WO2019059275A1 - 骨のリモデリング促進剤 - Google Patents

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WO2019059275A1
WO2019059275A1 PCT/JP2018/034808 JP2018034808W WO2019059275A1 WO 2019059275 A1 WO2019059275 A1 WO 2019059275A1 JP 2018034808 W JP2018034808 W JP 2018034808W WO 2019059275 A1 WO2019059275 A1 WO 2019059275A1
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bone
present
agent
group
osteoporosis
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PCT/JP2018/034808
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雅一 三浦
達雄 高橋
鈴木　宏一
幸雄 川田
翔子 北出
麻子 竹中
まさのり 大本
佐藤　友紀
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学校法人北陸大学
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    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
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    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH

Definitions

  • the present invention relates to a bone remodeling promoter useful for preventing or improving osteoporosis or loss of bone strength.
  • Osteoporosis is defined as a bone metabolic disorder characterized by a loss of bone strength, which tends to increase the risk of fractures. Bone strength varies depending on bone mass and bone quality. Even if the growth phase is over, bone remodeling by osteoclasts and bone formation by osteoblasts is repeated, and 20% to 30% of bone is replaced with new bone in one year . If this remodeling is out of balance and bone resorption exceeds bone formation, bone loss will occur. In addition, bone quality is lowered due to changes in microstructure of the bone (micro damage), accumulation of micro fractures, deterioration of components forming the bone such as collagen, and the like.
  • Such loss of bone mass and loss of bone quality is due to aging; imbalance of hormone due to decrease in secretion of female hormone (estrogen) etc .; deficiency due to lack of calcium, protein, vitamin D, vitamin K etc., decrease in nutrient absorption etc. It is known that it may be caused by an imbalance of exercise, lack of exercise, smoking, alcohol drinking, diseases such as endocrine diseases, diabetes, rheumatoid arthritis and the like, drugs such as steroids and the like.
  • osteoporosis patients the risk of fracture increases even with a slight impact such as falling, and in the case of the elderly, fractures often require care. Therefore, it is important to treat, improve and prevent osteoporosis.
  • a treatment for osteoporosis there is a diet, walking, etc. in which calcium and protein, which are the main components of bone, vitamin D necessary for bone remodeling, vitamin K, etc. are actively consumed and a balanced diet is kept in mind.
  • Exercise therapy with moderate strength exercise and exercise to train the back muscles continuously, alendronate sodium hydrate, risedronate sodium hydrate, ibandronate sodium hydrate, zoledronate hydration, etc.
  • Prevent bone resorption such as bisphosphonates such as substances, selective estrogen receptor modulators (SERMs) such as raloxifene hydrochloride, and anti-RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) monoclonal antibodies such as denosumab, etc.
  • SERMs selective estrogen receptor modulators
  • RARMs selective estrogen receptor modulators
  • RLMs Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand
  • monoclonal antibodies such as denosumab, etc.
  • Drugs to increase bone formation parathyroid hormone preparations such as teriparatide, etc. Proceeds to, drugs that increase bone mass, alfacalcidol, calcitriol, an active vitamin D 3 preparations such eldecalcitol, vitamin K 2 preparation such as menatetrenone, drug therapy using drugs such as helping the metabolism of bone Has been done.
  • whey protein hydrolyzate (patent document 1), ascorbic acid phosphate Ester magnesium salts, ascorbic acid derivatives such as ascorbic acid 2-glucoside (patent document 2), menaquinone-7 (patent document 3), alame extract (patent document 4), shark nasal cartilage proteoglycan (patent document 5), etc.
  • patent document 1 whey protein hydrolyzate
  • ascorbic acid phosphate Ester magnesium salts ascorbic acid derivatives such as ascorbic acid 2-glucoside
  • pattern 3 menaquinone-7
  • Patent Document 6 an extract with a solvent selected from ethanol, water and mixtures thereof of Kawara-tsutsumei, which has been used since ancient times as a folklore medicine, has a bone resorption suppressive effect.
  • a bisphosphonate preparation used as a therapeutic agent for osteoporosis suppresses not only bone resorption but also bone formation, and hormone preparations such as parathyroid hormone preparation promote bone formation, bone
  • hormone preparations such as parathyroid hormone preparation promote bone formation, bone
  • a preventive or therapeutic agent for osteoporosis not only suppression of bone resorption is the main action, but bone formation can be actively promoted, and it is highly safe and can be taken continuously for a long time.
  • the fact is that there are few components for which the bone formation promoting action has been reported, for which sufficient safety and efficacy have been confirmed. Therefore, there is a need for a highly safe agent for preventing or improving osteoporosis, which can promote bone formation as well as inhibit bone resorption.
  • the present invention can promote bone formation well, is effective for preventing or improving osteoporosis or reducing bone strength, is highly safe, and is suitable for long-term continuous intake or administration. The purpose was to provide.
  • flavanones and their glycosides have an action to promote bone remodeling well and are highly safe, and have reduced osteoporosis or bone strength.
  • the present invention has been found to be useful for the prevention or improvement of
  • the present invention relates to the following.
  • An agent for promoting bone remodeling which contains one or more selected from the group consisting of flavanones and glycosides thereof.
  • a pharmaceutical product for preventing or improving osteoporosis or reduction in bone strength comprising the agent for promoting bone remodeling according to any one of [1] to [4].
  • a food composition for preventing or improving osteoporosis or reduction in bone strength comprising the bone remodeling promoter according to any one of [1] to [4].
  • [7] The agent for promoting bone remodeling according to any one of [1] to [4], and the agent for promoting bone remodeling or for preventing or improving osteoporosis or reduction in bone strength
  • One or more selected from the group consisting of flavanone and its glycosides in an amount effective to promote bone remodeling, as a target animal in need of promoting bone remodeling A method of promoting bone remodeling, including ingesting or administering.
  • the promoting method according to [8], wherein the flavanone and its glycoside are flavanones of a plant belonging to the genus Chamaecrista and its glycoside.
  • At least one member selected from the group consisting of flavanone and its glycosides in an amount effective to prevent or ameliorate osteoporosis or decrease in bone strength or prevent osteoporosis or decrease in bone strength or A method for preventing or improving osteoporosis or reduction in bone strength, which comprises ingesting or administering to a subject animal in need of improvement.
  • the flavanone and its glycoside are flavanones of a plant belonging to the genus Chamaecrista and its glycoside.
  • [14] One or more selected from the group consisting of flavanones and glycosides thereof are contained in [12] as an extract with methanol and ethyl acetate of a plant belonging to Chamaecrista How to prevent or improve [15] The method for preventing or ameliorating any one of [12] to [14], wherein the flavanone and its glycoside are 3 ', 4', 7-trihydroxyflavanone and its glycoside.
  • the present invention provides an agent for promoting bone remodeling, which can promote differentiation of both osteoblasts and osteoclasts well and promote bone remodeling by promoting bone resorption and bone formation in a well-balanced manner. can do.
  • the agent for promoting bone remodeling of the present invention promotes bone metabolism and is useful for preventing or improving osteoporosis or loss of bone strength.
  • FIG. 1 is a diagram showing the examination results of Test Example 1.
  • the number of ALP-positive osteoblast nodules ratio to control
  • “*” in the figure indicates that p ⁇ 0.05 relative to the control is significant
  • “**” indicates p ⁇ 0.01 relative to the control.
  • FIG. 2 is a diagram showing the examination results of Test Example 2.
  • “*” in the figure indicates that p ⁇ 0.05 relative to the control is significant, and "**” indicates p ⁇ 0.01 relative to the control.
  • FIG. 3 is a view showing a Von Kossa stained image of a non-decalcified sliced sample of the spine of each group of mice in Test Example 3. Bars in the figure indicate scales (200 ⁇ m).
  • FIG. 7 is a view showing the measurement results of ALP-positive osteoblast surface (ratio to the sham operation group) on the cancellous bone surface of the vertebral bodies of mice of each group in Test Example 3.
  • “#” in the figure indicates that p ⁇ 0.05 is significant relative to the control group, and "##" indicates p ⁇ 0.01 relative to the control group.
  • FIG. 8 is a diagram showing measurement results of TRAP-positive osteoclast surface (ratio to the sham operation group) on the cancellous bone surface of the vertebral body of each group of mice in Test Example 3.
  • "**" in the figure indicates that p ⁇ 0.01 with respect to the sham operation group is significant.
  • the present invention provides a bone remodeling promoting agent (hereinafter also referred to as "the agent of the present invention”).
  • the agent of the present invention contains one or more selected from the group consisting of flavanone and its glycoside.
  • the “bone remodeling promoting agent” of the present invention refers to an ingredient or composition which has an action of promoting bone remodeling and can be contained in a pharmaceutical or the like for preventing or improving osteoporosis.
  • the flavanone contained in the agent of the present invention is a compound having a flavanone skeleton represented by the following formula (1), and the glycoside thereof is usually a compound glycosylated at the 7-position.
  • flavanone and its glycoside may be used by synthesizing a desired compound by a known enantioselective chemical synthesis method, biochemical synthesis method or the like, and plants containing these compounds, etc. And may be used after isolation and purification.
  • the flavanone and its glycoside can also be used in the form of an extract obtained from plants or the like, or in the form of a crudely purified product.
  • a plant containing flavanone and its glycosides a plant belonging to the genus Chamaecrista is exemplified as a preferred plant, and the one derived from chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi is more preferred.
  • Kawara-ketsumei (Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi) is an annual grass belonging to the leguminous (Leguminosae) subfamily (Caesalpinioideae) kawaraketsume (Chamaecrista), and since ancient times it has been a private diuretic privately as a hoho tea, a beach tea, It is used as a medicine.
  • flavanones obtained by extraction with an extraction solvent from a plant of a plant belonging to the genus Kawara et al. And a glycoside thereof are preferably used.
  • the plants of the plant belonging to the genus Kovalella are washed with water and subjected to extraction as a slurry, fine granules, granules or powders as they are or by slicing, drying, pulverizing and the like.
  • extraction each part of flowers, leaves, stems, fruits, roots and the like of plants belonging to the genus Kawara-tsutsumei can be used, but it is preferable to use the above-ground parts excluding the fruits.
  • extraction solvents include water, lower alcohols (eg, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol etc.), polyhydric alcohols (eg, propanediol, butanediol, glycerin etc.), esters of low molecular weight carboxylic acids (ethyl acetate)
  • organic solvents having polarity such as ketones (acetone and the like) can be used. One of these may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • the extraction solvent is usually 100 mL to 1000 mL, preferably 400 mL to 1000 mL, per 100 g (dry weight) of the plant body of the plant belonging to the genus Kovalachite.
  • the extraction can be carried out by immersing a plant of a plant belonging to the genus Penicillium in the above-mentioned extraction solvent and leaving it still or stirring it.
  • a plant body of a plant belonging to the genus Penicillium may be crushed in an extraction solvent, or the plant body may be homogenized in an extraction solvent using a bead-type crushing apparatus or the like.
  • Extraction temperature and extraction time can be suitably determined according to the method of pre-treatment of the plant body of the plant belonging to the genus Citrula, the type of extraction solvent, the extraction method and the like.
  • the extraction is usually performed at 70 ° C. to 80 ° C. for 1 hour to 4 hours, preferably at 70 ° C. to 80 ° C. for 2 hours to 4 hours.
  • the extract is recovered according to a conventional method, for example, by filtration, centrifugation or the like.
  • flavanones and glycosides extracted from plants belonging to the genus Kawara tsutsumei can also be used in the state of being contained in the extract of plants belonging to the genus Kawara tsutsumei, but crude purification or It can also be purified and used as a fraction containing these as the main component, or as isolated as flavanone or its glycoside.
  • Preferred flavanones include 3 ', 4', 7-trihydroxyflavanone (butyne), and preferred flavanone glycosides include glycosides of the flavanones described above, 3 ', 4', 7- tori. Hydroxyflavanone 7-O- ⁇ -D-glucopyranoside is mentioned as a particularly preferred flavanone glycoside.
  • the agents of the present invention include flavanones and their glycosides synthesized by chemical synthesis methods and biochemical synthesis methods, flavanones obtained by extraction from various plants including plants belonging to the genus Penicilli, and their glycosides, etc.
  • flavanones and their glycosides synthesized by chemical synthesis methods and biochemical synthesis methods flavanones obtained by extraction from various plants including plants belonging to the genus Penicilli, and their glycosides, etc.
  • One or more selected from a group consisting of various flavanones and glycosides thereof can be contained.
  • the agent of the present invention may optionally be formulated into one or more selected from the group consisting of flavanones and glycosides thereof (hereinafter sometimes referred to as "flavanones" in the present specification).
  • flavanones and glycosides thereof
  • Liquid such as solution, suspension, and emulsion
  • semisolid such as gel, paste, and cream
  • solid such as powder, granule, tablet, and capsule. be able to.
  • excipients As the above additives, excipients, binders, disintegrants, lubricants, coatings, bases, solvents, emulsifiers, dispersants, suspending agents, stabilizers, thickeners, pH adjusters, Antioxidants, preservatives, preservatives, flavoring agents, sweeteners, flavors, coloring agents and the like can be mentioned.
  • Excipients such as anhydrous silicic acid, calcium silicate, magnesium aluminosilicate, starch (corn starch, potato starch, wheat starch etc.), saccharides (glucose, lactose, sucrose etc.), sugar alcohol (sorbitol, maltitol And mannitol etc.).
  • Binders include gelatin, sodium casein, starch and modified starches (corn starch, hydroxypropyl starch, pregelatinized starch, partially pregelatinized starch, etc.), cellulose and its derivatives (crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, carboxymethylcellulose etc.), etc. Can be mentioned.
  • povidone povidone, crospovidone, cellulose and derivatives thereof (crystalline cellulose, methyl cellulose etc.) and the like can be mentioned.
  • talc synthetic aluminum silicate, magnesium silicate, calcium stearate, magnesium stearate and the like can be mentioned.
  • methacrylic acid copolymer methacrylic acid / ethyl acrylate copolymer etc.
  • methacrylate copolymer ethyl acrylate / methyl methacrylate copolymer, ethyl acrylate / methacrylic acid methacrylate / methacrylic acid conversion
  • Trimethyl ammonium ethyl copolymer etc. etc. are mentioned.
  • hydrocarbons liquid paraffin and the like
  • polyethylene glycol macrogol 400, macrogol 1500 and the like
  • solvent examples include purified water, monohydric alcohol (such as ethanol), polyhydric alcohol (such as propylene glycol and glycerin).
  • nonionic surfactants sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, etc.
  • anionic surfactants sodium alkyl sulfate, N-acyl glutamate salt, etc.
  • gum arabic As a dispersing agent, gum arabic, propylene glycol alginate, nonionic surfactant (polyoxyethylene hardened castor oil, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol etc.), anionic surfactant ( And sodium alkyl sulfate etc.).
  • nonionic surfactant polyoxyethylene hardened castor oil, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol etc.
  • anionic surfactant And sodium alkyl sulfate etc.
  • suspending agent examples include sodium alginate, nonionic surfactants (polyoxyethylene lauryl ether, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, etc.) and the like.
  • the stabilizer examples include adipic acid, ethylenediamine tetraacetate (calcium disodium ethylenediaminetetraacetate, disodium ethylenediaminetetraacetate etc), ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and the like.
  • thickener examples include water-soluble polymers (sodium polyacrylate, carboxyvinyl polymer, etc.), polysaccharides (sodium alginate, xanthan gum, tragacanth, etc.) and the like.
  • pH adjusters examples include hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, lactic acid, sodium hydroxide, sodium hydrogen phosphate and the like.
  • antioxidants examples include dibutyl hydroxytoluene (BHT), butyl hydroxyanisole (BHA), dl- ⁇ -tocopherol, erythorbic acid, propyl gallate and the like.
  • preservatives examples include sodium benzoate, sorbic acid, potassium sorbate, dehydroacetic acid, sodium dehydroacetate, esters of parahydroxybenzoate (methyl parahydroxybenzoate and the like) and the like.
  • preservatives include benzoic acid, sodium benzoate, sorbitol, parahydroxybenzoic acid ester (methyl parahydroxybenzoate etc.), propylene glycol and the like.
  • ascorbic acid Ascorbic acid, erythritol, disodium 5'-guanylate, citric acid, sodium L-glutamate, tartaric acid, DL-malic acid and the like can be mentioned.
  • aspartame Aspartame, licorice extract, saccharin etc. are mentioned.
  • Examples of the flavor include orange essence, l-menthol, d-borneol, vanillin, linalool and the like.
  • tar pigment food red No. 2, food blue No. 1, food yellow No. 4, etc.
  • inorganic pigment inorganic pigment (bengara, yellow ferric oxide, titanium oxide etc.), natural pigment (anato pigment, turmeric pigment, carotenoid) Etc.
  • additives may be used alone or in combination of two or more as needed.
  • the agent of the present invention can promote differentiation of both osteoblasts and osteoclasts well, promote bone remodeling by promoting bone resorption and bone formation in a well-balanced manner, and promote bone metabolism. it can.
  • the agent of the present invention is effective for the prevention or improvement of osteoporosis or reduction of bone strength, and a decrease in bone strength is observed due to osteoporosis patients or deterioration of hormonal balance or nutritional condition, etc., and the risk of developing osteoporosis.
  • the flavanones contained in the agent of the present invention are components obtained mainly from plants such as pomegranate vulgaris which have been used for a long time as health tea, and are highly safe.
  • the agent of the present invention can be taken or administered continuously over a long period of time.
  • the content of flavanones in the agent of the present invention is appropriately determined depending on the type thereof and the strength of the bone remodeling promoting action, etc., preferably 0.01% by weight to 100% of the total amount of the agent of the present invention. % By weight, more preferably 0.05% by weight to 100% by weight.
  • the daily intake or dose of the agent of the present invention is determined based on the sex, age, and bone strength observed in the subject to which it is applied (hereinafter, also referred to as "subject" in the present specification).
  • the amount of flavanones is preferably 3 mg to 150 mg, more preferably 3 mg to 150 mg, when the target of application is a human adult, although it is appropriately determined depending on the situation and degree of reduction, the form of the agent of the present invention, administration method and the like. It is 10 mg to 100 mg, more preferably 10 mg to 50 mg, and still more preferably 15 mg to 50 mg.
  • the above amounts may be taken or administered in a single dose, or may be taken or administered in divided doses several times a day (eg, 2 to 3 times).
  • the intake or administration period of the agent of the present invention is also appropriately set according to the situation and the degree of the decrease in bone strength to which the agent is applied.
  • the agent of the present invention may be taken continuously or for a long time It is preferred to administer.
  • the agent of the present invention can be in unit package form.
  • the “unit package form” refers to a specific amount (for example, an intake or a dose per dose, etc.) as one unit, and the one unit or two or more units are packed in one container, or packaged.
  • the container or package used in the unit package form may be appropriately selected according to the form of the agent of the present invention, etc. For example, a paper container or bag, a plastic container or bag, a pouch, an aluminum can , Steel cans, glass bottles, plastic bottles, PTP (press through pack) packaging sheets and the like.
  • Subjects to which the agent of the present invention is applied include mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, horses, donkeys, pigs, sheep, etc.) and birds (eg, Ducks, chickens, geese, turkeys etc.
  • a non-human application target animal hereinafter, also simply referred to as “target animal”
  • the intake or dose of the agent of the present invention depends on the type, sex, body weight, etc. of the target animal. It may be set appropriately.
  • the agent of the present invention can be provided as a pharmaceutical (hereinafter, also referred to as “the pharmaceutical of the present invention” hereinafter) as it is or further including the pharmaceutically acceptable additive described above.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention includes tablets, coated tablets, chewable tablets, pills, capsules, microcapsules, granules, fine granules, powders, elixirs, limonase, syrups, suspensions, emulsions, oral jelly Preparations such as oral preparations such as oral preparations, injections such as solutions, suspensions, emulsions, etc., solid injections to be dissolved or suspended at the time of use, injections such as transfusions, long-acting injections, etc. It can be done.
  • the flavanones contained in the agent of the present invention are mainly obtained from the plants suitable for drinking or eating, such as Kawara-tsutsumei etc., which have long been consumed as health tea, and are suitable for oral consumption, May be suitably provided as an oral formulation.
  • the medicament of the present invention may further contain an osteoporosis therapeutic agent such as an active vitamin D 3 preparation such as alphacalcidol and calcitriol, and a vitamin K 2 preparation such as menatetrenone, as long as the characteristics of the present invention are not impaired. You can also.
  • an osteoporosis therapeutic agent such as an active vitamin D 3 preparation such as alphacalcidol and calcitriol
  • a vitamin K 2 preparation such as menatetrenone
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be suitably administered to patients with osteoporosis or those who are at a high risk of developing osteoporosis due to a decrease in bone strength due to deterioration of hormonal balance, nutritional status, and the like.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention is administered to the above-mentioned application subject as the amount of flavanones per day, so as to achieve the above-mentioned intake or dose per day.
  • the agent of the present invention can be added to various foods and ingested.
  • the food to which the agent of the present invention is added is not particularly limited, and it may be any food in the form generally provided for meals and desserts.
  • the agent of the present invention can be added to beverages such as teas, soft drinks and the like and, if desired, an appropriate flavor can be added to make a functional beverage.
  • the agent of the present invention includes, for example, soft drinks such as tea-based beverages and fruit drinks; teas such as green tea, black tea and Chinese tea; dairy products such as milk and yogurt; jelly, biscuits, candy , Caramel etc. can be added.
  • the agent of the present invention is preferably added to the above-mentioned various foods in an amount to be ingested per day so that the amount of flavanones is the above-mentioned intake per day.
  • the agent of the present invention may be a food composition (hereinafter referred to as "the food composition of the present invention” according to the present specification) according to a conventional food production technology, as it is or adding common food additives as needed.
  • the food composition of the present invention can be in various forms such as liquid, suspension, milk, gel, cream, powder, granule, sheet, capsule, tablet and the like.
  • the food composition of the present invention adds the agent of the present invention to various food raw materials and, if necessary, general food additives, to add a soft drink (fruit juice drink, sports drink, coffee drink, tea system) Beverages, etc., Tea (green tea, white tea, yellow tea, blue tea, black tea, flower tea etc.), Dairy products (Lactic acid bacteria drink, fermented milk, butter, cheese, yogurt, processed milk, skimmed milk etc.), Meat processing Products (ham, sausage, hamburg etc.), fish paste products (egg, bamboo ring etc.), processed egg products (dashi rolls, egg tofu, steamed egg custard etc), processed soybean products (miso, tofu, natto etc.), processed wheat products (bread, etc.
  • a soft drink fruit juice drink, sports drink, coffee drink, tea system
  • Beverages, etc. Tea (green tea, white tea, yellow tea, blue tea, black tea, flower tea etc.), Dairy products (Lactic acid bacteria drink, fermented milk
  • Udon, pasta etc. dried seafood, dried bonito flakes, dried bonito, etc., confectionery (cookies, biscuits, jellies, chewing gum, candy, caramel, ice cream etc), soup (miso soup, consomme soup, corn sou , Potage, etc.), seasonings (dressing, can be Worcestershire sauce, mayonnaise and the like) and the like, and food of various forms, can be bottled, canned, also be employed packaging forms such as retort pouch.
  • manufacturing agents water soluble, binder, etc.
  • thickening stabilizers xanthan gum, sodium carboxymethyl cellulose, etc.
  • gelling agents gelatin, agar, carrageenan, etc.
  • gum base vinyl acetate resin, Gelton, chicle etc.
  • emulsifier glycolin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, saponin, lecithin etc
  • preservative benzoic acid, sodium benzoate, sorbic acid, potassium sorbate, ⁇ -polylysine etc
  • antioxidants Ascorbic acid, erythorbic acid, catechin etc.
  • brighteners asealac, paraffin wax, beeswax etc.
  • fungicides thiabentazole, fludioxonil etc.
  • swelling agents sodium hydrogen carbonate, glucono ⁇ -lactone, alum etc
  • Sweetener aspartame, acesulfate
  • the food composition of the present invention is a food material containing calcium, protein, vitamin D, vitamin K 2 and the like, nutrients necessary for maintenance and increase of bone strength, and such nutrients as long as the features of the present invention are not impaired. Can be contained.
  • the food composition of the present invention reduces the risk of developing osteoporosis or decreases bone strength, such as osteoporosis patients, menopausal women, etc. who are in a state of hormonal imbalance, those who are undernourished by excessive diet etc. It can be taken suitably by those at high risk. In addition, it can be taken widely to middle and old people, pregnant women, etc. for the purpose of preventing osteoporosis and lowering of bone strength.
  • the food composition of the present invention is a food for specified health use for preventing or improving osteoporosis and reduction of bone strength, a food for nutritional function, a food for health function such as a food for functional indication, a food for sick people, a food for pregnant women, etc. Special purpose food, health supplements, dietary supplements etc.
  • the food composition of the present invention is preferably ingested as the amount of flavanones per day, as the amount taken per day as described above.
  • the present invention can also be used or should be used as an agent of the present invention as described above, and an agent of the present invention for promoting bone remodeling, or preventing or improving osteoporosis or reduction of bone strength. It is possible to provide a commercial package that includes the described items.
  • the present invention provides a method for promoting bone remodeling in a subject animal in need of promoting bone remodeling (hereinafter, also referred to as “promotion method of the present invention” in the present specification).
  • a subject animal in need of promoting bone remodeling receives or administers an amount of flavanones effective to promote bone remodeling of the subject animal. Including.
  • the present invention provides a method for preventing or improving osteoporosis or bone strength reduction in a subject in need of preventing or improving osteoporosis or bone strength reduction (hereinafter referred to as “prophylaxis or improvement method according to the present invention” Also referred to as “prophylaxis or improvement method according to the present invention” Also referred to as “prophylaxis or improvement method according to the present invention” Also referred to as “prophylaxis or improvement method according to the present invention” Also referred to as
  • the method for preventing or ameliorating the present invention is an effective amount of flavanones for preventing or improving osteoporosis or reduction in bone strength in a subject in need of preventing or improving osteoporosis or reduction in bone strength. Ingesting or administering
  • mammals eg, human, monkey, mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, cat, dog, cow, horse, donkey, Pigs, sheep, etc.
  • birds eg, ducks, chickens, geese, turkeys, etc.
  • the promotion method of the present invention and the prevention or improvement method of the present invention are effective in the prevention or improvement of osteoporosis or a decrease in bone strength.
  • the promotion method of the present invention and the prevention or improvement method of the present invention are patients with osteoporosis or those with a high risk of developing osteoporosis due to a decrease in bone strength due to deterioration of hormone balance or nutritional condition. Is preferably applied.
  • the effective amount of the flavanones in the promoting method of the present invention and the preventing or improving method of the present invention is appropriately determined according to the type, age, sex of the target animal, the state and degree of decrease in bone strength, etc.
  • the same amount as the intake or dose described above for human and non-human subjects can be taken or administered at the above-described number and period.
  • oral administration injection, administration by infusion, etc. may be mentioned as the intake or administration method of flavanones in the promotion method of the present invention and the prevention or improvement method of the present invention, under medical supervision of a physician. Oral administration is preferred because it does not have to be carried out and can be conveniently taken.
  • the obtained methanol extract (253 g) was extracted three times with water-ethyl acetate, and the ethyl acetate layer was collected to obtain an ethyl acetate extract (89.5 g).
  • Ethyl acetate extract (89.5 g) was mixed with a mixture of methanol and water in a Cosmoseal 140C18-OPN column (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.), and the methanol concentration was 40 (v / v)%, 50 (v / v) Elute in steps of 60% (v / v), 70% (v / v), 80% (v / v), 90% (v / v) and 100% (v / v) ,separated.
  • the fourth to 22th fractions (total 28.2 g) are collected, and then methanol concentration is 25 (v / v)%, using a methanol-water mixture on Toyopearl HW-40 column (manufactured by Tosoh Corporation). It elutes and separates in steps of 30 (v / v)%, 35 (v / v)% and 40 (v / v)%.
  • the 30th to 40th fractions were collected, and eluted with chloroform-methanol-water on a Wakogel C-200 column (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to separate, and the 82nd to 88th Fraction (160 mg) and fractions 89-92 (160 mg) were collected.
  • the collected fractions were separated by HPLC under the following conditions to obtain peaks with retention times of 15 minutes and 27 minutes.
  • the compound of two peaks obtained by HPLC analysis was recovered, and the structure was determined by nuclear magnetic resonance spectrum (NMR).
  • the measurement of NMR was carried out by dissolving the compound in deuterated dimethyl sulfoxide (d6-DMSO) and using a 500 MHz nuclear magnetic resonance spectrometer “JNM-ECP500” (manufactured by JEOL Ltd.).
  • JNM-ECP500 500 MHz nuclear magnetic resonance spectrometer
  • the compound with a retention time of 15 minutes was a novel compound (F1).
  • the compound having a peak at a retention time of 27 minutes was identified as a flavanone glycoside represented by the formula (2), 3 ', 4', 7-trihydroxyflavanone 7-O- ⁇ -D-glucopyranoside.
  • ⁇ -MEM Eagle's minimal essential medium ⁇ -modified
  • Differentiation-inducing reagents (0.2 mM ascorbic acid, 2.5 mM ⁇ -glycerophosphate, 10 nM dexamethasone) were added on day 1 and day 4 of culture, respectively, to give the following final concentrations. After 6 days of culture, the cells were stained with alkaline phosphatase (ALP) and observed microscopically (inverted culture microscope “CK40”, manufactured by Olympus Co., Ltd., magnification: 40 ⁇ ), and ALP-stained osteoblast nodules, ie, differentiation Cell nodules formed by osteoblasts were detected. In addition, the case where neither F2 nor F2a was added was set as control.
  • ALP alkaline phosphatase
  • the number of osteoblast nodules (ALP-positive osteoblast nodules) stained with ALP when cultured by adding each of F2 and F2a is a ratio to the number of cell nodules of the control, It is shown in FIG. For the ratio, an unpaired t-test was performed between the group to which each of F2 and F2a was added and the control.
  • F2 and F2a were added to concentrations of 1 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively, and culture was continued.
  • the differentiation inducing reagent (calcitriol) was added to the final concentration of 10 nM on the 1st and 4th day of the culture.
  • CK40 tartaric acid resistant acid phosphatase
  • F2 exhibits a concentration-dependent osteoclast differentiation promoting action when added to a final concentration of 2.5 ⁇ M or more and F2a at a final concentration of 5 ⁇ M or more
  • F2 There was a significant difference at p ⁇ 0.01 between the group to which p ⁇ 0.05 and F2a was added at a final concentration of 10 ⁇ M between the group to which control was added at each final concentration of 5 ⁇ M and 10 ⁇ M and the control. Admitted.
  • 0.1 mL of purified water is orally administered once a day for 4 weeks to the control group, and 3 groups to which F2a is administered are 3 mg / kg body weight, 10 mg / kg body weight and 30 mg / kg body weight F2a Were orally administered once a day for 4 weeks.
  • the flavanone glucoside derived from Kawara-tsutsumei or the aglycone thereof promotes bone remodeling by promoting differentiation of both osteoblasts and osteoclasts, thereby promoting osteoporosis. It was suggested that it could improve.
  • bone remodeling that promotes well differentiation of both osteoblasts and osteoclasts, and promotes well-balanced bone resorption and bone formation to promote bone remodeling.
  • An accelerator can be provided.
  • the agent for promoting bone remodeling of the present invention promotes bone metabolism and is useful for preventing or improving osteoporosis or loss of bone strength.

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Abstract

本発明は、フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上を含有する骨のリモデリング促進剤とすることにより、骨形成を良好に促進することができ、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防又は改善に有効で、かつ安全性が高く、長期間の連続摂取または投与に適する予防または改善剤を提供する。

Description

骨のリモデリング促進剤
　本発明は、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善に有用な骨のリモデリング促進剤に関する。
　骨粗鬆症は、骨強度の低下を特徴とし、骨折のリスクが増大しやすくなる骨代謝性疾患であると定義される。
　骨強度は、骨量と骨質に依存して変化する。骨は、成長期が終了しても、破骨細胞による骨吸収と、骨芽細胞による骨形成とを行うリモデリングを繰り返し、１年間に２０％～３０％の骨が新しい骨に入れ替わっている。このリモデリングのバランスが崩れて、骨吸収が骨形成を上回ると、骨量の低下が生じる。
　また、骨質は、骨の微細構造の変化（マイクロダメージ）、微小骨折の蓄積、コラーゲン等の骨を形成する成分の劣化等により低下する。
　かかる骨量の低下や骨質の低下は、加齢；女性ホルモン（エストロゲン）の分泌の低下等によるホルモンのアンバランス；カルシウム、タンパク質、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の不足、栄養吸収の低下等による栄養のアンバランス；運動不足；喫煙；飲酒；内分泌系疾患、糖尿病、関節リウマチ等の疾患；ステロイド薬等の薬物等により引き起こされ得ることが知られている。
　骨粗鬆症患者では、転倒等の軽い衝撃でも骨折の危険性が高まり、特に高齢者の場合、骨折により介護が必要となることが多い。従って、骨粗鬆症を治療、改善し、また予防することは重要である。
　骨粗鬆症の治療法としては、骨の主成分であるカルシウムやタンパク質、骨のリモデリングに必要なビタミンＤ、ビタミンＫ等を積極的に摂取し、かつバランスの取れた食事を心がける食事療法、ウォーキングやエアロビクス等、中程度の強度のある運動や、背筋を鍛える運動を継続して行う運動療法、アレンドロン酸ナトリウム水和物、リセドロン酸ナトリウム水和物、イバンドロン酸ナトリウム水和物、ゾレドロン酸水和物等のビスホスホネート製剤、塩酸ラロキシフェン等の選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）製剤、デノスマブ等の抗ＲＡＮＫＬ（Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand）モノクローナル抗体製剤等、骨の吸収を防ぎ、骨量を増加させる薬物、テリパラチド等の副甲状腺ホルモン製剤等、骨の形成を促進し、骨量を増加させる薬物、アルファカルシドール、カルシトリオール、エルデカルシトール等の活性型ビタミンＤ３製剤、メナテトレノン等のビタミンＫ２製剤等、骨の代謝を助ける薬物等を用いた薬物療法が行われている。
　また、骨密度の増加、骨形成促進、骨代謝異常の予防または改善効果等を有し、食品としても摂取可能な成分として、たとえば、ホエイタンパク質加水分解物（特許文献１）、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩、アスコルビン酸－２－グルコシド等のアスコルビン酸誘導体（特許文献２）、メナキノン－７（特許文献３）、アラメ抽出物（特許文献４）、サメ鼻軟骨プロテオグリカン（特許文献５）等、多くの提案がなされている。
　さらに、古くから民間伝承薬として利用されてきたカワラケツメイのエタノール、水およびそれらの混合物から選ばれた溶媒による抽出物が、骨吸収抑制効果を有することが報告されている（特許文献６）。
　しかしながら、たとえば骨粗鬆症治療薬として用いられているビスホスホネート製剤は、骨吸収のみならず骨形成をも抑制することが知られており、副甲状腺ホルモン製剤等のホルモン製剤には、骨の形成促進、骨量増加作用の他に、ホルモン様作用の発現等が懸念される。
　また、骨粗鬆症の予防または治療薬としては、骨吸収の抑制を主な作用とするのみでなく、積極的に骨形成を促進することができ、さらに安全性が高く、長期間連続して摂取させ得るものまたは投与し得るものが求められるが、骨形成促進作用の報告されている成分については、十分な安全性と有効性が確認されているものが少ないのが実情である。
　従って、骨吸収を抑制するのみでなく、骨形成を促進することができ、かつ安全性の高い骨粗鬆症の予防または改善剤が求められている。
特開２０１３－１８４９６１号公報 特開２０１４－００１２０１号公報 特開２０１５－１８１３６６号公報 特開２０１４－１５２１２９号公報 特開２０１５－１８２９６０号公報 特開２００１－０７２５９８号公報
　そこで、本発明は、骨形成を良好に促進することができ、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善に有効で、かつ安全性が高く、長期間の連続摂取または投与に適する予防または改善剤を提供することを目的とした。
　上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明者らは、フラバノンおよびその配糖体が骨のリモデリングを良好に促進する作用を有し、かつ安全性が高く、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下に関する。
［１］フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上を含有する、骨のリモデリング促進剤。
［２］フラバノンおよびその配糖体が、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物のフラバノンおよびその配糖体である、［１］に記載の骨のリモデリング促進剤。
［３］フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上が、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物のメタノールおよび酢酸エチルによる抽出物として含有される、［１］に記載の骨のリモデリング促進剤。
［４］フラバノンおよびその配糖体が、３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノンおよびその配糖体である、［１］～［３］のいずれかに記載の骨のリモデリング促進剤。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の骨のリモデリング促進剤を含有する、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善用医薬品。
［６］［１］～［４］のいずれかに記載の骨のリモデリング促進剤を含有する、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善用食品組成物。
［７］［１］～［４］のいずれかに記載の骨のリモデリング促進剤、ならびに、当該促進剤を骨のリモデリングの促進、あるいは骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善に使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業的パッケージ。
［８］骨のリモデリングを促進するために有効な量のフラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上を、骨のリモデリングを促進する必要のある対象動物に摂取させること、または投与することを含む、骨のリモデリングの促進方法。
［９］フラバノンおよびその配糖体が、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物のフラバノンおよびその配糖体である、［８］に記載の促進方法。
［１０］フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上が、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物のメタノールおよび酢酸エチルによる抽出物として含有される、［８］に記載の促進方法。
［１１］フラバノンおよびその配糖体が、３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノンおよびその配糖体である、［８］～［１０］のいずれかに記載の促進方法。
［１２］骨粗鬆症または骨強度の低下を予防または改善するために有効な量のフラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上を、骨粗鬆症または骨強度の低下を予防または改善する必要のある対象動物に摂取させること、または投与することを含む、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善方法。
［１３］フラバノンおよびその配糖体が、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物のフラバノンおよびその配糖体である、［１２］に記載の予防または改善方法。
［１４］フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上が、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物のメタノールおよび酢酸エチルによる抽出物として含有される、［１２］に記載の予防または改善方法。
［１５］フラバノンおよびその配糖体が、３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノンおよびその配糖体である、［１２］～［１４］のいずれかに記載の予防または改善方法。
　本発明により、骨芽細胞および破骨細胞の双方の分化を良好に促進し、骨吸収と骨形成をバランスよく促進することにより骨のリモデリングを促進し得る、骨のリモデリング促進剤を提供することができる。
　本発明の骨のリモデリング促進剤は、骨代謝を促進し、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善に有用である。
図１は、試験例１の検討結果を示す図である。図中、ＡＬＰ陽性骨芽細胞結節数（コントロールに対する比）は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）にて示す。また、図中の「＊」は、コントロールに対しｐ＜０．０５で有意であることを示し、「＊＊」は、コントロールに対しｐ＜０．０１で有意であることを示す。 図２は、試験例２の検討結果を示す図である。図中、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞数（／ウェル）は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）にて示す。また、図中の「＊」は、コントロールに対しｐ＜０．０５で有意であることを示し、「＊＊」は、コントロールに対しｐ＜０．０１で有意であることを示す。 図３は、試験例３において、各群のマウスの脊椎の非脱灰薄切標本のＶｏｎ　Ｋｏｓｓａ染色画像を示す図である。図中のバーは、スケール（２００μｍ）を示す。 図４は、試験例３において、各群のマウスの椎体の海綿骨量の測定結果を示す図である。海綿骨量の測定結果は、平均値±標準偏差（ｎ＝６）にて示す。また、図中の「＊＊」は、偽手術群に対しｐ＜０．０１で有意であることを示し、「＃」は、コントロール群に対しｐ＜０．０５で有意であることを示し、「＃＃」は、コントロール群に対しｐ＜０．０１で有意であることを示す。 図５は、試験例３において、各群のマウスの椎体の骨梁数の測定結果を示す図である。骨梁数の測定結果は、平均値±標準偏差（ｎ＝６）にて示す。また、図中の「＊＊」は、偽手術群に対しｐ＜０．０１で有意であることを示し、「＃＃」は、コントロール群に対しｐ＜０．０１で有意であることを示す。 図６は、試験例３において、各群のマウスの椎体の骨梁幅の測定結果を示す図である。骨梁幅の測定結果は、平均値±標準偏差（ｎ＝６）にて示す。また、図中の「＊＊」は、偽手術群に対しｐ＜０．０１で有意であることを示す。 図７は、試験例３において、各群のマウスの椎体の海綿骨表面におけるＡＬＰ陽性骨芽細胞面（偽手術群に対する比）の測定結果を示す図である。ＡＬＰ陽性骨芽細胞面の測定結果は、平均値±標準偏差（ｎ＝６）にて示す。また、図中の「＃」は、コントロール群に対しｐ＜０．０５で有意であることを示し、「＃＃」は、コントロール群に対しｐ＜０．０１で有意であることを示す。 図８は、試験例３において、各群のマウスの椎体の海綿骨表面におけるＴＲＡＰ陽性破骨細胞面（偽手術群に対する比）の測定結果を示す図である。ＴＲＡＰ陽性破骨細胞面の測定結果は、平均値±標準偏差（ｎ＝６）にて示す。また、図中の「＊＊」は、偽手術群に対しｐ＜０．０１で有意であることを示す。
　本発明は、骨のリモデリング促進剤（以下、本明細書において「本発明の剤」とも称する）を提供する。
　本発明の剤は、フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上を含有する。
　本発明の「骨のリモデリング促進剤」とは、骨のリモデリングを促進する作用を有し、骨粗鬆症の予防または改善用の医薬品等に含有され得る成分または組成物をいう。
　本発明の剤に含有されるフラバノンは、下記の式（１）で示されるフラバノン骨格を有する化合物であり、その配糖体は、通常、７位においてグリコシル化された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明においては、フラバノンおよびその配糖体は、公知のエナンチオ選択性化学的合成法、生化学的合成法等により、所望の化合物を合成して用いてもよく、また、これらを含む植物等から抽出し、単離、精製して用いてもよい。フラバノンおよびその配糖体として、植物等から得られた抽出物、または粗精製物の状態で用いることもできる。
　フラバノンおよびその配糖体を含む植物としては、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物が好ましい植物として例示され、カワラケツメイ（Chamaecrista nomame (Siebold) H.Ohashi）がより好ましい。
　カワラケツメイ（Chamaecrista nomame (Siebold) H.Ohashi）は、マメ科（Leguminosae）ジャケツイバラ亜科（Caesalpinioideae）カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する一年草であり、古くから弘法茶、浜茶として、また利尿の民間薬として利用されている。
　本発明の剤には、カワラケツメイ等、カワラケツメイ属に属する植物の植物体から、抽出溶媒により抽出して得られるフラバノンおよびその配糖体が好ましく用いられる。
　カワラケツメイ属に属する植物の植物体は水洗し、そのまま、または細切、乾燥、粉砕等を行うことにより、スラリー状、細粒状、顆粒状または粉末状として抽出に供する。
　抽出には、カワラケツメイ属に属する植物の花、葉、茎、果実、根等の各部位を用いることができるが、果実を除く地上部を用いることが好ましい。
　抽出溶媒としては、水や、低級アルコール（たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等）、多価アルコール（たとえば、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン等）、低分子カルボン酸のエステル（酢酸エチル等）、ケトン（アセトン等）等の極性を有する有機溶媒を用いることができる。これらは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　本発明の目的には、メタノール、エタノール等の低級アルコール、酢酸エチル等の低分子カルボン酸のエステルを用いることが好ましく、メタノールおよび酢酸エチルを用いることがより好ましい。
　抽出溶媒は、カワラケツメイ属に属する植物の植物体１００ｇ（乾燥重量）に対し、通常１００ｍＬ～１０００ｍＬ、好ましくは４００ｍＬ～１０００ｍＬを用いる。
　抽出は、上記抽出溶媒にカワラケツメイ属に属する植物の植物体を浸漬し、そのまま静置し、もしくは撹拌して行うことができる。また、ビーズ式破砕装置等により、カワラケツメイ属に属する植物の植物体を抽出溶媒中で破砕し、または該植物体を抽出溶媒中でホモジネートして行ってもよい。
　抽出温度および抽出時間は、カワラケツメイ属に属する植物の植物体の前処理の方法、抽出溶媒の種類、抽出方法等に応じて、適宜決定することができる。たとえば、低級アルコールを含む抽出溶媒に浸漬して抽出する場合、抽出は通常７０℃～８０℃で１時間～４時間行い、７０℃～８０℃で２時間～４時間行うことが好ましい。
　抽出後、常法に従い、たとえばろ過、遠心分離等により、抽出液を回収する。
　本発明の剤において、カワラケツメイ属に属する植物から抽出されたフラバノンおよびその配糖体は、カワラケツメイ属に属する植物の抽出物中に含有された状態で用いることもできるが、常法に従って粗精製または精製し、これらを主成分として含有する画分として、あるいはフラバノンまたはその配糖体としてそれぞれ単離された状態で用いることもできる。
　カワラケツメイ属に属する植物の抽出物からの、フラバノンまたはその配糖体の粗精製または精製は、抽出物の濃縮、シリカゲルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等による分離等を組み合わせて行うことができる。
　好ましいフラバノンとしては、３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノン（ブチン）が挙げられ、好ましいフラバノン配糖体としては、前記フラバノンの配糖体が挙げられ、３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノン　７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドが、特に好ましいフラバノン配糖体として挙げられる。
　本発明の剤には、化学的合成法や生化学的合成法により合成したフラバノンおよびその配糖体、カワラケツメイ属に属する植物をはじめ各種植物から抽出して得られたフラバノンおよびその配糖体等、各種のフラバノンおよびその配糖体からなる群より、１種または２種以上を選択して含有させることができる。
　本発明の剤は、フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上（以下、本明細書において「フラバノン類」と称することがある）に、必要に応じて、製剤の分野で用いられる一般的な添加剤を加えて、製剤の分野で周知の製剤化手段、たとえば第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された方法等により調製することができ、溶液状、懸濁液状、乳液状等の液状；ゲル状、ペースト状、クリーム状等の半固形状；粉末状、顆粒状、タブレット状、カプセル状等の固形状等の形態とすることができる。
　上記添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、基剤、溶剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、矯味剤、甘味剤、香料、着色剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、無水ケイ酸、ケイ酸カルシウム、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、デンプン（トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、コムギデンプン等）、糖類（ブドウ糖、乳糖、白糖等）、糖アルコール（ソルビトール、マルチトール、マンニトール等）等が挙げられる。
　結合剤としては、ゼラチン、カゼインナトリウム、デンプンおよび加工デンプン（トウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン等）、セルロースおよびその誘導体（結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等）等が挙げられる。
　崩壊剤としては、ポビドン、クロスポビドン、セルロースおよびその誘導体（結晶セルロース、メチルセルロース等）等が挙げられる。
　滑沢剤としては、タルク、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
　被覆剤としては、メタクリル酸共重合体（メタクリル酸・アクリル酸エチル共重合体等）、メタクリレート共重合体（アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル共重合体、アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル・メタクリル酸塩化トリメチルアンモニウムエチル共重合体等）等が挙げられる。
　基剤としては、炭化水素（流動パラフィン等）、ポリエチレングリコール（マクロゴール４００、マクロゴール１５００等）等が挙げられる。
　溶剤としては、精製水、一価アルコール（エタノール等）、多価アルコール（プロピレングリコール、グリセリン等）等が挙げられる。
　乳化剤としては、非イオン性界面活性剤（ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等）、陰イオン性界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム、Ｎ－アシルグルタミン酸塩等）、精製大豆レシチン等が挙げられる。
　分散剤としては、アラビアゴム、アルギン酸プロピレングリコール、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等）、陰イオン性界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。
　懸濁化剤としては、アルギン酸ナトリウム、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）等が挙げられる。
　安定化剤としては、アジピン酸、エチレンジアミン四酢酸塩（エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム等）、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン等が挙げられる。
　粘稠剤としては、水溶性高分子（ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー等）、多糖類（アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、トラガント等）等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、水酸化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等が挙げられる。
　抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｄｌ－α－トコフェロール、エリソルビン酸、没食子酸プロピル等が挙げられる。
　防腐剤としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル（パラオキシ安息香酸メチル等）等が挙げられる。
　また、保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビトール、パラオキシ安息香酸エステル（パラオキシ安息香酸メチル等）、プロピレングリコール等が挙げられる。
　矯味剤としては、アスコルビン酸、エリスリトール、５’－グアニル酸二ナトリウム、クエン酸、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム、酒石酸、ＤＬ－リンゴ酸等が挙げられる。
　また、甘味剤としては、アスパルテーム、カンゾウエキス、サッカリン等が挙げられる。
　香料としては、オレンジエッセンス、ｌ－メントール、ｄ－ボルネオール、バニリン、リナロール等が挙げられる。
　着色剤としては、タール色素（食用赤色２号、食用青色１号、食用黄色４号等）、無機顔料（ベンガラ、黄色三二酸化鉄、酸化チタン等）、天然色素（アナトー色素、ウコン色素、カロテノイド等）等が挙げられる。
　上記した添加剤は、必要に応じて、１種または２種以上を用いることができる。
　本発明の剤は、骨芽細胞および破骨細胞の双方の分化を良好に促進し、骨吸収と骨形成をバランスよく促進することにより骨のリモデリングを促進し、骨代謝を促進することができる。
　その結果、本発明の剤は、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防又は改善に有効であり、骨粗鬆症患者、またはホルモンバランスや栄養状態の悪化等により骨強度の低下が見られ、骨粗鬆症を発症するリスクを有する者に好適に適用される。
　さらに、本発明の剤に含有されるフラバノン類は、主として、古くから健康茶として飲用されてきたカワラケツメイ等の植物から得られる成分であり、安全性が高い。
　従って、本発明の剤は、長期間にわたり連続して摂取させまたは投与することができる。
　本発明の剤におけるフラバノン類の含有量は、その種類や骨のリモデリング促進作用の強さ等により適宜決定されるが、本発明の剤の全量に対し、好ましくは０．０１重量％～１００重量％であり、より好ましくは０．０５重量％～１００重量％である。
　また、本発明の剤の１日あたりの摂取量または投与量は、適用される対象（以下、本明細書において「適用対象」ともいう）の性別、年齢、適用対象に観察される骨強度の低下の状況および程度、ならびに本発明の剤の形態、投与方法等により適宜決定されるが、適用対象がヒト成人である場合、フラバノン類の量として、好ましくは３ｍｇ～１５０ｍｇであり、より好ましくは１０ｍｇ～１００ｍｇであり、さらに好ましくは１０ｍｇ～５０ｍｇであり、より一層好ましくは１５ｍｇ～５０ｍｇである。
　上記の量は、１回で摂取させまたは投与してもよく、１日数回（たとえば２～３回）に分けて摂取させまたは投与してもよい。
　また、本発明の剤の摂取または投与期間も、適用対象の骨強度の低下の状況および程度等に応じて適宜設定される。骨粗鬆症が、加齢やホルモンのアンバランス等により引き起こされる骨代謝性疾患であることを考慮すると、骨粗鬆症を予防または改善するためには、本発明の剤は、長期間にわたり継続して摂取させまたは投与することが好ましい。
　本発明の剤は、単位包装形態とすることができる。本明細書において「単位包装形態」とは、特定量（たとえば、１回あたりの摂取量または投与量等）を１単位とし、該１単位又は２単位以上が一つの容器に充填され、または包装体に包装される等して収容された形態をいい、たとえば、１回あたりの摂取量または投与量を１単位とする単位包装形態は、「１回あたりの摂取量または投与量単位の包装形態」と称する。単位包装形態に用いられる容器または包装体は、本発明の剤の形態等に応じて適宜選択し得るが、たとえば、紙製の容器または袋体、プラスチック製の容器または袋体、パウチ、アルミ缶、スチール缶、ガラス瓶、ペットボトル、ＰＴＰ（press through pack）包装シート等が挙げられる。
　本発明の剤の適用対象としては、哺乳動物（たとえば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ等）や、鳥類（たとえば、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、七面鳥等）等が挙げられる。
　本発明の剤をヒト以外の適用対象動物（以下、単に「対象動物」ともいう）に適用する場合、本発明の剤の摂取量または投与量は、対象動物の種類、性別、体重等に応じて適宜設定すればよい。
　本発明の剤は、そのまま、またはさらに上記した薬学的に許容される添加剤を加えて、医薬品（以下、本明細書において「本発明の医薬品」とも称する）として提供することができる。
　本発明の医薬品は、錠剤、被覆錠剤、チュアブル錠、丸剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、エリキシル剤、リモナーゼ剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、経口ゼリー剤等の経口製剤、溶液状、懸濁液状、乳液状等の注射剤、用時溶解または懸濁して用いる固形状の注射剤、輸液剤、持続性注射剤等の注射用製剤等の剤形とすることができる。
　上記の通り、本発明の剤に含有されるフラバノン類は、主として、古くから健康茶として飲用されるカワラケツメイ等、飲用または食用に適する植物から得られ、経口摂取に適することから、本発明の医薬品は、経口製剤として好適に提供され得る。
　本発明の医薬品には、本発明の特徴を損なわない範囲で、さらに、アルファカルシドール、カルシトリオール等の活性型ビタミンＤ３製剤、メナテトレノン等のビタミンＫ２製剤等の骨粗鬆症治療薬を含有させることもできる。
　本発明の医薬品は、骨粗鬆症患者または、ホルモンバランスや栄養状態の悪化等により骨強度の低下が見られ、骨粗鬆症を発症するリスクの高い者に対し、好適に投与され得る。
　本発明の医薬品は、上記適用対象に対し、１日あたりに、フラバノン類の量として、上記した１日あたりの摂取量または投与量となるように、投与される。
　さらに、本発明の剤は、各種食品に添加して摂取させることができる。本発明の剤が添加される食品は特に制限されず、一般的に食事やデザートに供される形態の食品であれば如何なるものでもよい。
　たとえば、本発明の剤を茶類、清涼飲料水等の飲料に添加し、所望により適当な風味を加えて、機能性飲料とすることができる。
　より具体的には、本発明の剤は、たとえば、茶系飲料、果実飲料等の清涼飲料水；緑茶、紅茶、中国茶等の茶類；牛乳、ヨーグルト等の乳製品；ゼリー、ビスケット、キャンディ、キャラメル等の菓子等に添加することができる。
　本発明の剤は、１日あたりに摂取される量の上記各種食品に対し、フラバノン類の量が、上記した１日あたりの摂取量となるように添加されることが好ましい。
　また、本発明の剤は、そのまま、または必要に応じて一般的な食品添加物を加えて、通常の食品製造技術により、食品組成物（以下、本明細書において「本発明の食品組成物」とも称する）として提供することができる。
　本発明の食品組成物は、液状、懸濁液状、乳状、ゲル状、クリーム状、粉末状、顆粒状、シート状、カプセル状、タブレット状等、種々の形態とすることができる。
　さらに、本発明の食品組成物は、本発明の剤を各種食品原材料に加え、必要に応じて一般的な食品添加物を加えて、清涼飲料水（果汁飲料、スポーツ飲料、コーヒー飲料、茶系飲料等）、茶（緑茶、白茶、黄茶、青茶、紅茶、黒茶、花茶等）、乳製品（乳酸菌飲料、発酵乳、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、脱脂乳等）、食肉加工品（ハム、ソーセージ、ハンバーグ等）、魚肉練り製品（蒲鉾、竹輪等）、卵加工品（だし巻き、卵豆腐、茶碗蒸し等）、大豆加工品（味噌、豆腐、納豆等）、小麦加工品（パン、うどん、パスタ等）、魚介乾物（鰹節、煮干、ちりめんじゃこ等）、菓子（クッキー、ビスケット、ゼリー、チューイングガム、キャンディ、キャラメル、アイスクリーム等）、スープ（味噌汁、コンソメスープ、コーンスープ、ポタージュ等）、調味料（ドレッシング、ウスターソース、マヨネーズ等）等、種々の形態の食品とすることができ、瓶詰め、缶詰、レトルトパウチ等の包装形態を採用することもできる。
　上記食品添加物としては、製造用剤（かんすい、結着剤等）、増粘安定剤（キサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）、ゲル化剤（ゼラチン、寒天、カラギーナン等）、ガムベース（酢酸ビニル樹脂、ジェルトン、チクル等）、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、サポニン、レシチン等）、保存料（安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ε－ポリリシン等）、酸化防止剤（アスコルビン酸、エリソルビン酸、カテキン等）、光沢剤（セラック、パラフィンワックス、ミツロウ等）、防かび剤（チアベンタゾール、フルジオキソニル等）、膨張剤（炭酸水素ナトリウム、グルコノδ－ラクトン、ミョウバン等）、甘味料（アスパルテーム、アセスルファムカリウム、カンゾウ抽出物等）、苦味料（カフェイン、ナリンジン、ニガヨモギ抽出物等）、酸味料（クエン酸、酒石酸、乳酸等）、調味料（Ｌ－グルタミン酸ナトリウム、５’－イノシン酸二ナトリウム等）、着色料（アナトー色素、ウコン色素、クチナシ色素等）、香料（アセト酢酸エチル、アニスアルデヒド等の合成香料、オレンジ、ラベンダー等の天然香料）等が挙げられる。
　本発明において、上記食品添加物は、１種または２種以上を用いることができる。
　さらに本発明の食品組成物には、本発明の特徴を損なわない範囲で、カルシウム、タンパク質、ビタミンＤ、ビタミンＫ２等、骨強度の維持、上昇に必要な栄養素や、これら栄養素を含む食品素材を含有させることができる。
　本発明の食品組成物は、骨粗鬆症患者や、更年期の女性等、ホルモンバランスの乱れがちな者、過度のダイエット等により低栄養状態となった者等、骨粗鬆症を発症するリスクまたは骨強度が低下するリスクの高い者に好適に摂取させ得る。また、中高齢者や妊産婦等に対し、骨粗鬆症や骨強度の低下の予防を目的として、幅広く摂取させることができる。
　従って、本発明の食品組成物は、骨粗鬆症や骨強度の低下の予防または改善用の特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の保健機能食品、病者用食品、妊産婦用食品等の特別用途食品、健康補助食品、ダイエタリーサプリメント等としても提供され得る。
　本発明の食品組成物は、上記適用対象に対し、１日あたりに、フラバノン類の量として、上記した１日あたりの摂取量となるように摂取させることが好ましい。
　本発明はまた、上記した本発明の剤、ならびに、本発明の剤を骨のリモデリングの促進、あるいは骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善に使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業的パッケージを提供することができる。
　さらに本発明は、骨のリモデリングを促進する必要のある対象動物における骨のリモデリングの促進方法（以下、本明細書において「本発明の促進方法」ともいう）を提供する。
　本発明の促進方法は、骨のリモデリングを促進する必要のある対象動物に、当該対象動物の骨のリモデリングを促進するために有効な量のフラバノン類を摂取させること、または投与することを含む。
　さらにまた、本発明は、骨粗鬆症または骨強度の低下を予防または改善する必要のある対象動物における骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善方法（以下、本明細書において「本発明の予防または改善方法」ともいう）を提供する。
　本発明の予防または改善方法は、骨粗鬆症または骨強度の低下を予防または改善する必要のある対象動物に、当該対象動物の骨粗鬆症または骨強度の低下を予防または改善するために有効な量のフラバノン類を摂取させること、または投与することを含む。
　上記した本発明の促進方法および本発明の予防または改善方法における対象動物としては、哺乳動物（たとえば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ等）や、鳥類（たとえば、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、七面鳥等）等が挙げられる。
　本発明の促進方法および本発明の予防または改善方法は、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善に有効である。
　ヒトの場合、本発明の促進方法および本発明の予防または改善方法は、骨粗鬆症の患者、または、ホルモンバランスや栄養状態の悪化等により骨強度の低下が見られ、骨粗鬆症を発症するリスクの高い者に好適に適用される。
　本発明の促進方法および本発明の予防または改善方法におけるフラバノン類の有効量は、対象動物の種類、年齢、性別、骨強度の低下の状況および程度等に応じて適宜決定されるが、本発明の剤において、ヒトおよびヒト以外の対象動物について上記した摂取量または投与量と同様の量を、上記した回数および期間にて摂取させまたは投与することができる。
　さらに、本発明の促進方法および本発明の予防または改善方法におけるフラバノン類の摂取または投与方法としては、経口投与、注射、輸液による投与等が挙げられるが、医療機関にて医師の指導監督下に行う必要がなく、簡便に摂取させることができることから、経口投与が好ましい。
　以下に試験例等により、本発明についてさらに詳細に説明する。
　［製造例１］カワラケツメイからのフラバノン配糖体の調製
　カワラケツメイ（Chamaecrista nomame (Siebold) H.Ohashi）の地上部を水洗し、果実を除去して適当な長さに切り、５０℃で乾燥した。このカワラケツメイの乾燥物（１．３３ｋｇ）をメタノール７Ｌ中で８０℃で１時間加熱し、次いでメタノール６Ｌ中で８０℃で１時間加熱した。得られたメタノール抽出物（２５３ｇ）を、水－酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル層を回収して、酢酸エチル抽出物（８９．５ｇ）を得た。
　酢酸エチル抽出物（８９．５ｇ）を、コスモシール　１４０Ｃ１８－ＯＰＮカラム（ナカライテスク株式会社製）にて、メタノール・水混液により、メタノール濃度を４０（ｖ／ｖ）％、５０（ｖ／ｖ）％、６０（ｖ／ｖ）％、７０（ｖ／ｖ）％、８０（ｖ／ｖ）％、９０（ｖ／ｖ）％、１００（ｖ／ｖ）％と段階的に変化させて溶出し、分離した。第４番目～２２番目のフラクション（計２８．２ｇ）を回収し、次いでトヨパール　ＨＷ－４０カラム（東ソー株式会社製）にて、メタノール・水混液により、メタノール濃度を２５（ｖ／ｖ）％、３０（ｖ／ｖ）％、３５（ｖ／ｖ）％、４０（ｖ／ｖ）％と段階的に変化させて溶出し、分離した。第３０番目～４０番目のフラクション（６１０ｍｇ）を回収し、ワコーゲル　Ｃ－２００カラム（和光純薬工業株式会社製）にて、クロロホルム－メタノール－水により溶出して分離し、第８２番目～８８番目のフラクション（１６０ｍｇ）および第８９番目～９２番目のフラクション（１６０ｍｇ）を回収した。
　回収した上記フラクションを下記条件下にＨＰＬＣにより分離し、保持時間が１５分および２７分のピークを得た。
　＜ＨＰＬＣ分析条件＞
　　カラム：コスモシール　５Ｃ１８ＡＲ－ＩＩ（ナカライテスク株式会社製）（２０ｍｍ×２５０ｍｍ）
　　移動相：メタノール・水混液（４０：６０（体積比））
　　流速：６ｍＬ／ｍｉｎ
　　検出：紫外線（２１０ｎｍ）
　ＨＰＬＣ分析で得られた２個のピークの化合物を回収し、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）により構造を決定した。ＮＭＲの測定は、化合物を重水素化ジメチルスルホキシド（ｄ６－ＤＭＳＯ）に溶解し、５００ＭＨｚ核磁気共鳴分光装置「ＪＮＭ－ＥＣＰ５００」（日本電子株式会社製）を用いて行った。
　その結果、保持時間＝１５分のピークの化合物は、新規な化合物（Ｆ１）であった。また、保持時間＝２７分のピークの化合物は、式（２）で示されるフラバノン配糖体、３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノン　７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドと同定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　［試験例１］骨芽細胞の分化に及ぼすカワラケツメイ由来のフラバノン類の影響の検討
　上記製造例で得られたカワラケツメイ由来のフラバノン配糖体（Ｆ２）と、そのアグリコン（下記式（３）で示される３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノン）（Ｆ２ａ）について、骨芽細胞の分化に及ぼす影響を検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　マウス骨髄細胞を、イーグル最小必須培地α改変型（α－ＭＥＭ）（ＭＰバイオメディカルズ社（MP Biomedicals INC.）製）０．５ｍＬを入れたマイクロプレートの各ウェルに、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、３７℃、二酸化炭素濃度＝５（ｖ／ｖ）％にて培養した。培養１日目にＦ２およびＦ２ａのそれぞれを、１μＭ、２．５μＭ、５μＭおよび１０μＭの各濃度となるように添加し、培養を継続した。培養１日目および４日目に、それぞれ以下の最終濃度となるように分化誘導試薬（０．２ｍＭアスコルビン酸、２．５ｍＭβ－グリセロリン酸、１０ｎＭデキサメサゾン）を添加した。培養６日後に細胞をアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色し、顕微鏡観察（倒立型培養顕微鏡「ＣＫ４０」、オリンパス株式会社製、倍率＝４０倍）して、ＡＬＰで染色された骨芽細胞結節、すなわち分化した骨芽細胞により形成された細胞結節を検出した。なお、Ｆ２およびＦ２ａのいずれも添加しない場合をコントロールとした。
　顕微鏡による観察結果より、Ｆ２およびＦ２ａのそれぞれを添加して培養した場合のＡＬＰで染色された骨芽細胞結節（ＡＬＰ陽性骨芽細胞結節）数を、コントロールの該細胞結節数に対する比にて、図１に示した。前記比については、Ｆ２およびＦ２ａのそれぞれを添加した群とコントロールとの間で対応のないｔ検定を実施した。
　図１に示されるように、Ｆ２およびＦ２ａのそれぞれを添加して培養した場合、２．５μＭ以上の終濃度で濃度依存的な骨芽細胞の分化促進作用が認められ、５μＭおよび１０μＭの各終濃度で、コントロールに対し有意差が認められた（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。
　また、Ｆ２ａを５μＭの終濃度で添加して培養した場合において、培養４日目に、骨芽細胞の分化マーカーとなる転写因子（Ｒｕｎｘ２およびＯｓｔｅｒｉｘ（Ｏｓｘ））ならびにタンパク質（Ｉ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン）の各遺伝子の発現量をそれぞれＲＴ－ＰＣＲ法により定量し、β－アクチンに対する比により、表１に示した。各遺伝子発現量については、コントロールとの間で対応のないｔ検定を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１において、Ｆ２ａを添加した群で、Ｏｓｘ、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンの遺伝子の発現が、コントロールに比べて有意に増加したことが認められた。
　すなわち、Ｆ２ａを５μＭの終濃度で添加して４日間培養した場合に、コントロールに比べて、骨芽細胞の分化マーカーとなる転写因子およびタンパク質の遺伝子の発現が促進されることが示され、カワラケツメイ由来のフラバノン配糖体のアグリコンである３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノンにより、骨芽細胞の分化が促進されることが確認された。
　［試験例２］破骨細胞の分化に及ぼすカワラケツメイ由来のフラバノン類の影響の検討
　上記製造例で得られたカワラケツメイ由来のフラバノン配糖体（Ｆ２）およびそのアグリコン（Ｆ２ａ）について、破骨細胞の分化に及ぼす影響を検討した。
　マウス骨髄細胞を、α－ＭＥＭ（ＭＰバイオメディカルズ社（MP Biomedicals INC.）製）０．５ｍＬを入れたマイクロプレートの各ウェルに、３．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、３７℃、二酸化炭素濃度＝５（ｖ／ｖ）％にて培養した。培養１日目にＦ２およびＦ２ａのそれぞれを、１μＭ、２．５μＭ、５μＭおよび１０μＭの各濃度となるように添加し、培養を継続した。培養１日目および４日目に、最終濃度が１０ｎＭとなるように分化誘導試薬（カルシトリオール）を添加した。培養６日後に細胞を酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色し、顕微鏡観察（倒立型培養顕微鏡「ＣＫ４０」、オリンパス株式会社製、倍率＝４０倍）して、ＴＲＡＰで染色された細胞、すなわち分化した破骨細胞を検出した。なお、Ｆ２およびＦ２ａのいずれも添加しない場合をコントロールとした。
　観察結果は、１ウェルあたりのＴＲＡＰで染色された破骨細胞数（ＴＲＡＰ陽性破骨細胞数）にて、図２に示した。前記細胞数については、Ｆ２およびＦ２ａのそれぞれを添加した群とコントロールとの間で、対応のないｔ検定を実施した。
　図２に示されるように、Ｆ２は、終濃度が２．５μＭ以上、Ｆ２ａは終濃度が５μＭ以上となるように添加した場合に、濃度依存的な破骨細胞の分化促進作用を示し、Ｆ２を５μＭおよび１０μＭの各終濃度で添加した群とコントロールとの間でｐ＜０．０５、Ｆ２ａを１０μＭの終濃度で添加した群とコントロールとの間でｐ＜０．０１にて有意差が認められた。
　［試験例３］卵巣切除マウスの椎体の骨量に及ぼすカワラケツメイ由来のフラバノンの影響の検討
　閉経後骨粗鬆症のモデル動物として卵巣切除マウスを用いて、上記製造例で得られたカワラケツメイ由来のフラバノン配糖体のアグリコンである３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノン（Ｆ２ａ）が椎体の骨量に及ぼす影響を検討した。
　ｄｄＹマウス（雌性、７週齢）の卵巣を切除したマウス（ＯＶＸマウス）を４群（ｎ＝６／群）に分け、４週間飼育した。次いで、コントロール群には精製水０．１ｍＬを１日に１回、４週間経口投与し、Ｆ２ａを投与する３群には、３ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重および３０ｍｇ／ｋｇ体重のＦ２ａを、それぞれ１日１回、４週間経口投与した。一方、偽手術群（ｎ＝６）として、偽手術を行った後４週間飼育し、次いで精製水０．１ｍＬを１日１回、４週間経口投与した。
　次に、各群のマウスから脊椎を摘出し、凍結標本を作成し、非脱灰薄切標本を得た後、Ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ染色により石灰化部を染色して、海綿骨の形態を顕微鏡（倒立型培養顕微鏡「ＣＫ４０」、オリンパス株式会社製、倍率＝４０倍）により観察した。各群の標本における海綿骨の染色画像を図３に示した。
　また、上記顕微鏡下の観察画像から、各群の海綿骨量、骨梁数および骨梁幅を求め、図４～６に示した。海綿骨量、骨梁数および骨梁幅については、それぞれコントロール群と偽手術群、および各量のＦ２ａ投与群とコントロール群との間で、対応のないｔ検定を実施した。
　さらに、非脱灰薄切標本をＡＬＰ染色し、ＡＬＰで染色された骨芽細胞を顕微鏡（倒立型培養顕微鏡「ＣＫ４０」、オリンパス株式会社製、倍率＝２００倍）により観察した。また、非脱灰薄切標本をＴＲＡＰ染色し、ＴＲＡＰで染色された破骨細胞を顕微鏡（倒立型培養顕微鏡「ＣＫ４０」、オリンパス株式会社製、倍率＝２００倍）により観察した。これらの顕微鏡下における観察画像から、各群について、骨表面におけるＡＬＰ陽性骨芽細胞の占める面積の割合（ＡＬＰ陽性骨芽細胞面）（％）および、骨表面におけるＴＲＡＰ陽性破骨細胞の占める面積の割合（ＴＲＡＰ陽性破骨細胞面）（％）を求め、それぞれ偽手術群に対する比にて、図７および図８に示した。
　ＡＬＰ陽性骨芽細胞面およびＴＲＡＰ陽性破骨細胞面の測定結果については、いずれもコントロール群と偽手術群、および各量のＦ２ａ投与群とコントロール群との間で、それぞれ対応のないｔ検定を実施した。
　図３において、ＯＶＸマウスでは偽手術マウスに比べて、椎体の海綿骨量の明らかな減少が認められた。
　これに対し、各量のＦ２ａの経口投与により、椎体の海綿骨量が増加したことが認められた。
　図４～６に示されるように、卵巣の切除により、海綿骨量、骨梁数および骨梁幅の全てが、偽手術群に比べて有意（ｐ＜０．０１）に減少したことが認められた。
　ＯＶＸマウスにＦ２ａを経口投与することにより、海綿骨量および骨梁数の有意な増加が認められ（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）、１０ｍｇ／ｋｇ体重の経口投与で、最も増加が認められた。また、骨梁幅についても、有意差は認められなかったが、Ｆ２ａの経口投与により、増加する傾向が見られた。
　図７および図８に示されるように、卵巣の切除により、ＡＬＰ陽性骨芽細胞面に変化は認められなかったが、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞面は偽手術群に比べて有意（ｐ＜０．０１）に減少した。
　ＯＶＸマウスにＦ２ａを経口投与した群では、１０ｍｇ／ｋｇ体重以上のＦ２ａ経口投与群において、ＡＬＰ陽性骨芽細胞面の有意な増加が認められた（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。ＴＲＡＰ陽性破骨細胞面については、コントロール群と比較して有意な差を認めなかったが、Ｆ２ａの経口投与群において、増加する傾向が見られた。
　図３～８に示される結果から、カワラケツメイ由来のフラバノン配糖体のアグリコンである３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノンの経口投与により、骨粗鬆症が改善される可能性が示唆された。
　上記試験例１～３の結果から、カワラケツメイ由来のフラバノン配糖体、またはそのアグリコンが、骨芽細胞および破骨細胞の双方の分化を促進することにより、骨のリモデリングを促進し、骨粗鬆症を改善し得ることが示唆された。
　以上詳述したように、本発明により、骨芽細胞および破骨細胞の双方の分化を良好に促進し、骨吸収と骨形成をバランスよく促進して骨のリモデリングを促進する骨のリモデリング促進剤を提供することができる。
　本発明の骨のリモデリング促進剤は、骨代謝を促進し、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善に有用である。
　本願は、日本国で出願された特願2017-181670を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (6)

  1. 　フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上を含有する、骨のリモデリング促進剤。
  2. 　フラバノンおよびその配糖体が、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物のフラバノンおよびその配糖体である、請求項１に記載の骨のリモデリング促進剤。
  3. 　フラバノンおよびその配糖体からなる群より選択される１種または２種以上が、カワラケツメイ属（Chamaecrista）に属する植物のメタノールおよび酢酸エチルによる抽出物として含有される、請求項１に記載の骨のリモデリング促進剤。
  4. 　フラバノンおよびその配糖体が、３’，４’，７－トリヒドロキシフラバノンおよびその配糖体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の骨のリモデリング促進剤。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の骨のリモデリング促進剤を含有する、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善用医薬品。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の骨のリモデリング促進剤を含有する、骨粗鬆症または骨強度の低下の予防または改善用食品組成物。
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