WO2019192454A9 - 新型小分子免疫激动剂和免疫靶向化合物及其应用 - Google Patents

新型小分子免疫激动剂和免疫靶向化合物及其应用 Download PDF

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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
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Definitions

  • the invention relates to a series of small-molecule immune agonists, and immunotargeting compounds obtained by coupling them with a targeting drug, and applications thereof, and belongs to the interdisciplinary field of medicinal chemistry and immunology.
  • TLR Toll-like receptor
  • ssRNA the natural ligand that activates TLR7 is ssRNA, which plays an important role in defense against ssRNA series virus invasion (Blasius, A.L. & Beutler, B. Intracellular toll-like receptors. Immunity 32, 305-315 (2010)).
  • TLR7 can be activated by artificially synthesized small molecule compounds, which induces the body's immune regulation and plays an important role in antiviral and antitumor (Huju Chi, Chunman Li, Flora Sha Zhao, Li Zhang, Tzi Bun Ng, Guangyi Jin Jinand Ou Sha. Anti-tumor Activity of Toll-Like Receptor 7 Agonists. Front Pharmacol. 2017 May 31; 8: 304.doi: 10.3389 / fphar.2017.00304).
  • TKI tumor necrosinekinase inhibitor
  • the object of the present invention is to provide a series of small molecule immune agonists with immune activating effects and applications thereof, and to provide an immune targeting compound obtained by coupling the small molecule immune agonist with a targeting drug and its application.
  • a first aspect of the invention relates to a small molecule immunoagonist of formula (I) or an isomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • a 1 represents O or C
  • a 2 represents a nitro group, an amino group, an isocyanate group, an alkyleneamino group, an alkylene isocyanate group, or a group selected from the group consisting of formula (II) or formula (III):
  • R 1 and R 2 each independently represent (CH 2 ) p (NH) q , wherein p is 0, 1 or 2, and q is 0, 1 or 2;
  • R 3 represents O or S
  • the carbon atom in (CH 2 ) s near the carbonyl group may be substituted by a group selected from the group consisting of -NHBoc, amino, -NHFmoc, Or form a double bond with another carbon atom;
  • R 5 represents a hydroxyl group, an alkoxy group, a hydroxylamine group, a vinyl group, or a group selected from the group consisting of:
  • R 6 represents an alkyl group or a group selected from:
  • the isomer is an isomer or an enantiomer.
  • the invention relates to a small molecule immune agonist of formula (I) or an isomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • a 1 represents O or C
  • a 2 represents a nitro group, an amino group, an isocyanate group, a C 1 -C 6 alkylene amino group, a C 1 -C 6 alkylene isocyanate group, or a group selected from the group consisting of formula (II) or formula (III):
  • R 1 and R 2 each independently represent (CH 2 ) p (NH) q , where p is 0 or 1, and q is 0 or 1;
  • R 3 represents O or S
  • the carbon atom near the carbonyl group may be substituted by a group selected from -NHBoc, amino, -NHFmoc, Or form a double bond with another carbon atom;
  • R 5 represents a hydroxyl group, a C 1 -C 6 alkoxy group, a hydroxylamine group, a vinyl group, or a group selected from the group consisting of:
  • R 6 represents a C 1 -C 6 alkyl group or a group selected from:
  • the invention relates to a small molecule immune agonist of formula (I) or an isomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • a 1 represents O or C
  • a 2 represents a nitro group, an amino group, an isocyanate group, a methyleneamino group, a methylene isocyanate group, or a group selected from the group consisting of formula (II) or formula (III):
  • R 1 and R 2 each independently represent (CH 2 ) p (NH) q , where p is 0 or 1, and q is 0 or 1;
  • R 3 represents O or S
  • the carbon atom near the carbonyl group may be substituted by a group selected from -NHBoc, amino, -NHFmoc, Or form a double bond with another carbon atom;
  • R 5 represents a hydroxyl group, a methoxy group, a hydroxylamine group, a vinyl group, or a group selected from the group consisting of:
  • R 6 represents a methyl group or a group selected from:
  • the present invention relates to a small molecule immune agonist of formula (I), or an isomer or pharmaceutically acceptable salt thereof, which is a compound selected from the SZU series of compounds (the specific structural formula is shown in Table 1 below) ) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof: SZU-104, SZU-105, SZU-107, SZU-108, SZU-109, SZU-110, SZU-111, SZU-112, SZU-113, SZU-115, SZU-118, SZU-120, SZU-127, SZU-128, SZU-129, SZU-131, SZU-132, SZU-133, SZU-134, SZU-135, SZU-136, SZU-137, SZU- 138, SZU-139, SZU-140, SZU-142, SZU-143, SZU-144, SZU-145, SZU-149, SZU
  • a second aspect of the present invention relates to an immunotargeting compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is a small molecule immune agonist or an addition product thereof formed with a thiol-containing polypeptide such as glutathione and a targeting drug or antibody.
  • Valence coupling is formed, and its general formula is expressed as follows:
  • TLA represents a small molecule immune agonist or an addition product formed with a thiol-containing polypeptide such as glutathione; Tar represents a targeted drug or antibody; n and m each independently represent a value between 1 and 5; L Represents a connecting chain, which is a linear or branched alkane or a polyethylene glycol chain, and both ends of L are directly covalently connected to TLA and / or Tar or covalently connected to TLA and / or Tar through other groups.
  • the small molecule immune agonist comprises the small molecule immune agonist according to the first aspect of the present invention and a compound selected from the following:
  • the small molecule immune agonist is selected from the following SZU series compounds (the specific structural formula is shown in Table 1 below) or a pharmaceutically acceptable salt thereof: SZU-102, SZU-104, SZU- 105, SZU-106, SZU-107, SZU-108, SZU-109, SZU-110, SZU-111, SZU-112, SZU-113, SZU-115, SZU-118, SZU-120, SZU-127, SZU-128, SZU-129, SZU-131, SZU-132, SZU-133, SZU-134, SZU-135, SZU-136, SZU-137, SZU-138, SZU-139, SZU-140, SZU- 142, SZU-143, SZU-144, SZU-145, SZU-149, SZU-158, SZU-159, SZU-160,
  • SZU series compounds
  • TLA is a compound selected from the following (the specific structural formula is shown in Table 3 below): SZU-103-GSH, SZU-114-GSH, SZU-117-GSH, SZU-122-GSH, SZU-127-GSH, SZU-133-GSH, SZU-138-GSH or SZU-144-GSH.
  • the Tar is selected from at least one of the following: Dasatinib, Imatinib, Saracatinib, Ponatinib, Nilotinib, Danusertib, AT9283Degrasyn, Bafetinib, kw-2449, nyp-bhg712, dcc-2036, GZD824., GNF-2, PD173955, GNF-5, Bosutinib, Gefitinib, Erlotinib, Sunitinib, Ruxolitinib, Tofacitinib, Lapatinib, Vandetanib, Sorafenib, Sunitinib, Axitinib, Ninededanib, Regorafenib, Pazopanib, Lenvatinib, Cirizinib, Cirizinib Ibrutinib, Niraparib, Palbociclib, B43, KU004, Foreinib, Dasatinib,
  • the Tar is selected from at least one of the following: TKI, EGFR inhibitor, KRAS inhibitor, BRAF inhibitor, BTK inhibitor, BRD4 inhibitor, PD-L1 inhibitor, PD- 1 inhibitor, OX40 agonist, PARP inhibitor or CDK4 / 6 inhibitor.
  • the other group includes an amide, an alkoxy bond, an alkyl sulfur bond, a substituted amine group, a quaternary amine salt, a heterocyclic ring formed by a cilck reaction, an amino acid group dissociable with a protease, a urea group Or thiourea groups.
  • the immune targeting compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is selected from the following SZU series compounds (the specific structural formula is shown in Table 4 below) or a pharmaceutically acceptable salt thereof: SZU-116, SZU-119, SZU-124, SZU-125, SZU-146, SZU-147, SZU-168, SZU-169, SZU-174, SZU-175, SZU-176, SZU-177, SZU-178, SZU- 179, SZU-180, SZU-181, SZU-158-PD-L1, SZU-158-OX40, SZU-158-PD-1 or SZU-136-miRNA21.
  • SZU series compounds the specific structural formula is shown in Table 4 below
  • the third aspect of the present invention relates to the small molecule immune agonist of formula (I) or its isomer or pharmaceutically acceptable salt according to the first aspect of the present invention, the compounds SZU-101, SZU-103, SZU-114, Use of SZU-117, SZU-122 and SZU-130 (the specific structural formula is shown in Table 2 below) and the immunotargeting compound described in the second aspect of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the preparation of a medicament involved in immune regulation .
  • the fourth aspect of the present invention relates to the small molecule immune agonist of formula (I) according to the first aspect of the present invention or an isomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compounds SZU-101, SZU-103, SZU-114, SZU-117, SZU-122, and SZU-130 and the immunotargeting compounds or pharmaceutically acceptable salts thereof according to the second aspect of the present invention are used in the preparation of antitumor drugs, antiviral drugs, and drugs that target clearance proteins. use.
  • the invention also relates to the use of the compound SZU-136-miRNA21 and its analogs in the preparation of a medicament for immune targeting RNA.
  • the compound SZU-136-miRNA21 and its analogs are used as small molecules for immune targeting.
  • the medicament can be in various dosage forms, including solid preparations, liquid preparations, complexes formed by the medicaments and various carriers, or crystal water complexes of the medicaments.
  • the invention also relates to the use of compounds SZU-179, SZU-180 and SZU-181 in the preparation of medicines against AIDS and hepatitis B.
  • compounds SZU-179, SZU-180 and SZU-181 are used as antiviral immune targeting compounds.
  • the invention also relates to the use of the compounds SZU-161 and SZU-162 in determining the degree of coupling between a small molecule immune agonist coupled protein drug and a cell.
  • compounds SZU-161 and SZU-162 serve as small molecule immune agonists with specific ultraviolet absorption.
  • the invention also relates to the use of the compounds SZU-116 and SZU-124 in observing and studying the cellular absorption and in vivo distribution of proteins or targeted drugs, wherein the compounds SZU-116 and SZU-124 are coupled to the protein or targeted drugs.
  • Compounds SZU-116 and SZU-124 as compounds with optical tracer properties of small molecule immune agonist color indicator, can be coupled with protein or targeted drug to show cell absorption and distribution of protein or targeted drug in real time .
  • the present invention also relates to the use of compounds SZU-114, SZU-117, SZU-122, SZU-127, SZU-133, SZU-138, and SZU-143 in the preparation of a medicament with an immunotargeting dual function, wherein the compound SZU- 114, SZU-117, SZU-122, SZU-127, SZU-133, SZU-138, SZU-143 are conjugated to the targeting drug or antibody.
  • the small molecule immune agonist of the present invention itself has an immune activating effect.
  • those skilled in the art know that the combined application of TKI and TLR7 immune agonist can cause TKI to antagonize the immune cell activation of TLR7 agonist and inhibit the production of immune-activating cytokines.
  • the inventors covalently conjugated the TKI targeting drug and the TLR7 small molecule immune agonist, it was unexpectedly discovered that such covalently coupled compounds not only maintain or enhance the immune activation of small molecule immune agonists, but also improve Antitumor effects of targeted drugs.
  • the immune targeting compound obtained by the method of the present invention is of great significance for long-term and highly effective treatment of tumors.
  • Some of the small molecule immune agonists in Tables 1 and 2 can form adducts with thiol-containing polypeptides such as glutathione (GSH), which can target glutathione transferase, synergistic chemotherapy drugs, irreversible TKI-targeted drugs and other irreversible targeted drugs to improve the treatment of diseases, eliminate drug resistance, and activate immune effects.
  • GSH glutathione
  • SZU-117 and glutathione to form SZU-117-GSH adduct the synthesis process is shown in the following formula.
  • the exemplified adducts of small molecule immune agonists and GSH are shown in Table 3:
  • thiol-containing compounds include, for example, 2-methylamine ethyl mercaptan and SZU-033T Wait.
  • the small molecule immune agonists in Tables 1 and 2 and some of the small molecule immune agonists in Table 3 and GSH compounds can be coupled with targeting drugs to obtain bifunctional immune targeting compounds with immune targeting effects.
  • the immune targeting compounds are shown in Table 4 below:
  • the same method described above is also applicable to the coupling of SZU-144 or SZU-133 with a targeting drug to form an immune-targeting compound.
  • the linker can also be a simple linear alkane, or it can be replaced according to various needs.
  • Small molecule agonists with carboxyl groups can couple antibodies with addition reactions and coupling reactions to form soluble functional protein polypeptide conjugates, which can form salts due to the dimethylamino group.
  • the formation of an ionized positive charge is beneficial to improve the therapeutic effect and water solubility, thereby solving the solubility problem of the coupling product.
  • carboxyl-containing small molecule immune agonist can also be coupled with two different targeting drugs to form a dual-targeted immune compound.
  • the product formed by a small molecule immune agonist and glutathione can also be coupled with two different targeted drugs to improve the efficacy.
  • the targeted drugs can be various TKI drugs and various tumor targeting drugs, or antibodies such as CD3 antibody, PD-1 antibody, OX40 antibody, CD19 antibody, CD20 antibody, HER2 antibody, MUC1 antibody and various tumors. Protein antibodies and pathogenic antibodies.
  • the coupling chain can be various alkane chains or alkoxy chains, etc., which can be adjusted according to the needs of dissolution and metabolism optimization.
  • the above-mentioned double-coupling immunotargeting compound has the advantage that it can form 2 positive ion amino groups (amino salt -HN + -, -NH + 3 ), high solubility, and the double target can be adjusted and optimized as needed; for example, targeting 1 CD3 antibody or CD122 antibody for T cells, and HER2 inhibitor targeted for tumor cells, which can promote the infiltration of T cells into the tumor microenvironment, enhance the anti-tumor effect, and activate immune TLR7 receptors to generate targeted immune memory .
  • Small molecule immune agonist Take SZU-166 as an example, it is a unique isocyanate small molecule immune agonist, which has the advantage of mild and quantitative coupling and addition with amino compounds) Coupling of targeted drug synthesis route five:
  • SZU-115 and SZU-160 are new-type small molecule immune agonists with click-reactive groups. Their functions basically include two points. 1) After coupling with macromolecules and biologically active substances, use the click reaction to attach a color indicator. The agent performs optical tracing on the coupling product, for example, after the protein is coupled or the drug is targeted, the cell absorption and distribution of the protein or the drug are observed.
  • SZU-115 can also connect antibodies and targeted drugs at the same time, reducing the off-target effect of antibodies, enhancing the effectiveness of targeted drugs, and activating anti-tumor immunity:
  • Compound SZU-136 and compound SZU-160 have similar effects and application effects.
  • SZU-139 in the present invention is generated by the reaction between SZU-136 and ribose click:
  • miRNA21 small molecule immune agonists coupled with small molecule RNA (miRNA), for example, miRNA21 (microRNA21) has an important role in tumorigenesis and development (Cell Death Dis. 2018 Feb 13; 9 (2): 219.doi : 10.1038 / s41419-017-0243-9; Proc Natl Acad Sci US A. 2015 Jun 30; 112 (26): E3355-64.doi: 10.1073 / pnas.1504630112; Cancer Lett.
  • miRNA21 small molecule immune agonists coupled with small molecule RNA
  • the alkynyl immune agonist can be replaced by SZU-115, and the carboxyl group of SZU-115 can be coupled with Argonaute to form a complex, which interferes with the formation of miRNA and Argonaute complex, and is guided to the endosomes of immune cells under the action of TLR7 agonist, resulting in Immunization and memory:
  • the effect of tumors and other diseases has given the dual function of the targeted drug (dual-function targeted drug). This enhanced effect is caused by having immune anti-tumor factors (such as IFN- ⁇ ) and targeting pathogenic targets.
  • immune anti-tumor factors such as IFN- ⁇
  • the point of inhibiting the synergy of two functions is generated, and the present invention relates to a novel and highly efficient targeted drug with a combination of functions.
  • a reasonable effect of the immune targeting compound described in the present invention is to eliminate pathogenic targets (proteins) through the immune pathway, as shown in FIG. 70.
  • An immunotargeting compound formed by coupling a small molecule immune agonist with a targeting drug is guided to the pathogenic protein by the targeting drug, causing the targeted cell to die, releasing the pathogenic protein, and then guided by the immune agonist to the antigen-presenting cell (Such as DC, antigen presenting cells), cleavage of pathogenic proteins in cells, resulting in the degradation of these proteins.
  • the immune targeting compound formed by the small molecule immune agonist coupled with a targeting drug can overcome drug resistance and improve the therapeutic effect.
  • Acid series of small molecule immune agonist lysine-derived compounds SZU-104, SZU-105, SZU-112, SZU-113 are amino acid derivatives with immune agonist activity.
  • SZU-161 and SZU-162 as small molecule immune agonists for protein-coupled drugs, have specific UV absorption peaks (342nM), and can be used as a general method for determining the coupling degree of small molecule immune agonist-coupled protein drugs:
  • Assay method 1) Determine the light absorption intensity of SZU-161 at ultraviolet 342nM at different concentrations, make a standard curve of concentration and absorbance, and get the concentration-absorbance relationship; 2) determine the coupling protein after coupling protein The absorbance at 342 nM at the concentration can be substituted into the relationship to obtain the relative concentration of SZU-161 in the conjugate.
  • SZU-162 has the same application effect.
  • immunocytokines represent Cytokine (including IFN- ⁇ , IL-12, IL-6, TNF- ⁇ , etc.), and their concentration can be used to indicate the level of the compound's effect on activating immune cells.
  • Figure 1 shows the immune cytokine (IL-6) activation effect of SZU-GSH series compounds.
  • FIG. 1 shows the intracellular distribution of fluorescently labeled SZU-116.
  • Figure 3 shows the immune cytokine (IFN- ⁇ ) activation effect of SZU-102, 103, 106, 107, 108, 110, 111, 114, 115, 116, 117, 118.
  • SZU-101 and R848 are used as standard controls. They are internationally recognized and standard small molecule immune agonists with immune activating effects, the same applies hereinafter.
  • Figure 4 shows the immune cytokine (IFN- ⁇ ) activation effect of SZU-143, 144, 146, 147, 149. Where con is the PBS blank control, the same below.
  • Figure 5 shows the immune cytokine (IL-12) activation effect of SZU-143, 144, 146, 147, 149.
  • Figure 6 shows the immune cytokine (TNF-?) Activation effect of SZU-143, 144, 146, 147, 149.
  • Figure 7 shows the immune cytokine (IL-6) activation effect of SZU-143, 144, 146, 147, 149.
  • Figure 8 shows the immune cytokine (IFN- ⁇ ) activation effect of SZU-145, 158, 104, 109, 112, 124.
  • Figure 9 shows the immune cytokine (IL-12) activation effect of SZU-145, 158, 104, 109, 112, 124.
  • Figure 10 shows the immune cytokine (TNF- ⁇ ) activation effect of SZU-145, 158, 104, 109, 112, 124.
  • Figure 11 shows the immune cytokine (IL-6) activation effect of SZU-145, 158, 104, 109, 112, 124.
  • FIG. 12 shows the activation effect of each immune cytokine of SZU-125.
  • Figure 13 shows the immune cytokine (IFN- ⁇ ) activation effect of SZU-105.
  • Figure 14 shows the immune cytokine (IL-12) activation effect of SZU-105.
  • Figure 15 shows the immune cytokine (IFN- ⁇ ) activation effect of SZU-113.
  • Figure 16 shows the immune cytokine (IL-12) activation effect of SZU-113.
  • Figure 17 shows the immune cytokine (IL-12) activation effect of SZU-119.
  • Figure 18 shows the immune cytokine (IL-6) activation effect of SZU-119.
  • FIG. 19 shows the immune cytokine (IFN- ⁇ ) activation effect of SZU-120.
  • Figure 20 shows the immune cytokine (IL-6) activation effect of SZU-120.
  • 21 to 54 show the activation effects of the immune cytokines of the small molecule immune agonists SZU-122 and 127-142 in the present invention, respectively.
  • Figure 55 shows the effect of SZU-102, 119, 125, 146, 147, 169, 174, 175, 168, 176, 177, 179 on activating immune cells to produce IFN- ⁇ .
  • Figure 56 shows the effect of SZU-102, 119, 125, 146, 147, 169, 174, 175, 168, 176, 177, 179 on activating immune cells to produce IL-12.
  • Figure 57 shows the antitumor (CT26) activity effect of the novel immune targeting compound in vivo: Veh (unadministered control), A (SZU-177), B (SZU-175), C (SZU-174), D ( SZU-147), E (SZU-176).
  • CT26 antitumor
  • Figure 58 shows the antitumor (B16) activity effect of the novel immune targeting compounds in vivo: Veh (unadministered control), G (PD-L1 antibody), H (SZU-178), I (SZU-158-PD- L1), J (SZU-158-OX40), K (PD-1 antibody), L (SZU-158-PD-1).
  • Figure 59 shows that JQ1 inhibits TLR7 agonist activity of SZU-101; SZU-119 maintains the immune cytokine-stimulating activity of TLR7 agonist.
  • Figure 60 shows that JQ1 inhibits TLR7 agonist activity of SZU-101; SZU-119 maintains the immunocytokine-stimulating activity of TLR7 agonist.
  • Figure 61 shows that SZU-119 maintained the CD274 (PD-L1) inhibitory activity of JQ1 on B16 cells.
  • the "control” refers to a blank control.
  • Figure 62 shows the effect of SZU-163 and SZU-166 on activating immune cells to produce IFN- ⁇ .
  • Figure 63 shows the effect of SZU-180 and SZU-136-miRNA21 on activating IFN- ⁇ production by immune cells.
  • FIG. 64 shows the antitumor (4T1) survival rate effect of PD-1 antibody, PD-L1 antibody, OX40 antibody and their SZU-158 conjugates and SZU-178.
  • Figure 65 shows the effect of PD-1 antibody, PD-L1 antibody, OX40 antibody and their SZU-158 conjugates and SZU-178 to activate immune cells to produce IFN- ⁇ .
  • Figure 66 shows the effect of SZU-181 on activating immune cells to produce IFN- ⁇ .
  • FIG. 67 shows the effects of SZU-106, SZU-158, and SZU-160 on activating immune cells to produce IFN- ⁇ , where “control” is a PBS blank control.
  • Figure 68 shows the effect of SZU-106, SZU-158, and SZU-160 on activating immune cells to produce IL-6, where "control" is a blank control.
  • Figure 69 shows a schematic diagram of the effect of coupling a TLR7 small molecule immune agonist with human miRNA to immuno-target to interfere with the binding of agonist protein and eliminate its related pathogenic effect.
  • FIG. 70 is a schematic diagram showing the action of the immune targeting compound in the present invention to eliminate pathogenic targets (proteins) through the immune pathway.
  • the synthesis methods of the compounds related to the present invention are exemplified as follows.
  • the exemplified synthesis methods can inspire those skilled in the art to realize the synthesis of the novel compounds in the present invention, but the synthesis of the novel compounds in the present invention is not limited to the exemplified synthesis methods.
  • the SZU-030T obtained in the previous step was dissolved in 10 mL of anhydrous tetrahydrofuran (THF), 484 mg of triphenylphosphine was added under an ice bath, and the mixture was transferred to room temperature to continue stirring overnight. The progress of the reaction was monitored by LC-MS. After the reaction was completed, 20 mL of water was added, stirring was continued for 30 min, suction filtration was performed under reduced pressure, water was washed twice, and dried to obtain SZU-031T 625 mg. The combined yield in two steps was 79%.
  • THF anhydrous tetrahydrofuran
  • the preparation method is the same as SZU-116, except that FITC is used instead of SZU-017T to obtain a grass-green semi-solid.
  • the combined yield in two steps is 31%.
  • ESI-MS: m / z 1199.5 [M + H] + .
  • the preparation method is the same as that of SZU-125, except that the PD-1 / PD-L1 inhibitor is replaced by glutaric anhydride, and a white solid is obtained.
  • ESI-MS: m / z 459.1 [M + H] + .
  • the preparation method is the same as that of SZU-125, except that the PD-1 / PD-L1 inhibitor is replaced by itaconic anhydride, and a white solid is obtained.
  • ESI-MS: m / z 457.1 [M + H] + .
  • the preparation method is the same as SZU-125, except that the PD-1 / PD-L1 inhibitor is replaced with acetic anhydride, and a white solid is obtained.
  • ESI-MS: m / z 387.1 [M + H] + .
  • the preparation method is the same as SZU-103-GSH, except that SZU-114 is used instead of SZU-103 to obtain a white solid.
  • ESI-MS: m / z 763.3 [M + H] + .
  • the preparation method is the same as SZU-103-GSH, except that SZU-117 is used instead of SZU-103 to obtain a white solid.
  • ESI-MS: m / z 874.3 [M + H] + .
  • the preparation method is the same as SZU-103-GSH, except that SZU-138 is used to replace SZU-103, and 2-dimethylaminoethylthiol is used to replace glutathione. A white solid is obtained.
  • ESI-MS: m / z 562.2 [M + H] + .
  • the same method can be used to prepare SZU-159, except that SZU138 is replaced with SZU-144 and 2-dimethylaminoethyl mercaptan to react for 24 hours at room temperature to obtain SZU-159.
  • the preparation method is the same as SZU-103-GSH, except that SZU-138 is used instead of SZU-103, and SZU-033T is used instead of glutathione. A white solid is obtained.
  • ESI-MS: m / z 708.4 [M + H] + .
  • the preparation method is the same as SZU-115, except that SZU-032T is used instead of SZU-013T to obtain a white solid.
  • ESI-MS: m / z 599.3 [M + H] + .
  • Bromine was slowly added dropwise to the acetic acid solution of SZU-151. After stirring overnight, the reaction solution was neutralized with NaHCO 3 . To the obtained viscous compound, for example, a little ethanol is added. A solution of sodium thiosulfate was then added to remove remaining bromine. After suction filtration and drying of the obtained solid, a 10% NaOH solution was added, followed by suction filtration and drying under reduced pressure. Purified liquid chromatography gave bromide.
  • a carboxyl compound 155 mg was dissolved in 1.5 mL of DMSO, 79 mg of EDCI and 47 mg of NHS were sequentially added, and after stirring at room temperature for two hours, 50 mg of PEG3 was added to the reaction solution, followed by stirring at room temperature overnight. After the reaction was completed, DMSO was removed by lyophilization and separated by preparative liquid chromatography to obtain 174 mg of a white solid with a yield of 72%.
  • ESI-MS: m / z 563.6 [M + H] + .
  • SZU-134 was dissolved in DMSO, and equimolar NHS and EDCI were added. After stirring for 10 minutes, equimolar direct violet N (OX40 agonist) was added. The reaction was sealed at room temperature for 3 days. The reactant was added with 20 times water, the precipitated solid was filtered, 2N NaOH was added and stirred at 10 ° C for 30 minutes, and filtered. The filtrate was acidified to pH 1 with 2N hydrochloric acid, and solid product SZU-169 was precipitated. : m / z: [M + 2Na] 1611.64.
  • the new immunotargeting compound formed by the SZU-158 conjugated antibody can form a salt due to the dimethylamino group and form a positive ionized charge, which is beneficial to improve the therapeutic effect and water solubility.
  • Vemu-1 is a precursor of Vemurafenib and was purchased from WuXi AppTec.
  • Vemu-1 was dissolved in DMF, 2 times mole of triethylamine was added, cooled to 0 ° C, 1 times mole of vinylsulfonyl chloride was added, the mixture was slowly warmed to room temperature and stirred for 8 hours, and the mixture was added with 10 times the volume of ice water Stir well for 1 hour, adjust the pH to 8 with saturated Na 2 CO 3 , precipitate a solid, filter, wash twice with water, and dry to obtain Vemu-2.
  • 1 g of Vemu-2 was dissolved in 30 mL of DMF, 0.33 g of mercaptoethylamine was added, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain crude Vemu-3. Silica gel column chromatography gave Vemu-3 pure. Product 0.98 g, yield 85%, MS (ESI): m / z: [M + 1] 552.04.
  • Osimertinib intermediate was purchased from WuXi AppTec.
  • reaction solution was filtered through a filter
  • the membrane was filtered and freeze-dried to obtain white solid SZU-178 (that is, SZU-178 coupled with Erlotinib and PD-L1 antibody complex SZU-160-Erlotinib-PD-L1), 12 mg.
  • SZU-115-PD-L1-targeting drug that is, the complex formed by SZU-115 coupling PD-L1 antibody and targeting drug
  • the method of coupling PD-L1 antibody is the same as that in the preparation of SZU-178, and the click reaction method is the same as that in the preparation of SZU-179 to obtain SZU-180.
  • the resulting product can be used to treat AIDS.
  • the spleen lymphocytes inoculated in 24-well plates were stimulated with the SZU series of small molecule immune agonists and novel immune targeting compounds of the present invention at different concentrations.
  • the 24-well plates were moved into the incubator and the supernatant was gently aspirated after 24 hours of stimulation, that is Samples tested by Elisa. Concentrations and concentration gradients depend on the needs of each measurement sample.
  • Coating 10X coating buffer is diluted to 1X and used to dilute the capture antibody. Add 100 ⁇ l of the diluted capture antibody to a 96-well microtiter plate, seal with plastic wrap, and place in a refrigerator at 37 ° C for 2-4 hours or overnight at 4 ° C. Aspirate the liquid from the microtiter plate, wash the plate three times with washing buffer (PBST: PBS solution plus Tween-20 per thousand), and pat dry.
  • PBST PBS solution plus Tween-20 per thousand
  • Blocking Add 200 ⁇ l of diluted blocking solution to each well, seal with plastic wrap, and block at room temperature for one hour. Wash the plate three times with PBST and pat dry.
  • Standard concentrations are: 2000pg / mL, 1000pg / mL, 500pg / mL, 250pg / mL, 125pg / mL, 62.5pg / mL, 31.5pg / mL, 15.75pg / mL, 7.875pg / mL, 3.9375pg / mL , 1.98675 pg / mL, 0 pg / mL.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • Termination After the color development is completed, 50 ⁇ l of stop solution is added to each well, and the stop solution is 1 mol / L H 2 SO 4 .
  • Detection Put the terminated 96-well microplate into a full-wavelength microplate reader and read the absorbance at 450nm. The data was exported, the standard curve was made by software, and the linear regression equation was obtained. Calculate the concentration of immune factors (INF- ⁇ , IL-6, etc.) produced by immune cells. Please refer to the attached drawings for specific experimental results.
  • PBS blank control, immune agonist or novel immune targeting compound were administered separately.
  • the dosage is determined according to the actual needs (effective and safe dosage principles).
  • Each substance is dissolved in an appropriate solvent, and the volume of each administration is 100 ⁇ L; each group is administered by intraperitoneal injection.
  • Each group was administered on the 7th, 15th, 22nd, and 29th days after tumor implantation; tumor size was measured regularly. Mice were euthanized when tumors reached 1500 mm 3 or greater than 15% of body weight. See Figures 57, 58 and 64 for tumor suppression and survival results. It can be seen that the treatment group of the novel immune targeting compound in the present invention has a significantly improved antitumor effect.
  • the biological activity test method of the novel small molecule immune agonist and the novel immune targeting compound of the present invention is not limited to the above test method, and other related known or recognized activity test methods can also be used.
  • the schematic diagram of the activity in the present invention is not limited to the illustrated method. The illustrated method can inspire those skilled in the art to realize the application effect of the novel small molecule immune agonist and novel immune targeting compound in the present invention. .

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Abstract

提供一系列为同系物的小分子免疫激动剂以及它们与靶向药偶联得到的新的具有靶向作用及免疫激活功能的双功能免疫靶向化合物。所得免疫靶向化合物有利于提高靶向药的免疫激活效果和抗肿瘤及其它疾病的效果，这种提高的效果是由具有免疫抗肿瘤因素(如IFN-γ)和对致病性靶向位点的抑制二个功能协同作用产生。

Description

新型小分子免疫激动剂和免疫靶向化合物及其应用 技术领域
本发明涉及一系列为同系物的小分子免疫激动剂以及它们与靶向药偶联得到的免疫靶向化合物及其应用，属于药物化学和免疫学的交叉学科领域。
背景技术
Toll样受体(TLR)是生物体防御体系的第一道防线(Kaisho,T.&Akira,S.Toll-like receptor function and signaling.J.Allergy Clin.Immunol.117,979–987(2006)；Miyake,K.Innate immune sensing of pathogens and danger signals by cell surface Toll-like receptors.Semin.Immunol.19,3–10(2007))。其中TLR7的激活天然配体是ssRNA，在ssRNA系列病毒侵袭的防御中具有重要作用(Blasius,A.L.&Beutler,B.Intracellular toll-like receptors.Immunity 32,305–315(2010))。此外，TLR7能够被人工合成的小分子化合物激活，诱导机体的免疫调节，在抗病毒和抗肿瘤方面具有重要作用(Huju Chi,Chunman Li,Flora Sha Zhao,Li Zhang,Tzi Bun Ng,Guangyi Jin and Ou Sha.Anti-tumor Activity of Toll-Like Receptor 7 Agonists.Front Pharmacol.2017 May 31；8:304.doi:10.3389/fphar.2017.00304)。
以TKI(tyrosine kinase inhibitor，络氨酸激酶抑制剂)为代表的抗肿瘤靶向药延长了患者的生命，但是大部分在一年左右或更短时间内产生耐药性。为了解决TKI的耐药性，我们在前期研究中探索将TKI和TLR7免疫激动剂联合应用，以期产生靶向免疫协同作用。然而实验结果显示TKI拮抗了TLR7激动剂的免疫细胞激活作用，抑制了免疫激活细胞因子的产生(Scientific Reports,2016 Dec 21；6:39598.doi:10.1038/srep39598)。
发明内容
本发明的目的一方面在于提供一系列具有免疫激活作用的小分子免疫激动剂及其应用，另一方面在于提供由上述小分子免疫激动剂与靶向药偶联得到的免疫靶向化合物及其应用。
本发明第一方面涉及式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐：
Figure PCTCN2019080945-appb-000001
其中
A 1表示O或C；
A 2表示硝基、氨基、异氰酸酯基、亚烷基氨基、亚烷基异氰酸酯基或选自式(II)或式(III)的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000002
其中
R 1和R 2各自独立地表示(CH 2) p(NH) q，其中p为0、1或2，q为0、1或2；
R 3表示O或S；
R 4表示(CH 2) x(C＝O) y(NH) z[(CH 2) 2O] r(CH 2) s(C＝C) t，其中x为0至5的整数，y为0、1或2，z为0、1或2，r为0、1、2或3，s为0至5的整数且t为0、1或2，其中当s≠0且t＝0时，(CH 2) s中靠近羰基的碳原子可以被选自以下的基团取代：-NHBoc、氨基、-NHFmoc、
Figure PCTCN2019080945-appb-000003
或与另一碳原子形成双键；
R 5表示羟基、烷氧基、羟胺基、乙烯基或选自以下的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000004
R 6表示烷基或选自以下的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000005
Figure PCTCN2019080945-appb-000006
其中*表示连接至碳原子的位点；
其中排除选自以下的化合物：
Figure PCTCN2019080945-appb-000007
优选地，所述异构体为同分异构体或对映异构体。
在优选的实施方案中，本发明涉及式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐：
Figure PCTCN2019080945-appb-000008
其中
A 1表示O或C；
A 2表示硝基、氨基、异氰酸酯基、C 1-C 6亚烷基氨基、C 1-C 6亚烷基异氰酸酯基或选自式(II)或式(III)的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000009
其中
R 1和R 2各自独立地表示(CH 2) p(NH) q，其中p为0或1，q为0或1；
R 3表示O或S；
R 4表示(CH 2) x(C＝O) y(NH) z[(CH 2) 2O] r(CH 2) s(C＝C) t，其中x为0至5的整数，y为0或1，z为0或1，r为0、1、2或3，s为0至5的整数且t为0或1，其中当s≠0且t＝0时，(CH 2) s中靠近羰基的碳原子可以被选自以下的基团取代：-NHBoc、氨基、-NHFmoc、
Figure PCTCN2019080945-appb-000010
或与另一碳原子形成双键；
R 5表示羟基、C 1-C 6烷氧基、羟胺基、乙烯基或选自以下的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000011
R 6表示C 1-C 6烷基或选自以下的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000012
Figure PCTCN2019080945-appb-000013
其中*表示连接至碳原子的位点；
其中排除选自以下的化合物：
Figure PCTCN2019080945-appb-000014
在进一步优选的实施方案中，本发明涉及式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐：
Figure PCTCN2019080945-appb-000015
其中
A 1表示O或C；
A 2表示硝基、氨基、异氰酸酯基、亚甲基氨基、亚甲基异氰酸酯基或选自式(II)或式(III)的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000016
其中
R 1和R 2各自独立地表示(CH 2) p(NH) q，其中p为0或1，q为0或1；
R 3表示O或S；
R 4表示(CH 2) x(C＝O) y(NH) z[(CH 2) 2O] r(CH 2) s(C＝C) t，其中x为0至5的整数，y为0或1，z为0或1，r为0、1、2或3，s为0至5的整数且t为0或1，其中当 s≠0且t＝0时，(CH 2) s中靠近羰基的碳原子可以被选自以下的基团取代：-NHBoc、氨基、-NHFmoc、
Figure PCTCN2019080945-appb-000017
或与另一碳原子形成双键；
R 5表示羟基、甲氧基、羟胺基、乙烯基或选自以下的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000018
R 6表示甲基或选自以下的基团：
Figure PCTCN2019080945-appb-000019
Figure PCTCN2019080945-appb-000020
其中*表示连接至碳原子的位点；
其中排除选自以下的化合物：
Figure PCTCN2019080945-appb-000021
在优选的实施方案中，本发明涉及式(I)的小分子免疫激动剂，或其异构体或药学上可接受的盐，其为选自以下的SZU系列化合物(具体结构式见下表1)或其药学上可接受的盐：SZU-104、SZU-105、SZU-107、SZU-108、SZU-109、SZU-110、SZU-111、SZU-112、SZU-113、SZU-115、SZU-118、SZU-120、SZU-127、SZU-128、 SZU-129、SZU-131、SZU-132、SZU-133、SZU-134、SZU-135、SZU-136、SZU-137、SZU-138、SZU-139、SZU-140、SZU-142、SZU-143、SZU-144、SZU-145、SZU-149、SZU-158、SZU-159、SZU-160、SZU-161、SZU-162、SZU-163、SZU-166或SZU-171。
本发明第二方面涉及免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其由小分子免疫激动剂或其与含巯基的多肽如谷胱甘肽形成的加成产物与靶向药或抗体共价偶联形成，其通式表示如下：
(TLA) n-L-(Tar) m
其中TLA表示小分子免疫激动剂或其与含巯基的多肽如谷胱甘肽形成的加成产物；Tar表示靶向药或抗体；n和m各自独立地表示1至5之间的数值；L代表连接链，其为直链或支链烷烃或者聚乙二醇链，L的两端直接与TLA和/或Tar共价连接或通过其他基团与TLA和/或Tar共价连接。
在优选的实施方案中，其中所述小分子免疫激动剂包括本发明第一方面所述的小分子免疫激动剂以及选自以下的化合物：
Figure PCTCN2019080945-appb-000022
在优选的实施方案中，其中所述小分子免疫激动剂为选自以下的SZU系列化合物(具体结构式见下表1)或其药学上可接受的盐：SZU-102、SZU-104、SZU-105、SZU-106、SZU-107、SZU-108、SZU-109、SZU-110、SZU-111、SZU-112、SZU-113、SZU-115、SZU-118、SZU-120、SZU-127、SZU-128、SZU-129、SZU-131、SZU-132、SZU-133、SZU-134、SZU-135、SZU-136、SZU-137、SZU-138、SZU-139、SZU-140、SZU-142、SZU-143、SZU-144、SZU-145、SZU-149、SZU-158、SZU-159、SZU-160、SZU-161、SZU-162、SZU-163、SZU-166、SZU-171、SZU-101、SZU-103、SZU-114、SZU-117、SZU-122或SZU-130。
在优选的实施方案中，其中所述TLA为选自以下的化合物(具体结构式见下表3)：SZU-103-GSH、SZU-114-GSH、SZU-117-GSH、SZU-122-GSH、SZU-127-GSH、SZU-133-GSH、SZU-138-GSH或SZU-144-GSH。
在优选的实施方案中，其中所述Tar选自以下的至少一种：Dasatinib，Imatinib，Saracatinib，Ponatinib，Nilotinib，Danusertib，AT9283Degrasyn，Bafetinib，kw-2449，nyp-bhg712，dcc-2036，GZD824.，GNF-2，PD173955，GNF-5，Bosutinib，Gefitinib，Erlotinib，Sunitinib，Ruxolitinib，Tofacitinib，Lapatinib，Vandetanib，Sorafenib，Sunitinib，Axitinib，Nintedanib，Regorafenib，Pazopanib，Lenvatinib，Crizotinib，Ceritinib，Cabozantinib，DWF，Afatinib，Ibrutinib，Niraparib，Palbociclib，B43，KU004，Foreinib，KRCA-0008，PF-06439015，PF-06463922，Canerlinib，GSA-10，GW2974，GW583340，W24002，CP-380736，D2667，Mubritinib，PD153035，PD168393，Pelitinib，PF-06459988，PF06672131，PF-6422899，PKI166，ReveromycinA，Tyrphostin 1，tyrphostin23，lyrphostin51，Tyrphostin，AG528，Tyrphostin，AG658，Tyrphostin，AG825，Tyrphostin，AG835，Tyrphostin，AG1478，Tyrphostin，RG13022，Tyrphostin，RG14620，B178，GSK1838705A，PD-161570，PD173074，SU-5402，Roslin2，Picropodophyllotoxin，PQ401，i-ome-tyrphostin，AG538，GNF5837，GW441756，Tyrphostin，AG879，DMPQ，jnj-10198409，PLX647，Trapidil，TyrphostinA9，Tyrhostin，AG370，Lestaurtinib，DMH4，Eldanamvcin，Genistein，Gw2580，HerbimycinA，Lavendustin，CMidostaurin，nvp-bhg712，PD158780，pd-166866，pf-0627334，PP2，RPL，SU11274，SU5614，Symadex，Tyrphostin，AG34，Tyrphostin，AG974，Tyrphostin，AG1007，UNC2881，Honokiol，SU1498，SKLB1002，cp-547632，jk-p3，KRN633，sc-1，ST638，SU 5416，Sulochrin，Tyrphostin，SU1498，rociletinib，Dacomitinib，Tivantinib，Neratinib，Masitinib，Vatalanib，Icotinib，xl-184，osi-930，AB1010，Quizartinib，AZD9291，Tandutinib，HM61713，Brigantinib，Vemurafenib(plx-4032)，Semaxanib，AZD2171，Crenolanib，Damnacanthal，Fostamatinib，Motesanib，Radotinib，osi-027，Linsitinib，BIX02189，PF-431396，PND-1186，PF-03814735，PF-431396，sirollmus，temsirolimus，everolimus，deforolimus，Zotarolimus，BEZ235，INK128，Omipalisib，AZD8055，MHY1485，PI-103，KU-0063794，ETP-46464，GDC0349，XL388，WYE-354，WYE-132，GiSK1059615，WAY-600，PF-04691502，wYE-687，PP121，BGT226，AZD2o014，PP242，CH5132799，P529，GDC0980，GDC-0994，XMD82，Ulixertinib，FR180204，SCH772984，Trametinib，PD184352，PD98059，Selumetinib，PD325901， U0126，Pimasertinib，tak-733，AZD8330，Binimetinib，PD318088，SL-327，Refametinib，gdc-0623，Cobimetinib，b1-847325，Adaphostin，GNF2，PPYA，aim-100，ASP 3026，LFM，Toceranib，JQ1，Niraparib，Fuzuopali，palbociclib，ARS-853，ARS-1620，Chlorazol-violet N(直接紫N)，miRNA-21，PreS，Zidovudine，Lenvatinib，LY-364947，ARS-1620或Reparixin，EGFR抑制剂，TKI，BRD4抑制剂，KRAS通路相关靶点抑制剂，BRAF抑制剂，BTK抑制剂，PARP抑制剂，PD-L1抑制剂(包括抗体、小分子)，PD-1抑制剂(包括抗体、小分子)，OX40激动剂(包括抗体、小分子)，CD122抗体，CD3抗体，CD19抑制剂，CD20抑制剂，MUC1抑制剂，MUC16抑制剂，CDK4/6抑制剂，TGF-β抑制剂，CXCR抑制剂，CCL和CXCL趋化因子抑制剂以及miRNA。
在进一步优选的实施方案中，其中所述Tar选自如下的至少一种：TKI、EGFR抑制剂、KRAS抑制剂、BRAF抑制剂、BTK抑制剂、BRD4抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂、OX40激动剂、PARP抑制剂或CDK4/6抑制剂。
在优选的实施方案中，其中L为
Figure PCTCN2019080945-appb-000023
在优选的实施方案中，其中所述其他基团包括酰胺、烷氧键、烷硫键、取代胺基、季胺盐、cilck反应形成的杂环、可用蛋白酶解离的氨基酸基团、脲基团或硫脲基团。
在优选的实施方案中，所述免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐为选自以下的SZU系列化合物(具体结构式见下表4)或其药学上可接受的盐：SZU-116、SZU-119、SZU-124、SZU-125、SZU-146、SZU-147、SZU-168、SZU-169、SZU-174、SZU-175、SZU-176、SZU-177、SZU-178、SZU-179、SZU-180、SZU-181、SZU-158-PD-L1、SZU-158-OX40、SZU-158-PD-1或SZU-136-miRNA21。
本发明第三方面涉及本发明第一方面所述的式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐，化合物SZU-101、SZU-103、SZU-114、SZU-117、SZU-122和SZU-130(具体结构式见下表2)以及本发明第二方面所述的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐在制备参与免疫调节的药物中的用途。
本发明第四方面涉及本发明第一方面所述的式(I)的小分子免疫激动剂或其异 构体或药学上可接受的盐，化合物SZU-101、SZU-103、SZU-114、SZU-117、SZU-122和SZU-130以及本发明第二方面所述的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物、抗病毒药物和靶向清除蛋白的药物中的用途。
本发明还涉及化合物SZU-136-miRNA21及其类似物在制备免疫靶向RNA的药物中的用途。其中化合物SZU-136-miRNA21及其类似物作为免疫靶向的小分子RNA。所述药物可以为各种剂型，包括固体制剂、液体制剂、药物与各种载体形成的复合物或药物的结晶水复合物。
本发明还涉及化合物SZU-179、SZU-180和SZU-181在制备抗艾滋病和抗乙肝的药物中的用途。其中化合物SZU-179、SZU-180和SZU-181作为抗病毒免疫靶向化合物。
本发明还涉及化合物SZU-161和SZU-162在测定小分子免疫激动剂偶联蛋白药物和细胞的偶联度中的用途。其中化合物SZU-161和SZU-162作为具有特异紫外吸收的小分子免疫激动剂。
本发明还涉及化合物SZU-116和SZU-124在观察研究蛋白或靶向药的细胞吸收和体内分布中的用途，其中化合物SZU-116和SZU-124与蛋白或者靶向药偶联。化合物SZU-116和SZU-124作为具有小分子免疫激动剂发色指示剂的光学示踪特性的化合物，与蛋白或者靶向药偶联后可以实时显示蛋白或者靶向药的细胞吸收和体内分布。
本发明还涉及化合物SZU-114、SZU-117、SZU-122、SZU-127、SZU-133、SZU-138、SZU-143在制备具有免疫靶向双功能的药物中的用途，其中化合物SZU-114、SZU-117、SZU-122、SZU-127、SZU-133、SZU-138、SZU-143与靶向药或抗体偶联。
本领域技术人员意外地发现，本发明的小分子免疫激动剂本身具有免疫激活作用。另外，本领域技术人员已知将TKI和TLR7免疫激动剂联合应用会导致TKI拮抗TLR7激动剂的免疫细胞激活作用，抑制免疫激活细胞因子的产生。但是发明人将TKI靶向药和TLR7小分子免疫激动剂共价化合偶联后，意外发现这类共价偶联化合物不但保持或提高了小分子免疫激动剂的免疫激活作用，而且也提高了靶向药的抗肿瘤效果。通过本发明的方法得到的这种免疫靶向化合物对于肿瘤的长期高效治疗具有重要意义。
上述具有免疫激活作用并且可以与靶向药偶联形成具有靶向作用的免疫靶向化合物的新型小分子免疫激动剂如下表1所示：
表1
Figure PCTCN2019080945-appb-000024
Figure PCTCN2019080945-appb-000025
Figure PCTCN2019080945-appb-000026
Figure PCTCN2019080945-appb-000027
Figure PCTCN2019080945-appb-000028
其他具有免疫激活作用并且可以与靶向药偶联形成具有靶向作用的免疫靶向化合物的其他小分子免疫激动剂如下表2所示：
表2
Figure PCTCN2019080945-appb-000029
Figure PCTCN2019080945-appb-000030
其中，化合物SZU-103、SZU-114、SZU-117、SZU-122和SZU-130的结构式及其制备方法已公开于中国专利申请CN107281483A。化合物SZU-102和SZU-106的结构式及其制备方法已公开于中国专利申请CN106267188A，其中化合物SZU-102为其中的化合物1，化合物SZU-106为其中的化合物19。
其中表1和表2中的部分小分子免疫激动剂可与含巯基的多肽例如谷胱甘肽(glutathione，GSH)形成加成物，其能够靶向谷胱甘肽转移酶，协同化疗药物、不可逆TKI靶向药和其它不可逆靶向药来提高对疾病的治疗效果，消除耐药性，同时激活免疫效果。以SZU-117与谷胱甘肽反应形成SZU-117-GSH加成物为例，其合成过程如下式所示。举例说明的小分子免疫激动剂与GSH形成的加成物如表3所示：
Figure PCTCN2019080945-appb-000031
表3
Figure PCTCN2019080945-appb-000032
Figure PCTCN2019080945-appb-000033
其他含巯基的化合物包括例如2-甲胺乙硫醇和SZU-033T
Figure PCTCN2019080945-appb-000034
等。
表1和表2中的小分子免疫激动剂以及表3中的部分小分子免疫激动剂与GSH形成的化合物可以与靶向药偶联得到具有免疫靶向作用的双功能免疫靶向化合物，所得免疫靶向化合物如下表4所示：
表4
Figure PCTCN2019080945-appb-000035
Figure PCTCN2019080945-appb-000036
Figure PCTCN2019080945-appb-000037
Figure PCTCN2019080945-appb-000038
小分子免疫激动剂与靶向药偶联形成免疫靶向化合物的合成路线如下所示：
小分子免疫激动剂偶联靶向药合成路线之一：
Figure PCTCN2019080945-appb-000039
小分子免疫激动剂(以SZU-137为例)偶联靶向药合成路线之二：
Figure PCTCN2019080945-appb-000040
上述同样的方法也适用于由SZU-144或SZU-133与靶向药偶联形成免疫靶向化合物，linker也可以是简单的直链烷烃，也可以根据各种需要进行替换。
含羧基的小分子免疫激动剂(例如SZU-138)可以通过加成反应和偶联反应偶联抗体形成可溶性的功能蛋白多肽偶联体，其由于带有了二甲氨基基团可以成盐，形成离子化的正电荷，有利于提高治疗效果和水溶解性，从而解决偶联产物的溶解度问题。
另外，上述含羧基的小分子免疫激动剂也可以偶联2个不同的靶向药，形成双靶向免疫化合物。
小分子免疫激动剂(以SZU-171为例)偶联靶向药合成路线之三：
Figure PCTCN2019080945-appb-000041
由小分子免疫激动剂和谷胱甘肽形成的产物(以SZU-114-GSH为例)，也可以偶联2个不同的靶向药，以提高疗效。
小分子免疫激动剂偶联靶向药合成路线之四：
Figure PCTCN2019080945-appb-000042
其中的靶向药可以是各种TKI药物以及各种肿瘤靶向药，也可以是抗体如CD3抗体、PD-1抗体、OX40抗体、CD19抗体、CD20抗体、HER2抗体、MUC1抗体以及各种肿瘤蛋白抗体和致病原的抗体等。其中的偶联链可以是各种烷烃链或者烷氧基链等，可以根据溶解和代谢优化需要进行调整。
上述双偶联免疫靶向化合物的优点是可以形成2个正离子氨基基团(氨基盐-HN +-、-NH + 3)，溶解性高，双靶可以根据需要调整优化；比如靶向1为T细胞的CD3抗体或CD122抗体，靶向2为靶向肿瘤细胞HER2抑制剂，可以推动T细胞向肿瘤微环境的浸润，加强抗肿瘤效果的同时激活免疫TLR7受体，产生靶向免疫记忆。
小分子免疫激动剂(以SZU-166为例，其作为独特的异氰酸酯小分子免疫激动剂，具有和氨基化合物温和定量偶联加成的优势)偶联靶向药合成路线之五：
Figure PCTCN2019080945-appb-000043
SZU-115和SZU-160是具有click反应基团的新型小分子免疫激动剂，其功能基本包括二点，1)在与大分子和生物活性物质偶联后，利用click反应接上发色指示剂对偶联产物进行光学示踪，例如在偶联蛋白后或者靶向药后，观察蛋白或靶向药的细胞吸收和体内分布情况。
小分子免疫激动剂偶联靶向药合成路线之六：
Figure PCTCN2019080945-appb-000044
2)SZU-115也可以同时连接抗体和靶向药，减小抗体的脱靶效应，增强靶向药效，激活抗肿瘤免疫：
Figure PCTCN2019080945-appb-000045
化合物SZU-136和化合物SZU-160具有相似的作用和应用效果。
本发明中的SZU-139由SZU-136与核糖click反应生成：
Figure PCTCN2019080945-appb-000046
同样方法可以应用于小分子免疫激动剂偶联小分子RNA(miRNA)，例如miRNA21(microRNA21)在肿瘤发生和发展中具有重要作用(Cell Death Dis.2018 Feb 13；9(2):219.doi:10.1038/s41419-017-0243-9；Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Jun 30；112(26):E3355-64.doi:10.1073/pnas.1504630112；Cancer Lett.2017 May 1；393:86-93.doi:10.1016/j.canlet.2017.02.019； https://en.wikipedia.org/wiki/MIRN21)，应用小分子免疫激动剂偶联致病的miRNA可以引导免疫系统切断疾病的发生源头，阻断相关蛋白的变化和相关疾病的发生。
小分子免疫激动剂偶联靶向药合成路线之七：
Figure PCTCN2019080945-appb-000047
叠氮化miRNA的合成可参考文献(Bioconjug Chem.2003 May-Jun； 14(3):697-701)：
Figure PCTCN2019080945-appb-000048
炔基免疫激动剂可用SZU-115代替，SZU-115的羧基可以与Argonaute偶联成复合物，干扰miRNA和Argonaute复合物的形成，并在TLR7激动剂的作用下引导到免疫细胞内涵体，导致免疫消除和记忆：
Figure PCTCN2019080945-appb-000049
近期研究证实肿瘤外泌体释放致病性的miRNA是导致肿瘤耐药扩散的重要原因(Proc Natl Acad Sci U S A.2018 Feb 12.pii:201717363.doi:10.1073/pnas.1717363115；J Clin Invest.2016 Apr 1；126(4):1163-72.doi:10.1172/JCI81130)；人体自身产生的miRNA，特别是肿瘤细胞释放的miRNA一般没有免疫诱导能力，外源的反义寡核苷酸RNA虽然可以特异识别目标miRNA，但是大都具有免疫原性而被清除，或者在体内极快的被降解。应用上述方法可将致病性自身miRNA形成天然免疫能够识别的免疫原性miRNA。相同的方法同样适用于其它的致病性miRNA如miRNA30c等。
miRNA的一个重要作用是引导相应的Argonaute蛋白到目标mRNA切割或者进行转录抑制(https://en.wikipedia.org/wiki/Argonaute)。因此TLR7免疫激动剂和人体自身miRNA偶联的创新作用之一是免疫靶向干扰Argonaute蛋白的结合，消除其有关的致病作用，该作用示意图请参见图69。综上所述，发明人发现系列小分子免疫激动剂偶联靶向药，形成新的具有免疫激活功能的免疫靶向化合物，在体外体内产生了有利于提高靶向药的免疫激活效果和抗肿瘤及其它疾病的效果，赋予了所述靶向药双功能(双功能靶向药)，这种提高的效果是由具有免疫抗肿瘤因素 (如IFN-γ)和对致病性靶向位点的抑制二个功能协同作用产生，本发明涉及一种功能合二为一的新型高效靶向药。
本发明中所述免疫靶向化合物的一个合理作用是通过免疫途径清除病原性靶点(蛋白)，如图70所示。小分子免疫激动剂偶联靶向药后形成的免疫靶向化合物，由靶向药引导至病原性蛋白，导致靶向细胞死亡，释放病原性蛋白，进而由免疫激动剂引导至抗原递呈细胞(如DC，antigen presenting cell)，在细胞内对病原性蛋白进行切割处理，导致这些蛋白降解。本发明中小分子免疫激动剂偶联靶向药(如TKI等)形成的免疫靶向化合物，能够克服耐药性，提高治疗效果。
酸式系列的小分子免疫激动剂赖氨酸衍生化合物SZU-104、SZU-105、SZU-112、SZU-113为具有免疫激动剂活性的氨基酸衍生物，在制备免疫抗原多肽中，可以按照需要插入多肽(或抗体)的定点位置达到定位偶联的目的：
Figure PCTCN2019080945-appb-000050
SZU-161和SZU-162作为偶联蛋白药物的小分子免疫激动剂，具有特异性紫外吸收峰(342nM)，可以作为测定小分子免疫激动剂偶联蛋白药物偶联度的通用方法：
Figure PCTCN2019080945-appb-000051
测定方法，1)在不同浓度下测定SZU-161在紫外342nM处的光吸收强度，作出浓度和吸光度的标准曲线，得出浓度-吸光度关系式；2)偶联蛋白后测定偶联蛋白在一定浓度下的342nM处的吸光度，代入关系式即可得出偶联物中SZU-161的相对浓度既得偶联度。SZU-162具有同样的应用效果。
附图说明
以下各图中提及的“免疫细胞因子”表示Cytokine(包括IFN-γ、IL-12、IL-6、TNF-α等)，它们的浓度高低可以用于指示化合物激活免疫细胞效应的高低。
图1示出了SZU-GSH系列化合物的免疫细胞因子(IL-6)激活效果。
图2示出了荧光标记的SZU-116在细胞内的分布。
图3示出了SZU-102、103、106、107、108、110、111、114、115、116、117、118的免疫细胞因子(IFN-γ)激活效果。其中SZU-101和R848作为标准对照物，它们是国际公认的标准的具有免疫激活作用的小分子免疫激动剂，下同。
图4示出了SZU-143、144、146、147、149的免疫细胞因子(IFN-γ)激活效果。其中con为PBS空白对照，下同。
图5示出了SZU-143、144、146、147、149的免疫细胞因子(IL-12)激活效果。
图6示出了SZU-143、144、146、147、149的免疫细胞因子(TNF-α)激活效 果。
图7示出了SZU-143、144、146、147、149的免疫细胞因子(IL-6)激活效果。
图8示出了SZU-145、158、104、109、112、124的免疫细胞因子(IFN-γ)激活效果。
图9示出了SZU-145、158、104、109、112、124的免疫细胞因子(IL-12)激活效果。
图10示出了SZU-145、158、104、109、112、124的免疫细胞因子(TNF-α)激活效果。
图11示出了SZU-145、158、104、109、112、124的免疫细胞因子(IL-6)激活效果。
图12示出了SZU-125的各免疫细胞因子激活效果。
图13示出了SZU-105的免疫细胞因子(IFN-γ)激活效果。
图14示出了SZU-105的免疫细胞因子(IL-12)激活效果。
图15示出了SZU-113的免疫细胞因子(IFN-γ)激活效果。
图16示出了SZU-113的免疫细胞因子(IL-12)激活效果。
图17示出了SZU-119的免疫细胞因子(IL-12)激活效果。
图18示出了SZU-119的免疫细胞因子(IL-6)激活效果。
图19示出了SZU-120的免疫细胞因子(IFN-γ)激活效果。
图20示出了SZU-120的免疫细胞因子(IL-6)激活效果。
图21-图54分别示出了本发明中小分子免疫激动剂SZU-122、127-142的各免疫细胞因子激活效果。
图55示出了SZU-102、119、125、146、147、169、174、175、168、176、177、179激活免疫细胞产生IFN-γ的效果。
图56示出了SZU-102、119、125、146、147、169、174、175、168、176、177、179激活免疫细胞产生IL-12的效果。
图57示出了新型免疫靶向化合物体内抗肿瘤(CT26)活性效果：Veh(未给药对照)，A(SZU-177)，B(SZU-175)，C(SZU-174)，D(SZU-147)，E(SZU-176)。
图58示出了新型免疫靶向化合物体内抗肿瘤(B16)活性效果：Veh(未给药对照)，G(PD-L1抗体)，H(SZU-178)，I(SZU-158-PD-L1)，J(SZU-158-OX40)，K(PD-1抗体)，L(SZU-158-PD-1)。
图59示出了JQ1抑制SZU-101的TLR7激动剂活性；SZU-119保持了TLR7激动剂的免疫细胞因子激发活性。
图60示出了JQ1抑制SZU-101的TLR7激动剂活性；SZU-119保持了TLR7激动剂的免疫细胞因子激发活性。
图61示出了SZU-119保持了JQ1对B16细胞的CD274(PD-L1)抑制活性。其中的“control”指的是空白对照。
图62示出了SZU-163和SZU-166激活免疫细胞产生IFN-γ的效果。
图63示出了SZU-180和SZU-136-miRNA21激活免疫细胞产生IFN-γ的效果。
图64示出了PD-1抗体、PD-L1抗体、OX40抗体和它们的SZU-158偶联物以及SZU-178的抗肿瘤(4T1)存活率效果。
图65示出了PD-1抗体、PD-L1抗体、OX40抗体和它们的SZU-158偶联物及SZU-178激活免疫细胞产生IFN-γ的效果。
图66示出了SZU-181激活免疫细胞产生IFN-γ的效果。
图67示出了SZU-106、SZU-158、SZU-160激活免疫细胞产生IFN-γ的效果，其中的“control”为PBS空白对照。
图68示出了SZU-106、SZU-158、SZU-160激活免疫细胞产生IL-6的效果，其中的“control”为空白对照。
图69示出了TLR7小分子免疫激动剂和人体自身miRNA偶联以免疫靶向干扰激动剂蛋白的结合，消除其有关的致病作用的作用示意图。
图70示出了本发明中免疫靶向化合物通过免疫途径清除病原性靶点(蛋白)的作用示意图。
具体实施方式
本发明有关的化合物的合成方法举例如下，举例的合成方法可以启示本领域技术人员实现本发明中新型化合物的合成，但是本发明中新型化合物的合成不局限于举例的合成方法。
制备实施例
SZU-112
Figure PCTCN2019080945-appb-000052
将1g SZU-101、311mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和518mg二氯乙烷(EDC)溶于12mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护条件下室温反应2h，TLC监测反应。反应结束后，将反应液倒入水中，析出沉淀，过滤干燥，得SZU-009T粗品，直接进行下一步反应。
将500mg SZU-009T与339mg Fmoc-D-赖氨酸溶于10mL无水DMF中，室温搅拌1h。反应完成后，加水析出固体，抽滤。经氯仿：甲醇＝3:1柱层析分离，得白色固体576mg，产率78.9％，ESI-MS:m/z＝795.3[M+H] +。
SZU-107
Figure PCTCN2019080945-appb-000053
将1g SZU-101溶解在无水20倍重量的DMSO中，按照顺序加入等摩尔的1)、2)、3)；反应物混合室温搅拌12小时，加入反应体积10倍体积的水，混合物离心沉淀，得到粗品沉淀产物。将此沉淀产物加入20毫升饱和碳酸钠水中，搅拌10分钟，过滤，滤液用浓盐酸调剂PH值为3，析出纯品SZU-107，真空干燥，收率65％。 ESI-MS:m/z＝647.6865[M+H] +。
SZU-113
Figure PCTCN2019080945-appb-000054
将50mg SZU-112溶于1mL二乙胺中，室温搅拌1h，TLC监测反应进程。反应完成后，减压除去二乙胺。加入1mL二氯甲烷洗涤，10,000rpm离心5min，移除上清，沉淀重复洗涤一次。减压干燥，得白色固体32mg，产率90％，ESI-MS:m/z＝573.2[M+H] +。
SZU-115
Figure PCTCN2019080945-appb-000055
将108mg SZU-009T溶于2mL无水DMF中，依次加入31mg SZU-013T和100μL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，室温搅拌过夜，LC-MS监测反应进程。反应结束后，经制备型液相色谱分离，得白色固体65mg，产率56％，ESI-MS:m/z＝582.2[M+H] +。
SZU-116
Figure PCTCN2019080945-appb-000056
将264mg SZU-017T、324mg HBTU和119mg 1-羟基苯并三唑(HOBt)溶于 5mL无水DMF中，滴加256μL DIEA，室温搅拌10min。加入5mL SZU-020T(230mg)的无水DMF溶液后，室温搅拌过夜。将反应液倒入100mL 5％HCl中，用30mL二氯甲烷萃取3次，合并有机层，分别用饱和碳酸氢钠溶液、5％HCl和饱和氯化钠溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝50:1)，得紫红色半固体SZU-021T 180mg，产率51.6％。
将28mg SZU-021T溶于0.1mL二甲基亚砜(DMSO)中，与0.5mL、97mg三(2-羧乙基)膦(TCEP)水溶液，0.1mL、18mg TBTA的DMSO溶液和0.5mL、54mg无水硫酸铜的水溶液混合，加入20mg SZU-115的甲醇/水混合溶液2mL，室温搅拌2h。经柱层析分离得紫红色固体31mg，产率66％，ESI-MS:m/z＝1393.7[M+H] +。
SZU-119
Figure PCTCN2019080945-appb-000057
将667mg SZU-009T溶于2mL无水DMF中，加入300mg SZU-020T，室温搅拌过夜。反应完成后，将反应液倒入水中，析出白色固体，干燥得SZU-030T粗品。
将上一步所得SZU-030T溶于10mL无水四氢呋喃(THF)中，冰浴下加入484mg三苯基膦，转入室温继续搅拌过夜，LC-MS监测反应进程。反应毕，加入20mL水，继续搅拌30min，减压抽滤，水洗两次，干燥得SZU-031T 625mg，两步合并收率79％。
取71mg SZU-031T、42mg(+)-JQ-1-COOH(JQ1活性体)、46mg HBTU溶于2mL无水DMF中，加入催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温搅拌24h，LC-MS监测反应进程。经制备型液相色谱分离，冻干得淡黄色固体27mg，产率27％，ESI-MS:m/z＝1001.2[M+H] +。
SZU-124
Figure PCTCN2019080945-appb-000058
制备方法同SZU-116，只是用FITC替代SZU-017T，得草绿色半固体，两步合并收率31％，ESI-MS:m/z＝1199.5[M+H] +。
SZU-125
Figure PCTCN2019080945-appb-000059
将34mg SZU-008T溶于500μL无水DMF中，依次加入53mg PD-1/PD-L1抑制剂(CAS#:1675203-84-5)、43mg HBTU、42μL三乙胺(TEA)以及催化量的DMAP，室温搅拌5h。反应完成后，经制备型液相色谱分离，冻干，得白色固体45mg，产率56％，ESI-MS:m/z＝802.3[M+H] +。
SZU-127
Figure PCTCN2019080945-appb-000060
制备方法同SZU-125，只是用维甲酸替代PD-1/PD-L1抑制剂，得黄色固体， ESI-MS:m/z＝627.4[M+H] +。
SZU-134
Figure PCTCN2019080945-appb-000061
制备方法同SZU-125，只是用戊二酸酐替代PD-1/PD-L1抑制剂，得白色固体，ESI-MS:m/z＝459.1[M+H] +。
SZU-138
Figure PCTCN2019080945-appb-000062
制备方法同SZU-125，只是用衣康酸酐替代PD-1/PD-L1抑制剂，得白色固体，ESI-MS:m/z＝457.1[M+H] +。
SZU-140
Figure PCTCN2019080945-appb-000063
制备方法同SZU-125，只是用乙酸酐替代PD-1/PD-L1抑制剂，得白色固体，ESI-MS:m/z＝387.1[M+H] +。
SZU-103-GSH
Figure PCTCN2019080945-appb-000064
将SZU-103和等当量谷胱甘肽(Glutathione，GSH)溶于无水DMF中，室温搅拌过夜，LC-MS监测反应进程。反应结束后，经制备型液相色谱分离，得白色固体，产率85％，ESI-MS:m/z＝936.2[M+H] +。
SZU-142
Figure PCTCN2019080945-appb-000065
将5g SZU-005T置于圆底烧瓶中，加入浓盐酸，反应12h，反应毕，低温下用氢氧化钠调节pH至3-4，析出白色固体4.56g，产率95％，ESI-MS:m/z＝345.2[M+H] +。
SZU-145
Figure PCTCN2019080945-appb-000066
将20mg SZU-138溶于2mL无水DMF中，依次加入8.7mg D-葡糖胺、9.2mg EDC、6.5mg HOBt，室温搅拌2h。反应结束后，经制备型液相色谱分离，得白色固体12mg，产率44％，ESI-MS:m/z＝618.2[M+H] +。
SZU-114-GSH
Figure PCTCN2019080945-appb-000067
制备方法同SZU-103-GSH，只是用SZU-114替代SZU-103，得白色固体，ESI-MS:m/z＝763.3[M+H] +。
SZU-117-GSH
Figure PCTCN2019080945-appb-000068
制备方法同SZU-103-GSH，只是用SZU-117替代SZU-103，得白色固体，ESI-MS:m/z＝874.3[M+H] +。
SZU-158
Figure PCTCN2019080945-appb-000069
制备方法同SZU-103-GSH，只是用SZU-138替代SZU-103，用2-二甲胺基乙硫醇替代谷胱甘肽，得白色固体，ESI-MS:m/z＝562.2[M+H] +。同样方法可以制备SZU-159,只是将SZU138替代为SZU-144和2-二甲胺基乙硫醇室温反应24小时既得SZU-159。
SZU-161
Figure PCTCN2019080945-appb-000070
制备方法同SZU-103-GSH，只是用SZU-138替代SZU-103，用SZU-033T替代谷胱甘肽，得白色固体，ESI-MS:m/z＝708.4[M+H] +。
SZU-162
制备方法同SZU-161，ESI-MS:m/z＝695.81[M+H] +。
SZU-160
Figure PCTCN2019080945-appb-000071
制备方法同SZU-115，只是用SZU-032T替代SZU-013T，得白色固体，ESI-MS: m/z＝599.3[M+H] +。
SZU-114
Figure PCTCN2019080945-appb-000072
在0℃下，向TL-008的无水DMF溶液中加入HBTU、DMAP和TEA。室温搅拌0.5h后，在0℃下加入反式-4-二甲氨基巴豆酸盐酸盐。室温反应24h。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝456.6[M+H] +)。
SZU-117
Figure PCTCN2019080945-appb-000073
SZU-001S的合成:
在0℃下，向SZU-101的无水DMF溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、HOBt和DIPEA。室温搅拌0.5h后，在0℃下加入N-B℃哌嗪。室温反应24h。反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝613.4[M+H] +)。
SZU-130的合成:
向SZU-001S的二氯甲烷溶液中滴加三氟乙酸。搅拌2h后，减压浓缩反应液。加入5mL乙醇及2N HCl溶液得到其盐酸盐。减压除去溶剂后，加入乙醚或二氯甲烷再次减压除去溶剂，重复多次后得到固体纯品(ESI-MS：m/z＝513.5[M+H] +)。 SZU-117的合成:
在0℃下，向SZU-130的无水DMF溶液中依次加入TEA和丙烯酰氯。室温搅拌2h后，将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝567.7[M+H] +)。
SZU-118
Figure PCTCN2019080945-appb-000074
向SZU-101的无水DMF溶液中加入EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入盐酸羟胺，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝460.4[M+H] +)。
SZU-120
Figure PCTCN2019080945-appb-000075
向SZU-101的无水DMF溶液中加入EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入吗啉，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝514.5[M+H] +)。
SZU-122
Figure PCTCN2019080945-appb-000076
在0℃下，向SZU-142的无水DMF溶液中依次加入TEA和丙烯酰氯。室温搅 拌2h后，将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝399.4[M+H] +)。
SZU-128
Figure PCTCN2019080945-appb-000077
向SZU-101的无水DMF溶液中加入EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入1-甲基哌嗪，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝527.7[M+H] +)。
SZU-129
Figure PCTCN2019080945-appb-000078
向SZU-101的无水DMF溶液中加入EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入硫吗啉，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝530.6[M+H] +)。
SZU-131
Figure PCTCN2019080945-appb-000079
向SZU-101的无水DMF溶液中加入EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入1-乙酰基哌嗪，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝555.6 [M+H] +)。
SZU-132
Figure PCTCN2019080945-appb-000080
向SZU-101的无水DMF溶液中加入EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入吡咯烷，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝498.5[M+H] +)。
SZU-133
Figure PCTCN2019080945-appb-000081
向SZU-142的无水DMF溶液中加入马来酸酐。反应过夜后，将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝443.3[M+H] +)。
SZU-143
Figure PCTCN2019080945-appb-000082
向富马酸单甲酯的无水DMF溶液中加入EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入SZU-142，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经高效液相HPLC分离纯化得纯品(ESI-MS： m/z＝457.4[M+H] +)。
SZU-144
Figure PCTCN2019080945-appb-000083
向SZU-143的甲醇/水(1:1)混合溶液中加入氢氧化钠(1.1当量)。室温搅拌8小时，反应完成后用1N HCl溶液中和反应液，经抽滤、水洗得到粗品，后经高效液相HPLC分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝443.5[M+H] +)。
SZU-146
Figure PCTCN2019080945-appb-000084
向SZU-101的无水DMF溶液中加入EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪(Fuzuopali中间体)，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经液相分离纯化得纯品(ESI-MS：m/z＝619.6[M+H] +)。
SZU-147
Figure PCTCN2019080945-appb-000085
向SZU-101的无水DMF溶液中加入等摩尔的EDCI和HOBt。搅拌15min后，在0℃下加入DIPEA。室温反应0.5h后，在0℃下加入等摩尔的Niraparib，室温反应过夜。将反应液倒入水中，抽滤得到粗品，后经高效液相HPLC分离纯化得纯品SZU-147(ESI-MS：m/z＝747.77[M+H] +)。
SZU-148
Figure PCTCN2019080945-appb-000086
将1:1的氢氧化锂和SZU-101加入水中，搅拌2-3h，后冻干除去溶剂得纯品。
SZU-150、151、152和153
Figure PCTCN2019080945-appb-000087
SZU-151的合成：
向N,N-二甲基乙醇胺中加入金属Na，形成钠盐后，向反应液中加入起始原料，加热至95℃反应3h。减压除去溶剂后加入水，抽滤得到固体，水洗至pH值7-8后，减压干燥得纯品SZU-151。
SZU-152的合成：
向SZU-151的乙酸溶液中缓慢滴加溴素。搅拌过夜后，用NaHCO 3中和反应液。向所得粘性化合物中加如少许乙醇。后加入硫代硫酸钠溶液除去剩余溴。抽滤并干燥所得固体后，加入10％NaOH溶液，再次抽滤后减压干燥。制备型液相色谱纯化得溴化物。
向甲醇中加入金属Na，搅拌后加入起始原料，加热至80℃反应2h。减压除去甲醇，用HCl中和。抽滤并减压干燥所得固体SZU-152。
SZU-150和SZU-153的合成：
将SZU-152加入HCl并搅拌12h。减压除去溶液，经液相制备型色谱分离后得到化合物SZU-150(ESI-MS:354.5[M+H] +)和SZU-153(ESI-MS:m/z＝372.4[M+H] +)。
SZU-154
Figure PCTCN2019080945-appb-000088
向SZU-152的乙醇/水(1:1)混合溶液中加入NaOH，回流过夜。减压浓缩，调pH至3。液相制备型色谱纯化得纯品SZU-154(ESI-MS：m/z＝387.5[M+H] +)。
SZU-155
Figure PCTCN2019080945-appb-000089
将SZU-154溶解于浓HCl并搅拌过夜。减压除去溶剂，制备型液相色谱纯化得纯品SZU-155(ESI-MS：m/z＝373.5[M+H] +)。
SZU-104
Figure PCTCN2019080945-appb-000090
将50mg SZU-102溶于0.5mL DMSO中，加入41mg叔丁氧羰基(Boc)保护的赖氨酸，室温搅拌过夜。反应结束后，冻干除去DMSO，经制备型液相色谱分离，得到白色固体69mg，收率85％，ESI-MS：m/z＝633.7[M+H] +。
SZU-105
Figure PCTCN2019080945-appb-000091
将50mg SZU-102溶于0.5mL DMSO中，加入47mg B℃保护的赖氨酸，室温搅拌过夜。反应结束后，冻干除去DMSO，经制备型液相色谱分离，得到白色固体68mg，收率83％，ESI-MS：m/z＝533.6[M+H] +。
SZU-108
Figure PCTCN2019080945-appb-000092
将109mg SZU-102溶于1mL DMSO中，加入50mg PEG2，室温搅拌过夜。反应结束后，冻干除去DMSO，经制备型液相色谱分离，得到白色固体125mg，收率79％，ESI-MS：m/z＝564.6[M+H] +。
SZU-109
Figure PCTCN2019080945-appb-000093
将87mg SZU-102溶于0.9mL DMSO中，加入50mg PEG3，室温搅拌过夜。反应结束后，冻干除去DMSO，经制备型液相色谱分离，得到白色固体105mg，收率77％，ESI-MS：m/z＝608.7[M+H] +。
SZU-110
Figure PCTCN2019080945-appb-000094
将193mg羧基化合物溶于2mL DMSO中，依次加入100mg EDCI和59mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌两小时后，向反应液中加入50mg PEG2，室温搅拌过夜。反应结束后，冻干除去DMSO，经制备型液相色谱分离，得到白色固体203mg，收率73％，ESI-MS：m/z＝519.5[M+H] +。
SZU-111
Figure PCTCN2019080945-appb-000095
将155mg羧基化合物溶于1.5mL DMSO中，依次加入79mg EDCI和47mg NHS，室温搅拌两小时后，向反应液中加入50mg PEG3，室温搅拌过夜。反应结束后，冻干除去DMSO，经制备型液相色谱分离，得到白色固体174mg，收率72％，ESI-MS：m/z＝563.6[M+H] +。
SZU-149和SZU-163
Figure PCTCN2019080945-appb-000096
将100mL的无水正丁醇中，于0℃下缓慢加入0.5g的金属钠。30min后，加入3g的反应物a，反应物于100℃搅拌8小时，冷却到室温，倾倒大量水中，析出黄色固体过滤，用四氢呋喃洗三次，干燥得产物b 2.5g。
将2.5gb与100mL的氯仿混合搅拌均匀，加入10mL的溴素，室温反应24小时，过滤得产物c 2.2g。将产物c与二氧六环60mL混合，加入浓盐酸10mL，混合物于110℃反应12小时，反应物倾入600mL水中，析出固体粗品，产物过滤，溶解于60mL的1N NaOH中，冷却下用盐酸中和到pH4，析出纯品，干燥后得1g SZU-149，收率55％。MS(ESI):m/z:[M+Na]381.42。
将0.5g SZU-149溶解于无水甲醇，加入蓝尼镍0.5g，于氢气压力3个大气压下氢化反应24小时，过滤，减压蒸馏得SZU-163纯品0.4g，收率89％；MS(ESI):m/z:[M+H]329.41。
SZU-166和SZU-181
Figure PCTCN2019080945-appb-000097
SZU-166的合成：
取SZU-163 1.5g溶解在30mL的DMSO中，加入1mL三乙胺，0.5g的氯甲酸乙酯；混合物室温搅拌2小时。混合物真空蒸馏至少量体积，冷却至室温，加入30mL乙酸乙酯，析出固体，过滤，乙酸乙酯洗，干燥得到SZU-166纯品0.75g，收率46％,MS(ESI):m/z:[M+H]355.40。
SZU-181的合成(SZU-166偶联乙肝PreS抗原表位形成的复合物)：
Figure PCTCN2019080945-appb-000098
取SZU-166(10mg)与PreS-肽(90mg)混合溶液于3mL的DMF中，加入0.2mL的三乙胺，混合物于20℃搅拌反应24小时。加入3mL的二氯甲烷，产品沉淀离心分离，粗品HPLC分离纯化，冷冻干燥得SZU-181 65mg。质谱确定分子量：3512.80：(1756.3x2)，(1170.9x3)。
SZU-136和SZU-139
Figure PCTCN2019080945-appb-000099
将EDCI和HOBt加入等摩尔数的4-戊炔酸的DMF溶液中，15分钟后加入三乙胺，反应与0℃搅拌15分钟后，继续室温搅拌反应30分钟，然后加入等摩尔的TL-008于室温下反应过夜。反应也倾倒与水中，析出的产品过滤，真空干燥后得SZU-136收率87％，MS(ESI):m/z:[M+1]425.51.
将SZU-136、叠氮化合物2、抗坏血酸钠以等摩尔加入DMSO和水的1:1溶液中，于室温搅拌过夜，加入10倍体积的水，过滤，HPLC纯化，干燥得SZU-139，收率77％，MS(ESI):m/z:[M+1]654.72。
SZU-169
Figure PCTCN2019080945-appb-000100
将SZU-134溶解于DMSO中，加入等摩尔的NHS和EDCI，搅拌10分钟后，加入等摩尔的直接紫N(OX40激动剂)。反应物室温密闭反应3天。反应物加入20倍的水，析出的固体过滤，加入2N的NaOH与10℃搅拌30分钟，过滤，滤液用2N盐酸酸化到PH1，析出固体产品SZU-169，收率52％，MS(ESI):m/z:[M+2Na]1611.64。
SZU-174
Figure PCTCN2019080945-appb-000101
将a反应物溶解于少量DMF中，加入一倍当量的叠氮化钠，于室温搅拌反应24小时，反应物中加入10倍量体积的水，用乙酸乙酯提取，提取相用水洗三次，减压蒸馏除去溶剂，得产物b，收率90％。
将Afatinib(阿法替尼)100mg和50mg b溶解于15mL的DMF中，加入微量的NaI，于60℃反应24小时；向反应混合物加入正丁醇100mL，混合物减压蒸馏至少量体积(约5mL)，冷却至室温，加入50mL的乙酸乙酯，析出固体产品c，真空干燥得118mg产物c，MS(ESI):m/z:[M+H]688.21。
将产物c 100mg、60mg SZU-136、10mg硫酸铜、30mg微生素c加入DMSO和水的1:1溶液中，于室温搅拌过夜，加入10倍体积的水，过滤，HPLC纯化，干燥得SZU-174，105mg，收率65％，MS(ESI):m/z:[M+1]1112.70。
SZU-158-PD-1
Figure PCTCN2019080945-appb-000102
取5mg的SZU-158，溶解于0.5mL的DMSO中，加入等摩尔的NHS和EDCI，室温搅拌4小时。将PD-1抗体20mg(购自Bioxcell，J43)的0.5mLPBS溶液加入，混合物于密闭15℃搅拌过夜。混合反应液用滤膜过滤，得SZU-158-PD-1偶联产物，冷冻干燥得白色固体SZU-158-PD-1，18mg。质谱检测偶联度为n＝4。(SZU-158-PD-1的免疫细胞因子活性见图58和65，抗体功能见图58、64和65)。
SZU-158-OX40
Figure PCTCN2019080945-appb-000103
取5mg的SZU-158，溶解于0.5mL的DMSO中，加入等摩尔的NHS和EDCI，室温搅拌4小时。将OX40抗体20mg(购自Bioxcell，OX-86)的0.5mLPBS溶液加入，混合物于密闭15℃搅拌过夜。混合反应液用滤膜过滤，得SZU-158-OX40偶联产物，冷冻干燥得白色固体SZU-158-OX40，17mg。质谱检测偶联度为n＝4。(SZU-158-OX40的免疫细胞因子活性见图58和65，抗体功能见图58、64和65)。
SZU-158-PD-L1
Figure PCTCN2019080945-appb-000104
取5mg的SZU-158，溶解于0.5mL的DMSO中，加入等摩尔的NHS和EDCI，室温搅拌4小时。将PD-L1抗体20mg(购自Bioxcell，10F.9G2)的0.5mLPBS溶液加入，混合物于密闭15℃搅拌过夜。混合反应液用滤膜过滤，得SZU-158-PD-L1偶联产物，冷冻干燥得白色固体SZU-158-PD-L1，15mg。质谱检测偶联度为n＝4。(SZU-158-PD-L1的免疫细胞因子活性见图58和65，抗体功能见图58、64和65)。
SZU-158偶联抗体形成的新的免疫靶向化合物由于带有了二甲氨基基团可以成盐，形成离子化的正电荷，有利于提高治疗效果和水溶解性。
SZU-168和SZU-175
Vemu-1是Vemurafenib的前体，购自药明康德公司。
Figure PCTCN2019080945-appb-000105
Figure PCTCN2019080945-appb-000106
将Vemu-1溶解于DMF中，加入2倍摩尔的三乙胺，冷却至0℃，加入1倍摩尔的乙烯基磺酰氯，混合物缓慢升至室温搅拌8小时，混合物加入10倍体积的冰水，充分搅拌1小时，饱和Na 2CO 3调节pH至8，析出固体，过滤，水洗2次，干燥得Vemu-2。将1g Vemu-2溶解在30mL的DMF中，加入0.33g的巯基乙胺，混合物室温搅拌12小时，反应物减压蒸馏除溶剂，得Vemu-3粗品，硅胶柱层析分离得Vemu-3纯品0.98g，收率85％，MS(ESI):m/z:[M+1]552.04。
将0.3g Vemu-3溶解在10mL的DMSO中，加入0.2g的SZU-166，混合物于40℃搅拌反应8小时，加入100mL水，离心沉淀得粗品，粗品溶解在20mL的冰 醋酸中，过滤后，滤液加入100mL的水，析出纯品SZU-168，干燥得0.33g，MS(ESI):m/z:[M+1]906.41。
将1g SZU-158溶解在10mL的DMSO中，加入0.2g NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、0.33g EDCI(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐)，混合物室温搅拌过夜得SZU-137。加入0.9g Vemu-3，室温继续搅拌12小时，混合物加入100mL水，过滤，得粗品，用乙酸重结晶，得SZU-175醋酸盐1.22g，MS(ESI):m/z:[M+1]1095.81。
SZU-176
Osimertinib中间体购自药明康德公司。
Figure PCTCN2019080945-appb-000107
Figure PCTCN2019080945-appb-000108
将1g SZU-144溶解在10mL的DMSO中，加入0.26g NHS、0.4g EDCI，混合物室温搅拌过夜。加入1g Osimertinib中间体，室温继续搅拌12小时，混合物加入100mL水，过滤，得粗品，用乙酸重结晶，得SZU-176醋酸盐1.5g，MS(ESI):m/z:[M+1]870.81。
SZU-177
Figure PCTCN2019080945-appb-000109
将100mg Erlotinib、150mg SZU-160、20mg硫酸铜和20mg微生素c加入DMSO和水的1:1溶液中(10mL)，于室温搅拌过夜，加入10倍体积的水，过滤，HPLC纯化，干燥得SZU-177，176mg，收率70％，MS(ESI):m/z:[M+1]993.10。
SZU-178
Figure PCTCN2019080945-appb-000110
取3.5mg的SZU-160，溶解于0.5mL的DMSO中，加入等摩尔的NHS和EDCI，室温搅拌4小时。将PD-L1抗体20mg(购自Bioxcell，10F.9G2)的0.5mLPBS溶液加入，混合物于密闭15℃搅拌过夜。混合反应液用滤膜过滤，得SZU-160-PD-L1抗体偶联产物溶液；将2.5mg的Erlotinib、2mg的抗坏血酸钠和2mg的硫酸铜加入，混合物室温搅拌反应12小时，反应液用滤膜过滤，冷冻干燥得白色固体SZU-178(即SZU-178偶联Erlotinib和PD-L1抗体形成的复合物SZU-160-Erlotinib-PD-L1)，12mg。质谱检测偶联度为n＝4。(SZU-178的免疫细胞因子激活功能和抗肿瘤功能见附图58、64和65)。
SZU-136-miRNA21
Figure PCTCN2019080945-appb-000111
将71mg的miRNA21(购自苏州吉玛基因股份有限公司)溶于10mL的乙腈和水1:1的溶剂中，加入14mg的Ag 2CO 3，混合物于室温搅拌12小时，减压蒸除溶剂得Ag-miRNA21，69mg(96％)。将此Ag-miRNA21与氯化叠氮物5mg混合于20mL的乙腈，混合物加热回流4小时，冷却到室温，加入50mL水，搅拌15分钟后，过滤。滤液减压蒸馏至少量体积(10mL)，加入50mL的四氢呋喃，搅拌10分钟后，离心沉淀，沉淀真空干燥得N3-miRNA21，45mg(收率61％)。MS(ESI):m/z:[M+Na]7307.42。
取40mg的N3-miRNA21、3mg的SZU-136、2mg的硫酸铜和2mg的维生素c，混合加入DMSO和水的1:1溶液中(10mL)，于室温搅拌过夜，产物经HPLC纯化，冷冻干燥，真空干燥得SZU-136-miRNA21(即SZU-136偶联miRNA21形成的复合物)，14mg，收率33％，MS(ESI):m/z:[M+Na]7731.86。
SZU-179
Figure PCTCN2019080945-appb-000112
取580mg的SZU-115、267mg的Zidovudine、25mg的硫酸铜和25mg的抗坏血酸钠，混合加入DMSO和水的1:1溶液中(25mL)，于室温搅拌过夜，加入10倍体积的水，真空蒸馏至较少体积(约10mL)，加入30mL水，混合液用5％NaOH调节到pH10，过滤，滤液用冰乙酸调节为pH5，析出产物，过滤出产品，真空干燥得SZU-179，728mg，收率86％，MS(ESI):m/z:[M+Na]871.42。
SZU-115-PD-L1-靶向药(即SZU-115偶联PD-L1抗体和靶向药形成的复合物)
Figure PCTCN2019080945-appb-000113
SZU-115-抗体-靶向药的复合物
SZU-180
Figure PCTCN2019080945-appb-000114
偶联PD-L1抗体的方法与SZU-178制备中相同，click反应方法与SZU-179制备中相同，得到SZU-180。所得产物可用于治疗艾滋病。
效果实施例
效果实施例1：检测本发明SZU系列小分子免疫激动剂和新型免疫靶向化合物对脾 淋巴细胞的免疫激发作用
1.脾淋巴细胞的提取
(1)取BALB/c或者C57BL/6小鼠脾，在含小鼠淋巴细胞分离液的小皿内研磨，经0.22μm滤膜过滤后得到细胞悬液。经离心处理得到淋巴细胞。将取出的淋巴细胞放入15mL离心管内并加入10mL 1640完全培养基，混匀。转速250g离心10min，弃上清。
(2)用1mL红细胞裂解液重悬细胞，裂解1分钟后加4mL 1640完全培养基终止。转速1000rpm，离心5分钟，弃上清。
(3)用2mL 1640完全培养基重悬细胞并计数，将细胞按照1×10 6个/孔种于24孔板内。
2.获取样品
用不同浓度的本发明SZU系列小分子免疫激动剂和新型免疫靶向化合物刺激接种于24孔板内的脾淋巴细胞，将24孔板移入孵箱，刺激24小时后轻轻吸取上清，即为Elisa检测的样品。浓度和浓度梯度由各个测定样品的需要而定。
3.Elisa检测
(1)包被：10X包被缓冲液稀释到1X后，用于稀释捕获抗体。在96孔酶标板内加入稀释后的捕获抗体，每孔100μl，用保鲜膜封好放置在37℃ 2-4小时或者4℃冰箱过夜。吸去酶标板内的液体，用洗涤缓冲液(PBST:PBS溶液加千分之五Tween-20)洗板三次，拍干。
(2)封闭：每孔加入200μl已稀释的封闭液，用保鲜膜封好，室温封闭一小时。用PBST洗板三次，拍干。
(3)加样品：设置12个标准品，每个标准品浓度设立2个复孔。标准品最高浓度为2000pg/mL，用稀释缓冲液倍比稀释至所需浓度。标准品浓度依次为：2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.5pg/mL、15.75pg/mL、7.875pg/mL、3.9375pg/mL、1.96875pg/mL、0pg/mL。将不同浓度的药物刺激脾淋巴细胞得到的上清样品加入到对应的孔内，每个样品设置三个复孔，另需设置空白对照孔和阴性对照孔，并作好相应的标记。将加好标准品和样品的96孔酶标板用保鲜膜封好，室温孵育2小时或者4℃冰箱过夜。吸去板内液体，用PBST洗板三次，拍干。
(4)二抗：用稀释缓冲液将检测抗体稀释到所需浓度，每孔加入100μl，室温孵育1小时。吸去板内液体，用PBST洗涤五次，拍干。
(5)加酶标抗体：用稀释缓冲液将Avidin-HRP稀释到所需浓度，每孔加入100μl，室温孵育30分钟。吸去板内液体，用PBST洗板五次，拍干。
(6)显色：每孔加入100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液，室温避光孵育15分钟。
(7)终止：显色完成后，每孔加入50μl终止液，终止液为1mol/L H 2SO 4。
(8)检测：将终止后的96孔酶标板放入全波长酶标仪内，在450nm波长处读取吸光度值。将数据导出，用软件作出标准曲线图，并得出线性回归方程。计算出免疫细胞产生免疫因子(INF-γ、IL-6等)的浓度。具体实验结果请参见附图。
效果实施例2：本发明新型免疫靶向化合物的抗肿瘤效果
1.小鼠肿瘤治疗方案
(1)将6-8周龄的BALB/c或者C57BL/6小鼠称重，按50mg/kg i.p.戊巴比妥麻醉，种植瘤部位(背部)剃毛，胶带固定。
(2)用棉签蘸取75％酒精在手术部位消毒，在种植瘤部位开1cm左右小口，向里注入100ul肿瘤细胞悬液(5×10 4个CT26细胞、B16细胞或4T1细胞)。用手术线缝合，消毒。术后连续3天腹腔注射5万单位氨苄青霉素/100μL/只。
2.给药
分别给药PBS空白对照、免疫激动剂或新型免疫靶向化合物。给药剂量按照实际需要而定(有效、安全剂量原则)，将各物质溶解在适当的溶剂，每次给药体积100μL；各组给药方式为腹腔注射。在种植肿瘤后的第7天、第15天、第22天和第29天各组分别给药；并定期量瘤大小。当肿瘤达到1500mm 3或者大于体重的15％时 将小鼠安乐死。肿瘤抑制和存活率结果见附图57、58和64。可见本发明中新型免疫靶向化合物处理组具有显著提高的抗肿瘤效应。
本发明的新型小分子免疫激动剂和新型免疫靶向化合物的生物活性测试方法不局限于上述测试方法，也可使用其它相关公知或公认的活性测试方法。同理本发明中的有关活性示意图也不局限于所表示的一种图示方法，图示方法可以启示本领域技术人员实现本发明中新型小分子免疫激动剂和新型免疫靶向化合物的应用效果。

Claims (20)

  1. 式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100001
    其中
    A 1表示O或C；
    A 2表示硝基、氨基、异氰酸酯基、亚烷基氨基、亚烷基异氰酸酯基或选自式(II)或式(III)的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100002
    其中
    R 1和R 2各自独立地表示(CH 2) p(NH) q，其中p为0、1或2，q为0、1或2；
    R 3表示O或S；
    R 4表示(CH 2) x(C＝O) y(NH) z[(CH 2) 2O] r(CH 2) s(C＝C) t，其中x为0至5的整数，y为0、1或2，z为0、1或2，r为0、1、2或3，s为0至5的整数且t为0、1或2，其中当s≠0且t＝0时，(CH 2) s中靠近羰基的碳原子可以被选自以下的基团取代：-NHBoc、氨基、-NHFmoc、
    Figure PCTCN2019080945-appb-100003
    Figure PCTCN2019080945-appb-100004
    或与另一碳原子形成双键；
    R 5表示羟基、烷氧基、羟胺基、乙烯基或选自以下的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100005
    R 6表示烷基或选自以下的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100006
    Figure PCTCN2019080945-appb-100007
    其中*表示连接至碳原子的位点；
    其中排除选自以下的化合物：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100008
  2. 权利要求1的式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100009
    Figure PCTCN2019080945-appb-100010
    其中
    A 1表示O或C；
    A 2表示硝基、氨基、异氰酸酯基、C 1-C 6亚烷基氨基、C 1-C 6亚烷基异氰酸酯基或选自式(II)或式(III)的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100011
    其中
    R 1和R 2各自独立地表示(CH 2) p(NH) q，其中p为0或1，q为0或1；
    R 3表示O或S；
    R 4表示(CH 2) x(C＝O) y(NH) z[(CH 2) 2O] r(CH 2) s(C＝C) t，其中x为0至5的整数，y为0或1，z为0或1，r为0、1、2或3，s为0至5的整数且t为0或1，其中当s≠0且t＝0时，(CH 2) s中靠近羰基的碳原子可以被选自以下的基团取代：-NHBoc、氨基、-NHFmoc、
    Figure PCTCN2019080945-appb-100012
    Figure PCTCN2019080945-appb-100013
    或与另一碳原子形成双键；
    R 5表示羟基、C 1-C 6烷氧基、羟胺基、乙烯基或选自以下的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100014
    R 6表示C 1-C 6烷基或选自以下的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100015
    Figure PCTCN2019080945-appb-100016
    其中*表示连接至碳原子的位点；
    其中排除选自以下的化合物：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100017
  3. 权利要求2的式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100018
    其中
    A 1表示O或C；
    A 2表示硝基、氨基、异氰酸酯基、亚甲基氨基、亚甲基异氰酸酯基或选自式(II)或式(III)的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100019
    其中
    R 1和R 2各自独立地表示(CH 2) p(NH) q，其中p为0或1，q为0或1；
    R 3表示O或S；
    R 4表示(CH 2) x(C＝O) y(NH) z[(CH 2) 2O] r(CH 2) s(C＝C) t，其中x为0至5的整数，y为0或1，z为0或1，r为0、1、2或3，s为0至5的整数且t为0或1，其中当s≠0且t＝0时，(CH 2) s中靠近羰基的碳原子可以被选自以下的基团取代：-NHBoc、氨基、-NHFmoc、
    Figure PCTCN2019080945-appb-100020
    Figure PCTCN2019080945-appb-100021
    或与另一碳原子形成双键；
    R 5表示羟基、甲氧基、羟胺基、乙烯基或选自以下的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100022
    R 6表示甲基或选自以下的基团：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100023
    Figure PCTCN2019080945-appb-100024
    其中*表示连接至碳原子的位点；
    其中排除选自以下的化合物：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100025
    Figure PCTCN2019080945-appb-100026
  4. 权利要求3的式(I)的小分子免疫激动剂，或其异构体或药学上可接受的盐，其为选自以下的SZU系列化合物或其药学上可接受的盐：SZU-104、SZU-105、SZU-107、SZU-108、SZU-109、SZU-110、SZU-111、SZU-112、SZU-113、SZU-115、SZU-118、SZU-120、SZU-127、SZU-128、SZU-129、SZU-131、SZU-132、SZU-133、SZU-134、SZU-135、SZU-136、SZU-137、SZU-138、SZU-139、SZU-140、SZU-142、SZU-143、SZU-144、SZU-145、SZU-149、SZU-158、SZU-159、SZU-160、SZU-161、SZU-162、SZU-163、SZU-166或SZU-171。
  5. 免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其由小分子免疫激动剂或其与含巯基的多肽如谷胱甘肽形成的加成产物与靶向药或抗体共价偶联形成，其通式表示如下：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100027
    其中TLA表示小分子免疫激动剂或其与含巯基的多肽如谷胱甘肽形成的加成产物；Tar表示靶向药或抗体；n和m各自独立地表示1至5之间的数值；L代表连接链，其为直链或支链烷烃或者聚乙二醇链，L的两端直接与TLA和/或Tar共价连接或通过其他基团与TLA和/或Tar共价连接。
  6. 权利要求5的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其中所述小分子免疫激动剂包括权利要求1至3中任一项的小分子免疫激动剂以及选自以下的化合物：
    Figure PCTCN2019080945-appb-100028
    Figure PCTCN2019080945-appb-100029
  7. 权利要求5的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其中所述小分子免疫激动剂为选自以下的SZU系列化合物或其药学上可接受的盐：SZU-102、SZU-104、SZU-105、SZU-106、SZU-107、SZU-108、SZU-109、SZU-110、SZU-111、SZU-112、SZU-113、SZU-115、SZU-118、SZU-120、SZU-127、SZU-128、SZU-129、SZU-131、SZU-132、SZU-133、SZU-134、SZU-135、SZU-136、SZU-137、SZU-138、SZU-139、SZU-140、SZU-142、SZU-143、SZU-144、SZU-145、SZU-149、SZU-158、SZU-159、SZU-160、SZU-161、SZU-162、SZU-163、SZU-166、SZU-171、SZU-101、SZU-103、SZU-114、SZU-117、SZU-122或SZU-130。
  8. 权利要求5的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其中所述TLA为选自以下的化合物：SZU-103-GSH、SZU-114-GSH、SZU-117-GSH、SZU-122-GSH、SZU-127-GSH、SZU-133-GSH、SZU-138-GSH或SZU-144-GSH。
  9. 权利要求5的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其中所述Tar选自以下的至少一种：Dasatinib，Imatinib，Saracatinib，Ponatinib，Nilotinib，Danusertib，AT9283Degrasyn，Bafetinib，kw-2449，nyp-bhg712，dcc-2036，GZD824.，GNF-2，PD173955，GNF-5，Bosutinib，Gefitinib，Erlotinib，Sunitinib，Ruxolitinib，Tofacitinib，Lapatinib，Vandetanib，Sorafenib，Sunitinib，Axitinib，Nintedanib，Regorafenib，Pazopanib，Lenvatinib，Crizotinib，Ceritinib，Cabozantinib，DWF，Afatinib，Ibrutinib，Niraparib，Palbociclib，B43，KU004，Foreinib，KRCA-0008，PF-06439015，PF-06463922，Canerlinib，GSA-10，GW2974，GW583340，W24002，CP-380736，D2667，Mubritinib，PD153035，PD168393，Pelitinib，PF-06459988，PF06672131，PF-6422899，PKI166，ReveromycinA， Tyrphostin 1，tyrphostin23，lyrphostin51，Tyrphostin，AG528，Tyrphostin，AG658，Tyrphostin，AG825，Tyrphostin，AG835，Tyrphostin，AG1478，Tyrphostin，RG13022，Tyrphostin，RG14620，B178，GSK1838705A，PD-161570，PD173074，SU-5402，Roslin2，Picropodophyllotoxin，PQ401，i-ome-tyrphostin，AG538，GNF5837，GW441756，Tyrphostin，AG879，DMPQ，jnj-10198409，PLX647，Trapidil，TyrphostinA9，Tyrhostin，AG370，Lestaurtinib，DMH4，Eldanamvcin，Genistein，Gw2580，HerbimycinA，Lavendustin，CMidostaurin，nvp-bhg712，PD158780，pd-166866，pf-0627334，PP2，RPL，SU11274，SU5614，Symadex，Tyrphostin，AG34，Tyrphostin，AG974，Tyrphostin，AG1007，UNC2881，Honokiol，SU1498，SKLB1002，cp-547632，jk-p3，KRN633，sc-1，ST638，SU 5416，Sulochrin，Tyrphostin，SU1498，rociletinib，Dacomitinib，Tivantinib，Neratinib，Masitinib，Vatalanib，Icotinib，xl-184，osi-930，AB1010，Quizartinib，AZD9291，Tandutinib，HM61713，Brigantinib，Vemurafenib(plx-4032)，Semaxanib，AZD2171，Crenolanib，Damnacanthal，Fostamatinib，Motesanib，Radotinib，osi-027，Linsitinib，BIX02189，PF-431396，PND-1186，PF-03814735，PF-431396，sirollmus，temsirolimus，everolimus，deforolimus，Zotarolimus，BEZ235，INK128，Omipalisib，AZD8055，MHY1485，PI-103，KU-0063794，ETP-46464，GDC0349，XL388，WYE-354，WYE-132，GiSK1059615，WAY-600，PF-04691502，wYE-687，PP121，BGT226，AZD2o014，PP242，CH5132799，P529，GDC0980，GDC-0994，XMD82，Ulixertinib，FR180204，SCH772984，Trametinib，PD184352，PD98059，Selumetinib，PD325901，U0126，Pimasertinib，tak-733，AZD8330，Binimetinib，PD318088，SL-327，Refametinib，gdc-0623，Cobimetinib，b1-847325，Adaphostin，GNF2，PPYA，aim-100，ASP 3026，LFM，Toceranib，JQ1，Niraparib，Fuzuopali，palbociclib，ARS-853，ARS-1620，Chlorazol-violet N(直接紫N)，miRNA-21，PreS，Zidovudine，Lenvatinib，LY-364947，ARS-1620或Reparixin，EGFR抑制剂，TKI，BRD4抑制剂，KRAS通路相关靶点抑制剂，BRAF抑制剂，BTK抑制剂，PARP抑制剂，PD-L1抑制剂(包括抗体、小分子)，PD-1抑制剂(包括抗体、小分子)，OX40激动剂(包括 抗体、小分子)，CD122抗体，CD3抗体，CD19抑制剂，CD20抑制剂，MUC1抑制剂，MUC16抑制剂，CDK4/6抑制剂，TGF-β抑制剂，CXCR抑制剂，CCL和CXCL趋化因子抑制剂以及miRNA。
  10. 权利要求9的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其中所述Tar选自如下的至少一种：TKI、EGFR抑制剂、KRAS抑制剂、BRAF抑制剂、BTK抑制剂、BRD4抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂、OX40激动剂、PARP抑制剂或CDK4/6抑制剂。
  11. 权利要求5的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其中L为
    Figure PCTCN2019080945-appb-100030
  12. 权利要求5的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其中所述其他基团包括酰胺、烷氧键、烷硫键、取代胺基、季胺盐、cilck反应形成的杂环、可用蛋白酶解离的氨基酸基团、脲基团或硫脲基团。
  13. 权利要求5的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐，其为选自以下的SZU系列化合物或其药学上可接受的盐：SZU-116、SZU-119、SZU-124、SZU-125、SZU-146、SZU-147、SZU-168、SZU-169、SZU-174、SZU-175、SZU-176、SZU-177、SZU-178、SZU-179、SZU-180、SZU-181、
    SZU-158-PD-L1、SZU-158-OX40、SZU-158-PD-1或SZU-136-miRNA21。
  14. 权利要求1至4中任一项的式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐，化合物SZU-101、SZU-103、SZU-114、SZU-117、SZU-122和SZU-130以及权利要求5至13中任一项的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐在制备参与免疫调节的药物中的用途。
  15. 权利要求1至4中任一项的式(I)的小分子免疫激动剂或其异构体或药学上可接受的盐，化合物SZU-101、SZU-103、SZU-114、SZU-117、SZU-122和SZU-130以及权利要求5至13中任一项的免疫靶向化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物、抗病毒药物和靶向清除蛋白的药物中的用途。
  16. 化合物SZU-136-miRNA21及其类似物在制备免疫靶向RNA的药物中 的用途。
  17. 化合物SZU-179、SZU-180和SZU-181在制备抗艾滋病和抗乙肝的药物中的用途。
  18. 化合物SZU-161和SZU-162在测定小分子免疫激动剂偶联蛋白药物和细胞的偶联度中的用途。
  19. 化合物SZU-116和SZU-124在观察研究蛋白或靶向药的细胞吸收和体内分布中的用途，其中化合物SZU-116和SZU-124与蛋白或者靶向药偶联。
  20. 化合物SZU-114、SZU-117、SZU-122、SZU-127、SZU-133、SZU-138、SZU-143在制备具有免疫靶向双功能的药物中的用途，其中化合物SZU-114、SZU-117、SZU-122、SZU-127、SZU-133、SZU-138、SZU-143与靶向药或抗体偶联。
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