WO2023042902A1 - 軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、リクイリチゲニンの配糖体を含有する、軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤に関する。　本発明によれば、安定性および安全性に優れ、優れた軟骨細胞への分化促進作用、軟骨細胞の増殖促進作用および軟骨基質産生促進作用を有し、軟骨の再生、さらには変形性関節症等の軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善に有効な軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤を提供することができる。

Description

軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤

　本発明は、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を促進し、さらに軟骨細胞の増殖および軟骨基質の産生を促進し得る軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤に関する。

　軟骨は軟骨細胞とそれを取り囲む基質からなる結合組織である。加齢や、関節の先天的もしくは後天的異常、靭帯断裂等の外傷、体重の増加等によって生じる過度の力学的負荷（メカニカルストレス）等により、軟骨細胞数の減少と機能の低下を引き起こし、軟骨組織の変性を来すことにより、変形性関節症等の疾患を引き起こすことが知られている。
　かかる疾患に対しては、抗炎症剤の投与等の対症療法；局所の安静、装具療法、ヒアルロン酸の関節内注射等の保存療法；関節鏡下骨髄刺激法、自家骨軟骨柱移植術、自家培養軟骨移植術、高位脛骨骨切り術等の手術治療が行われている。
　しかし、対症療法や保存療法は根本的な治療方法ではなく、手術療法のうち、関節鏡下骨髄刺激法や自家骨軟骨柱移植術は、小規模の軟骨欠損を対象としたものであり、重篤度の高い変形性膝関節症等、大規模な軟骨欠損への適用には向かないとされている。また、自家培養軟骨移植術においては、患者自身の細胞を関節より採取する必要があるため、侵襲性の問題が指摘されている。さらに、該移植術では、採取した細胞を大幅に増幅させる必要があるが、分化した軟骨細胞は増幅させることにより、軟骨細胞本来の機能を失うという脱分化の問題も指摘されている。

　それゆえ、軟骨細胞への分化もしくは軟骨細胞の増殖を促進し、あるいは軟骨基質の産生を促進する成分または軟骨の再生を促進する成分の探索が進められ、「ニューロコンドリン」と称するタンパク質であるＣ１６Ｎ、当該Ｃ１６ＮのアイソフォームであるＣ１６Ｎ－１およびＣ１６Ｎ－２、またはこれらタンパク質の類似タンパク質（特許文献１）、破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）作用物質であるペプチドおよびタンパク質（特許文献２）や、ハルミンまたはその塩（特許文献３）、ムベ葉抽出物（特許文献４）、２０－ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物（特許文献５）等の植物由来成分が報告されている。
　しかしながら、タンパク質やペプチドについては感作性や製剤安定性等における問題が懸念され、植物由来成分についても、安定性、安全性、効果等の面で十分に満足できるとはいえなかった。

　それゆえ、安定性および安全性に優れ、優れた軟骨細胞への分化促進作用もしくは軟骨細胞の増殖促進作用、または軟骨基質産生促進作用を有し、軟骨の再生、さらには変形性関節症等の治療に有用な軟骨細胞への分化促進剤等が求められている。

国際公開第２０００／００１４０５号 国際公開第２０１０／０３８６１０号 特開２０１２－１７１９４７号公報 特表２０１６－５２００５９号公報 特開２０１６－２１０７６７号公報

　そこで本発明は、安定性および安全性に優れ、優れた軟骨細胞への分化促進作用および軟骨細胞増殖促進作用、さらには軟骨基質産生促進作用を有し、軟骨の再生、さらには変形性関節症等の軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善に有用な軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤を提供することを目的とする。

　本発明者らは、甘草抽出物に含まれるリクイリチゲニンが軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を促進し、さらに軟骨細胞の増殖を促進し、軟骨基質の産生を促進する作用を有することを見出し、すでに開示した（特願２０２０－０７９７４０号）。
　今回、リクイリチゲニンの配糖体が、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への優れた分化促進作用等を有することを見出し、さらに検討して、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下に関する。
［１］リクイリチゲニンの配糖体を含有する、軟骨細胞への分化促進剤。
［２］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［１］に記載の分化促進剤。
［３］リクイリチゲニンの配糖体を含有する、軟骨細胞の増殖促進剤。
［４］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［３］に記載の増殖促進剤。
［５］リクイリチゲニの配糖体を含有する、軟骨基質産生促進剤。
［６］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［５］に記載の産生促進剤。
［７］リクイリチゲニンの配糖体を含有する、軟骨の再生剤。
［８］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［７］に記載の再生剤。
［９］［１］または［２］に記載の分化促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用医薬品。
［１０］軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、［９］に記載の医薬品。
［１１］［３］または［４］に記載の増殖促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用医薬品。
［１２］軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、［１１］に記載の医薬品。
［１３］［５］または［６］に記載の産生促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用医薬品。
［１４］軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、［１３］に記載の医薬品。
［１５］［１］または［２］に記載の分化促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用食品。
［１６］軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、［１５］に記載の食品。
［１７］［３］または［４］に記載の増殖促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用食品。
［１８］軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、［１７］に記載の食品。
［１９］［５］または［６］に記載の産生促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用食品。
［２０］軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、［１９］に記載の食品。

［２１］リクイリチゲニンの配糖体を、軟骨細胞への分化もしくは軟骨細胞の増殖を促進する必要のある対象動物に、当該対象動物の軟骨細胞への分化もしくは軟骨細胞の増殖を促進するために有効な量摂取させることまたは投与することを含む、軟骨細胞への分化もしくは軟骨細胞の増殖を促進する方法。
［２２］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［２１］に記載の方法。
［２３］リクイリチゲニンの配糖体を、軟骨基質の産生を促進する必要のある対象動物に、当該対象動物の軟骨基質の産生を促進するために有効な量摂取させることまたは投与することを含む、軟骨基質の産生を促進する方法。
［２４］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［２３］に記載の方法。
［２５］リクイリチゲニンの配糖体を、軟骨を再生する必要のある対象動物に、当該対象動物の軟骨を再生するために有効な量摂取させることまたは投与することを含む、軟骨の再生方法。
［２６］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［２５］に記載の再生方法。
［２７］リクイリチゲニンの配糖体を、軟骨の低減もしくは欠損を予防または改善する必要のある対象動物に、当該対象動物の軟骨の低減もしくは欠損を予防または改善するために有効な量摂取させることまたは投与することを含む、軟骨の低減もしくは欠損を予防または改善する方法。
［２８］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［２７］に記載の方法。
［２９］リクイリチゲニンの配糖体を、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を予防または改善する必要のある対象動物に、当該対象動物の前記症状や疾患を予防または改善するために有効な量摂取させることまたは投与することを含む、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を予防または改善する方法。
［３０］リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、［２９］に記載の方法。
［３１］軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、［２９］または［３０］に記載の方法。

　本発明により、安定性および安全性が高く、軟骨細胞への分化促進作用、軟骨細胞の増殖促進作用および軟骨基質産生促進作用に優れる軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤を提供することができる。
　本発明の軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤は、軟骨の再生に有効で、変形性関節症等、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善に有用である。

図１は、試験例１において、培養２４日目の細胞をアルシアンブルー染色した後、細胞から可溶化されたアルシアンブルー色素の量を、６２０ｎｍにおける吸光度により測定し、コントロールに対する相対値により示す図である。図中、「＊」は、コントロールに対し、Ｐ＜０．０５にて有意であることを示す。 図２は、試験例１において、培養２４日目の細胞の消化液中における硫酸化グリコサミノグリカンの含有量を示す図である。図中、「＊＊」は、コントロールに対し、Ｐ＜０．０１にて有意であることを示す。 図３は、試験例１において、培養２４日目の細胞の消化液中のＤＮＡ含有量を示す図である。図中、「＊＊」は、コントロールに対し、Ｐ＜０．０１にて有意であることを示す。 図４は、試験例１において、培養２４日目の細胞数を示す図である。図中、「＊」は、コントロールに対し、Ｐ＜０．０５にて有意であることを示す。

　本発明は、軟骨細胞への分化促進剤（以下、本明細書にて「本発明の分化促進剤」と称することがある）、軟骨細胞の増殖促進剤（以下、本明細書にて「本発明の増殖促進剤」と称することがある）、および軟骨基質産生促進剤（以下、本明細書にて「本発明の産生促進剤」と称することがある）を提供する。

　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、リクイリチゲニンの配糖体を有効成分として含有する。
　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤に有効成分として含有されるリクイリチゲニンの配糖体は、甘草に含有されるフラバノン配糖体であり、たとえば、下記化学式（１）で示されるリクイリチン（（２Ｓ）－２，３－ジヒドロ－７－ヒドロキシ－２－［４－（β－Ｄ－グルコピラノシルオキシ）フェニル］－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン）、下記化学式（２）で示されるリクイリチンアピオシド（（２Ｓ）－４’－（２－Ｏ－Ｄ－アピオ－β－Ｄ－フラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシルオキシ)－７－ヒドロキシフラバノン）、下記化学式（３）で示されるグルコリクイリチンアピオシド（（２Ｓ）－４’－（２－Ｏ－Ｄ－アピオ－β－Ｄ－フラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシルオキシ）－７－（β－Ｄ－グルコピラノシルオキシ）フラバノン）、下記化学式（４）で示されるネオリクイリチン（（Ｓ）－２，３－ジヒドロ－７－（β－Ｄ－グルコピラノシルオキシ）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン）等が挙げられる。
　本発明においては、リクイリチゲニンの配糖体は、１種を選択して単独で用いてもよく、２種以上を選択して、組み合わせて用いることもできる。
　なお、軟骨細胞への分化促進効果等の観点からは、本発明においては、リクイリチンが好ましく用いられる。

　本発明においては、リクイリチゲニンの配糖体として、それぞれ各社より精製品として提供されている製品を利用することもできるが、リクイリチン等、リクイリチゲニンの配糖体を高含有量にて含有する甘草抽出物の分画物を用いることもできる。
　なお、甘草抽出物の分画物を用いる場合には、甘草の主たる薬効成分であるが、副作用として偽アルドステロン症を発症する恐れのあるグリチルリチンを含有しない分画物を用いることが望ましい。本発明においては、リクイリチン等のリクイリチゲニンの配糖体類の選択的な抽出と、合成吸着剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製を経て得られる分画物が、グリチルリチン等のサポニン類を含まないのみならず、イソリクイリチン等のフラボノイドも含まないため、より好ましく利用することができる。

　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、１種または２種以上のリクイリチゲニンの配糖体に、必要に応じて、製剤の分野で一般的に用いられる添加剤を加えて、製剤の分野で周知の製剤化手段、たとえば第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された方法等により調製することができ、溶液状、懸濁液状、乳液状等の液状；ゲル状、ペースト状、クリーム状等の半固形状；粉末状、顆粒状、タブレット状、カプセル状等の固形状等の形態とすることができる。

　上記添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、基剤、溶剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、矯味剤、甘味剤、香料、着色剤等が挙げられる。

　賦形剤としては、無水ケイ酸、ケイ酸カルシウム、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、デンプン（トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、コムギデンプン等）、糖類（ブドウ糖、乳糖、白糖等）、糖アルコール（ソルビトール、マルチトール、マンニトール等）等が挙げられる。

　結合剤としては、ゼラチン、カゼインナトリウム、デンプンおよび加工デンプン（トウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン等）、セルロースおよびその誘導体（結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等）等が挙げられる。

　崩壊剤としては、ポビドン、クロスポビドン、セルロースおよびその誘導体（結晶セルロース、メチルセルロース等）等が挙げられる。

　滑沢剤としては、タルク、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。

　被覆剤としては、メタクリル酸共重合体（メタクリル酸・アクリル酸エチル共重合体等）、メタクリレート共重合体（アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル共重合体、アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル・メタクリル酸塩化トリメチルアンモニオエチル共重合体等）等が挙げられる。

　基剤としては、炭化水素（流動パラフィン等）、ポリエチレングリコール（マクロゴール４００、マクロゴール１５００等）等が挙げられる。

　溶剤としては、精製水、一価アルコール（エタノール等）、多価アルコール（プロピレングリコール、グリセリン等）等が挙げられる。

　乳化剤としては、非イオン性界面活性剤（ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等）、陰イオン性界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム、Ｎ－アシルグルタミン酸塩等）、精製大豆レシチン等が挙げられる。

　分散剤としては、アラビアゴム、アルギン酸プロピレングリコール、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等）、陰イオン性界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。

　懸濁化剤としては、アルギン酸ナトリウム、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）等が挙げられる。

　安定化剤としては、アジピン酸、エチレンジアミン四酢酸塩（エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム等）、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン等が挙げられる。

　粘稠剤としては、水溶性高分子（ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー等）、多糖類（アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、トラガント等）等が挙げられる。

　ｐＨ調整剤としては、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、水酸化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。

　抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｄｌ－α－トコフェロール、エリソルビン酸、没食子酸プロピル等が挙げられる。

　防腐剤または保存剤としては、パラオキシ安息香酸エステル（パラオキシ安息香酸メチル等）、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等が挙げられる。

　矯味剤としては、アスコルビン酸、エリスリトール、５’－グアニル酸二ナトリウム、クエン酸、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム、酒石酸、ＤＬ－リンゴ酸等が挙げられる。
　また、甘味剤としては、アスパルテーム、ステビア、サッカリン等が挙げられる。

　香料としては、オレンジエッセンス、ｌ－メントール、ｄ－ボルネオール、バニリン、リナロール等が挙げられる。

　着色剤としては、タール色素（食用赤色２号、食用青色１号、食用黄色４号等）、無機顔料（ベンガラ、黄色三二酸化鉄、酸化チタン等）、天然色素（アナトー色素、ウコン色素、カロテノイド等）等が挙げられる。

　上記した添加剤は、必要に応じて、１種または２種以上を用いることができる。

　本発明の分化促進剤は、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を良好に促進し、軟骨細胞の形成を促進することができる。
　また、本発明の増殖促進剤は、分化した軟骨細胞の増殖を促進することができる。
　さらに、本発明の産生促進剤は、軟骨細胞による軟骨基質の産生を良好に促進することができる。
　それゆえ、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、有効な軟骨の再生作用を有し、軟骨が損傷し、または炎症を受けた組織において、軟骨の低減または欠損を補う効果を奏する。
　また、本発明の分化促進剤および増殖促進剤は、軟骨の低減または欠損した組織を補填するための軟骨細胞の培養に好適に用いることができる。
　従って、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、変形性関節症等、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または治療に好適に用いることができる。
　さらに、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤に含有されるリクイリチゲニンの配糖体は、古くから漢方薬として利用されてきた甘草に含まれる成分であり、安全性が高い成分である。
　従って、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、長期間にわたり連続して摂取させまたは投与することができる。

　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤におけるリクイリチゲニンの配糖体の含有量は、リクイリチンの含有量として通常０．００００５重量％～１００重量％であり、好ましくは０．０００１重量％～１００重量％であり、より好ましくは０．０００２重量％～１００重量％である。

　また、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤の１日あたりの摂取量または投与量は、適用される対象（以下本明細書において、「適用対象」ともいう）の性別、年齢、適用対象において観察される軟骨の損傷や炎症の状態および程度、もしくは軟骨の欠損の状態および程度、ならびに本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤の形態、投与方法等により適宜決定されるが、適用対象がヒト成人である場合、リクイリチンの量として、通常２ｍｇ～４０００ｍｇであり、好ましくは２０ｍｇ～２０００ｍｇであり、より好ましくは５０ｍｇ～５００ｍｇである。
　上記の量は、１回で摂取させまたは投与してもよく、１日数回（たとえば２～３回）に分けて摂取させまたは投与してもよい。

　また、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤の摂取または投与期間も、適用対象の軟骨の損傷や炎症の状態および程度、もしくは軟骨の欠損の状態および程度等に応じて適宜設定される。リクイリチゲニンの配糖体が、古くから漢方薬等として利用されてきた甘草に含有される成分であって、安全性が高いことや、変形性関節症等の軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、加齢や長期にわたる力学的負荷等により引き起こされる症状や疾患であること、あるいは関節リウマチ等の自己免疫疾患等であること等を考慮すると、かかる症状や疾患を予防または改善するためには、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、長期間にわたり継続して摂取させまたは投与することが好ましい。

　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、単位包装形態とすることができる。本明細書において「単位包装形態」とは、特定量（たとえば、１回あたりの摂取量または投与量等）を１単位とし、該１単位または２単位以上が一つの容器に充填され、または包装体に包装される等して収容された形態をいい、たとえば、１回あたりの摂取量または投与量を１単位とする単位包装形態は、「１回あたりの摂取量または投与量単位の包装形態」と称する。単位包装形態に用いられる容器または包装体は、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤の形態等に応じて適宜選択し得るが、たとえば、紙製の容器または袋体、プラスチック製の容器または袋体、パウチ、アルミ缶、スチール缶、ガラス瓶、ペットボトル、ＰＴＰ（press through pack）包装シート等が挙げられる。

　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤の適用対象としては、哺乳動物（たとえば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ等）や、鳥類（たとえば、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、七面鳥等）等が挙げられる。
　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤を、上記のような適用対象動物（以下、単に「対象動物」ともいう）のうちヒト以外の動物に適用する場合、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤の摂取量または投与量は、対象動物の種類、性別、体重等に応じて適宜設定すればよい。

　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、上述した通り、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への良好な分化促進作用、分化した軟骨細胞の増殖を促進する作用および軟骨細胞による軟骨基質の産生を促進する作用を有し、軟骨の再生剤として機能する。
　従って、本発明は他の実施態様として、軟骨の再生剤（以下、本明細書にて「本発明の再生剤」とも称する）を提供する。

　本発明の再生剤は、リクイリチゲニンの配糖体を有効成分として含有する。
　本発明の再生剤に含有されるリクイリチゲニンの配糖体、本発明の再生剤におけるその含有量、１日あたりの投与量または摂取量および投与または摂取回数、投与または摂取期間については、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤について上記した通りである。
　また、本発明の再生剤の形態、包装形態、適用対象についても、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤について上記した通りである。

　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、そのまま、またはさらに上記した製剤の分野で一般的な添加剤を加えて、医薬品（以下、本明細書において「本発明の医薬品」とも称する）として提供することができる。
　本発明の医薬品は、錠剤、被覆錠剤、チュアブル錠、丸剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、エリキシル剤、リモナーゼ剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、経口ゼリー剤等の経口製剤；溶液状、懸濁液状、乳液状等の注射剤、用時溶解または懸濁して用いる固形状の注射剤、輸液剤、持続性注射剤等の注射用製剤等の剤形とすることができる。
　上記の通り、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤に含有されるリクイリチゲニンの配糖体は、主として、古くから漢方薬として利用される甘草から得られ、経口摂取に適することから、本発明の医薬品は、経口製剤として好適に提供され得る。

　本発明の医薬品には、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、リクイリチンの含有量として、通常０．００１重量％～１００重量％、好ましくは０．０１重量％～１００重量％、より好ましくは０．１重量％～１００重量％含有される。

　本発明の医薬品には、本発明の特徴を損なわない範囲で、さらに、アセトアミノフェン等の鎮痛剤；ロキソプロフェン、ジクロフェナク等の非ステロイド性抗炎症剤等、変形性関節症等の軟骨の損傷、炎症に起因する疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する疾患の症状の緩和に用いられる薬物を添加することもできる。

　本発明の医薬品は、変形性関節症等の軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を有する者や、加齢や長期にわたる力学的負荷等により、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を発症するリスクの高い者に対し、好適に投与され得る。
　本発明の医薬品は、上記適用対象に対し、リクイリチン量に換算した１日あたりの摂取量または投与量が、上記した１日あたりの摂取量または投与量となるように、投与される。

　さらに、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、各種食品に添加して摂取させることができる。本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤が添加される食品は特に制限されず、一般的に食事やデザートに供される形態の食品であれば如何なるものでもよい。
　たとえば、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤を茶類、清涼飲料水等の飲料に添加し、所望により適当な風味を加えて、機能性飲料とすることができる。
　より具体的には、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、たとえば、茶系飲料、果実飲料等の清涼飲料水；緑茶、紅茶、中国茶等の茶類；牛乳、ヨーグルト等の乳製品；ゼリー、ビスケット、キャンディ、キャラメル等の菓子等に添加することができる。

　本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、１日あたりに摂取される量の上記各種食品に対し、リクイリチン量に換算した量として、上記した１日あたりの摂取量となるように添加されることが好ましい。

　また、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、そのまま、または必要に応じて一般的な食品添加物を加えて、通常の食品製造技術により、食品（以下、本明細書において「本発明の食品」とも称する）として提供することができる。
　本発明の食品は、溶液状、懸濁液状、乳状等の液状；ゲル状、クリーム状、ペースト状等の半固形状；粉末状、顆粒状、シート状、カプセル状、タブレット状等の固形状等、種々の形態とすることができる。
　さらに、本発明の食品は、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤を各種食品原材料に加え、必要に応じて一般的な食品添加物を加えて、清涼飲料水（果汁飲料、スポーツ飲料、コーヒー飲料、茶系飲料等）、茶（緑茶、白茶、黄茶、青茶、紅茶、黒茶、花茶等）、乳製品（乳酸菌飲料、発酵乳、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、脱脂乳等）、食肉加工品（ハム、ソーセージ、ハンバーグ等）、魚肉練り製品（蒲鉾、竹輪等）、卵加工品（だし巻き、卵豆腐、茶碗蒸し等）、大豆加工品（味噌、豆腐、納豆等）、小麦加工品（パン、うどん、パスタ等）、魚介乾物（鰹節、煮干、ちりめんじゃこ等）、菓子（クッキー、ビスケット、ゼリー、チューイングガム、キャンディ、キャラメル、アイスクリーム等）、スープ（味噌汁、コンソメスープ、コーンスープ、ポタージュ等）、調味料（ドレッシング、ウスターソース、マヨネーズ等）等、種々の形態とすることができ、瓶詰め、缶詰、レトルトパウチ等の包装形態を採用することもできる。

　上記食品添加物としては、製造用剤（かんすい、結着剤等）、増粘安定剤（キサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）、ゲル化剤（ゼラチン、寒天、カラギーナン等）、ガムベース（酢酸ビニル樹脂、ジェルトン、チクル等）、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、サポニン、レシチン等）、保存料（安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ε－ポリリシン等）、酸化防止剤（アスコルビン酸、エリソルビン酸、カテキン等）、光沢剤（セラック、パラフィンワックス、ミツロウ等）、防かび剤（チアベンダゾール、フルジオキソニル等）、膨張剤（炭酸水素ナトリウム、グルコノδ－ラクトン、ミョウバン等）、甘味料（アスパルテーム、アセスルファムカリウム、ステビア等）、苦味料（カフェイン、ナリンジン、ニガヨモギ抽出物等）、酸味料（クエン酸、酒石酸、乳酸等）、調味料（Ｌ－グルタミン酸ナトリウム、５’－イノシン酸二ナトリウム等）、着色料（アナトー色素、ウコン色素、クチナシ色素等）、香料（アセト酢酸エチル、アニスアルデヒド等の合成香料、オレンジ、ラベンダー等の天然香料）等が挙げられる。
　本発明において、上記食品添加物は、１種または２種以上を用いることができる。

　本発明の食品には、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤は、リクイリチンの含有量として、通常０．００００５重量％～１００重量％、好ましくは０．０００１重量％～１００重量％、より好ましくは０．０００２重量％～９９．９重量％含有される。

　さらに本発明の食品には、本発明の特徴を損なわない範囲で、カルシウム、タンパク質、コンドロイチン、グルコサミン等、軟骨の損傷や減少に有効な栄養素や、これら栄養素を含む食品素材を添加することができる。

　本発明の食品は、変形性関節症等、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を有する者や、加齢や長期にわたる力学的負荷等により、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を発症するリスクの高い者等に好適に摂取させ得る。また、中高齢者やスポーツ選手等に対し、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防を目的として、幅広く摂取させることができる。

　従って、本発明の食品は、変形性関節症等、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用の特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の保健機能食品、病者用食品、高齢者用食品等の特別用途食品、健康補助食品、ダイエタリーサプリメント等としても提供され得る。

　本発明の食品は、上記適用対象に対し、リクイリチン量に換算した１日あたりの摂取量が、上記した１日あたりの摂取量となるように摂取させることが好ましい。

　本発明はまた、上記した本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤と、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤を軟骨細胞への分化促進、軟骨細胞の増殖促進や軟骨基質の産生促進、または軟骨の再生、あるいは軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善に使用することができること、または使用すべきであることを記載した記載物とを含む、商業的パッケージを提供することができる。

　さらに本発明は、軟骨細胞への分化もしくは軟骨細胞の増殖、または軟骨基質の産生を促進する必要のある対象動物における、軟骨細胞への分化もしくは軟骨細胞の増殖、または軟骨基質の産生を促進する方法（以下、本明細書において「本発明の促進方法」ともいう）を提供する。

　本発明の促進方法は、軟骨細胞への分化もしくは軟骨細胞の増殖、または軟骨基質の産生を促進する必要のある対象動物に、当該対象動物の軟骨細胞への分化もしくは軟骨細胞の増殖、または軟骨基質の産生を促進するために有効な量の、リクイリチゲニンの配糖体を摂取させること、または投与することを含む。

　本発明の促進方法は、軟骨が低減または欠損した組織を補填するための軟骨細胞の培養や、低減または欠損した軟骨の再生において、好適に用いることができる。

　従って、本発明は、軟骨を再生する必要のある対象動物における軟骨の再生方法（以下、本明細書において「本発明の再生方法」ともいう）を提供する。
　本発明の再生方法は、軟骨を再生する必要のある対象動物に、当該対象動物の軟骨を再生するために有効な量の、リクイリチゲニンの配糖体を摂取させること、または投与することを含む。

　さらに本発明は、軟骨の低減もしくは欠損を予防または改善する必要のある対象動物における、軟骨の低減もしくは欠損を予防または改善する方法、および、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を予防または改善する必要のある対象動物における、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を予防または改善する方法（以下、本明細書において「本発明の予防または改善方法」ともいう）をも提供する。

　本発明の予防または改善方法は、軟骨の低減もしくは欠損を予防または改善する必要のある対象動物、あるいは、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を予防または改善する必要のある対象動物に、当該対象動物の軟骨の低減もしくは欠損を予防または改善するために有効な量、あるいは、当該対象動物の軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を予防または改善するために有効な量の、リクイリチゲニンの配糖体を摂取させること、または投与することを含む。

　本発明の予防または改善方法は、変形性関節症等、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または治療に好適に用いることができる。

　上記した本発明の促進方法、本発明の再生方法、および本発明の予防または改善方法における対象動物としては、哺乳動物（たとえば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ等）や、鳥類（たとえば、アヒル、ニワトリ、ガチョウ、七面鳥等）等が挙げられる。

　ヒトの場合、本発明の促進方法、本発明の再生方法、および本発明の予防または改善方法は、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を有する患者、または、加齢や長期にわたる力学的負荷等により、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患を発症するリスクの高い者に好適に適用され得る。

　本発明の促進方法、本発明の再生方法、および本発明の予防または改善方法におけるリクイリチゲニンの配糖体の有効量は、対象動物の種類、年齢、性別、軟骨の炎症、損傷もしくは欠損の状況および程度等に応じて適宜決定されるが、本発明の分化促進剤、増殖促進剤および産生促進剤において、ヒトおよびヒト以外の対象動物について上記した摂取量または投与量と同様の量を、上記した回数および期間にて摂取させまたは投与することができる。

　さらに、本発明の促進方法、本発明の再生方法、および本発明の予防または改善方法におけるリクイリチゲニンの配糖体の摂取または投与方法としては、経口摂取または経口投与、注射、輸液による投与等が挙げられるが、医療機関にて医師の指導監督下に行う必要がなく、簡便に摂取させまたは投与することができることから、経口摂取または経口投与が好ましい。

　以下に試験例により、本発明についてさらに詳細に説明する。

　以下の試験例において、リクイリチンとしては、富士フイルム和光純薬株式会社製の純品を使用した。

　［試験例１］リクイリチンが軟骨細胞の分化、増殖および軟骨基質産生に及ぼす効果の検討
　軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５細胞を用いて、リクイリチンが軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化、軟骨細胞の増殖および軟骨基質の産生に及ぼす効果について、下記の通り検討した。
　（１）軟骨前駆細胞の培養および軟骨細胞への分化誘導
　ＡＴＤＣ５細胞（国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センターより入手）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムズ（Ｈａｍ’ｓ）　Ｆ－１２培地（富士フイルム和光純薬株式会社製）０．５ｍＬを入れたマイクロプレートに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、５体積％二酸化炭素存在下３７℃にて培養した。
　培養３日目、６日目、９日目、１２日目、１５日目、１８日目および２１日目に、前記培地に、分化誘導試薬であるトランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウムをそれぞれ終濃度が１０μｇ／ｍＬおよび３０ｎＭとなるように添加し、さらに、リクイリチンを５μＭ、１０μＭおよび２０μＭの各終濃度となるように添加した培地にてそれぞれ培地交換を行い、培養を継続した。
　なお、リクイリチンを添加せずに、同様に処理した場合（リクイリチン濃度＝０μＭ）をコントロールとした。

　（２）アルシアンブルー染色によるグリコサミノグリカンの検出
　培養２４日目に、細胞を９５体積％エタノールで固定した後、アルシアンブルー染色液（１重量％アルシアンブルー、３重量％酢酸水溶液により調製、ｐＨ＝２．５）で染色し、グリコサミノグリカンを検出した。
　次いで、染色された培養細胞のアルシアンブルー色素を６Ｍのグアニジン塩酸塩で可溶化し、プレートリーダー（インフィニット（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ）２００　ＰＲＯ、テカンジャパン株式会社製）にて６２０ｎｍにおける吸光度を測定した（リクイリチンの各濃度およびコントロールについて、それぞれｎ＝４）。測定結果は、コントロールにおける吸光度を１００とした場合の相対値により、平均値±標準偏差にて、図１に示した。測定結果については、リクイリチンを上記濃度でそれぞれ添加した各群とコントロールとの間で、対応のないｔ検定を実施した。

　図１に示されるように、１０μＭ以上のリクイリチンの添加により、培養細胞において、アルシアンブルーで染色されるグリコサミノグリカンが増加したことが認められ、２０μＭのリクイリチンの添加により、コントロールに対し有意な吸光度の増加が認められた（Ｐ＜０．０５）。

　（３）細胞内の硫酸化グリコサミノグリカンの定量
　培養２４日目に、細胞を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）で洗浄した後、１００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む水溶液（ｐＨ＝７．１）にて調製）を０．２ｍＬ添加し、３７℃にて一晩インキュベートして細胞を消化した。細胞の消化液を遠心分離し、得られた上清を試料とした。
　各試料２０μＬを、１６ｍｇ／Ｌのジメチルメチレンブルー溶液（４０ｍＭグリシン、２７ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ酢酸を含む水溶液（ｐＨ＝３．０）にて調製）２００μＬと混和し、５２５ｎｍにおける吸光度を測定して、試料中の硫酸化グリコサミノグリカンを定量した（それぞれｎ＝４）。定量結果を、平均値±標準偏差にて図２に示した。定量結果については、リクイリチンを上記濃度でそれぞれ添加した各群とコントロールとの間で、対応のないｔ検定を実施した。

　図２に示されるように、細胞消化液中に含まれる硫酸化グリコサミノグリカン量は、リクイリチンの添加濃度に従って増加し、５μＭ～２０μＭのリクイリチンにより、コントロールに対し有意な増加が認められた（Ｐ＜０．０１）。

　（４）軟骨細胞数の測定
　上記試料中のＤＮＡ含有量を、ＤＮＡ定量キット（「ＤＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ」、コスモ・バイオ株式会社製）を用いて測定し（それぞれｎ＝４）、細胞数の指標とした。測定結果は、平均値±標準偏差にて図３に示した。測定結果については、リクイリチンを添加した群とコントロールとの間で、対応のないｔ検定を実施した。
　また、培養２４日目に、細胞を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．４）で洗浄した後、細胞を０．２５（ｗ／ｖ）％トリプシン－１ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム溶液（富士フイルム和光純薬株式会社製）を用いて剥離し、細胞懸濁液中の細胞数を倒立型培養顕微鏡（ＣＫ４０、オリンパス株式会社製）下で観察し（倍率＝１０倍）、細胞数を計測した（それぞれｎ＝４）。計測結果を、平均値±標準偏差にて図４に示した。計測結果については、リクイリチンを上記濃度でそれぞれ添加した各群とコントロールとの間で、対応のないｔ検定を実施した。

　図３に示されるように、細胞数の指標とした細胞消化液中のＤＮＡ含有量は、リクイリチンの添加濃度に従って増加した（１０μＭおよび２０μＭにて、コントロールに対しＰ＜０．０１にて有意）。
　また、図４に示されるように、培養２４日目の細胞数も、リクイリチンの添加濃度に従って増加した（１０μＭおよび２０μＭにて、コントロールに対しＰ＜０．０５にて有意）。

　以上の結果により、リクイリチンは、１０μＭ～２０μＭの濃度で軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を促進し、５μＭという低濃度で、軟骨細胞によるグリコサミノグリカンの産生を促進し得ることが示唆された。また、リクイリチンは、１０μＭ～２０μＭの濃度で軟骨細胞の増殖を促進し、前記濃度範囲では細胞毒性を示さないことが示唆された。
　従って、リクイリチンは、非常に低濃度で軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化を促進し、さらに軟骨細胞の増殖および軟骨基質産生を促進して、軟骨再生作用を向上させ得ることが示唆された。

　以上、詳述したように、本発明により、軟骨細胞への分化促進作用、軟骨細胞の増殖促進作用および軟骨基質産生促進作用に優れる軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤を提供することができる。
　本発明の軟骨細胞への分化促進剤、軟骨細胞の増殖促進剤および軟骨基質産生促進剤は、安定性および安全性が高く、軟骨の再生に有効で、変形性関節症等、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善に有用である。

　本願は、日本国で出願された特願２０２１－１５２６１５を基礎としており、その内容は、本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (20)

1. 　リクイリチゲニンの配糖体を含有する、軟骨細胞への分化促進剤。
2. 　リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、請求項１に記載の分化促進剤。
3. 　リクイリチゲニンの配糖体を含有する、軟骨細胞の増殖促進剤。
4. 　リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、請求項３に記載の増殖促進剤。
5. 　リクイリチゲニの配糖体を含有する、軟骨基質産生促進剤。
6. 　リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、請求項５に記載の産生促進剤。
7. 　リクイリチゲニンの配糖体を含有する、軟骨の再生剤。
8. 　リクイリチゲニンの配糖体がリクイリチンである、請求項７に記載の再生剤。
9. 　請求項１または２に記載の分化促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用医薬品。
10. 　軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、請求項９に記載の医薬品。
11. 　請求項３または４に記載の増殖促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用医薬品。
12. 　軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、請求項１１に記載の医薬品。
13. 　請求項５または６に記載の産生促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用医薬品。
14. 　軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、請求項１３に記載の医薬品。
15. 　請求項１または２に記載の分化促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用食品。
16. 　軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、請求項１５に記載の食品。
17. 　請求項３または４に記載の増殖促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用食品。
18. 　軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、請求項１７に記載の食品。
19. 　請求項５または６に記載の産生促進剤を含有する、軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患の予防または改善用食品。
20. 　軟骨の損傷、炎症に起因する症状や疾患、もしくは軟骨の欠損を呈する症状や疾患が、変形性関節症である、請求項１９に記載の食品。

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