WO2018061846A1 - 細胞組織の製造方法、及び多孔フィルム - Google Patents

細胞組織の製造方法、及び多孔フィルム Download PDF

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俊 後藤
創一 小橋
中澤　浩二
藪　浩
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富士フイルム株式会社
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Definitions

  • the present disclosure relates to a method for manufacturing a cell tissue and a porous film used for manufacturing the cell tissue.
  • a filter for concentrating cells, a scaffold for growing cells, and a transplant material for engrafting cells and transplanting them into a living body which are used for the purpose of transplanting cells or cell tissues into a living body.
  • a transplant material for engrafting cells and transplanting them into a living body which are used for the purpose of transplanting cells or cell tissues into a living body.
  • Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2012-006010 discloses a composite porous membrane that separates target cells by size.
  • International Publication No. 2006/093207 discloses a culture substrate having pores arranged in a honeycomb on the cell culture surface.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-110709 discloses a bone formed by combining a through hole and a communication hole as a bone prosthetic material that is engrafted with bone marrow mesenchymal stem cells and induced to differentiate into osteoblasts and then transplanted to a bone defect.
  • a fill material is disclosed.
  • a porous support having the above structure is disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-199962 discloses spheroid formation in which a plurality of cell adhesive regions and a cell non-adhesive region surrounding the cell adhesive region are arranged on the surface of a porous film having a three-dimensional network structure.
  • a substrate is disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-523383 discloses a porous polymer scaffold comprising pores connected to each other as a scaffold for engrafting and proliferating osteogenic cells.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-307180 discloses a scaffold in which struts arranged in a vertical and horizontal lattice are stacked as a transplant material for injecting stem cells into a structure and transplanting the same into a living body.
  • Japanese Patent No. 4437227 discloses a cylindrical porous body made of a water-insoluble polymer, vascular endothelial cells that coat the inner surface of the cylindrical porous body, and vascular smooth muscle that covers the outer surface of the cylindrical porous body.
  • An artificial blood vessel containing cells is disclosed.
  • An object of this indication is to provide the manufacturing method which manufactures the cell tissue provided with the network structure of a micro order, and the porous film with which it uses for manufacture of the cell tissue provided with the network structure of the micro order.
  • a method for producing a cellular tissue comprising: [2] The culture process according to [1], wherein the culture process is a culture process in which a cell having feeder ability and at least one of a vascular endothelial cell and a lymphatic endothelial cell are co-cultured inside the opening and the communication hole.
  • a method for producing a cell tissue comprising: [2] The culture process according to [1], wherein the culture process is a culture process in which a cell having feeder ability and at least one of a vascular endothelial cell and a lymphatic endothelial cell are co-cultured inside the opening and the communication hole.
  • the culturing step is a culturing step in which cells having feeder ability, at least one of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells, and cells forming a parenchymal organ are co-cultured inside the open holes and communication holes.
  • [5] The method for producing a cellular tissue according to any one of [1] to [4], wherein the cells having feeder ability are at least one of mesenchymal stem cells and fibroblasts.
  • [6] The method for producing a cell tissue according to any one of [1] to [5], wherein the plurality of apertures are arranged in a honeycomb shape on the surface of the porous film.
  • [7] The method for producing a cell tissue according to any one of [1] to [6], wherein the communication holes are provided at substantially the same depth over the entire surface direction of the porous film.
  • a porous film having a plurality of apertures provided on the surface and communication holes communicating with adjacent apertures, the aperture depth being in the range of 20 ⁇ m to 100 ⁇ m .
  • a manufacturing method for manufacturing a cell tissue having a micro-order network structure and a porous film used for manufacturing a cell tissue having a micro-order network structure are provided.
  • FIG. 1C is a cross-sectional view taken along the line cc in FIG. 1B.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line dd in FIG. 1B.
  • It is a schematic diagram which shows an example of the manufacturing method of a porous film. It is a scanning electron microscope image of a porous film. It is an example of the part of a culture device and a culture device. It is a scanning electron microscope image of the cross section and surface of a porous film. It is a scanning electron microscope image of the cross section and surface of a porous film.
  • process is not only an independent process, but is included in this term if the intended purpose of the process is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other processes.
  • the amount of each component in the composition when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition, the plurality of the substances present in the composition unless otherwise specified. It means the total amount of substance.
  • coefficient of variation is expressed as a percentage.
  • the variation coefficient is a value obtained by dividing the standard deviation for a certain group by an average, and is an index indicating the degree of variation of the group.
  • the method for producing a cellular tissue is a method for producing a cellular tissue in vitro, and includes a plurality of apertures provided on the surface and a porous film having communication holes communicating with adjacent apertures. A culturing step for culturing cells inside the opening and the communication hole. First, the porous film used for manufacturing the cell tissue will be described.
  • the porous film of this embodiment functions as a scaffold for engrafting cells and forming a tissue.
  • the porous film of the present embodiment has a plurality of apertures provided on the surface and communication holes that allow adjacent apertures to communicate with each other.
  • the wall surface of the opening and the communication hole provided in the porous film is a scaffold for engraftment of cells.
  • the cells seeded in the porous film of the present embodiment are engrafted inside the open holes and the communication holes to form a cell tissue having a micro-order network structure.
  • surface direction means the main surface direction of the porous film
  • thickness direction means the thickness direction of the porous film.
  • major axis means the maximum length of any distance between two points on the contour. However, when a direction is specified, among the distances between any two points in that direction. Means the maximum length of
  • the center of the opening means the center of gravity when the opening is regarded as a two-dimensional figure in the surface direction.
  • FIG. 1A is a perspective view showing the structure of the porous film
  • FIG. 1B is a plan view seen from the opening side in FIG. 1A
  • FIG. 1C is a cross-sectional view taken along the line cc in FIG. 1B
  • FIG. 1D is a cross-sectional view taken along the line dd in FIG. 1B.
  • 1A to 1D show a porous film 200 as an example of this embodiment.
  • the porous film 200 is a laminate including a porous layer 204 in which a plurality of apertures 210 are arranged in a plane direction, and a support 202 that supports the porous layer 204.
  • the porous film 200 may not be provided with the support 202 and may be a single layer only of the porous layer 204.
  • openings 210 are arranged over the entire surface direction. However, when the porous layer 204 includes a region where cells cannot contact, the aperture 210 may not be disposed in the region.
  • the opening surface 206 of the porous film 200 is a surface on the side where a plurality of apertures 210 are opened, and is a surface on the side where cells are seeded.
  • the openings of the openings 210 adjacent to each other are separated by a flat portion 208 extending between the openings 210a.
  • the liquid medium is supplied to the inside of the opening 210 and the communication hole 212 through the opening of the opening 210 in the opening surface 206.
  • Each opening 210 is a bottomed hole that does not penetrate through the porous layer 204.
  • each opening 210 may be a bottomed hole that penetrates the porous layer 204 and has the surface of the support 202 as a bottom surface.
  • each opening 210 may be a bottomed hole that does not penetrate the porous layer 204, or may be a through-hole that penetrates the porous layer 204.
  • each of the openings 210 for example, a spherical shape obtained by cutting a part of a sphere, a barrel shape, a cylindrical shape, or a prismatic shape may be mentioned.
  • Examples of the shape of each opening 210 include a circle, an ellipse, and a polygon.
  • the plurality of apertures 210 are regularly arranged, and specifically, arranged in a honeycomb shape.
  • the plurality of apertures 210 may be arranged in a lattice shape or a face-centered lattice shape.
  • the arrangement of the plurality of apertures 210 may be random, from the viewpoint of making the density of the apertures 210 in the plane direction uniform and improving the homogeneity of the tissue formed by cells in the porous film 200, the plurality of apertures 210 are regular. Are preferably arranged.
  • the regular arrangement may be interrupted or misaligned, but is preferably repeated continuously without any gaps in any direction.
  • the honeycomb arrangement is an arrangement in which a parallel hexagon (preferably regular hexagon) or a shape close thereto is used as a unit, and the center of gravity of the opening is located at the intersection of the vertex and the diagonal line of these figures.
  • the grid-like arrangement is an arrangement in which a parallelogram (including, of course, a square, a rectangle, and a rhombus is included, preferably a square) or a shape close to this, and the center of gravity of the opening is located at the top of these figures. is there.
  • the face-centered lattice arrangement is a parallelogram (including, of course, a square, a rectangle, a rhombus, preferably a square) or a shape close to this, and an opening is formed at the intersection of the vertices and diagonals of these figures. It is an arrangement where the center of gravity is located.
  • the standard of regular arrangement is that the coefficient of variation is 10% or less with respect to the area of the parallelogram or parallelogram that is the unit of arrangement.
  • the openings 210 adjacent to each other communicate with each other through the communication holes 212 inside the porous layer 204. It is preferable that one aperture 210 communicates with all adjacent apertures 210. In the porous film 200 in which a plurality of apertures 210 are arranged in a honeycomb shape, one aperture 210 is preferably communicated with six adjacent apertures 210, that is, one aperture.
  • the hole 210 preferably has six communication holes 212.
  • the openings 210 adjacent to each other are arranged such that a part of each wall surface is continuous, and the communication hole 212 is a hole surrounded by a connecting portion 210 b between the openings 210.
  • the adjacent openings 210 may be independent, and the communication holes 212 that are cylindrical gaps may connect the adjacent openings 210.
  • the plurality of apertures 210 have a size that allows cells seeded on the porous film 200 to enter and engraft.
  • the major axis of the cells seeded on the porous film 200 is, for example, 10 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the opening diameter Da of the opening 210 is preferably 50% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 120% or more with respect to the long diameter of the cells seeded on the porous film 200. .
  • the opening diameter Da of the opening 210 is preferably 5 ⁇ m or more, more preferably 8 ⁇ m or more, and further preferably 12 ⁇ m or more.
  • the opening diameter Da of the opening 210 is preferably 90 ⁇ m or less, more preferably 70 ⁇ m or less, and even more preferably 50 ⁇ m or less, depending on the relationship between the preferred arrangement and size of the opening 210.
  • the opening diameter Da is the long diameter of the opening 210, and the range of the opening diameter Da is confirmed by measuring the opening diameters of 10 or more arbitrarily selected openings.
  • the variation coefficient of the opening diameter Da of the opening 210 is preferably 20% or less, and is preferably as small as possible. The smaller the variation coefficient of the opening diameter Da, the higher the homogeneity of the tissue formed by the cells in the porous film 200.
  • the ratio of the total area of the openings of the opening 210 to the total area of the opening surface 206 is preferably 20% to 90%, and more preferably 30% to 80%. Preferably, it is 40% to 70%.
  • the major axis Db in the surface direction of the opening 210 is preferably in the range of 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, more preferably in the range of 20 ⁇ m to 80 ⁇ m, and still more preferably in the range of 30 ⁇ m to 60 ⁇ m.
  • 10 ⁇ m or more more preferably 20 ⁇ m or more, more preferably 30 ⁇ m or more
  • a space where proliferative cells proliferate is secured, and a space where a plurality of types of co-cultured cells coexist is secured.
  • the thickness is 100 ⁇ m or less (more preferably 80 ⁇ m or less, still more preferably 60 ⁇ m or less)
  • a micro-order network structure can be formed.
  • the major axis Db is the major axis in the surface direction of the outline of the aperture 210 that appears on the cut surface obtained by cutting the aperture 210 on the major axis of the aperture (that is, on the aperture diameter Da) and in the thickness direction.
  • a plurality of apertures 210 that are isotropic in the plane direction and have substantially the same size (including the same) are arranged in a honeycomb shape in units of regular hexagons or shapes close thereto, and adjacent to each other.
  • the center-to-center distance P1 between adjacent openings is regarded as the major axis Db.
  • the range of the major axis Db is confirmed by measuring a total distance of 10 or more in three directions in which the center-to-center distance P1 is shifted by approximately 60 degrees (including 60 degrees).
  • confirmation is made according to the regularity of the arrangement of the apertures 210 according to the above.
  • the depth Dc of the opening 210 is preferably in the range of 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, more preferably in the range of 20 ⁇ m to 80 ⁇ m, and still more preferably in the range of 30 ⁇ m to 60 ⁇ m.
  • 10 ⁇ m or more more preferably 20 ⁇ m or more, more preferably 30 ⁇ m or more
  • a space where proliferative cells proliferate is secured, and a space where a plurality of types of co-cultured cells coexist is secured.
  • the thickness is 100 ⁇ m or less (more preferably 80 ⁇ m or less, still more preferably 60 ⁇ m or less)
  • a micro-order network structure can be formed.
  • the depth Dc is a distance from the opening surface 206 to the deepest part of the opening 210 in each opening 210.
  • the porous film 200 in which the plurality of apertures 210 are arranged in a honeycomb shape having a regular hexagonal shape or a shape close thereto as a unit the apertures appearing on the cut surface cut in the thickness direction on the line connecting the centers of the apertures In the outline of 210, the distance from the opening surface 206 to the deepest part of the opening 210 is defined as a depth Dc.
  • the range of the depth Dc is confirmed by forming three cut surfaces in which the angle of the cutting line is shifted by approximately 60 degrees (including 60 degrees) and measuring a total of 10 or more.
  • the pore diameter Dd of the communication hole 212 is preferably in the range of 50% to 500% with respect to the long diameter of the cells seeded on the porous film 200.
  • the hole diameter Dd of the communication hole 212 is 50% or more with respect to the long diameter of the cells to be seeded, the cells can move between the adjacent openings 210.
  • the hole diameter Dd of the communication hole 212 is more preferably 80% or more, and still more preferably 120% or more with respect to the long diameter of the cells to be seeded.
  • the hole diameter Dd of the communication hole 212 is 500% or less with respect to the long diameter of the seeded cell, the number of cells engrafted in the communication hole 212 becomes appropriate.
  • the hole diameter Dd of the communication hole 212 is more preferably 400% or less, and still more preferably 300% or less, with respect to the long diameter of the cells to be seeded.
  • the hole diameter Dd of the communication hole 212 is preferably in the range of 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, more preferably in the range of 8 ⁇ m to 45 ⁇ m, and still more preferably in the range of 12 ⁇ m to 40 ⁇ m.
  • the hole diameter Dd is the major axis in the thickness direction in the outline of the communication hole 212 that appears on the cut surface cut in the thickness direction on the line connecting the centers of the openings.
  • the range of the hole diameter Dd is about 60 degrees (including 60 degrees) of the angle of the cutting line.
  • the variation coefficient of the hole diameter Dd of the communication hole 212 is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, and the smaller the value.
  • the communication holes 212 are preferably provided at substantially the same (including the same) depth over the entire surface direction. Thereby, the homogeneity of the tissue formed by the cells in the porous film 200 is ensured.
  • the substantially same standard is that the variation coefficient of the distance from the opening surface 206 to the deepest part of the communication hole 212 is 10% or less in the cut surface for measuring the hole diameter Dd.
  • the width W of the flat portion 208 is preferably narrower than the major axis of the cell. Thereby, the ratio of the cells cultured on the flat portion 208 is reduced, and the ratio of the cells cultured inside the opening 210 and the communication hole 212 is increased.
  • the width W is the length of the flat portion 208 measured between the centers of the openings.
  • the material of the porous film 200 is selected from the viewpoint of cell adhesiveness, the affinity with the transplanted site in the living body, the difficulty of decomposition or absorption in the living body, and the like.
  • a hydrophobic polymer that is soluble in a hydrophobic organic solvent is preferable from the viewpoint of manufacturing the porous film 200 by a manufacturing method described later.
  • the hydrophobic organic solvent is a liquid having a solubility in water of 25 ° C. of 10 (g / 100 g water) or less.
  • Hydrophobic polymers include polystyrene, polyacrylate, polymethacrylate, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinylidene fluoride, polyhexafluoropropene, polyvinyl ether, polyvinyl carbazole, polyvinyl acetate, polytetra Fluoroethylene etc.), polyester (eg polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, polyethylene succinate, polybutylene succinate, polylactic acid, poly-3-hydroxybutyrate etc.), polylactone (eg polycaprolactone etc.), polyamide or polyimide (Eg, nylon, polyamic acid, etc.), polyurethane, polyurea, polybutadiene, polycarbonate, polyaromatics, polysulfur Emissions, polyethersulfone, polysiloxane derivatives, cellulose acylate (e.g., triacetyl cellulose, cellulose
  • These polymers may be homopolymers, copolymers, polymer blends or polymer alloys as necessary from the viewpoints of solubility in solvents, optical physical properties, electrical physical properties, film strength, elasticity, and the like. These polymers may be used alone or in combination of two or more. From the viewpoint of bioabsorbability, polylactic acid, polycaprolactone, poly-3-hydroxybutyrate and the like are preferable.
  • the material of the support 202 may be the same as or different from the porous layer 204.
  • Examples of the material of the support 202 include synthetic resin, glass, and metal.
  • the material of the support 202 is preferably a material different from the porous layer 204.
  • the porous film 200 is manufactured, for example, by a manufacturing method that sequentially performs the following steps (a) to (e).
  • FIG. 2 is a schematic view showing a cross section of the porous film 200 in the steps (a) to (e).
  • Step (a) A coating solution in which a hydrophobic polymer constituting the porous layer 204 is dissolved in a solvent is prepared, and the coating solution is applied onto the support 202 to form a coating film 204 a on the support 202.
  • the coating solution is prepared by mixing a hydrophobic polymer, a solvent, and an amphiphilic compound.
  • the solvent is preferably a mixed solvent of a hydrophobic polymer good solvent and a hydrophobic liquid, or a hydrophobic organic solvent that is a good solvent for the hydrophobic polymer. Examples of the latter include halogen solvents such as trichloromethane, dichloromethane, chloroform, etc. Hydrophobic compounds such as n-hexane, cyclohexane, n-pentane, n-octane and n-heptane which are hydrophobic liquids. May be used in combination.
  • An amphiphilic compound is a compound having both a hydrophilic group and a hydrophobic group.
  • water droplets are easily formed on the surface of the coating film.
  • the growth of water droplets can be more easily controlled by controlling the dispersion state of the hydrophobic polymer in the solvent with an amphiphilic compound.
  • the amphiphilic compound include many commercially available surfactants, oligomers such as dimers and trimers, and polymer compounds such as polymers.
  • amphiphilic compound examples include a compound having a polyacryl skeleton as a main chain, a long-chain aliphatic group (for example, dodecyl group) as a lipophilic side chain, and a carboxyl group as a hydrophilic side chain; polyethylene glycol / Polypropylene glycol block copolymer; phospholipid; and the like.
  • concentration of the hydrophobic polymer is preferably 0.1% by mass to 10% by mass
  • concentration of the amphiphilic compound is preferably 0.01% by mass to 1% by mass.
  • Step (b) Humidified air is made to flow over the entire surface of the coating film 204a, and water droplets 210S are formed on the coating film 204a by the dew condensation phenomenon.
  • Control at least one of Formula (1): 3 ° C. ⁇ ⁇ T ⁇ 30 ° C.
  • Water droplets 210S are grown by continuing the supply of humidified air. Each of the water droplets 210S grows to have substantially the same size (including the same). As the solvent contained in the coating film 204a evaporates, the water droplets 210S are arranged in a honeycomb shape by the lateral capillary force and enter the coating film 204a. In parallel with this, as the solvent contained in the coating film 204a evaporates, the hydrophobic polymer precipitates around the water droplets 210S.
  • Step (d) The supply of humidified air is continued, and the water droplets 210S are grown until the water droplets 210S come into close contact with each other across the amphiphilic compound film 220 in the coating film 204a.
  • Step (e) In parallel with the evaporation of the solvent or after the evaporation of the solvent, the water droplets 210S are evaporated, leaving the portions where the water droplets 210S enter the coating film 204a as the apertures 210, and in parallel, separating the water droplets 210S that are in close contact with each other.
  • the amphiphilic compound film 220 is broken.
  • a porous layer 204 is formed in which a plurality of apertures 210 are arranged in a honeycomb shape and connected inside.
  • FIG. 3 is a photograph of an example of a porous film manufactured through steps (a) to (e) taken from the opening surface side using a scanning electron microscope.
  • the opening diameter Da, the long diameter Db and the depth Dc of the opening 210 and the hole diameter Dd of the communication hole 212 can be controlled by adjusting the size of the water droplet 210S.
  • the size of the water droplet 210S can be adjusted by adjusting the film thickness of the coating film 204a, the amount of water vapor contained in the humidified air, and the timing of evaporating the water droplet 210S.
  • the above manufacturing method it is possible to manufacture a porous film in which a plurality of apertures are arranged in a honeycomb shape with high uniformity without using a mold or a mask. Details of the above manufacturing method are described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 2007-291367, 2009-256624, 2011-74140, and 2011-202100.
  • the porous film 200 can be manufactured by etching, sandblasting, press molding, or the like.
  • the manufacturing method of the cell tissue of this embodiment is a manufacturing method which manufactures a cell tissue in-vitro, and includes the culture
  • the openings and communication holes of the porous film are collectively referred to as “holes”.
  • a cell tissue having a micro-order network structure is formed.
  • a cellular tissue having a micro-order network structure is useful as a material for transplantation into a living body, and as a cellular tissue for a test that replaces an animal experiment or a clinical test.
  • the cellular tissue may be used together with the porous film, or may be used by removing the flat portion around the opening of the porous film and removing it from the pores of the porous film. It is also possible to use a plurality of stacked cell tissues.
  • the culture process of the present embodiment includes the following embodiments (1) to (4).
  • Embodiment (1) A culture step of culturing cells having feeder ability alone.
  • the number of cells having feeder ability may be one, or two or more.
  • a cell tissue having a network structure of feeder cells is provided.
  • the cell tissue produced according to the embodiment (1) is used as, for example, a scaffold for cell culture outside the living body or a scaffold that is transplanted in vivo and regenerates the tissue at the transplantation site.
  • Examples of cells having feeder ability include mesenchymal stem cells and fibroblasts.
  • Mesenchymal stem cells are somatic stem cells that can differentiate into muscle cells, adipocytes, chondrocytes, and the like, and are also known to have feeder ability.
  • a differentiation-inducing factor for mesenchymal stem cells can be added to the medium to differentiate the mesenchymal stem cells into somatic cells (eg, muscle cells, adipocytes, chondrocytes).
  • somatic cells eg, muscle cells, adipocytes, chondrocytes.
  • muscle tissue, adipose tissue, or cartilage tissue having a micro-order network structure is provided.
  • Embodiment (2) A culture step of co-culturing cells having feeder ability and at least one of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells.
  • a cellular tissue having a network structure of vascular endothelial cells or lymphatic endothelial cells is provided.
  • the cell tissue produced by the embodiment (2) is used as, for example, a scaffold for culturing somatic cells in vitro or a scaffold for transplanting in vivo and regenerating the tissue at the transplant site.
  • vascular endothelial cells examples include vascular endothelial cells derived from umbilical veins, umbilical arteries, aorta, coronary arteries, pulmonary arteries, pulmonary microvasculature and skin microvasculature, and vascular endothelial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • lymphatic endothelial cells examples include lymphatic endothelial cells derived from skin microlymphatic vessels, pulmonary microlymphatic vessels, etc., and lymphatic endothelial cells derived from pluripotent stem cells.
  • Embodiment (3) A culturing step of co-culturing cells having feeder ability and cells forming a parenchymal organ.
  • a cellular tissue having a micro-order network structure is provided.
  • the cell tissue produced according to the embodiment (3) is transplanted into a living body and used to supplement the function of the tissue or organ, for example.
  • the cell tissue produced according to the embodiment (3) is used as a test cell tissue to replace animal experiments and clinical tests.
  • parenchymal organs examples include liver, pancreas, kidney, spleen, heart, lung, mammary tissue, adipose tissue, ovary, testis, thymus, and so on. Parenchymal cells, epithelial cells, glandular cells, adipocytes, stem cells or progenitor cells of these cells. One type of cells forming a parenchymal organ may be used, or two or more types may be used.
  • Examples of combinations of two or more cells that form a parenchymal organ include hepatocytes and bile duct epithelial cells; pancreatic ⁇ cells, pancreatic ⁇ cells, and pancreatic ⁇ cells; type I alveolar epithelial cells and type II alveolar epithelial cells; Mammary acinar cells and ductal epithelial cells; and the like.
  • pluripotent stem cells examples include pluripotent stem cells.
  • a pluripotent stem cell is an undifferentiated cell having “self-replicating ability” that can proliferate while maintaining an undifferentiated state and “multipotent ability” that can differentiate into all three germ layers.
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells (embryonic stem cells; ES cells), induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells; iPS cells), embryonic germ cells (embryonic germm cells; EG cells), embryos Sex cancer cells (embryonal carcinoma cells; EC cells), pluripotent adult progenitor cells (multipotent progenitor cells; MAP cells), adult pluripotent stem cells (adult pluripotent stem cells; APS cells), Muse cells (multi-lineage differentiating stress enduring cell); and the like.
  • a differentiation inducing factor that induces differentiation into a desired somatic cell is added to the medium to differentiate the pluripotent stem cells into somatic cells.
  • Embodiment (4) A culturing step in which cells having feeder ability, at least one of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells, and cells forming a parenchymal organ are co-cultured.
  • a cell tissue provided with a network structure of vascular endothelial cells or lymphatic endothelial cells is provided on the surface or inside of the cell tissue of the parenchymal organ.
  • the cell tissue produced according to the embodiment (4) is transplanted in a living body and used to supplement the function of the tissue or organ, for example.
  • the cell tissue produced by the embodiment (4) is used as a test cell tissue to replace animal experiments and clinical tests.
  • the culturing step of the embodiment (4) may be a culturing step in which three types of cells are seeded at the same time and the three types of cells are co-cultured at the same time. May be a step of co-culturing in a stepwise manner. As the latter, for example, cells having feeder ability and at least one of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells are seeded at the same time and cultured for several days to form a network structure of vascular endothelial cells or lymphatic endothelial cells. After that, cells that form a parenchymal organ are seeded and culture is continued.
  • the culturing step is performed, for example, by placing a porous film on a culture vessel with the surface on the side where a plurality of apertures are opened, inoculating a cell suspension on the porous film, and culturing conditions according to the seeded cell type To do.
  • the culture container on which the porous film is placed include all culture containers known for cell culture.
  • the material for the culture vessel include resins (for example, polystyrene, polycarbonate, polyester, acrylonitrile-butadiene-styrene resin), glass, ceramics, metals, and the like.
  • Examples of the shape of the culture container include a multiwell plate, a petri dish, a microarray plate, a tube, a flask, a roller bottle, and a bag.
  • cells are seeded on the surface of the porous film where a plurality of apertures are opened, and then centrifugal force is applied in the direction from the surface on which the cells are seeded to the opposite surface. It is preferable to include a centrifugation process step of moving the inside of the plurality of apertures. Since the cells seeded on the porous film move into the pores of the porous film by the centrifugation process, the proportion of cells cultured in the pores increases.
  • the centrifugal treatment step may be performed by seeding a cell suspension in which cells are suspended in a relatively small amount of medium. preferable. And a culture medium is added in a culture container after a centrifugation process.
  • the medium used in this embodiment is selected from known media used for culturing mammalian cells according to the cell type to be cultured. Specific examples of the medium include DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM: F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), EMEM (Eagle's minimal essential medium), and MEM ⁇ (Minimum Essential Medium Alpha). , BME (Basal Medium Eagle) and other basic media added with a cell growth factor and optimized according to the cell type. Such a medium is commercially available.
  • the medium used in the present embodiment may be a medium in which a plurality of types of media are mixed depending on the cell type to be co-cultured.
  • the pH of the medium is, for example, pH 7.0 to 8.0, preferably pH 7.3 to 7.4.
  • the medium contains various commonly added components such as FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2), TGF- ⁇ (Transforming Growth Factor- ⁇ ), EGF (Epidermal Growth Factor), VEGF (Vascular Endothelial Growth Cell growth factors such as Factor); vitamins or vitamin derivatives such as ascorbic acid and retinoic acid; sugar sources such as glucose; amino acids; inorganic salts such as sodium selenite and sodium chloride; proteins such as transferrin; hormones such as insulin; Differentiation-inhibiting factors; differentiation-inducing factors; antioxidants such as 2-mercaptoethanol and dithiothreitol; antibiotics such as penicillin and streptomycin;
  • the above ingredients may be supplemented to the medium during cell culture in order to keep the concentration in the desired range throughout the culture period. It is preferable that the medium does not contain serum and serum substitutes from the viewpoint of suppressing antigenic substances and infection sources from being mixed into the cell tissue.
  • the medium used for a series of culture steps may not have the same composition.
  • the culture may be continued while replacing with a medium having a different composition depending on the cell type to be co-cultured.
  • the mixing ratio of the first cell and the second cell is preferably in the above range.
  • the seeding density of the cells on the porous film is, for example, 1 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 , preferably 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 . is there.
  • the total seeding density is preferably within the above range.
  • General conditions may be applied to the culture conditions in the present embodiment.
  • culture in an incubator with a temperature of 37 ° C. and a concentration of 5% (v / v) CO 2 is applied.
  • the culture period is not particularly limited, and it is preferable to culture for a period during which the cell network structure is sufficiently developed.
  • PET means polyethylene terephthalate
  • PMMA means polymethylmethacrylate
  • PDMS means polydimethylsiloxane
  • SEM means a scanning electron microscope (Scanning Electron Microscope)
  • FBS means fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum).
  • the opening and the communication hole of the porous film are collectively referred to as “hole”.
  • a coating solution was prepared by mixing 5 parts by mass of polylactic acid, 94.5 parts by mass of trichloromethane, and 0.5 parts by mass of a polyacrylamide-based amphiphilic polymer as an amphiphilic compound.
  • the coating solution was applied on a PET film (film thickness: 188 ⁇ m) to form a coating film on the PET film.
  • Humidified air was flowed over the entire surface of the coating film, and water droplets were formed on the coating film due to the condensation phenomenon. While the supply of humidified air was continued to grow the water droplets, the water droplets entered the coating film.
  • FIG. 4 shows an example of a porous film, a ring, and a culture device.
  • the porous film with a ring was placed on a tissue culture dish with the PET film layer side of the porous film facing down to obtain a culture device.
  • the culture device was irradiated with ultraviolet rays for 2 hours.
  • Table 1 shows the dimensions of the structure of the porous film included in each culture device.
  • FIG. 5A is a SEM image of the cross section and surface of the porous film provided in the PLA 10
  • FIG. 5B is a SEM image of the cross section and surface of the porous film provided in the PLA 40.
  • the openings of adjacent openings were separated by a flat portion, and adjacent openings were partly connected to each other and communicated.
  • the openings arranged in the porous layer made of polylactic acid did not penetrate the porous layer.
  • a device As a control culture device, a device (referred to as “Flat”) having a laminate in which a flat polylactic acid layer having no pores is laminated on a PET film, instead of a porous film, and a tissue culture dish (Tissue)
  • a device (referred to as “TCP”) having a ring attached to the culture surface of culture ⁇ polystyrene: TCPS, diameter 35 mm, trade name: Falcon Cell Culture Dish 353001, manufactured by Corning) was prepared.
  • the bottom surface in the ring is a culture surface for culturing cells, and the area of the bottom surface surrounded by the ring is 2 cm 2 .
  • -Mesenchymal stem cells human adult bone marrow-derived normal cells, purchased from Lonza Japan.
  • MSC normal human skin-derived NHSF46, RIKEN BioResource Center (3-1-1 Takanodai, Tsukuba, Ibaraki, Japan).
  • -Vascular endothelial cells Normal cells derived from human neonatal umbilical vein, purchased from Lonza Japan.
  • HUVEC human neonatal umbilical vein
  • MSC medium human mesenchymal stem cell medium kit MSCGM BulletKit, Lonza Japan, NHSF46 medium: MEM ⁇ + 10% FBS ⁇ HUVEC medium: Human endothelial cell medium kit EGM-2 BulletKit, Lonza Japan ⁇ HepG2 medium: DMEM + 10% FBS
  • ⁇ Culture experiment 1 Mesenchymal stem cell single culture> MSC was cultured alone under the following culture conditions using TCP, Flat, PLA3, PLA10, PLA30 as culture devices.
  • ⁇ Seeding density 1 ⁇ 10 5 cells / disk (5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 )
  • Centrifugal treatment after sowing Centrifugal treatment with a rotation radius of 120 mm, a rotation speed of 1100 rpm, and a rotation time of 3 minutes was performed on the culture device provided with the porous film.
  • Bone differentiation induction medium hMSC differentiation BulletKit-osteogenic (Product number: PT-3002, Lonza Japan)
  • hMSC differentiation BulletKit-adipogenic Product number: PT-3004, Lonza Japan
  • Culture volume 1.0ml / disk Incubator: 37 ° C., 5% CO 2
  • the culture was started using MSC medium, and on the first day of culture, the bone differentiation induction medium and the fat differentiation induction medium were replaced with a 1: 1 differentiation induction medium, and then the differentiation induction medium was replaced every three days. Incubated for a total of 15 days.
  • the expression of Runx2 and Osx, which are differentiation markers for bone cells, and C / EBP ⁇ and PPAR ⁇ , which are differentiation markers for adipocytes were analyzed by real-time PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • fluorescent immunostaining of actin was performed on the 14th day of differentiation induction.
  • FIG. 6 shows a fluorescent immunostaining image of actin on the 14th day of differentiation induction.
  • ⁇ Culture experiment 2 co-culture of mesenchymal stem cells and vascular endothelial cells> Using TCP and PLA40 as a culture device, HUVEC was cultured alone or MSC and HUVEC were co-cultured under the following culture conditions.
  • Centrifugal treatment after sowing Centrifugal treatment was performed on half of the culture devices equipped with the porous film at a rotation radius of 120 mm, a rotation number of 1100 rpm, and a rotation time of 3 minutes.
  • Culture volume 1.0ml / disk Incubator: 37 ° C., 5% CO 2 -Culture period: 7 days of culture. The medium was changed every two days.
  • 7A to 7D and Table 2 show confocal laser microscope images and network analysis results.
  • “Mono-” means single culture
  • “Co-” means co-culture.
  • images with “cfg” are examples of cultures that have been subjected to centrifugation
  • images without “cfg” are examples of cultures that have not been subjected to centrifugation.
  • FIG. 7A Fluorescent immunostaining image of CD31 on day 3 of culture (low magnification).
  • FIG. 7B Fluorescent immunostaining image (high magnification) of CD31 on the third day of culture.
  • FIG. 7C Fluorescent immunostaining image of CD31 on day 7 of culture (high magnification).
  • FIG. 7D Table 2: Total length and total area of the network in co-culture.
  • HUVEC is a cell that forms the intima of the blood vessel.
  • formation of a capillary network-like network is difficult with HUVEC alone, but a capillary network-like network was formed by co-culture of MSC and HUVEC. It is thought that cells that support endothelial cells are necessary for endothelial cells to form a luminal structure, and MSCs can secrete cytokines that act on endothelial cells and can differentiate into mural cells. It was suggested that MSC effectively acts on the formation of a capillary network-like network of HUVEC.
  • -Formation of a capillary network-like network progressed with time, and a more developed network was formed on the 7th day of culture than on the 3rd day of culture.
  • PLA40 many cells were present in the pores of the porous film.
  • PLA 40 a developed capillary network-like network was formed as compared with TCP.
  • a capillary network-like network has been developed longer than the PLA 40 not subjected to the centrifugal treatment. It was suggested that the ratio of the cells that migrate into the pores of the porous film is increased by performing the centrifugal treatment.
  • the cell density tended to be high around the ring of the culture device, but in the culture after the centrifugal treatment, a relatively uniform network formation was observed on the entire culture surface. It was. Since the seeded cells migrated into the pores of the porous film by centrifugation, it was suggested that the cells were suppressed from migrating around the ring.
  • ⁇ Culture experiment 3 Mesenchymal stem cells or fibroblasts and vascular endothelial cells co-culture> Using TCP, Flat, and PLA40 as culture devices, MSC and HUVEC were co-cultured or NHSF46 and HUVEC were co-cultured under the following culture conditions.
  • MSC and HUVEC were mixed and seeded.
  • MSC seeding density 0.5 ⁇ 10 5 cells / disk
  • HUVEC seeding density 1 ⁇ 10 5 cells / disk total seeding density 1.5 ⁇ 10 5 cells / disk (7.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 ) .
  • -Co-culture of NHSF46 and HUVEC NHSF46 and HUVEC were mixed and then seeded.
  • Centrifugal treatment after sowing Centrifugal treatment with a rotation radius of 120 mm, a rotation speed of 1100 rpm, and a rotation time of 3 minutes was performed on the culture device provided with the porous film.
  • Incubator 37 ° C., 5% CO 2 -Culture period: 7 days of culture. The medium was changed every day.
  • Fluorescent immunostaining of CD31 was performed on the 3rd and 7th days of culture and observed using a confocal laser microscope.
  • 8A to 8D and Table 3 show microscopic images and network analysis results.
  • FIG. 8A Fluorescent immunostaining image (high magnification) of CD31 on the third day of culture.
  • FIG. 8B Image of fluorescent immunostaining of CD31 on day 7 of culture (high magnification).
  • FIG. 8C Table 3: Total length and total area of network on day 3 of culture.
  • FIG. 8D Table 3: Total length and total area of network on day 7 of culture.
  • ⁇ Culture experiment 4 Examination of dimensions of porous film> MSC and HUVEC were co-cultured under the following culture conditions using TCP, Flat, PLA3, PLA10, PLA20, PLA40 as culture devices.
  • -Seeding Seed after mixing MSC and HUVEC.
  • -Seeding density MSC 0.5 ⁇ 10 5 cells / disk, HUVEC 1 ⁇ 10 5 cells / disk, total 1.5 ⁇ 10 5 cells / disk (7.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 ).
  • Centrifugal treatment after sowing Centrifugal treatment with a rotation radius of 120 mm, a rotation speed of 1100 rpm, and a rotation time of 3 minutes was performed on the culture device provided with the porous film.
  • ⁇ Culture volume 1.0ml / disk Incubator: 37 ° C., 5% CO 2 -Culture period: 7 days of culture. The medium was changed every two days.
  • Fluorescent immunostaining of CD31 was performed on the 3rd and 7th days of culture and observed using a confocal laser microscope.
  • 9A to 9E and Table 4 show microscopic images and network analysis results.
  • FIG. 9A Fluorescent immunostaining image (low magnification) of CD31 on the third day of culture.
  • FIG. 9B Fluorescence immunostaining image of CD31 on day 3 of culture (high magnification).
  • FIG. 9C Fluorescent immunostaining image of CD31 on day 7 of culture (low magnification).
  • FIG. 9D Fluorescent immunostaining image (high magnification) of CD31 on day 7 of culture.
  • FIG. 9E, Table 4 Total length and total area of the network.
  • ⁇ Culture experiment 5 Simultaneous co-culture of three types of cells> Using TCP and PLA40 as the culture device, MSC, HUVEC and HepG2 were co-cultured under the following culture conditions.
  • MSC MSC, HUVEC and HepG2 were mixed and then seeded. HepG2 was previously labeled with the fluorescent dye CellTracker Red.
  • -Seeding density MSC 0.5 ⁇ 10 5 cells / disk, HUVEC 1 ⁇ 10 5 cells / disk, HepG2 5 ⁇ 10 5 cells / disk.
  • -Medium Mixed medium of MSC medium, HUVEC medium and HepG2 medium
  • MSC medium: HUVEC medium: HepG2 medium volume ratio 1: 2: 3.
  • Centrifugal treatment after sowing Centrifugal treatment with a rotation radius of 120 mm, a rotation speed of 1100 rpm, and a rotation time of 3 minutes was performed on the culture device provided with the porous film.
  • ⁇ Culture volume 1.0ml / disk Incubator: 37 ° C., 5% CO 2 -Culture period: 3 days of culture. The medium was changed every day.
  • FIG. 10A Fluorescence image on the third day of culture (superimposed image of green fluorescence and red fluorescence).
  • FIG. 10B Fluorescent immunostaining image of CD31 on the third day of culture.
  • ⁇ Culture experiment 6 Staged co-culture of three types of cells> Using TCP and PLA40 as the culture device, MSC, HUVEC and HepG2 were co-cultured under the following culture conditions.
  • MSC and HUVEC were mixed and then seeded, cultured for 3 days, and then seeded with HepG2.
  • HepG2 was previously labeled with the fluorescent dye CellTracker Red.
  • -Seeding density MSC 0.5 ⁇ 10 5 cells / disk, HUVEC 1 ⁇ 10 5 cells / disk, HepG2 5 ⁇ 10 5 cells / disk.
  • Centrifugal treatment after sowing Centrifugal treatment with a rotation radius of 120 mm, a rotation speed of 1100 rpm, and a rotation time of 3 minutes was performed on the culture device provided with the porous film.
  • ⁇ Culture volume 1.0ml / disk Incubator: 37 ° C., 5% CO 2 -Culturing period: Two-type co-culture was performed for 3 days, and three-type co-culture was performed for 3 days.
  • -Medium For 3 days from the start of culture, the medium was cultured in a mixed medium of MSC medium and HUVEC medium (volume ratio 1: 2), and the medium was changed on the first day. After inoculating HepG2, the medium was changed to a mixed medium of MSC medium, HUVEC medium, and HepG2 medium (volume ratio 1: 2: 3), and cultured while changing the medium every day.
  • Fluorescence immunostaining of CD31 was performed on the third day after the seeding of HepG2, and the network formed by the cells was analyzed from the fluorescence image of CD31 and the fluorescence image of HepG2.
  • 11A to 11B show microscopic images.
  • FIG. 11C and Table 5 show the total length and total area of the network obtained by analyzing the fluorescent image of CD31.
  • FIG. 11A Fluorescence image on day 3 of culture after seeding HepG2 (superimposed image of green fluorescence and red fluorescence).
  • FIG. 11B Fluorescent immunostaining image of CD31 on the third day of culture after seeding with HepG2.
  • FIG. 11C Table 5: Total length and total area of each of the co-culture (culture experiment 5) and stepwise co-culture (culture experiment 6) on day 3 of the three types of co-culture.

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Abstract

表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、フィーダー能を有する細胞を培養する培養工程を含む、細胞組織の製造方法、及び、表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルム。

Description

細胞組織の製造方法、及び多孔フィルム
　本開示は、細胞組織の製造方法、及び細胞組織の製造に供する多孔フィルムに関する。
　生体内へ細胞又は細胞組織を移植することを目的に使用される、細胞を濃縮するフィルタ、細胞を増殖させるための足場材、細胞を生着させて生体内へと移植するための移植材が知られている。
　例えば特開２０１２－００６０１０号公報には、目的とする細胞を大きさで分離する複合多孔膜が開示されている。例えば国際公開第２００６／０９３２０７号には、細胞培養面に孔がハニカム配列した培養基材が開示されている。例えば特開２００５－１１０７０９号公報には、骨髄間葉系幹細胞を生着させ骨芽細胞に分化誘導後に骨欠損部に移植する骨補填材として、貫通孔と連通孔とが組み合わされてなる骨補填材が開示されている。例えば特開２００４－２１６１１９号公報には、細胞が生着して増殖するための足場材として、厚さ方向に長い形状の孔が面方向に並列的に配置され各孔間が小孔で連通した構造を有する多孔性支持体が開示されている。例えば特開２００８－１９９９６２号公報には、三次元網目構造を有する多孔質フィルム表面に、複数個の細胞接着性領域と、細胞接着性領域を取り囲む細胞非接着性領域とが配置されたスフェロイド形成用基材が開示されている。例えば特開２００１－５２３４８３号公報には、骨形成原細胞が生着して増殖するための足場材として、相互に連結した孔を含んでなる多孔性ポリマースカフォードが開示されている。例えば特開２００８－３０７１８０号公報には、構造体内部に幹細胞を注入し生体内に移植する移植材として、縦横格子状に配置した支柱を積層してなるスカフォールドが開示されている。例えば特許第４４３７２２７号公報には、非水溶性ポリマーからなる筒状多孔質体と、筒状多孔質体の内面を被覆する血管内皮細胞と、筒状多孔質体の外面を被覆する血管平滑筋細胞とを含む人工血管が開示されている。
　現在、皮膚、軟骨といった、構造が比較的単純な細胞組織が人工的に作られ、移植医療の現場で使われている。一方で、多様な細胞が複雑な構造を形成している臓器、例えば肝臓、膵臓などを代替する人工的な細胞組織の実用化が待ち望まれているが、そのためには、臓器特異的な細胞が機能的に配置し且つ血管網とリンパ管網とを備えた細胞組織を製造する必要がある。また、動物実験や臨床試験に替わる試験用細胞組織としても、生体内の臓器に似た構造を有する細胞組織が待たれている。
　本開示は、上記状況のもとになされた。
　本開示は、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織を製造する製造方法、及び、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造に供する多孔フィルムを提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
［１］　表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、フィーダー能を有する細胞を培養する培養工程を含む、細胞組織の製造方法。
［２］　培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、［１］に記載の細胞組織の製造方法。
［３］　培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、実質臓器を形成する細胞とを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、［１］に記載の細胞組織の製造方法。
［４］　培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかと、実質臓器を形成する細胞とを、開孔及び連通孔の内部で共培養する培養工程である、［１］に記載の細胞組織の製造方法。
［５］　フィーダー能を有する細胞が、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の少なくともいずれかである、［１］～［４］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［６］　複数の開孔が、多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、［１］～［５］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［７］　連通孔が、多孔フィルムの面方向全域に亘って略同一の深さに設けられている、［１］～［６］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［８］　連通孔の孔径が、多孔フィルムに播種される細胞の長径に対して５０％～５００％の範囲である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［９］　連通孔の孔径が５μｍ～５０μｍの範囲である、［１］～［８］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１０］　連通孔の孔径の変動係数が３０％以下である、［１］～［９］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１１］　開孔の、多孔フィルムの面方向における長径が１０μｍ～１００μｍの範囲である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１２］　開孔の深さが１０μｍ～１００μの範囲である、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１３］　開孔の開口径が５μｍ～９０μｍの範囲である、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１４］　開孔の開口径の変動係数が２０％以下である、［１］～［１３］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１５］　培養工程の前に、多孔フィルムの複数の開孔が開口した側の面に細胞を播種した後、細胞を播種した側の面から反対面に向かう方向に遠心力をかけ細胞を複数の開孔の内部に移動させる遠心処理工程を含む、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の細胞組織の製造方法。
［１６］　表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、開孔の、多孔フィルムの面方向における長径が２０μｍ～１００μｍの範囲である、多孔フィルム。
［１７］　表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、開孔の深さが２０μｍ～１００μｍの範囲である、多孔フィルム。
［１８］　開孔の開口径が５μｍ～９０μｍの範囲である、［１６］又は［１７］に記載の多孔フィルム。
［１９］　連通孔の孔径が５μｍ～５０μｍの範囲である、［１６］～［１８］のいずれか１つに記載の多孔フィルム。
［２０］　複数の開孔が、多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、［１６］～［１９］のいずれか１つに記載の多孔フィルム。
　本開示によれば、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織を製造する製造方法、及び、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織の製造に供する多孔フィルムが提供される。
多孔フィルムの構造を示す斜視図である。 図１Ａにおける開口面側から見た平面図である。 図１Ｂにおけるｃ－ｃ線に沿った断面図である。 図１Ｂにおけるｄ－ｄ線に沿った断面図である。 多孔フィルムの製造方法の一例を示す模式図である。 多孔フィルムの走査型電子顕微鏡像である。 培養デバイスの部品及び培養デバイスの一例である。 多孔フィルムの断面及び表面の走査型電子顕微鏡像である。 多孔フィルムの断面及び表面の走査型電子顕微鏡像である。 間葉系幹細胞から分化誘導した細胞におけるアクチンの蛍光免疫染色像である。 血管内皮細胞を単独培養した又は間葉系幹細胞と血管内皮細胞を共培養した培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）である。 同じく培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）である。 同じく培養７日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）である。 間葉系幹細胞と血管内皮細胞の共培養におけるネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。 間葉系幹細胞又は線維芽細胞と血管内皮細胞を共培養した培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像である。 同じく培養７日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像である。 培養３日目におけるネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。 培養７日目におけるネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。 開孔寸法の異なる多孔フィルムを用いて間葉系幹細胞と血管内皮細胞を共培養した培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）である。 同じく培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）である。 同じく培養７日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）である。 同じく培養７日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）である。 培養３日目及び７日目におけるネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。 ３種類の細胞を同時に共培養した培養３日目の蛍光像である。 同じく培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像である。 ３種類の細胞を段階的に共培養した共培養３日目の蛍光像である。 同じく共培養３日目の細胞におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像である。 共培養３日目における、同時共培養、段階的共培養それぞれのネットワークの全長及び総面積を示すグラフである。
　以下に、本開示の実施形態について説明する。これらの説明及び実施例は実施形態を例示するものであり、発明の範囲を制限するものではない。
　本開示において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
　本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
　本開示において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
　本開示においては、変動係数を百分率で示す。変動係数は、ある集団について標準偏差を平均で除した値であり、その集団のばらつきの度合いを示す指標である。
＜多孔フィルム＞
　本実施形態の細胞組織の製造方法は、生体外において細胞組織を製造する方法であり、表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、細胞を培養する培養工程を含む。まず、細胞組織の製造に供する多孔フィルムについて説明する。本実施形態の多孔フィルムは、細胞が生着し組織を形成するための足場として機能する。
　本実施形態の多孔フィルムは、表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する開孔どうしを連通する連通孔とを有する。多孔フィルムが備える開孔及び連通孔の壁面は、細胞が生着する足場となる。本実施形態の多孔フィルムに播種された細胞は、開孔及び連通孔の内部に生着し、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織を形成する。
　以下、多孔フィルムの一例を、図面を参照しつつ説明する。各図面において同一又は等価な構成要素及び部分には同一の参照符号を付与している。以下の説明において、「面方向」とは、多孔フィルムの主面方向を意味し、「厚さ方向」とは、多孔フィルムの厚さ方向を意味する。以下の説明において、「長径」とは、輪郭上の任意の２点間距離のうちの最大長を意味し、但し方向が特定されている場合は、その方向の任意の２点間距離のうちの最大長を意味する。以下の説明において、「開口の中心」とは、開口を面方向の２次元図形と捉えた場合の重心を意味する。
　図１Ａは、多孔フィルムの構造を示す斜視図であり、図１Ｂは、図１Ａにおける開口面側から見た平面図であり、図１Ｃは、図１Ｂにおけるｃ－ｃ線に沿った断面図であり、図１Ｄは、図１Ｂにおけるｄ－ｄ線に沿った断面図である。図１Ａ～図１Ｄには、本実施形態の一例である多孔フィルム２００を示す。
　多孔フィルム２００は、面方向に複数の開孔２１０が配置された多孔層２０４と、多孔層２０４を支持する支持体２０２とを備える積層体である。ほかの例として、多孔フィルム２００は、支持体２０２を備えず、多孔層２０４のみの単層体でもよい。
　多孔フィルム２００の多孔層２０４には、面方向全域に亘って開孔２１０が配置されている。ただし、多孔層２０４に細胞が接触し得ない領域が有る場合、該領域には開孔２１０が配置されていなくてもよい。
　多孔フィルム２００の開口面２０６は、複数の開孔２１０が開口した側の面であり、細胞を播種する側の面である。開口面２０６において、互いに隣接する開孔２１０の開口どうしは、開口部２１０ａの間に延在する平坦部２０８により離間されている。開口面２０６における開孔２１０の開口を通じ、開孔２１０及び連通孔２１２の内部に液体培地が供給される。
　各々の開孔２１０は、多孔層２０４を貫通していない有底孔である。ほかの例として、各々の開孔２１０は、多孔層２０４を貫通し、支持体２０２の表面を底面とする有底孔でもよい。多孔フィルム２００が多孔層２０４の単層体である例において、各々の開孔２１０は、多孔層２０４を貫通していない有底孔でもよく、多孔層２０４を貫通した貫通孔でもよい。
　開孔２１０各々の形状としては、例えば、球体の一部を切り取った球欠形状、バレル形状、円柱形状、又は角柱形状が挙げられる。開孔２１０各々の開口の形状としては、例えば、円形、楕円形、又は多角形が挙げられる。
　複数の開孔２１０は、規則的に配置されており、具体的には、ハニカム状に配置されている。ほかの例として、複数の開孔２１０は、格子状又は面心格子状に配置されていてもよい。複数の開孔２１０の配置をランダムとしてもよいが、面方向における開孔２１０の密度を均一にし、多孔フィルム２００において細胞が形成する組織の均質性を高める観点から、複数の開孔２１０は規則的に配置されていることが好ましい。規則的な配置は、途切れたりズレがあったりしてもよいが、あらゆる方向に隙間無く連続して繰り返していることが好ましい。ハニカム状の配置とは、平行六辺形（好ましくは正六角形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口の重心が位置する配置である。格子状の配置とは、平行四辺形（言うまでもないが、正方形、長方形、菱形が含まれる。好ましくは正方形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点に開口の重心が位置する配置である。面心格子状の配置とは、平行四辺形（言うまでもないが、正方形、長方形、菱形が含まれる。好ましくは正方形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口の重心が位置する配置である。規則的に配置されていることの目安は、配置の単位である平行六辺形又は平行四辺形の面積に関し、その変動係数が１０％以下である。
　多孔フィルム２００において、互いに隣接する開孔２１０どうしは、多孔層２０４の内部において、連通孔２１２により連通している。１個の開孔２１０は、隣接する全部の開孔２１０と連通していることが好ましい。複数の開孔２１０がハニカム状に配置されている多孔フィルム２００においては、１個の開孔２１０は、隣接する６個の開孔２１０と連通していることが好ましく、即ち、１個の開孔２１０は、６個の連通孔２１２を有することが好ましい。
　多孔フィルム２００において、互いに隣接する開孔２１０どうしは、それぞれの壁面の一部を連続させて配置されており、連通孔２１２は、開孔２１０間の連結部２１０ｂで囲まれる孔である。ほかの例として、隣接する開孔２１０どうしは独立しており、筒状の空隙である連通孔２１２が、隣接する開孔２１０どうしを繋いでいてもよい。
　以下、多孔フィルム２００の構造の寸法について説明する。
　複数の開孔２１０は、多孔フィルム２００に播種された細胞が入り込み生着できる大きさを有する。多孔フィルム２００に播種される細胞の長径は、例えば、１０μｍ～５０μｍである。
　開孔２１０の開口径Ｄａは、多孔フィルム２００に播種される細胞の長径に対して５０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、１２０％以上であることが更に好ましい。５０％以上（より好ましくは８０％以上、更に好ましくは１２０％以上）であることにより、多孔フィルム２００に播種された細胞が開孔２１０の内部に入り込むことが可能となる。具体的には、開孔２１０の開口径Ｄａは、５μｍ以上であることが好ましく、８μｍ以上であることがより好ましく、１２μｍ以上であることが更に好ましい。開孔２１０の開口径Ｄａは、開孔２１０の好ましい配置及び大きさとの関係により、９０μｍ以下であることが好ましく、７０μｍ以下であることがより好ましく、５０μｍ以下であることが更に好ましい。開口径Ｄａは、開孔２１０の開口の長径であり、開口径Ｄａの範囲は、任意に選択した１０個以上の開口の開口径を測定し確認する。
　開孔２１０の開口径Ｄａの変動係数は、２０％以下であることが好ましく、小さいほど好ましい。開口径Ｄａの変動係数が小さいほど、多孔フィルム２００において細胞が形成する組織の均質性が高まる。
　多孔フィルム２００の細胞培養領域において、開口面２０６の全面積に占める開孔２１０の開口の合計面積の割合は、２０％～９０％であることが好ましく、３０％～８０％であることがより好ましく、４０％～７０％であることが更に好ましい。
　開孔２１０の面方向における長径Ｄｂは、１０μｍ～１００μｍの範囲であることが好ましく、２０μｍ～８０μｍの範囲であることがより好ましく、３０μｍ～６０μｍの範囲であることが更に好ましい。１０μｍ以上（より好ましくは２０μｍ以上、更に好ましくは３０μｍ以上）であることにより、増殖性の細胞が増殖する空間が確保され、また、共培養する複数種の細胞が共存する空間が確保される。１００μｍ以下（より好ましくは８０μｍ以下、更に好ましくは６０μｍ以下）であることにより、マイクロオーダーのネットワーク構造の形成が可能となる。長径Ｄｂは、開孔２１０をその開口の長軸上（つまり開口径Ｄａ上）且つ厚さ方向に切断した切断面に現れる開孔２１０の輪郭の面方向の長径である。面方向に等方的な形状且つ略同一（同一を含む）の大きさの複数の開孔２１０が正六角形又はこれに近い形状を単位にしたハニカム状に配置されており、互いに隣接する開孔２１０どうしがそれぞれの壁面の一部を連続させて配置されている多孔フィルム２００においては、互いに隣接する開口の間の中心間距離Ｐ１を長径Ｄｂとみなす。この場合、長径Ｄｂの範囲は、中心間距離Ｐ１を、角度を略６０度（６０度を含む）ずつずらした３方向に合計１０個以上測定し確認する。上記配置以外の多孔フィルムについては、上記に準じ、開孔２１０の配置の規則性に応じて確認する。
　開孔２１０の深さＤｃは、１０μｍ～１００μｍの範囲であることが好ましく、２０μｍ～８０μｍの範囲であることがより好ましく、３０μｍ～６０μｍの範囲であることが更に好ましい。１０μｍ以上（より好ましくは２０μｍ以上、更に好ましくは３０μｍ以上）であることにより、増殖性の細胞が増殖する空間が確保され、また、共培養する複数種の細胞が共存する空間が確保される。１００μｍ以下（より好ましくは８０μｍ以下、更に好ましくは６０μｍ以下）であることにより、マイクロオーダーのネットワーク構造の形成が可能となる。深さＤｃは、各々の開孔２１０において開口面２０６から開孔２１０の最深部までの距離である。複数の開孔２１０が正六角形又はこれに近い形状を単位にしたハニカム状に配置されている多孔フィルム２００においては、開口の中心間を結ぶ線上で厚さ方向に切断した切断面に現れる開孔２１０の輪郭において、開口面２０６から開孔２１０の最深部までの距離を、深さＤｃとする。この場合、深さＤｃの範囲は、切断線の角度を略６０度（６０度を含む）ずつずらした３個の切断面を形成し、合計１０個以上測定し確認する。
　連通孔２１２の孔径Ｄｄは、多孔フィルム２００に播種される細胞の長径に対して５０％～５００％の範囲であることが好ましい。連通孔２１２の孔径Ｄｄが播種される細胞の長径に対して５０％以上であることにより、互いに隣接する開孔２１０間を細胞が移動することが可能となる。該観点から、連通孔２１２の孔径Ｄｄは、播種される細胞の長径に対して、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは１２０％以上である。一方、連通孔２１２の孔径Ｄｄが播種される細胞の長径に対して５００％以下であることにより、連通孔２１２に生着する細胞数が適切になる。該観点から、連通孔２１２の孔径Ｄｄは、播種される細胞の長径に対して、より好ましくは４００％以下、更に好ましくは３００％以下である。
　連通孔２１２の孔径Ｄｄは、上記の観点から、５μｍ～５０μｍの範囲であることが好ましく、８μｍ～４５μｍの範囲であることがより好ましく、１２μｍ～４０μｍの範囲であることが更に好ましい。孔径Ｄｄは、開口の中心間を結ぶ線上で厚さ方向に切断した切断面に現れる連通孔２１２の輪郭において、厚さ方向の長径である。複数の開孔２１０が正六角形又はこれに近い形状を単位にしたハニカム状に配置されている多孔フィルム２００においては、孔径Ｄｄの範囲は、切断線の角度を略６０度（６０度を含む）ずつずらした３個の切断面を形成し、合計１０個以上測定し確認する。上記配置以外の多孔フィルムについては、上記に準じ、開孔２１０の配置の規則性に応じた切断面を形成して確認する。
　連通孔２１２の孔径Ｄｄの変動係数は、３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、小さいほど好ましい。孔径Ｄｄの変動係数が小さいほど、多孔フィルム２００において細胞が形成する組織の均質性が高まる。
　連通孔２１２は、面方向全域に亘って略同一（同一を含む）の深さに設けられていることが好ましい。これにより、多孔フィルム２００において細胞が形成する組織の均質性が確保される。略同一の目安は、孔径Ｄｄを測定するための切断面において、開口面２０６から連通孔２１２の最深部までの距離の変動係数が１０％以下である。
　平坦部２０８の幅Ｗは、細胞の長径よりも狭いことが好ましい。これにより、平坦部２０８上で培養される細胞の割合を小さくし、開孔２１０及び連通孔２１２の内部で培養される細胞の割合を大きくする。幅Ｗは、開口の中心間において測定される、平坦部２０８の長さである。
　以下、多孔フィルム２００の素材について説明する。多孔フィルム２００の素材は、細胞の接着性の観点、生体内における移植部位との親和性の観点、生体内での分解又は吸収の難易の観点等から選択される。
　多孔層２０４の素材としては、後述する製造方法により多孔フィルム２００を製造する観点からは、疎水性の有機溶媒に溶解可能な疎水性ポリマーが好ましい。疎水性の有機溶媒は、２５℃の水に対する溶解度が１０（ｇ／１００ｇ水）以下の液体である。
　疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸、ポリ－３－ヒドロキシブチレート等）、ポリラクトン(例えば、ポリカプロラクトン等)、ポリアミド又はポリイミド（例えば、ナイロン、ポリアミド酸等）、ポリウレタン、ポリウレア、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、セルロースアシレート（例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート）などのポリマーが挙げられる。これらのポリマーは、溶剤への溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマー、コポリマー、ポリマーブレンド又はポリマーアロイとしてよい。これらのポリマーは、１種単独で又は２種以上を混合して使用してよい。生体吸収性の観点からは、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリ－３－ヒドロキシブチレート等が好ましい。
　支持体２０２の素材は、多孔層２０４と同一でもよく異なっていてもよい。支持体２０２の素材としては、合成樹脂、ガラス、金属などが挙げられる。細胞組織の製造に使用する際又は細胞組織を製造した後に多孔層２０４を支持体２０２から剥離する場合は、支持体２０２の素材は、多孔層２０４とは異なる素材であることが好ましい。
　多孔フィルム２００は、例えば、下記の工程（ａ）～工程（ｅ）を順次行う製造方法により製造される。図２は、工程（ａ）～工程（ｅ）にある多孔フィルム２００の断面を示した模式図である。
［工程（ａ）］
　多孔層２０４を構成する疎水性ポリマーを溶媒に溶解した塗布液を用意し、塗布液を支持体２０２の上に塗布して、支持体２０２上に塗膜２０４ａを形成する。
　塗布液は、疎水性ポリマーと、溶媒と、両親媒性化合物とを混合して調製する。溶媒としては、疎水性ポリマーの良溶媒と疎水性の液体との混合溶媒、又は、疎水性ポリマーの良溶媒である疎水性有機溶剤が好ましい。後者としては、トリクロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶剤が挙げられ、これら溶剤に疎水性の液体であるｎ－ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ－ペンタン、ｎ－オクタン、ｎ－ヘプタン等の炭化水素化合物を混合して用いてもよい。
　両親媒性化合物は、親水性基と疎水性基を両方有する化合物である。両親媒性化合物を塗布液に配合することにより、塗膜の表面に水滴を形成しやすくなる。また、溶媒に対する疎水性ポリマーの分散状態を両親媒性化合物によって制御することにより、水滴の成長をより容易に制御することができる。両親媒性化合物としては、市販されている多くの界面活性剤、二量体や三量体等のオリゴマー、ポリマー等の高分子化合物が挙げられる。両親媒性化合物としては、具体的には例えば、ポリアクリル骨格を主鎖とし、親油性側鎖として長鎖脂肪族基（例えばドデシル基）及び親水性側鎖としてカルボキシル基を有する化合物；ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー；リン脂質；等が挙げられる。
　塗布液において、疎水性ポリマーの濃度は、０. １質量％～１０質量％が好ましく、両親媒性化合物の濃度は、０．０１質量％～１質量％が好ましい。
［工程（ｂ）］
　加湿空気を塗膜２０４ａの表面全体に亘って流し、結露現象によって塗膜２０４ａ上に水滴２１０Ｓを形成する。この際、塗膜２０４ａの近傍を流れる加湿空気の露点Ｔｄと、塗膜２０４ａの表面温度Ｔｓとの差分ΔＴ（＝Ｔｄ－Ｔｓ）が、下記の式（１）を満たすように、Ｔｄ及びＴｓの少なくとも一方を制御する。
式（１）：３℃≦ΔＴ≦３０℃
［工程（ｃ）］
　加湿空気の供給を継続することにより水滴２１０Ｓを成長させる。水滴２１０Ｓの各々は、互いに略同一（同一を含む）の大きさに成長する。水滴２１０Ｓは、塗膜２０４ａに含まれる溶媒の蒸発に伴って、横毛細管力によりハニカム状に配置されるとともに、塗膜２０４ａの中に入り込む。これと並行して、塗膜２０４ａに含まれる溶媒の蒸発に伴って、疎水性ポリマーが水滴２１０Ｓの周囲に析出する。
［工程（ｄ）］
　加湿空気の供給を続け、塗膜２０４ａの中で水滴２１０Ｓどうしが、両親媒性化合物の膜２２０を隔てて密接するまで水滴２１０Ｓを成長させる。
［工程（ｅ）］
　溶媒の蒸発に並行して又は溶媒を蒸発させた後に、水滴２１０Ｓを蒸発させ、塗膜２０４ａに水滴２１０Ｓが入り込んだ部分を開孔２１０として残し、並行して、密接する水滴２１０Ｓどうしを隔てていた両親媒性化合物の膜２２０を破膜する。こうして、複数の開孔２１０がハニカム状に配置し且つ内部で連結した多孔層２０４が形成される。
　以上の工程（ａ）～工程（ｅ）を経て、多孔層２０４と支持体２０２の積層体が得られる。多孔層２０４と支持体２０２の積層体を多孔フィルム２００としてもよく、多孔層２０４を支持体２０２から剥離し、多孔層２０４の単層体を多孔フィルム２００としてもよく、多孔層２０４を支持体２０２から剥離し別の支持体に貼り付けて多孔フィルム２００としてもよい。多孔フィルム２００の細胞を播種する側の面に、プラズマ放電等による電荷処理を施してもよい。図３は、工程（ａ）～工程（ｅ）を経て製造された多孔フィルムの一例を、開口面側から、走査型電子顕微鏡を用いて撮影した写真である。
　開孔２１０の開口径Ｄａ、長径Ｄｂ及び深さＤｃと、連通孔２１２の孔径Ｄｄとは、水滴２１０Ｓの大きさを調整することで制御可能である。水滴２１０Ｓの大きさの調整は、塗膜２０４ａの膜厚、加湿空気に含まれる水蒸気量、及び水滴２１０Ｓを蒸発させるタイミングにより調整可能である。
　上記の製造方法によれば、複数の開孔がハニカム状に均一性高く配置された多孔フィルムを、型やマスクを使用することなく製造可能である。上記の製造方法の詳細は、例えば、特開２００７－２９１３６７号公報、特開２００９－２５６６２４号公報、特開２０１１－７４１４０号公報、特開２０１１－２０２１００号公報に記載されている。多孔フィルム２００は、エッチング、サンドブラスト、プレス成形等によっても製造可能である。
＜細胞組織の製造方法＞
　本実施形態の細胞組織の製造方法は、生体外において細胞組織を製造する製造方法であり、本開示の多孔フィルムの開孔及び連通孔の内部で、細胞を培養する培養工程を含む。以下、多孔フィルムの開孔と連通孔とを総称して「孔」という。
　本実施形態によれば、本開示の多孔フィルムが備える孔が、細胞がマイクロオーダーの網状に配列する軌道の働きをするので、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織が形成される。マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織は、生体内への移植材料として、また、動物実験や臨床試験に替わる試験用細胞組織として、有用である。細胞組織は、多孔フィルムごと使用してもよく、多孔フィルムの開口周囲の平坦部を除去して多孔フィルムの孔内から取り出して使用してもよい。細胞組織は、複数個を積層して使用することも可能である。
　本実施形態の培養工程には、以下の実施形態（１）～（４）が含まれる。
　実施形態（１）：フィーダー能を有する細胞を単独で培養する培養工程。ただし、フィーダー能を有する細胞は、１種でもよく２種以上でもよい。
　実施形態（１）によれば、フィーダー細胞のネットワーク構造を備えた細胞組織が提供される。実施形態（１）によって製造された細胞組織は、例えば、生体外で細胞培養を行う際の足場材、又は、生体内に移植され移植部位において組織を再生する足場材として用いられる。
　フィーダー能を有する細胞としては、間葉系幹細胞、線維芽細胞が挙げられる。間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cell、ＭＳＣ）は、筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等へ分化可能な体性幹細胞であり、フィーダー能を有することも知られている。培養工程において間葉系幹細胞に対する分化誘導因子を培地に添加し、間葉系幹細胞を体細胞（例えば、筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞）に分化させることも可能である。この場合、例えば、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた筋肉組織、脂肪組織又は軟骨組織などが提供される。
　実施形態（２）：フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを共培養する培養工程。
　実施形態（２）によれば、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞のネットワーク構造を備えた細胞組織が提供される。実施形態（２）によって製造された細胞組織は、例えば、生体外で体細胞の培養を行う際の足場材、又は、生体内に移植され移植部位において組織を再生する足場材として用いられる。
　血管内皮細胞としては、臍帯静脈、臍帯動脈、大動脈、冠状動脈、肺動脈、肺微小血管、皮膚微小血管などに由来する血管内皮細胞、多能性幹細胞から分化誘導した血管内皮細胞が挙げられる。リンパ管内皮細胞としては、皮膚微小リンパ管、肺微小リンパ管などに由来するリンパ管内皮細胞、多能性幹細胞から分化誘導したリンパ管内皮細胞が挙げられる。培養工程において培地組成を変化させることにより、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞の増殖、遊走、管形成を制御することが可能である。
　実施形態（３）：フィーダー能を有する細胞と、実質臓器を形成する細胞とを共培養する培養工程。
　実施形態（３）によれば、マイクロオーダーのネットワーク構造を備えた細胞組織が提供される。実施形態（３）によって製造された細胞組織は、例えば、生体内に移植され組織又は臓器の機能を補うために用いられる。ほかに、実施形態（３）によって製造された細胞組織は、動物実験や臨床試験に替わる試験用細胞組織として用いられる。
　実質臓器（parenchymal organ）としては、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、心臓、肺、乳腺組織、脂肪組織、卵巣、精巣、胸腺などが挙げられ、実質臓器を形成する細胞としては、これら臓器を形成する実質細胞、上皮細胞、腺細胞、脂肪細胞、これらの細胞の幹細胞又は前駆細胞などが挙げられる。実質臓器を形成する細胞は、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。実質臓器を形成する細胞の２種以上の組合せとしては、例えば、肝細胞と胆管上皮細胞；膵α細胞と膵β細胞と膵δ細胞；Ｉ型肺胞上皮細胞とＩＩ型肺胞上皮細胞；乳腺腺房細胞と乳管上皮細胞；などが挙げられる。
　実質臓器を形成する細胞としては、多能性幹細胞も挙げられる。多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製能」と三胚葉系列すべてに分化できる「多分化能」とを有する未分化細胞である。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）；などが挙げられる。培養工程において目的の体細胞へと分化誘導する分化誘導因子を培地に添加し、多能性幹細胞を体細胞に分化させる。
　実施形態（４）：フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかと、実質臓器を形成する細胞とを共培養する培養工程。
　実施形態（４）によれば、実質臓器の細胞組織の表面又は内部に、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞のネットワーク構造を備えた細胞組織が提供される。実施形態（４）によって製造された細胞組織は、例えば、生体内に移植され組織又は臓器の機能を補うために用いられる。ほかに、実施形態（４）によって製造された細胞組織は、動物実験や臨床試験に替わる試験用細胞組織として用いられる。
　実施形態（４）の培養工程は、３種の細胞を同時期に播種して３種の細胞を同時に共培養する培養工程でもよく、３種の細胞を段階的に播種して３種の細胞を段階的に共培養する培養工程でもよい。後者としては、例えば、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを同時期に播種し、数日間培養を行い血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞のネットワーク構造を形成した後、実質臓器を形成する細胞を播種して培養を継続する。
　培養工程は、例えば、多孔フィルムを複数の開孔が開口した側の面を上にして培養容器に載置し、多孔フィルムに細胞懸濁液を播種し、播種した細胞種に合せた培養条件にて行う。多孔フィルムを載置する培養容器としては、細胞培養用として公知のあらゆる培養容器が挙げられる。培養容器の材質としては、例えば、樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂）、ガラス、セラミックス、金属等が挙げられる。培養容器の形状としては、例えば、マルチウェルプレート、ペトリディッシュ、マイクロアレイ用プレート、チューブ、フラスコ、ローラーボトル、バッグ等が挙げられる。
　本実施形態は、培養工程の前に、多孔フィルムの複数の開孔が開口した側の面に細胞を播種した後、細胞を播種した側の面から反対面に向かう方向に遠心力をかけ細胞を複数の開孔の内部に移動させる遠心処理工程を含むことが好ましい。多孔フィルムに播種された細胞が遠心処理工程によって多孔フィルムの開孔内に移行するので、孔内で培養される細胞の割合が大きくなる。
　本実施形態に遠心処理工程を含む場合、遠心処理工程の実施を容易にするため、比較的少ない量の培地に細胞を懸濁した細胞懸濁液を播種して遠心処理工程を実施することが好ましい。そして、遠心処理工程後に培養容器内に培地を追加する。
［培地、培養条件］
　本実施形態に用いる培地は、哺乳類細胞の培養に用いられる公知の培地の中から、培養対象となる細胞種に合せて選択される。具体的な培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、ＤＭＥＭ：Ｆ－１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）、ＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential medium）、ＭＥＭα（Minimum Essential Medium Alpha）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）等の基本培地に細胞増殖因子を添加し、細胞種に合せて最適化した培地が挙げられる。このような培地は市販品として入手可能である。本実施形態に用いる培地は、共培養する細胞種に応じて、複数種の培地を混合した培地でもよい。培地のｐＨは、例えばｐＨ７．０～８．０であり、好ましくはｐＨ７．３～７．４である。
　培地には、一般的に添加される各種の成分、例えば、ＦＧＦ－２（Fibroblast Growth Factor-2）、ＴＧＦ－β（Transforming Growth Factor-β）、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、ＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）等の細胞増殖因子；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；亜セレン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機塩；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；分化抑制因子；分化誘導因子；２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；などを添加してもよい。上記成分は、培養期間全体に亘って濃度を所期の範囲に保つために、細胞の培養中に培地に補充してもよい。培地は、抗原性物質や感染源などが細胞組織に混入することを抑制する観点から、血清及び血清代替物を含まないことが好ましい。
　本実施形態における培養工程においては、適宜、培地交換を行うことが好ましい。一連の培養工程に用いる培地は、同一組成でなくてもよい。共培養する細胞種に応じて異なる組成の培地に置き換えながら培養を継続してもよい。
　フィーダー能を有する細胞（第一の細胞）と、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞（第二の細胞）とを共培養する際、又は、フィーダー能を有する細胞（第一の細胞）と、実質臓器を形成する細胞（第二の細胞）とを共培養する際の二者の混合比は、例えば、第一の細胞の細胞数：第二の細胞の細胞数＝１：０．５～１：５であり、好ましくは第一の細胞の細胞数：第二の細胞の細胞数＝１：１～１：３である。
　フィーダー能を有する細胞（第一の細胞）と、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞（第二の細胞）と、実質臓器を形成する細胞（第三の細胞）とを共培養する際の三者の混合比は、例えば、（第一の細胞の細胞数＋第二の細胞の細胞数）：第三の細胞の細胞数＝１：１～１：１０であり、好ましくは（第一の細胞の細胞数＋第二の細胞の細胞数）：第三の細胞の細胞数＝１：２～１：５である。第一の細胞と第二の細胞の混合比は、上記の範囲が好ましい。
　多孔フィルムに対する細胞の播種密度は、例えば１×１０３cells/cm２～１×１０６cells/cm２であり、好ましくは１×１０４cells/cm２～１×１０６cells/cm２である。複数種の細胞を共培養する場合は、合計の播種密度を上記範囲とすることが好ましい。
　本実施形態における培養条件には、一般的な条件を適用してよい。例えば、温度３７℃且つ５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。培養期間は、特に制限されず、細胞のネットワーク構造が十分に発達する期間、培養することが好ましい。
　以下に実施例を挙げて、発明の実施形態を詳細に説明する。発明の実施形態は、以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。
　以下において、「ＰＥＴ」とは、ポリエチレンテレフタレート（Polyethylene Terephthalate）を意味し、「ＰＭＭＡ」とは、ポリメチルメタクリレート（Polymethyl methacrylate) を意味し、「ＰＤＭＳ」とは、ポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane）を意味し、「ＳＥＭ」とは、走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope）を意味し、「ＦＢＳ」とは、ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）を意味する。
　以下において、多孔フィルムの開孔と連通孔とを総称して「孔」という。
＜多孔フィルム及び培養デバイスの作製＞
［多孔フィルム］
　ポリ乳酸５質量部、トリクロロメタン９４．５質量部、両親媒性化合物としてポリアクリルアミド系の両親媒性ポリマー０．５質量部を混合し、塗布液を調製した。塗布液をＰＥＴフィルム（膜厚１８８μｍ）の上に塗布してＰＥＴフィルム上に塗膜を形成した。加湿空気を塗膜の表面全体に亘って流し、結露現象によって塗膜上に水滴を形成した。加湿空気の供給を継続して水滴を成長させながら、水滴を塗膜の中に入り込ませた。塗膜の中で水滴どうしが両親媒性化合物の膜を隔てて密接するまで水滴を成長させながら、塗膜に含まれる溶媒の蒸発により水滴の周囲にポリ乳酸を析出させた。次いで、加湿空気の供給を停止し、雰囲気温度を上げて水滴を蒸発させ、塗膜に水滴が入り込んだ部分を開孔として残し、複数の開孔がハニカム状に配列し且つ連通構造を有するポリ乳酸からなる多孔層と、ＰＥＴフィルム層とを備える多孔フィルムを得た。塗膜の膜厚、加湿空気に含まれる水蒸気量、及び水滴を蒸発させるタイミングにより、多孔層における開孔及び連通孔の寸法を調整し、表１に示す各多孔フィルムを得た。
［培養デバイス］
　多孔フィルムを直径２３ｍｍの円形に切り出し、その外周部に、リング（外径２２ｍｍ、内径１６ｍｍ、高さ８ｍｍ。ＰＭＭＡ製、側面にＰＤＭＳコート）を、両面粘着テープ（３Ｍ社の品番１５１０、皮膚貼付用テープ）を用いて貼り付け、リング付き多孔フィルムを作製した。リング付き多孔フィルムを、滅菌を目的に７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に数分間浸し、次いで滅菌水で洗浄してエタノールを除去した。図４に、多孔フィルム、リング及び培養デバイスの一例を示す。
　リング付き多孔フィルムを、多孔フィルムのＰＥＴフィルム層側が下になるように、組織培養用ディッシュに置き、培養デバイスを得た。滅菌を目的に、培養デバイスに対して紫外線照射を２時間行った。表１に、各培養デバイスが備える多孔フィルムの構造の寸法を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図５Ａは、ＰＬＡ１０が備える多孔フィルムの断面及び表面のＳＥＭ像であり、図５Ｂは、ＰＬＡ４０が備える多孔フィルムの断面及び表面のＳＥＭ像である。表１に示すすべての多孔フィルムにおいて、隣接する開孔の開口どうしは平坦部により離間されており、隣接する開孔どうしはそれぞれの壁面の一部が連続しており連通していた。表１に示すすべての多孔フィルムにおいて、ポリ乳酸からなる多孔層に配列している開孔は、多孔層を貫通していなかった。
　対照用培養デバイスとして、開孔のない平坦なポリ乳酸からなる層をＰＥＴフィルム上に積層した積層体を、多孔フィルムの代わりに備えるデバイス（「Ｆｌａｔ」という。）と、組織培養用ディッシュ（Tissue culture polystyrene：ＴＣＰＳ、直径３５ｍｍ、商品名：Ｆａｌｃｏｎセルカルチャーディッシュ３５３００１、コーニング社製）の培養面にリングを貼り付けたデバイス（「ＴＣＰ」という。）を用意した。
　これら培養デバイスにおいては、リング内の底面が細胞を培養する培養面であり、リングで囲まれた底面の面積は２ｃｍ２である。
＜培養実験の材料＞
［細胞］
・間葉系幹細胞：ヒト成人骨髄由来正常細胞、ロンザジャパン社から購入。以下「ＭＳＣ」という。
・線維芽細胞：ヒト皮膚由来正常細胞ＮＨＳＦ４６、理化学研究所バイオリソースセンター（日本国茨城県つくば市高野台３－１－１）から分譲。
・血管内皮細胞：ヒト新生児臍帯静脈由来正常細胞、ロンザジャパン社から購入。以下「ＨＵＶＥＣ」という。
・肝臓由来の増殖性細胞：ヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２、理化学研究所バイオリソースセンター（日本国茨城県つくば市高野台３－１－１）から分譲。
［培養液］
・ＭＳＣ培地：ヒト間葉系幹細胞培地キットMSCGM BulletKit、ロンザジャパン社
・ＮＨＳＦ４６培地：ＭＥＭα＋１０％ＦＢＳ
・ＨＵＶＥＣ培地：ヒト内皮細胞培地キットEGM-2 BulletKit、ロンザジャパン社
・ＨｅｐＧ２培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
＜培養実験１：間葉系幹細胞の単独培養＞
　培養デバイスとしてＴＣＰ、Ｆｌａｔ、ＰＬＡ３、ＰＬＡ１０、ＰＬＡ３０を用いて、下記の培養条件でＭＳＣを単独培養した。
・播種密度：１×１０５cells/disk（５×１０４cells/cm２）
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・骨分化誘導培地：hMSC differentiation BulletKit-osteogenic（商品番号：PT-3002、ロンザジャパン社）
・脂肪分化誘導培地：hMSC differentiation BulletKit-adipogenic（商品番号：PT-3004、ロンザジャパン社）
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ２
　ＭＳＣ培地を用いて培養を開始し、培養１日目に、骨分化誘導培地と脂肪分化誘導培地を１：１で混合した分化誘導培地に交換し、その後３日毎に分化誘導培地を交換し、合計１５日間培養した。分化誘導１４日目にリアルタイムＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）により、骨細胞の分化マーカーであるＲｕｎｘ２及びＯｓｘ、並びに、脂肪細胞の分化マーカーであるＣ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγの発現を解析した。また、分化誘導１４日目にアクチンの蛍光免疫染色を行った。図６に、分化誘導１４日目におけるアクチンの蛍光免疫染色像を示す。
　本実験から、以下のことが明らかになった。
・多孔フィルムの開孔の大きさに応じて細胞の形態が変化した。ＰＬＡ１０及びＰＬＡ３０において、細胞は多孔フィルムの孔内で細長い形態を示した。ＴＣＰ、Ｆｌａｔ及びＰＬＡ３において、細胞は多孔フィルムの表面において伸展した形態を示した。
・ＰＬＡ３及びＰＬＡ１０における細胞の増殖性は、Ｆｌａｔと同程度であったが、ＰＬＡ３０における細胞の増殖性は、Ｆｌａｔに比べ低かった。このことから、細胞が多孔フィルムの孔内に侵入すると増殖が抑制されることが示唆された。
・リアルタイムＰＣＲの解析結果は、いずれの培養デバイスにおいても、骨細胞への分化と脂肪細胞への分化とが起こることを示していた。
＜培養実験２：間葉系幹細胞と血管内皮細胞の共培養＞
　培養デバイスとしてＴＣＰとＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件で、ＨＵＶＥＣを単独培養、又は、ＭＳＣとＨＵＶＥＣを共培養した。
・単独培養：ＨＵＶＥＣの播種密度１×１０５cells/disk（５×１０４cells/cm２）。ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２）で培養。
・共培養：ＭＳＣとＨＵＶＥＣを混合したのち播種した。ＭＳＣの播種密度０．５×１０５cells/disk、ＨＵＶＥＣの播種密度１×１０５cells/disk、合計播種密度１．５×１０５cells/disk（７．５×１０４cells/cm２）。ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２）で培養。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスの半数に対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ２
・培養期間：７日間培養。２日毎に培地を交換した。
　培養３日目と７日目に、ＨＵＶＥＣ特異的な細胞表面マーカーであるＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ社Ｃ２＋、１０倍対物レンズ）を用いて観察した。細胞組織においてネットワーク構造が最も発達している深度に焦点を合せ、１．２７ｍｍ×１．２７ｍｍ（＝１．６１ｍｍ２）の領域を任意に１０個選択して蛍光画像を取得し、取得した蛍光画像を画像解析ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ社NIS-Elements Basic Research）を用いて二値化処理した。二値化処理した画像全体に散在する蛍光領域の長径を個別に計測し、その長さを足し合わせ、さらに１０領域の合計を算出し、ＨＵＶＥＣが形成しているネットワークの全長とした。二値化処理した画像全体中に散在する蛍光領域の面積を個別に計測し、その面積を足し合わせ、さらに１０領域の合計を算出し、ＨＵＶＥＣが形成しているネットワークの総面積とした。
　図７Ａ～図７Ｄ及び表２に、共焦点レーザー顕微鏡像及びネットワークの解析結果を示す。図７Ａ～図７Ｃにおいて、「Ｍｏｎｏ－」が単独培養を意味し、「Ｃｏ－」が共培養を意味する。図７Ａ～図７Ｄにおいては、「ｃｆｇ」を付した像が、遠心処理を施した培養例であり、「ｃｆｇ」を付していない像が、遠心処理を施していない培養例である。
・図７Ａ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）。
・図７Ｂ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図７Ｃ：培養７日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図７Ｄ、表２：共培養におけるネットワークの全長及び総面積。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＨＵＶＥＣは血管内膜を形成する細胞であるところ、ＨＵＶＥＣのみでは毛細血管網様のネットワークの形成は難しいが、ＭＳＣとＨＵＶＥＣの共培養により毛細血管網様のネットワークが形成された。内皮細胞が管腔構造を形成するには内皮細胞を支持する細胞が必要であると考えられるところ、ＭＳＣは内皮細胞に作用するサイトカインを分泌すること及び壁細胞への分化が可能であることから、ＨＵＶＥＣの毛細血管網様のネットワーク形成にＭＳＣが効果的に作用していることが示唆された。
・毛細血管網様のネットワークの形成は経時に伴って進行し、培養７日目では、培養３日目に比べ、より発達したネットワークが形成された。
・ＰＬＡ４０においては、多くの細胞が多孔フィルムの孔内に存在した。ＰＬＡ４０においては、ＴＣＰに比べ、発達した毛細血管網様のネットワークが形成された。
・遠心処理を施したＰＬＡ４０においては、遠心処理を施していないＰＬＡ４０に比べ、毛細血管網様のネットワークがより長く発達していた。遠心処理を施すことにより、多孔フィルムの孔内に移行する細胞の割合が大きくなることが示唆された。
・通常の播種操作後の培養においては、培養デバイスのリング周辺において細胞密度が高い傾向が見られたが、遠心処理を施した後の培養では、培養面全体において比較的均一なネットワーク形成が見られた。播種された細胞が遠心処理によって多孔フィルムの孔内に移行するので、リング周辺に細胞が移行することが抑制されることが示唆された。
＜培養実験３：間葉系幹細胞又は線維芽細胞と血管内皮細胞の共培養＞
　培養デバイスとしてＴＣＰ、Ｆｌａｔ、ＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件で、ＭＳＣとＨＵＶＥＣを共培養、又は、ＮＨＳＦ４６とＨＵＶＥＣを共培養した。
・ＭＳＣとＨＵＶＥＣの共培養：ＭＳＣとＨＵＶＥＣを混合したのち播種した。ＭＳＣの播種密度０．５×１０５cells/disk、ＨＵＶＥＣの播種密度１×１０５cells/disk、合計播種密度１．５×１０５cells/disk（７．５×１０４cells/cm２）。ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２）で培養。
・ＮＨＳＦ４６とＨＵＶＥＣの共培養：ＮＨＳＦ４６とＨＵＶＥＣを混合したのち播種した。ＮＨＳＦ４６の播種密度０．５×１０５cells/disk、ＨＵＶＥＣの播種密度１×１０５cells/disk、合計播種密度１．５×１０５cells/disk（７．５×１０４cells/cm２）。ＮＨＳＦ４６培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（ＮＨＳＦ４６培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２）で培養。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ２
・培養期間：７日間培養。毎日培地を交換した。
　培養３日目と７日目にＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。図８Ａ～図８Ｄ及び表３に、顕微鏡像及びネットワークの解析結果を示す。
・図８Ａ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図８Ｂ：培養７日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図８Ｃ、表３：培養３日目のネットワークの全長及び総面積。
・図８Ｄ、表３：培養７日目のネットワークの全長及び総面積。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＮＨＳＦ４６とＨＵＶＥＣの共培養により、ＭＳＣとＨＵＶＥＣの共培養と同様に、毛細血管網様のネットワークが形成された。
・毛細血管網様のネットワークは、経時に伴って発達した。
・ＰＬＡ４０においては、ＴＣＰ及びＦｌａｔに比べ、より発達したネットワークが形成された。
＜培養実験４：多孔フィルムの寸法の検討＞
　培養デバイスとしてＴＣＰ、Ｆｌａｔ、ＰＬＡ３、ＰＬＡ１０、ＰＬＡ２０、ＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件でＭＳＣとＨＵＶＥＣを共培養した。
・播種：ＭＳＣとＨＵＶＥＣを混合したのち播種した。
・播種密度：ＭＳＣ　０．５×１０５cells/disk、ＨＵＶＥＣ　１×１０５cells/disk、合計１．５×１０５cells/disk（７．５×１０４cells/cm２）。
・培地：ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地、ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地＝体積比１：２。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ２
・培養期間：７日間培養。２日毎に培地を交換した。
　培養３日目と７日目にＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。図９Ａ～図９Ｅ及び表４に、顕微鏡像及びネットワークの解析結果を示す。
・図９Ａ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）。
・図９Ｂ：培養３日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図９Ｃ：培養７日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（低倍率）。
・図９Ｄ：培養７日目のＣＤ３１の蛍光免疫染色像（高倍率）。
・図９Ｅ、表４：ネットワークの全長及び総面積。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＰＬＡ３及びＰＬＡ１０においては、細胞は、多孔フィルムの表面において伸展した形態を示し、ネットワークは形成されなかった。
・ＰＬＡ２０においては、細胞は、多孔フィルムの表面で伸展した形態と、多孔フィルムの孔内でネットワークを形成した形態を示した。
・ＰＬＡ４０においては、毛細血管網様のネットワークが形成された。
・上記のとおり、多孔フィルムの開孔の大きさに応じて細胞の形態が変化した。本実験で使用した細胞の長径が２０μｍ程度であることから、多孔フィルムの開孔の大きさが細胞サイズと同等以上であると、細胞は多孔フィルムの孔内でネットワークを形成しやすいことが示唆された。
＜培養実験５：３種類の細胞の同時共培養＞
　培養デバイスとしてＴＣＰ、ＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件でＭＳＣとＨＵＶＥＣとＨｅｐＧ２を共培養した。
・播種：ＭＳＣとＨＵＶＥＣとＨｅｐＧ２を混合したのち播種した。予めＨｅｐＧ２を蛍光染料CellTracker Redで標識した。
・播種密度：ＭＳＣ　０．５×１０５cells/disk、ＨＵＶＥＣ　１×１０５cells/disk、ＨｅｐＧ２　５×１０５cells/disk。
・培地：ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地とＨｅｐＧ２培地の混合培地、ＭＳＣ培地：ＨＵＶＥＣ培地：ＨｅｐＧ２培地＝体積比１：２：３。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ２
・培養期間：３日間培養。毎日培地を交換した。
　培養３日目にＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、細胞が形成しているネットワークを解析した。図１０Ａ～図１０Ｂに顕微鏡像を示す。
・図１０Ａ：培養３日目の蛍光像（緑色蛍光と赤色蛍光の重ね合せ画像）。
・図１０Ｂ：培養３日目におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像。
　本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＰＬＡ４０においては、細胞はネットワーク構造を形成したが、ネットワーク間の連結状態は乏しかった。
・ＭＳＣとＨＵＶＥＣとＨｅｐＧ２の３種共培養は、ＭＳＣとＨＵＶＥＣの２種共培養に比べ、播種密度が高く、多孔フィルムの孔内に高密度に細胞が充填されたことにより細胞の遊走性が低下し、ネットワーク形成の低下あるいは遅延が起こっていることが示唆された。播種密度の最適化又は培養時間の延長により、ネットワーク形成が可能と推測された。
＜培養実験６：３種類の細胞の段階的共培養＞
　培養デバイスとしてＴＣＰ、ＰＬＡ４０を用いて、下記の培養条件でＭＳＣとＨＵＶＥＣとＨｅｐＧ２を共培養した。
・播種：ＭＳＣとＨＵＶＥＣを混合したのち播種し、３日間培養した後、ＨｅｐＧ２を播種した。予めＨｅｐＧ２を蛍光染料CellTracker Redで標識した。
・播種密度：ＭＳＣ　０．５×１０５cells/disk、ＨＵＶＥＣ　１×１０５cells/disk、ＨｅｐＧ２　５×１０５cells/disk。
・播種後の遠心処理：多孔フィルムを備えた培養デバイスに対して、回転半径１２０ｍｍ、回転数１１００ｒｐｍ、回転時間３分間の遠心処理を施した。
・培養液量：１．０ml/disk
・インキュベーター：３７℃、５％ＣＯ２
・培養期間：２種共培養を３日間、３種共培養を３日間行った。
・培地：培養開始から３日間は、ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地の混合培地（体積比１：２）で培養し、１日目に培地交換を行った。ＨｅｐＧ２を播種した後は、ＭＳＣ培地とＨＵＶＥＣ培地とＨｅｐＧ２培地の混合培地（体積比１：２：３）に交換し、毎日培地を交換しながら培養した。
　ＨｅｐＧ２を播種してから３日目にＣＤ３１の蛍光免疫染色を行い、ＣＤ３１の蛍光像とＨｅｐＧ２の蛍光像とから、細胞が形成しているネットワークを解析した。図１１Ａ～図１１Ｂに顕微鏡像を示す。図１１Ｃ及び表５に、ＣＤ３１の蛍光像を解析して得たネットワークの全長及び総面積を示す。
・図１１Ａ：ＨｅｐＧ２を播種した後の培養３日目の蛍光像（緑色蛍光と赤色蛍光の重ね合せ画像）。
・図１１Ｂ：ＨｅｐＧ２を播種した後の培養３日目におけるＣＤ３１の蛍光免疫染色像。
・図１１Ｃ、表５：３種の共培養３日目における、同時共培養（培養実験５）、段階的共培養（培養実験６）それぞれのネットワークの全長及び総面積。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本実験から、以下のことが明らかになった。
・ＰＬＡ４０においては、ＴＣＰに比べ、細く長いネットワークが形成された。
・段階的共培養は、同時共培養に比べ、ネットワークの連結が増していた。ＭＳＣとＨＵＶＥＣを共培養してネットワークを予め形成した後にＨｅｐＧ２を播種することが、高次のネットワーク構造の形成に効果的であることが示唆された。
　２０１６年９月２７日に出願された日本国出願番号第２０１６－１８８６２７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (20)

  1. 　表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する前記開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムの前記開孔及び前記連通孔の内部で、フィーダー能を有する細胞を培養する培養工程を含む、細胞組織の製造方法。
  2. 　前記培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかとを、前記開孔及び前記連通孔の内部で共培養する培養工程である、請求項１に記載の細胞組織の製造方法。
  3. 　前記培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、実質臓器を形成する細胞とを、前記開孔及び前記連通孔の内部で共培養する培養工程である、請求項１に記載の細胞組織の製造方法。
  4. 　前記培養工程が、フィーダー能を有する細胞と、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の少なくともいずれかと、実質臓器を形成する細胞とを、前記開孔及び前記連通孔の内部で共培養する培養工程である、請求項１に記載の細胞組織の製造方法。
  5. 　前記フィーダー能を有する細胞が、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の少なくともいずれかである、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  6. 　前記複数の開孔が、前記多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  7. 　前記連通孔が、前記多孔フィルムの面方向全域に亘って略同一の深さに設けられている、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  8. 　前記連通孔の孔径が、前記多孔フィルムに播種される細胞の長径に対して５０％～５００％の範囲である、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  9. 　前記連通孔の孔径が５μｍ～５０μｍの範囲である、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  10. 　前記連通孔の孔径の変動係数が３０％以下である、請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  11. 　前記開孔の、前記多孔フィルムの面方向における長径が１０μｍ～１００μｍの範囲である、請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  12. 　前記開孔の深さが１０μｍ～１００μｍの範囲である、請求項１～請求項１１のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  13. 　前記開孔の開口径が５μｍ～９０μｍの範囲である、請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  14. 　前記開孔の開口径の変動係数が２０％以下である、請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  15. 　前記培養工程の前に、
    　前記多孔フィルムの前記複数の開孔が開口した側の面に細胞を播種した後、前記細胞を播種した側の面から反対面に向かう方向に遠心力をかけ前記細胞を前記複数の開孔の内部に移動させる遠心処理工程を含む、
    　請求項１～請求項１４のいずれか１項に記載の細胞組織の製造方法。
  16. 　表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する前記開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、
    　前記開孔の、前記多孔フィルムの面方向における長径が２０μｍ～１００μｍの範囲である、多孔フィルム。
  17. 　表面に設けられた複数の開孔と、互いに隣接する前記開孔どうしを連通する連通孔とを有する多孔フィルムであって、
    　前記開孔の深さが２０μｍ～１００μｍの範囲である、多孔フィルム。
  18. 　前記開孔の開口径が５μｍ～９０μｍの範囲である、請求項１６又は請求項１７に記載の多孔フィルム。
  19. 　前記連通孔の孔径が５μｍ～５０μｍの範囲である、請求項１６～請求項１８のいずれか１項に記載の多孔フィルム。
  20. 　前記複数の開孔が、前記多孔フィルムの表面にハニカム状に配置されている、請求項１６～請求項１９のいずれか１項に記載の多孔フィルム。
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