10ng/ml的IL-β刺激的3D SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图16是示出蒜氨酸(Alliin)对于在10ng/ml的IL-β刺激的3D SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图17是示出丁酸钠(SB)对于在10ng/ml的IL-β刺激的3D SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
图18是示出硫酸软骨素(CS)对于在10ng/ml的IL-β刺激的3D SW-1353细胞中MMP-3与MMP-13的表达所造成的效果的图表。试料的浓度是A-B：0μg/ml、C-D:10μg/ml、E-F:100μg/ml、G-H:1000μg/ml。
具体实施方式
下面详细说明本发明。
在为了通过2D、3D体外人软骨细胞模型(model)找出作为关节炎治疗剂的DNA片段混合物在细胞内的作用机制而进行试验的过程中，发现DNA片段混合物对基质金属蛋白酶(matix metalloproteinase；MMP)的生成问题，尤其是发现基质金属蛋白酶(matixmetalloproteinase；MMP)-13的生成问题而有了本发明。
因此，本发明揭示了以含有DNA片段混合物与基质金属蛋白酶生成抑制剂为特征的用于预防及治疗关节炎的组合物。
而且，本发明通过立体培养细胞的3D动态培养模型大幅提高了用于预防及治疗关节炎的组合物的安全与效率预测，因此能比2D培养方式更准确地确认人体反应。
本发明的另称为PDRN(polydeoxyribonucleotides)的DNA片段混合物是从鱼类，更具体地说，是从鳟鱼、鲑鱼等鱼类的精液乃至精巢制备后以减低了分子量的片段形态的状态混合存在的，其作为构成细胞的必需成分而能将其混合物适用于下列诸多用途：把它们的混合物注入创伤部位等处而发挥出创伤部位的治疗及改善、基于软骨再生效果而以关节炎治疗及改善为用途的医药品,健康功能性食品或以关于细胞活性的皱纹改善等为目的的化妆品、食品添加物、生化实验材料等。
本发明把DNA片段混合物用于关节炎的预防及治疗，其基本用途已为人知，本发明中也会直接利用上述已为人知的基本效果及机制，其可如下举例：大韩民国专利公开公报第10-2013-0044195号“含有从鱼类精巢分离出来的DNA片段混合物的软骨再生用组合物”及大韩民国专利公开公报第10-2017-0100236号“含有DNA片段混合物的用于预防或改善关节炎的健康功能食品”、PCT国际专利WO 2010/049898Al“INJECTABLEPOLYDEOXYRIBONUCLEOTIDE COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTICULARDISEASES”、公开发表的论文“Polydeoxyribonucleotide(PDRN)promotes humanosteoblast proliferation：A new proposal for bone tissue repair(Life Sciences73(2003)1973-1983)”及“Protective effects of polydeoxyribonucleotides oncartilage degradation in experimental cultures(Cell Biochem Funct 2013；31：214-227)”等。
上述本发明对于所使用的DNA片段混合物的分子量、粘度等没有特别限制，也没有特别限制制备方法，作为制备方法的一例，利用粉碎机把虹鳟鱼(是一种在海里养殖的鳟鱼，在韩国也称为海鳟鱼)的精巢和精制水及氯化钠一起予以粉碎后，在粉碎的精巢上进一步添加蒸馏水，投入十二烷基硫酸钠(以下称为“SDS”)后在100～105℃下反应4～5小时减少分子量，冷却到室温，在15,000rpm进行离心分离清除精巢渣滓并且予以过滤，在乙醇慢慢添加过滤液就能制成白色的DNA片段混合物，可以利用乙醇乃至无水乙醇对其进行脱水、过滤、干燥地提高纯度后使用。
而且，只要是本发明所属技术领域中广为人知者，本发明也不会特别限制上述基质金属蛋白酶生成抑制剂，作为一例，可以举例氨基葡萄糖或它的药学上允许的盐、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)、蒜氨酸(Alliin)、丁酸钠(SB)及硫酸软骨素(CS)。
下面通过针对DNA片段混合物、作为基质金属蛋白酶生成抑制剂的氨基葡萄糖(glucosamine)、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)、蒜氨酸(Alliin)、丁酸钠(SB)及硫酸软骨素(CS)进行的试验详细说明本发明。
<试验方法>
1.细胞培养
在添加了10％的FBS(fetal bovine serum)和1％的抗生素-抗真菌剂的DMEM(Dulbecco Modified Eagle's medium)培养了人软骨肉瘤细胞株SW-1353(HTB-94,ATCC,Mansassas,VA,USA)。细胞培养incubator维持了37℃，5％CO2。在细胞培养期间，细胞以1.2x104cells/cm2接种(seed)到培养瓶，达到80-90％的融合度(confluence)时进行了胰蛋白酶(trypsin)处理。细胞经过9次继代培养后用于实验。
2. 3D培养
SW-1353细胞是在添加或没有添加DNA片段混合物(polydeoxyribonucleotides(PDRN)、450kDa,sterilized,BR Pharm Co,Wonju,South Korea)的3D胶原水凝胶生长的。从2D培养得到SW-1353细胞，测量了培养液里的细胞数量。之后，把这些细胞予以spin down后冷却。为了把DNA片段混合物作为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)添加物用于3D软骨细胞，把10mg/ml浓度的DNA片段混合物溶解到10X PBS，利用10X PBS稀释到0μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml的浓度。把含有不同浓度的DNA片段混合物的10X PBS和利用DMEM稀释到4mg/ml浓度的rat tail胶原蛋白I型溶液按照1:10的比例混合后，利用NaOH把pH调整到7.0-7.4。之后，为了防止气泡进入胶原蛋白溶液而谨慎地混合了细胞。为了建立3Dgel-cell而在各个well以2μl注入了该溶液。把Gel放入incubator(37℃，5％CO2)45分钟，3D胶细胞基质则在不含有血清(serum)的培养液暴露了48小时。为了DNA片段混合物drug screen，在SW-1353细胞充分生长后利用培养液处理了不含有血清的DNA片段混合物。
3.以已知的criteria control进行DNA片段混合物监控
以glucosamine(GLN)、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)、蒜氨酸(Alliin)、丁酸钠(SB)及硫酸软骨素(CS)0.1-10mM以及DNA片段混合物10-1000μg/ml处理了SW-1353细胞24小时，为了进行MMP的表达分析而以10ng/ml浓度的IL-β给予刺激。
4.MMP-3与MMP-13的分析
为了评估MMP的表达，把IL-β溶解到不含有血清的DMEM培养液并且把最终浓度调整成10ng/ml浓度后使用。细胞则在37℃、5％CO2下进行了培养。采取细胞培养上清液并且予以离心分离后，在-80℃下一直保管到进行实验为止。培养上清液里的MMP-3与MMP-13的量则使用商业上允许的ELISA(enzyme-linked immunosorbent assays)依据制备厂商的protocol进行了测量。
5. 3D结构下细胞的活体染色
在常温下以calcein AM,ethidium homodimer 1(EthD-1)，Hoechst把3D培养的SW-1353细胞染色30分钟。之后，利用PBS漂洗细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜(ZEISS,LSM710)测量了PBS上的细胞。利用ZEN software针对各颜色获取了图像。
6.测量细胞生存率
SW-1353细胞(5x103cells/well)在96孔板培养了24小时。培养液则以没有添加血清的各种浓度的DNA片段混合物予以更换。24小时后，把10μl的CCK-8添加到各孔(well)。incubation了2小时后，细胞生存率则以microplate reader(CLARIOstar,BMG,USA)测量了450nm处的吸光度。
7.细胞层运动(migration)分析
使用ibidi Culture-insert进行了体外运动分析。SW-1353细胞在Culture-insert dish培养24小时而成为单层(monolayer)时，清除了Culture-insert。为了清除剩下的细胞debris，利用培养液漂洗了细胞两次。之后，在不含有血清的培养液或不含有血清但含有各种浓度的DNA片段混合物的培养液培养了单层细胞。控制组的细胞则只在培养液进行了培养。细胞的运动则是利用显微镜(EVOS fl,AMG)观察图像地进行了测量。
8.统计分析
各数值得自各个样本，数值则利用至少3次实验结果以平均±标准误差表示。
<实验结果>
1. 2D培养模型
1.1 DNA片段混合物对MMP的表达的效果
如图1所示，在以0、10、100、1000μg/ml的浓度含有DNA片段混合物的培养液(noserum)培养了对照组SW-1353细胞。实验组则和对照组维持相同条件地添加10ng/ml浓度的IL-β后进行了培养。
其结果，如图1A所示，MMP-3的表达数值不受DNA片段混合物浓度影响地在添加了IL-β(10ng/ml)的实验组有所增加。但如图1B所示，MMP-13的表达数值则随着DNA片段混合物浓度增加而跟着增加。
1.2由于DNA片段混合物处理而导致的SW-1353细胞的运动变化
如图2所示，为了确认DNA片段混合物在SW-1353细胞的运动(migration)上发挥的作用而利用2D创伤治疗assay调查了DNA片段混合物对运动造成的效果。把SW-1353细胞以0、10、100、1000μg/ml的浓度处理2天后，通过显微镜观察了0h、24h、48h后的细胞运动。
其结果，和不含有DNA片段混合物的控制组相比，以1000μg/ml的浓度处理了DNA片段混合物的组中软骨肉瘤细胞的运动显著地减少。
1.3 DNA片段混合物对SW-1353细胞的生存率所造成的效果
关节炎最显著的变化就是软骨恶化。为了评估软骨保护效果，针对SW-1353细胞以0、10、100、1000μg/ml的浓度利用DNA片段混合物处理了2天，利用CCK-8assay评估了细胞增殖。这也能评估医药品和有毒材料的细胞毒性潜力。
其结果，如图3所示，相比于控制(control)组，10μg/ml浓度的DNA片段混合物处理结果抑制了SW-1353细胞的生长，在100、1000μg/ml也没有发生细胞显著增殖的效果。而且，以显微镜图像观察生存细胞的结果表明，也没有发现细胞毒性的效果。
因此，相比于控制组，DNA片段混合物会根据DNA片段混合物的浓度而呈现出强大的抗增殖活性。
1.4 glucosamine(GLN)对MMP的表达所造成的效果
在上述1.1里的实验确认了DNA片段混合物能诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的glucosamine(GLN)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图4所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的glucosamine(GLN)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的glucosamine(GLN)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
1.5 N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)对MMP的表达所造成的效果
在上述1.1里的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图5所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
1.6蒜氨酸(Alliin)对MMP的表达所造成的效果
在上述1.1里的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的蒜氨酸(Alliin)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图6所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的蒜氨酸(Alliin)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的蒜氨酸(Alliin)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
1.7丁酸钠(SB)对MMP的表达所造成的效果
在上述1.1里的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的丁酸钠(SB)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图7所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的丁酸钠(SB)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的丁酸钠(SB)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
1.8硫酸软骨素(CS)对MMP的表达所造成的效果
在上述1.1里的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的硫酸软骨素(CS)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图8所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的硫酸软骨素(CS)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的硫酸软骨素(CS)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
2. 3D培养模型
2.1凭借SW-1353细胞网(network)建立3D软骨
为了建立基于胶原蛋白的含细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的3D软骨片(chip)，建立了胶细胞基质与tunable-dynamic flow管之间分离的微流控平台(Microfluidics platform)的3D软骨体外模型(图9A)。tunable管内则有用于细胞生长的培养液流动，培养液以平均1.5μl/hr的流速往胶细胞基质的相反测撒布。而且，SW-1353细胞在胶原蛋白基质进行了3D动态培养。在暴露于培养液的几天期间，确认了SW-1353细胞如图9B所示地具有诸如成纤维细胞(fibroblast)的形态(mophology)，如图9所示，得知良好地建立了SW-1353软骨肉瘤的3D软骨片(chip)。
2.2 3D动态培养模型中SW-1353细胞的形态
图10的图像示出了在48小时的3D动态培养过程中基于DNA片段混合物浓度的培养后的细胞的图像。各胶细胞基质在4mg/ml胶原蛋白基质(matrix)以0(contol)、10、100、1000μg/ml的不同浓度包含了DNA片段混合物。进行凝胶化45分钟后，测量了24h、48h后的图像的结果表明，SW-1353在gel上良好地进行了接种(seed)。
把不含有血清的培养液100μl投入各管，SW-1353细胞在添加了不同浓度的DNA片段混合物的ECM gel matrix进行了3D动态培养。暴露于培养液后，在48小时期间没有观察到细胞凝聚现象，gel面上则形成了诸如成纤维细胞(fibroblast)的相。因此，确认了DNA片段混合物对于细胞在gel的配置没有给予任何影响。
2.3在3D动态培养模型中DNA片段混合物对SW-1353细胞的生存率所造成的效果
图11示出了在图10的3D动态培养状况下的细胞生存率。为了找出DNA片段混合物对SW-1353细胞生存率的影响，在3D培养中测量细胞生存率时，在IL-β存在或不存在的情形下以0(contol)、10、100、1000μg/ml浓度的DNA片段混合物ECM处理后进行了24小时。相比于没有进行任何处理的控制组，以DNA片段混合物单独实现10-1000μg/ml浓度时，SW-1353没有呈现出特别的细胞毒性效果。在IL-β存在下，不同浓度的DNA片段混合物ECM也没有呈现出任何细胞毒性效果(图11)。
2.4在3D动态培养模型中DNA片段混合物对MMP的表达的效果
在3D细胞培养期间，以含有10％serum或不含有serum的培养液进行培养，培养后的3D软骨细胞则以IL-β(10ng/ml)进行刺激。
其结果，如图12所示，在10％血清条件下的MMP-1与MMP-13表达和在100、1000μg/ml浓度的DNA片段混合物条件下的MMP表达结果相似。因此，得知高浓度的DNA片段混合物活化MMP而让关节炎的治疗恶化。
而且，在利用不含有serum的DNA片段混合物和IL-β处理了24小时后，针对退行性关节炎常见的两种恶化标记(MMP-3与MMP-13)进行了分析。
其结果，如图13所示，对于DNA片段混合物的MMP-13表达数值随着DNA片段混合物的浓度而增加。因此，确认了DNA片段混合物诱导MMP的生成而让关节炎的治疗恶化。
2.5 glucosamine(GLN)对MMP的表达所造成的效果
在上述2.4里的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的glucosamine(GLN)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图14所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的glucosamine(GLN)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的glucosamine(GLN)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
2.6 N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)对MMP的表达所造成的效果
在上述2.4里的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图15所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
2.7蒜氨酸(Alliin)对MMP的表达所造成的效果
在上述2.4里的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的蒜氨酸(Alliin)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图16所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的蒜氨酸(Alliin)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的蒜氨酸(Alliin)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
2.8丁酸钠(SB)对MMP的表达所造成的效果
在上述2.4的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的丁酸钠(SB)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图17所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的丁酸钠(SB)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的丁酸钠(SB)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
2.9硫酸软骨素(CS)对MMP的表达所造成的效果
在上述2.4里的实验确认了DNA片段混合物诱导MMP-3与MMP-13的生成，在此，更进一步地，把能抑制生成的硫酸软骨素(CS)和DNA片段混合物一起添加后针对MMP-3与MMP-13的生成进行了实验。
如图18所示，对SW-1353细胞处理了0、10、100、1000μg/ml的浓度的DNA片段混合物和0、0.1、1、10mM浓度的硫酸软骨素(CS)，一起投入了10ng/ml浓度的IL-β后，和没有进行任何处理的控制组相比，观察了MMP-3与MMP-13蛋白质表达。
其结果，不受DNA片段混合物浓度影响地，处理了10mM浓度的硫酸软骨素(CS)时MMP-3与MMP-13的蛋白质表达减少。
<结论>
为了针对和退行性关节炎或类风湿性关节炎有关的drug screen进行研究而建立了3D体外软骨模型，确认了作为3D matrix的DNA片段混合物(PDRN)在骨关节炎治疗效果上发挥重要作用。
具体地说，细胞运动也被PDRN抑制了很多，其显著地抑制了侵入及转移而确认了DNA片段混合物(PDRN)在治疗关节炎时的效果。
也确认了DNA片段混合物(PDRN)诱导MMP的生成而对关节炎的治疗造成负面影响，但也证实了和作为MMP生成抑制剂的氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)、蒜氨酸(Alliin)、丁酸钠(SB)及硫酸软骨素(CS)所组成的群中的某一个成分一起使用就能解决。
因此，本发明能通过下列方法提供既能抑制DNA片段混合物(PDRN)对MMP生成的诱导又能发挥出关节炎预防及治疗效果的组合物，亦即，把DNA片段混合物(PDRN)和作为MMP生成抑制剂的诸如氨基葡萄糖或它的药学上允许的盐、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)、蒜氨酸(Alliin)、丁酸钠(SB)及硫酸软骨素(CS)所组成的群中的某一个作为活性成分一起包含。
Claims (6)
1.一种用于预防及治疗关节炎的组合物，其特征在于，
含有DNA片段混合物与MMP生成抑制剂。
2.根据权利要求1所述的用于预防及治疗关节炎的组合物，其特征在于，上述MMP生成抑制剂是氨基葡萄糖(glucosamine)或它的药学上允许的盐。
3.根据权利要求1所述的用于预防及治疗关节炎的组合物，其特征在于，上述MMP生成抑制剂是N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)或它的药学上允许的盐。
4.根据权利要求1所述的用于预防及治疗关节炎的组合物，其特征在于，上述MMP生成抑制剂是蒜氨酸(Alliin)或它的药学上允许的盐。
5.根据权利要求1所述的用于预防及治疗关节炎的组合物，其特征在于，上述基质金属蛋白酶生成抑制剂是丁酸钠(Sodium butyrate(SB))。
6.根据权利要求1所述的用于预防及治疗关节炎的组合物，其特征在于，上述基质金属蛋白酶生成抑制剂是硫酸软骨素(Chondroitin sulfate(CS))。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20200612 |