WO2016021864A9 - c-Met 특이적 인간 항체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an antibody or fragment thereof that specifically binds to c-Met, and more particularly, to a fully human antibody having high affinity and specificity for c-Met isolated from a human Fv (ScFv) phage library and the antibody.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a polynucleotide, a recombinant vector containing the polynucleotide, a cell transformed with the recombinant vector, and a method for producing a c-Met-specific antibody by culturing the cell.
  • the mesenchymal-epithelial transition factor (c-Met) is a cell-surface receptor, an oncogene of the receptor tyrosine kinase family, and consists of only 50 kD extracellular domains. It has been found to consist of a total of 145 kD beta ( ⁇ ) subunits consisting of subunits and extracellular, cell membrane permeation, tyrosine kinase domains and phosphorylation related tyrosine motifs (Dean et al., Nature , 4; 318 (6044): 385, 1985; Park et al., PNAS, 84 (18): 6379, 1987, Maggiora et al., J.
  • c-Met responds to HGF and stimulates various signaling pathways through phosphorylation of c-Met to enhance mitogenesis and cell motility of cancer cells and vascular cells, inhibit cell death, It promotes the formation and transformation of cancer by inducing invasion and metastasis into the extracellular matrix (ECM) (Jeffers et al., J. Mol. Med., 74: 505, 1996; Amicone et al., EMBO J., 16: 495, 1997; Matsumoto and Nakamura, Biochem.Biophys.Res.Comm., 239: 639, 1997; Corps et al., Int. J. Cancer, 73: 151 , 1997).
  • ECM extracellular matrix
  • glioma gliomas, Koochekpour et al., Cancer Res., 57: 5391, 1997)
  • breast cancer Nagy et al., Surg. Oncol., 5: 15,1996; Tuck et al., Am. J. Pathol., 148: 225, 1996)
  • pancreatic cancer Esbert et al., Cancer Res., 54: 5775, 1994
  • pleural mesotheliomas Tolpay et al., J. Cancer Res. Clin.Oncol., 124 : 291, 1998
  • These small molecule compounds include K252a from Fermentek biotechnology, SU11274 from Sugen, PHA-665752 from Pfiza (Morotti et al., Oncogene, 21 (32): 4885, 2002; Berthou et al., Oncogene, 23 (31): 5387, 2004; Pfizer, Christensen et al., Cancer Res., 63 (21): 7345, 2003), which interfere with c-Met phosphorylation, causing downstream proteins of signal transduction to It is designed not to be activated, but the disadvantage of these small molecule compounds is that they cannot specifically inhibit only phosphorylation by c-Met.
  • a second method of neutralizing HGF / c-Met signaling mechanism is a method of inhibiting the binding of c-Met and its ligand, HGF.
  • Such methods include missing HGF fragments (Matsumoto & Nakamura, Cancer Sci., 94 (4): 321,2003) or antibodies that neutralize HGF (Cao et al., PNAS., 98 (13): 7443, 2001; Kim et al., Clin.
  • Selected peptides are also applied to molecular imaging to search for tissues or organs in vivo that c-Met is overexpressed (Cao et al., Clin. Cancer Res., 13 (20); 6049, 2007). They have the limitation of inhibiting only HGF-dependent c-Met activation, but since they show real anticancer effects in vitro or in vivo, they can be combined with existing chemotherapy. It is considered to be useful.
  • gefitinib and erlotinib (EGFR) kinase inhibitors, gefitinib and erlotinib are often used as effective cancer drugs, but drug resistance is often caused by intensive amplification of c-Met receptors. (Engelman et al., Science, 316 (5827): 1039, 2007), therefore, anti-cancer effects are expected to be amplified by incorporating c-Met inhibitors.
  • c-Met is well known to be activated by HGF, contributing to angiogenesis by itself, and to stimulate angiogenesis through interaction with VEGFR-2, a major receptor for angiogenesis. have.
  • HGF HGF-like growth factor
  • VEGFR-2 VEGFR-2
  • tumor growth was synergistically inhibited in human xenograft models (Zhang et al., IDrugs, 13: 112, 2010).
  • the dysregulation between HGF and c-Met and the overexpression of c-Met are known to play an important role in the progression of metastatic cancer. Therefore, the antibody against c-Met is an antagonist. come.
  • the present inventors can bind specifically to c-Met with high affinity and consist of human-derived sequences, and as a result of intensive efforts to develop a c-Met human antibody having a low likelihood of inducing an immune response when administered in vivo, single-chain Fv From the (ScFv) phage library, phage display technology was used to isolate fully human antibodies that bind c-Met with high affinity and specificity, thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a heavy chain variable region of c-Met specific antibody having high affinity and specificity for c-Met.
  • Another object of the present invention is to provide a light chain variable region of a c-Met specific antibody having high affinity and specificity for c-Met.
  • Still another object of the present invention is a heavy chain variable region of a c-Met specific antibody; And it provides a c-Met specific antibody or fragment thereof comprising the light chain variable region of the c-Met specific antibody.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the heavy chain variable region of the c-Met specific antibody or the light chain variable region of the c-Met specific antibody.
  • Still another object of the present invention is to provide a recombinant vector containing the polynucleotide and a recombinant cell transformed with the recombinant vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing c-Met specific antibody using the recombinant cells.
  • the present invention provides a heavy chain variable region CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, heavy chain variable region CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • a heavy chain variable region of a c-Met specific antibody comprising CDR3 is provided, and preferably a heavy chain variable region of a c-Met specific antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is provided.
  • the present invention also provides a light chain variable region CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a light chain variable region CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 -Provides a light chain variable region of the Met-specific antibody, preferably provides a heavy chain variable region of the c-Met specific antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the present invention also provides a heavy chain variable region CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a heavy chain variable region CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain variable region CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Heavy chain variable region of a Met-specific antibody; And
  • C-Met specific antibody comprising a light chain variable region CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a light chain variable region CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 Light chain variable region;
  • c-Met specific antibody or fragment thereof comprising a.
  • the c-Met specific antibody or fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 8.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the heavy chain variable region of the c-Met specific antibody or the light chain variable region of the c-Met specific antibody.
  • the present invention also provides a recombinant vector containing the polynucleotide and a recombinant cell transformed with the recombinant vector.
  • the present invention comprises the steps of culturing the recombinant cells to produce c-Met specific antibodies; And it provides a method for producing a c-Met specific antibody comprising the step of recovering the generated c-Met specific antibody.
  • Figure 1 shows the c-Met binding capacity of c-Met-specific ScFv screened in the present invention.
  • Figure 2 shows the binding capacity of 1E4-ScFv to c-Met in accordance with the present invention.
  • FIG. 3 shows a series map of pIGHD-1E4Hvy, which is a vector including a heavy chain constant region and a heavy chain variable region of 1E4-IgG.
  • Figure 4 shows a sequence map of pIgGLD-1E4Lgt, a vector comprising a light chain constant region and a light chain variable region of IgG.
  • Figure 5 shows the SDS-PAGE results of purified 1E4-IgG.
  • Figure 6 shows the results confirmed by the scattering (scattering) of the c-Met specific antibody according to the present invention through the MDCK-2 cell line.
  • Figure 7 shows the results of confirming the phosphorylation capacity of c-Met of c-Met specific antibody according to the present invention by Western blotting.
  • Figure 8 shows the binding capacity of the c-Met specific antibody according to the present invention to the mouse c-Met and human c-Met.
  • the antibody according to the present invention can bind specifically to c-Met with high affinity and has a human-derived sequence.
  • heavy chain variable region CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • heavy chain variable region CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • heavy chain variable region CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 It relates to the heavy chain variable region of the c-Met specific antibody.
  • the present invention includes a light chain variable region CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a light chain variable region CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 It relates to the light chain variable region of the c-Met specific antibody.
  • the present invention provides a heavy chain variable region CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a heavy chain variable region CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain variable region CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: A heavy chain variable region of a c-Met specific antibody comprising;
  • C-Met specific antibody comprising a light chain variable region CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a light chain variable region CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 Light chain variable region;
  • c-Met specific antibody or fragment thereof comprising a.
  • a phage display technique from a single-chain Fv (ScFv) phage library to obtain a fully human antibody that binds to c-Met with high affinity and specificity.
  • the preparation and phage display of the phage library can be carried out by manufacturing as known in the US Patent No. 7063943, US Patent No. 6172197 and the like.
  • the c-Met-specific antibody according to the present invention obtained and provided by the above method has a heavy chain variable region CDR1 (HCDR1), a heavy chain variable region CDR2 (HCDR2) and a heavy chain variable having the sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively.
  • a heavy chain variable region comprising a region CDR3 (HCDR3) and a light chain variable region CDR1 (LCDR1), a light chain variable region CDR2 (LCDR2) and a light chain variable region CDR3 (LCDR3) having the sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively; Has a light chain variable region.
  • the c-Met specific antibody according to the invention is a 1E4 antibody consisting of a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the present invention also provides a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 represented by SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3 represented by SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively.
  • a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 8 are provided.
  • the fragment of the antibody according to the present invention is a single-chain antibody, diabodies, triabodies, tetrabodies, Fab fragments, F having a binding function to c-Met (ab ') 2 fragment, Fd, ScFv, domain antibody, bispecific antibodies, minibody, cap, IgD antibody, IgM antibody, IgG1 antibody, IgG2 antibody, IgG3 antibody, IgG4 antibody, derivatives of antibody constant regions, proteins Phosphorus receptors based on protein scaffolds and the like, but are not limited thereto.
  • fragments of the antibody according to the present invention also have the same characteristics as the antibody according to the present invention. It will be apparent to one of ordinary skill in the art.
  • Antibody fragments according to the invention can be prepared by cleavage of the entire antibody or expression of the DNA encoding the fragment. Antibody fragments can be prepared by methods described in the literature (Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235, 1983; Parham, J. Immunol., 131: 2895, 1983).
  • ScFv of the present invention can be linked to the heavy chain and light chain variable region sequence through a linker, it is preferable that the linker is an amino acid linker is used, the amino acid sequence of the linker in the ScFv of the 1E4 antibody according to the present invention is SEQ ID NO: 9 , Entire ScFv may be the sequence of SEQ ID NO: 10.
  • cE-specific human antibody 1E4 in the case of cE-specific human antibody 1E4, it was confirmed that phosphorylation of c-Met without HGF treatment, and cell dispersion capacity was confirmed using MDCK-2 cells, which are dog kidney epithelial cells, It was confirmed that the cell dispersion capacity of the same degree as the positive control group HGF treated cell group (Fig. 6).
  • antibodies in which the mutation occurs in the variable region are included in the scope of the present invention.
  • One such example is conservative substitution of amino acids in the variable region.
  • Conservative substitutions mean substitutions with other amino acid residues that have properties similar to those of the original amino acid sequence. For example, lysine, arginine, and histidine have similar properties because they have a base side chain. Aspartic acid and glutamic acid It has similar characteristics in that it has a mountain side chain.
  • glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, and tryptophan have similar characteristics in that they have a non-charged polar side chain, and alanine, valine, leucine, threonine, isoleucine, proline, phenylalanine, and methionine are nonpolar.
  • Tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine have similar properties in that they have side chains.
  • c-Met specific antibodies include affinity and affinity by methods such as direct mutation, affinity maturation, phage display or chain shuffling. Also included are antibodies with improved specificity. Affinity and specificity can be modified or improved by mutating the CDRs and screening for antigen binding sites with the desired characteristics (Yang et al., J. Mol. Bio., 254: 392,1995).
  • CDRs can be mutated in a variety of ways, for example, in one way, to randomize development residues or combinations of residues such that all 20 amino acids in a population of identical antigen binding sites are found at a particular position, and also mutations Mutations may be induced over a range of CDR residues by error prone PCR methods (Hawkins et al., J. Mol. Bio., 226: 889, 1992). Phage display vectors containing heavy and light chain variable region genes are propagated in mutant strains of E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359, 1996). Such mutagenesis methods are those commonly used in the art.
  • the antibody or fragment thereof according to the present invention is also available in the form of a conjugate conjugated with another substance. Accordingly, the present invention provides an antibody-drug conjugate in which a c-Met specific antibody and a therapeutic drug according to the present invention are combined. Therapeutic drugs that can be used in the antibody-drug conjugates according to the present invention can be used without limitation as long as they meet the object of the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the antibody or fragment thereof according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition may further include conventional pharmaceutically acceptable carriers and excipients.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding a heavy chain variable region of the c-Met specific antibody, a recombinant vector containing the polynucleotide, a polynucleotide encoding a light chain variable region of the c-Met specific antibody And to a recombinant vector containing the polynucleotide.
  • the polynucleotide sequence encoding the variable region of the antibody or fragment thereof according to the present invention preferably has a sequence represented by SEQ ID NO: 11 for the heavy chain variable region and SEQ ID NO: 12 for the light chain variable region, but is not limited thereto. It is also possible to use a degenerate sequence, i.e., encoding the same amino acid sequence as that of the heavy and light chain variable regions represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, but having a different polynucleotide sequence.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the nucleotide sequence and a host cell comprising the same, and a method for producing an antibody specifically binding to c-Met according to the present invention using the recombinant vector or host cell.
  • a method for producing an antibody specifically binding to c-Met according to the present invention using the recombinant vector or host cell it is preferable to prepare by expression and purification by genetic recombination method, specifically, the variable regions encoding the antibody specifically binding to c-Met according to the present invention are prepared separately or at the same time expressed in one host cell It is desirable to.
  • a polynucleotide encoding a leader sequence may be positioned at the N-terminus of the antibody according to the present invention, which may be used for the production of the antibody.
  • a tag may be attached to facilitate the separation purification and analysis of the produced antibody, a representative tag is his-tag, but is not limited thereto.
  • the term "recombinant vector” refers to a gene construct that is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and which comprises essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • operably linked means that the nucleic acid expression control sequence and the nucleic acid sequence encoding the protein of interest is functionally linked to perform a general function.
  • Operative linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation can be facilitated using enzymes commonly known in the art, and the like. have.
  • Suitable expression vectors of the invention may include signal sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers. Initiation and termination codons are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the immunogenic target protein and must be functional in the subject and be in frame with the coding sequence when the gene construct is administered. Generic promoters can be either constitutive or inducible. Prokaryotic cells include, but are not limited to, lac, tac, T3 and T7 promoters.
  • Eukaryotic cells include monkey virus 40 (SV40), mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, human immunodeficiency virus (HIV), for example the long terminal repeat (LTR) promoter of HIV, moronivirus, cytomegalovirus (CMV) ), Epstein bar virus (EBV), Loose sacoma virus (RSV) promoters, as well as promoters derived from ⁇ -actin promoter, human heroglobin, human muscle creatine, human metallothionein, but are not limited thereto. .
  • SV40 monkey virus 40
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • HSV human immunodeficiency virus
  • LTR long terminal repeat
  • CMV cytomegalovirus
  • EBV Epstein bar virus
  • RSV Loose sacoma virus
  • the expression vector may comprise a selectable marker for selecting a host cell containing the vector.
  • the selection marker is for selecting cells transformed with the vector, and markers conferring a selectable phenotype such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents or expression of surface proteins can be used. Since only cells expressing a selection marker survive in an environment treated with a selective agent, transformed cells can be selected.
  • the vector when the vector is a replicable expression vector, the vector may include a replication origin, which is a specific nucleic acid sequence from which replication is initiated.
  • a recombinant expression vector for inserting a foreign gene various forms of vectors such as plasmids, viruses, and cosmids can be used.
  • the type of recombinant vector is not particularly limited as long as it functions to express a desired gene and to produce a desired protein in various host cells of prokaryotic and eukaryotic cells, but has a promoter with strong activity and strong expression, similar to natural state. Vectors that can produce large amounts of foreign protein in form are preferred.
  • Suitable expression vectors for eukaryotic hosts include, but are not limited to, expression control sequences derived from SV40, bovine papilloma virus, adenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus, baculovirus and retroviruses. This includes.
  • Expression vectors that can be used in bacterial hosts include broader hosts such as bacterial plasmids derived from Escherichia coli, such as pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC vectors, col E1, pCR1, pBR322, pMB9, and derivatives thereof. Plasmids with ranges, phage DNA that can be exemplified by a wide variety of phage lambda derivatives such as ⁇ gt10 and ⁇ gt11, NM989, and other DNA phages such as M13 and filamentary single-stranded DNA phages.
  • Escherichia coli may include DNA sequences encoding anthranilate synthase (TrpE) and carboxy terminus polylinkers, and other expression vector systems include beta-galactosidase (pEX); Lambda PL maltose binding protein (pMAL); And glutathione S-transferase (pGST) (Gene 67: 31,1988; Peptide Research 3: 167, 1990).
  • TrpE anthranilate synthase
  • pGST glutathione S-transferase
  • the selection gene suitable for use in yeast is the trpl gene present in the yeast plasmid Yrp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, 1979; Kingsman et al, gene, 7: 141, 1979).
  • the Trpl gene is a mutant strain of yeast that lacks the ability to grow in tryptophan, for example ATCC No.
  • leu2-deficient yeast strains (ATCC 20,622 or 38,626) are complemented by known plasmids containing the Leu2 gene.
  • Useful expression vectors for yeast cells are 2 ⁇ plasmids and derivatives thereof, and useful vectors for insect cells are pVL941.
  • Expression vectors in the present invention may include one or more expression control sequences operably linked to the DNA sequence or fragment to be expressed. Expression control sequences are inserted into the vector to control or regulate the expression of the DNA sequence to be cloned.
  • useful expression control sequences include the lac system, trp system, tac system, trc-system, major operator and promoter sites of phage lambda, regulatory sites of fd coat protein, glycolytic promoters of yeast, for example 3- Promoter of phosphoglycerate kinase, promoter of yeast acid phosphatase, for example Pho5, promoter of yeast alpha cross-factor and promoter derived from polyoma, adenovirus, retrovirus and simian virus, for example SV40 Later promoters and other sequences known to modulate the gene expression of prokaryotic or eukaryotic cells and their viruses and combinations thereof may be included.
  • the present invention relates to a recombinant cell transformed with the recombinant vector.
  • the recombinant cell contains a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the heavy chain variable region of the c-Met specific antibody and a polynucleotide encoding the light chain variable region of the c-Met specific antibody. It may be characterized in that the cells transformed with the recombinant vector.
  • the present invention relates to a method for producing a c-Met antibody or fragment thereof using the recombinant cell, characterized in that for culturing the recombinant cell, and separating the cMet specific antibody from the culture thereof,
  • the c-Met specific antibody according to the present invention is preferably obtained by expression and purification by gene recombination method, the gene sequence encoding the heavy chain variable region or the entire heavy chain region and the light chain variable region or the light chain whole region of the antibody.
  • Gene sequence encoding the can be expressed separately in one vector or two vectors, but is not limited thereto.
  • the method for producing a c-Met specific antibody comprises the steps of preparing a recombinant vector by inserting a nucleotide sequence encoding a c-Met specific antibody of the present invention into a vector; Culturing the recombinant vector in a host cell; It may comprise the step of separating and purifying the c-Met specific antibody from the cultured transformant.
  • c-Met specific antibodies can be produced, and the medium and culture conditions can be appropriately selected and used according to the host cell. Conditions such as temperature, pH of the medium and incubation time can be appropriately adjusted to be suitable for the growth of cells and the mass production of proteins during the culture.
  • c-Met specific antibodies as described above can be recovered from the medium or cell lysate. If membrane bound, it may be liberated from the membrane using a suitable surfactant solution (eg Triton-X 100) or by enzymatic cleavage.
  • a suitable surfactant solution eg Triton-X 100
  • Cells used for c-Met specific antibody expression can be disrupted by a variety of physical or chemical means, such as freeze-thaw purification, sonication, mechanical disruption or cytolysis, and can be isolated and purified by conventional biochemical separation techniques.
  • Electrophoresis centrifugation, gel filtration, precipitation, dialysis, chromatography (ion exchange chromatography, affinity chromatography, immunosorbent chromatography, size exclusion chromatography, etc.), isoelectric focusing and various variations and combinations thereof It is possible, but not limited to.
  • phage display library As a full human non-immune single chain antibody (ScFv) phage display library used for biopanning, the phage display library established in the existing patent (Korean Patent No. 10-0883430) was used. To recover phage displayed with single-chain antibodies, phage library stocks were grown to log phase and rescued with M13K07 helper phage (GE healthcare, USA), followed by 34 ⁇ g / ml Chlorampenicol, 1 mM IPTG was added and amplified overnight at 30 ° C. in 2 ⁇ YT medium (2x YT / Cm +, Kan +) containing 70 ⁇ g / ml Kanamycin (Kan).
  • Phage preparations are precipitated in 4% PEG6000 / 0.5 M NaCl and 2% containing 500 ⁇ g / ml of human Fc protein to remove phages showing anti-human Fc ScFv using human Fc and to block other nonspecific binding Resuspend in skim milk / PBS and incubate at 37 ° C. for 1 hour.
  • c-Met 100 ng of c-Met (R & D system) was reacted with 2% skim milk / PBS at 37 ° C. for 2 hours. After washing the microplates with PBS, the phages obtained by panning were reacted for 1 hour at room temperature. After the reaction solution was washed with PBS, HRP (Horse radish peroxidase) conjugated mouse anti-M13 antibody (GE healthcare) was reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the wells were colored using TMB solution (BD), and the absorbance was measured at 450 nm (FIG. 1).
  • pAK-1E4, pAK-1A5, pAK-1D9, pAK-2H3, pAK-3D1 and pAK-3F1 obtained through biopanning were digested with XbaI and EcoRI To obtain fragments having the sequences 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv and 3F1-ScFv, and to obtain the E.
  • coli expression vector (pET21b-6A6) obtained using the same restriction enzyme. , Novagen, USA) to complete the production of pET21b-1E4, pET21b-1A5, pET21b-1D9, pET21b-2H3, pET21b-3D1 and pET21b-3F1.
  • the prepared pET21b-1E4, pET21b-1A5, pET21b-1D9, pET21b-2H3, pET21b-3D1 and pET21b-3F1 were transformed into E.
  • coli BL21 (DE3) for protein expression, through which soluble ScFv protein After expression, the cells were centrifuged to remove periplasmic fractions of cells using 50 mM Tris (pH 8.0) solution containing 20% sucrose and 200 ⁇ g / ml lysozyme and protease inhibitor cocktail (Roche, Switzerland). periplasmic fraction). The obtained fractions were purified with ScFv protein using Ni-NTA spin Kit (QIAGEN, Germany).
  • the purified soluble 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv and 3F1-ScFv purified in Example 2 were confirmed to have binding capacity to c-Met.
  • 100ng of c-Met was coated overnight at 4 ° C in 96well NUNC-IMMUNO plate (Nunc, Denmark), and then reacted for 2 hours at 37 ° C using 2% skim milk / PBS. After the reaction plate was washed with PBS, the purified ScFv was added and allowed to react at room temperature for 1 hour. After the reaction plate was washed with PBS, HRP conjugated anti-Myc mouse antibody (Sigma, USA) was added for 1 hour at room temperature, and then reacted with TMB solution and the absorbance was measured at 450 nm.
  • heavy and light chain expression vectors containing the whole constant region were prepared.
  • pIgGHD vector with heavy chain skeleton of human 4-1 bb (Aprogen, Korea) was treated with SfiI, and the heavy chain variable region of pAKScFv was ligated with the fragment treated with SfiI, and the entire heavy chain constant region and heavy chain variable were Expression vectors including regions pIgGHD-1E4Hvy, pIgGHD-1A5Hvy, pIgGHD-1D9Hvy, pIgGHD-2H3Hvy, pIgGHD-3D1Hvy and pIgGHD-3F1Hvy were prepared (FIG. 3).
  • the pIgGLD vector (Aprogen, Korea) containing the light chain skeletal of human 4-1 bb was treated with BstXI, and the light chain variable region of pAK-ScFv was ligated with the fragment treated with BstXI.
  • PIgGLD-1E4Lgt, pIgGLD-1A5Lgt, pIgGLD-1D9Lgt, pIgGLD-2H3Lgt, pIgGLD-3D1Lgt, and pIgGLD-3F1Lgt were prepared as expression vectors including light chain variable regions (FIG. 4).
  • Equal amounts of light and heavy chain expression vectors were cotransfected into HEK-293T cells for IgG expression.
  • the transfected cells were cultured in serum free medium free sytle 293 (37 ° C., 5% CO 2) and the media collected.
  • the supernatant was injected into a Protein A column equilibrated with 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) and 100 mM NaCl solution, washed with a solution containing 20 mM sodium phosphate (pH 7.0), 1 mM EDTA, and 500 mM NaCl, followed by 0.1 containing 100 mM NaCl. Eluted with M Glycine-HCl (pH 3.3) solution. Eluted protein was neutralized with 1M Tris.
  • the eluted protein was mixed 1: 1 with 5 mM sodium phosphate (pH 6.0) buffer and then injected into a prepacked SP-sepharose (GE healthcare) column equilibrated with 5 mM sodium phosphate (pH 6.0) containing 50 mM NaCl.
  • the protein bound to the column was eluted with sodium phosphate (pH 7.0) buffer containing 50 mM NaCl and injected into prepacked Q-sepharose (GE healthcare) equilibrated with an elution buffer to obtain an unbound protein.
  • the obtained protein was concentrated to 30 Kd vivaspin20 (Sartorius) and dialyzed with PBS.
  • the dog kidney kidney epithelial cells MDCK-2 (Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells-2) were cultured. Incubated in DMEM with 5% fetal calf serum added to 24-well plates at a concentration of 2 x 10 4 cells / well. When cells grew well adhered to the plate after incubation for one day, the cells were treated with 10 ⁇ g / ml of antibody or 30 ng / ml or 50 ng / ml HGF. After 16 hours of incubation, the cells were stained with Chrystal violet (Sigma-aldrich, USA), and photographed to evaluate how dispersed cells were grown (FIG. 6).
  • Chrystal violet Sigma-aldrich, USA
  • c-Met-specific antibodies 1A5 and 1E4 to c-Met were measured by Western blotting.
  • HT29 cells a rectal cancer cell line overexpressing c-Met, were incubated for 24 hours in a 6-well plate at 2 ⁇ 10 5 cells for 10 hours after serum-free medium treatment for 6 hours in RPMI medium without fetal bovine serum.
  • HIgG and c-Met antibodies were pretreated for 30 minutes. Thereafter, the treated group was treated with 30 ng / ml of human HGF for 15 minutes.
  • lysis buffer 1% (w / v) SDS, 10 mM Tris (pH 7.4), 1 mM Na3VO4 (sodium orthovanadate), 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and 1 mM sodium fluoride, 1 X protease inhibitor cocktail (Sigma)) to obtain a lysate to boil, and then centrifuged for 5 minutes at 10,000 g at 4 °C to remove the insoluble precipitate. The supernatant was prepared by mixing with SDS sample buffer and boiling for 10 minutes.
  • SDS-PAGE and Western blotting were applied according to the methods commonly used in the art, and the samples used were: 4-20% SDS-polyacrylamide Gel (BioRad, USA), PVDF membrane (Millipore # IPVH00010, USA ), anti-c-Met antibodies (Santa Cruz, USA) and anti-phospho-c-Met antibodies (Cell Signaling technology, USA) as primary antibodies for c-Met phosphorylation activity assay; HRP-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Santa Cruze Biotechnology, USA) and HRP-conjugated as anti-p-Erk antibody (Cell Signaling technology, USA) and as a secondary antibody to bind primary antibody for chemiluminescence goat anti-rabbit IgG (Cell Signaling technology, USA) (FIG. 7).
  • Ka, kd and Kd values of the antibodies according to the invention ka (1 / Ms) kd (1 / s) KD (M) mouse c-Met-Fc 2.58 ⁇ 10 6 1.59 ⁇ 10 -3 6.15 ⁇ 10 -10 human c-Met-Fc 2.71 ⁇ 10 6 8.07 ⁇ 10 -4 2.98 ⁇ 10 -10
  • the c-Met specific antibody according to the present invention not only can specifically bind to c-Met with high affinity, but also has an agonist function.

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Abstract

본 발명은 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인간 Fv(ScFv) 파지 라이브러리로부터 분리된 c-Met에 높은 친화도 및 특이성을 가지는 완전 인간 항체 및 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포 및 상기 세포를 배양하여 c-Met 특이적 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체는 생체 내에서 c-Met의 활성을 효율적으로 조절할 수 있다.

Description

c-Met 특이적 인간 항체 및 그 제조방법
본 발명은 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인간 Fv(ScFv) 파지 라이브러리로부터 분리된 c-Met에 높은 친화도 및 특이성을 가지는 완전 인간 항체 및 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포 및 상기 세포를 배양하여 c-Met에 특이적 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
c-Met(mesenchymal-epithelial transition factor)은 세포 표면의 수용체이며, 수용체 타이로신(tyrosine) 카이네이즈 패밀리(receptor tyrosine kinase family)의 암 유전자(oncogene)로써, 50 kD의 세포외 도메인만으로 구성된 알파(α) 서브유닛과 세포외, 세포막 투과, 타이로신 카이네이즈 도메인(domain) 그리고 인산화와 관련된 타이로신 모티프(motif)로 구성된 총 145 kD의 베타(β) 서브유닛으로 구성되어 있음이 밝혀졌다(Dean et al., Nature, 4;318(6044):385, 1985; Park et al., PNAS, 84(18):6379, 1987, Maggiora et al., J. Cell Physiol., 173:183, 1997). 부적절한 c-Met이나 HGF의 발현은 여러 타입의 악성 종양과 연관이 되어있으며, 과발현될 경우 그 예후가 좋지 않다고 보고되어있다(www.vai.org/met, Eder et al., Clin. Cancer Res.,15:2207, 2009).
c-Met은 HGF에 반응하여, c-Met의 인산화를 통한 다양한 신호전달 경로를 자극하여 암세포 및 혈관세포의 분열(mitogenesis)과 세포의 운동성(motility)을 증진시키고, 세포사멸을 억제하며, 혈관형성과 세포외기질(ECM, extracellular matrix)로 침윤(invasion)과 전이(metastasis)를 유도하는 등 암화과정(transformation)을 촉진시킨다(Jeffers et al., J. Mol. Med., 74:505, 1996; Amicone et al., EMBO J.,16:495, 1997; Matsumoto and Nakamura, Biochem. Biophys. Res. Comm., 239:639, 1997; Corps et al., Int.J. Cancer, 73:151, 1997). 특히, 신경교종(gliomas, Koochekpour et al., Cancer Res., 57:5391, 1997), 유방암( Nagy et al., Surg. Oncol., 5:15,1996; Tuck et al., Am. J. Pathol., 148:225, 1996), 췌장암(Ebert et al., Cancer Res., 54:5775,1994), 흉막 중피종(pleural mesotheliomas, Tolpay et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 124:291, 1998); Klominek et al. Intl. J. Cancer, 76:240, 1998)등 다양한 암 조직과 세포에서 c-Met과 HGF가 동시에 과발현되는 것으로 보고되고 있지만, HGF와 상관없이 c-Met의 과발현을 통해서도 암으로의 발달이 진행되는 경우가 흔하게 관찰되고 있으며, 간암(hepatocellular carcinoma, Suzuki et al., Hepatology, 20(5):1231, 1996)), 위암(Taniguchi et al., Cancer, 82:2112-2122(1998), 폐암(Harvey et al., J. Pathol., 180:389, 1996), 신장암(Natali et al., Intl. J. Cancer, 69:212, 1996), 난소암(Nagy et al., J. Surg. Oncol., 60:95, 1995), 대장암(Hiscox et al., Cancer Invest., 15:513, 1997) 등이 그 좋은 예이다. 이와 같이 c-Met이 활성화되거나 과발현할 경우 암화 과정이 촉진되므로, c-Met의 활성화를 억제하는 여러 방법들이 유망한 항암 치료 전략으로서 개발되고 있다. 그 일례로써 c-Met에 ATP(adenosine triphosphate)가 결합하는 것을 방해하도록 고안된 저분자 화합물들이 있다. 이들 저분자 화합물들에는 Fermentek biotechnology사의 K252a, 수젠(Sugen)사의 SU11274, 파이저(Pfiza)사의 PHA-665752 등(Morotti et al., Oncogene, 21(32):4885, 2002; Berthou et al., Oncogene, 23(31):5387, 2004; Pfizer, Christensen et al., Cancer Res., 63(21):7345, 2003)이 있으며, 이들은 c-Met의 인산화를 방해하여, 신호 전달의 하류 단백질들이 활성화되지 못하도록 고안되었다. 그러나 이들 저분자 화합물의 단점은 c-Met에 의한 인산화만을 특이적으로 저해할 수 없다는 데 있다.
또한, HGF/c-Met 신호전달 기작을 중화하는 두 번째 방법으로서 c-Met과 그것의 리간드인 HGF의 결합을 저해하는 방법이 있다. 이러한 방법에는 손실된 HGF 단편(Matsumoto & Nakamura, Cancer Sci., 94(4):321,2003)이나, HGF를 중화하는 항체(Cao et al., PNAS., 98(13):7443, 2001; Kim et al., Clin. Cancer Res.,12:1292, 2006; Burgess et al., Cancer Res., 66(3):1721, 2006) 또는 원래의 HGF 보다 강한 친화력으로 c-Met에 결합하지만 c-Met을 활성화 시키지는 않는 HGF 전구체(pro-HGF, Mazzone et al., J. Clin. Invest., 114(10):1418, 2004)를 사용하는 방법 등이 있다. 아울러 파아지 디스플레이방법(phage display method) 및 패닝기술(panning technique)을 이용해 c-Met의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드(peptide) 서열을 선별함으로써, 해당 펩타이드를 c-Met 활성화 방지에 이용하기도 한다 (Kim et al., Biochem Biophys Res Commun., 354: 115, 2007). 선별된 펩타이드는 c-Met이 과발현된 생체내 조직이나 기관을 탐색하기 위한 분자 영상에 적용되기도 한다(Cao et al., Clin. Cancer Res., 13(20);6049, 2007). 이들은 오로지 HGF 의존적인 c-Met 활성화만 저해한다는 한계를 가지고 있으나, 실험실에서(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 실제 항암효과를 나타내고 있으므로, 기존의 항암치료와 병합하는 등의 응용을 통하여 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 또, EGFR(epidermal growth factor receptor) 카이네이즈 억제제인 gefitinib과 erlotinib은 효과적인 암 치료제로 사용되고 있으나, 종종 약제 내성이 생기기도 하는데, 그 원인이 c-Met 수용체의 집중적인 증폭에서 기인하는 것으로 보고된 바 있으며(Engelman et al., Science, 316(5827):1039, 2007), 따라서 c-Met 억제물을 병합처리 한다면 항암 효과가 증폭될 것으로 기대한다.
또한, c-Met은 HGF에 의해 활성화 되어, 그 자체로써 신생 혈관형성에 기여하는 것으로 잘 알려져 있고, 신생혈관형성의 주요 수용체인 VEGFR-2과 상호작용을 통하여, 신생혈관 형성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 이때, c-Met을 VEGFR-2와 동시에 타켓팅하여 저해할 경우, 인간 이종이식모델에서 종양 성장이 상승적으로 저해됨을 관찰할 수 있었다(Zhang et al.,IDrugs, 13:112, 2010).
HGF와 c-Met 간의 조절장애(dysregulation) 및 c-Met의 과발현은 전이암의 진행에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 따라서 c-Met에 대한 항체는 길항제(antagonist)로서 항암제로의 개발이 많이 이루어져 왔다.
이에 본 발명자들은 c-Met에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합할 수 있으며, 인간 유래 서열로 이루어져 체내 투여 시 면역반응 유발 가능성이 낮은 c-Met 인간항체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 단일쇄 Fv(ScFv) 파지 라이브러리(phage library)로부터 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여 c-Met에 높은 친화도 및 특이성을 가지고 결합하는 완전 인간 항체를 분리하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 c-Met에 높은 친화도 및 특이성을 가지는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 c-Met에 높은 친화도 및 특이성을 가지는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역; 및 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역을 포함하는 c-Met 특이적 항체 또는 이의 단편을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역 또는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 세포를 이용한 c-Met 특이 항체의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역을 제공하며, 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역을 제공하며, 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역;
을 포함하는 c-Met 특이적 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변영역과 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역 또는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 세포를 배양하여 c-Met 특이 항체를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 c-Met 특이 항체를 회수하는 단계를 포함하는 c-Met 특이 항체의 제조방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에서 스크리닝된 c-Met 특이적 ScFv의 c-Met 대한 결합능력을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 1E4-ScFv의 c-Met에 대한 결합능력을 나타낸 것이다.
도 3은 1E4-IgG의 중쇄불변영역과 중쇄가변영역을 포함하는 벡터인 pIGHD-1E4Hvy의 계열 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 IgG의 경쇄불변영역과 경쇄가변영역을 포함하는 벡터인 pIgGLD-1E4Lgt의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 1E4-IgG의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체의 분산능(scattering)을 MDCK-2 세포주를 통해서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체의 c-Met의 인산화능을 웨스턴블로팅을 통해서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체의 마우스 c-Met과 인간 c-Met에 대한 결합능력을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 항체는 c-Met에 높은 친화도(affinity)를 가지고 특이적(specific)으로 결합할 수 있으며, 인간에서 유래한 서열로 이루어져 있다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역;
을 포함하는 c-Met 특이적 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명에서는 단일쇄 Fv(ScFv) 파지 라이브러리(phage library)로부터 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여 c-Met에 높은 친화도 및 특이성을 가지고 결합하는 완전 인간 항체를 수득하였다. 파지 라이브러리의 제조 및 파지 디스플레이는 미국등록특허 제7063943호, 미국등록특허 제6172197호 등에 공지된 바와 같이 제조하여 실시할 수 있다.
상기 방법을 통해 수득되어 제공되는 본 발명에 따른 c-Met-특이적 항체는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 CDR1(HCDR1), 중쇄 가변영역 CDR2(HCDR2) 및 중쇄 가변영역 CDR3(HCDR3)을 포함하는 중쇄 가변영역과, 각각 서열번호 4, 5 및 6의 서열을 가지는 경쇄 가변영역 CDR1(LCDR1), 경쇄 가변영역 CDR2(LCDR2) 및 경쇄 가변영역 CDR3(LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 가진다.
본 발명의 일양태에서, 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체는 서열번호 7의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 서열을 가지는 경쇄 가변영역으로 이루어진 1E4 항체이다.
또한 본 발명은 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과 및 각각 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 제공한다. 바람직하게는 1E4 항체의 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변영역을 제공한다.
Figure PCTKR2015007899-appb-T000001
상기와 같은 본 발명에 따른 항체의 단편도 동일한 목적으로 사용가능한데, 본 발명에서의 항체의 단편은 c-Met에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd, ScFv, 도메인 항체, 이중특이항체들, 미니바디, 스캡, IgD 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 항체 불변영역의 유도체들, 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)에 기초한 인공항체 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니며, c-Met에 대한 결합 기능이 유지되는 한, 본 발명에 따른 항체의 단편도 본 발명에 따른 항체와 동일한 특성을 나타낼 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
본 발명에 따른 항체 단편은 전체 항체의 절단 또는 상기 단편을 코딩하는 DNA를 발현시켜 제조할 수 있다. 항체단편은 공지 문헌에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다 (Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235, 1983; Parham, J. Immunol., 131: 2895, 1983).
본 발명에서의 ScFv는 링커를 통해 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열이 서로 연결될 수 있는데, 링커는 아미노산 링커가 사용되는 것이 바람직하며, 본 발명에 따른 1E4 항체의 ScFv에서의 링커의 아미노산 서열은 서열번호 9, 전체 ScFv는 서열번호 10의 서열일 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 c-Met 특이 인간항체인 1E4의 경우, HGF 처리 없이도, c-Met을 인산화시키는 것을 확인하였으며, 개의 신장상피세포인 MDCK-2 세포를 이용하여 세포분산능을 확인한 결과, 양성대조군인 HGF 처리 세포군과 동일한 정도의 세포분산능을 나타내는 것을 확인하였다(도 6).
또한 본 발명의 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다. 그러한 예로서 가변영역에서의 아미노산의 보존적 치환(conservative substitution)을 들 수 있다. 보존적 치환은 원래의 아미노산 서열과 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하는데, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘은 염기 곁사슬을 가지고 있어 유사한 특성을 가지고, 아스파라틱산과 글루타믹산은 산 곁사슬을 가진다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 또한, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판은 비전하 극성 곁사슬을 가진다는 점에서 특성이 유사하며, 알라닌, 발린, 루신, 트레오닌, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌은 비극성 곁사슬을 가지고 있다는 점에서, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘은 방향족 곁사슬을 가지고 있다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 따라서, 상기와 같이 유사한 특성을 가지는 그룹 내에서의 아미노산 치환이 일어나더라도 별다른 특성 변화를 보이지 않을 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이므로, 본 발명에 따른 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 보존적 치환에 의한 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체에는 지정 돌연변이(direct mutation), 친화도 성숙(affinity maturation), 파아지 디스플레이(phage display) 또는 사슬 셔플링(chain shuffling) 등의 방법에 의해 친화도 및 특이성이 개선된 항체도 포함된다. 친화도 및 특이성은 CDR를 돌연변이 시키고, 목적하는 특징을 갖는 항원 결합 위치에 대해 스크리닝 함으로써 변형 또는 개선 될 수 있다(Yang et al., J. Mol. Bio., 254: 392,1995). CDR는 다양한 방식으로 돌연변이 될 수 있는데, 예를 들어 한 가지 방법으로, 동일한 항원 결합 위치의 집단에서 20개의 모든 아미노산이 특정 위치에서 발견되도록 개발 잔기 또는 잔기의 조합을 랜덤화시킬 수 있으며, 또한 돌연변이를 일으키는 오류 유발(error prone) PCR 방법에 의해 CDR 잔기의 범위에 걸쳐 돌연변이를 유발시킬 수도 있다(Hawkins et al., J. Mol. Bio., 226: 889, 1992). 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 가변성 부위(variable region) 유전자를 함유하는 파아지 디스플레이 벡터(phagemid)는 E. coli의 돌연변이 균주에서 번식된다 (Low et al., J. Mol. Biol., 250:359, 1996). 이러한 돌연변이 유발 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이다.
또한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 다른 물질과 접합된 복합체(conjugate)의 형태로도 이용가능하다. 이에 따라 본 발명에서는 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체와 치료용 약물이 결합된 항체-약물 접합체를 제공한다. 본 발명에 따른 항체-약물 접합체에 이용될 수 있는 치료용 약물은 본 발명의 목적에 부합되는 것이라면 어느 것이라도 제한없이 사용가능하다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물에는 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 및 부형제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 상기 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 가변영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 중쇄 가변영역의 경우 서열번호 11, 경쇄 가변영역의 경우 서열번호 12로 표시되는 서열을 가지는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며 축퇴성 서열(denegerate sequence), 즉 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 인코딩하지만 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 것도 사용가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하 '통상의 기술자'라 한다)에게는 자명한 것이며, 본 발명에서 제공되는 각 중쇄 및 경쇄의 CDR 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 역시 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 각 CDR 서열로부터 통상의 기술자라면 자명하게 도출할 수 있는 것이다.
본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
SEQ ID NO. 구분 서열
11 중쇄 가변영역 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaggatc tcctgtcagg gttctggata cagttttccc acccactgga tcacctgggt gcgccagatg cccgggaaag gcctggagtg gatgggaacg attgatccta ctgactctta caatttctat ggaccgtcgt tccaaggcca cgtcaccatc tcagccgaca gctccagcag caccgcctac ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagagatggc aactactatg atagtcgcgg ttattactac gatacttttg atatgtgggg ccaagggaca ctggtcaccg tctcctca
12 경쇄 가변영역 tccgacatcc agatgaccca gtctccatcc ttcctctctg catctgtcgg agacagagtc accatcactt gccgggccag tcagggcatc agtacttatt tagcctggta tcaacaaaaa ccagggacag cccctaaact cctgatctat tctgcatcca ctttggaaag tggggtccca tcgcgattca gcggaagtgg atccgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag cctgaagatt ctgcaactta ctattgtcaa caggctgaca gtttcccgct cactttcggc ggagggacca aggtggagat caaacgtgga ggagccagcc tcgtggaa
본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포, 그리고 상기 재조합 벡터 또는 숙주세포를 이용하여 본 발명에 따른 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 특히 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 제조하는 것이 바람직한데, 구체적으로 본 발명에 따른 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 가변영역을 각각 따로, 또는 하나의 숙주세포에서 동시에 발현시켜서 제조하는 것이 바람직하다. 또한 리더 서열(leader sequence)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 따른 항체의 N-말단에 위치하도록 하여 항체의 생산에 이용될 수 있다. 또한, 생산된 항체의 분리 정제 및 분석을 용이하게 하기 위하여 태그(tag)가 부착될 수 있는데, 대표적인 태그는 his-태그이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.
상기 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다.
외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.
본 발명에 따른 이중표적항체를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스, 베큘로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다.
세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 특히, 대장균에서의 발현을 위해서는 안트라닐레이트 합성효소 (TrpE)및 카르복시 말단의 폴리링커를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있으며, 다른 발현 벡터 시스템은 베타-갈락토시다제 (pEX); 람다 PL 말토스 결합 단백질 (pMAL); 및 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 (pGST)에 기초한다(Gene 67:31,1988; Peptide Research 3:167, 1990).
효모에서 발현 시키는 것이 요망되는 경우에, 효모에서 사용하기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trpl 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, 1979; Kingsman et al, 유전자, 7: 141, 1979). Trpl 유전자는 트립토판 내에서 성장하는 능력이 결핍된 효모의 뮤턴트 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85: 12, 1977). 따라서 효모 숙주 세포 게놈 내에 trpl 손상의 존재는 트립토판의 부재 하에 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게 leu2-결함 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 함유하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이며, 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
본 발명에서의 발현벡터에는 발현되는 DNA 서열 또는 단편에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 클로닝되는 DNA 서열의 발현을 제어 또는 조절하기 위해 벡터에 삽입된다. 유용한 발현조절 서열의 예는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc-시스템, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 부위, fd 코트 단백질의 조절부위, 효모의 당분해 (glycolytic) 프로모터, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제의 프로모터, 효모 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모알파 교배 인자의 프로모터 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 시미안 바이러스에서 유래한 프로모터, 예를 들어 SV40의 초기및 후기의 프로모터, 및 원핵 또는 진핵세포 및 이들의 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열 및 이들의 조합물이 포함될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 재조합 세포는 상기 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 세포를 이용한 c-Met 항체 또는 그 단편의 생산 방법에 대한 것으로, 상기 재조합 세포를 배양하고, 이의 배양물로부터 cMet 특이적 항체를 분리하는 것을 특징으로 하며,
바람직하게는 본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득하는 것이 바람직한데, 항체의 중쇄 가변영역 또는 중쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열 및 경쇄 가변영역 또는 경쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열을 하나의 벡터 또는 2개의 벡터에서 따로 발현시킬 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 c-Met 특이적 항체의 제조방법은 본 발명의 c-Met 특이적 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 배양하는 단계; 상기 배양된 형질전환체로부터 c-Met 특이적 항체를 분리, 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 c-Met 특이적 항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.
상기와 같이 재조합적으로 생산된 c-Met 특이적 항체는 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. c-Met 특이적 항체 발현에 사용된 세포는 동결-해동 순화, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 바이오패닝(Biopanning)
바이오패닝에 사용된 완전인간 비면역 단쇄 항체(ScFv) 파아지 디스플레이 라이브러리는 기 등록특허(한국등록특허 10-0883430)에서 확립된 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하였다. 단쇄 항체가 디스플레이된 파아지를 회수하기 위해서, 파지 라이브러리 원액을 대수기(log phase)까지 성장시키고, M13K07 헬퍼 파아지(GE healthcare, USA)로 구제(rescue)한 후, 34μg/ml의 클로람페니콜(Chlorampenicol, Cm)과 70μg/ml의 카나마이신(Kanamycin, Kan)을 함유하는 2x YT 배지(2x YT/Cm+, Kan+)에서 1 mM IPTG를 첨가하여 30℃ 에서 하룻밤 증폭시켰다.
인간 Fc를 이용하여 항-인간 Fc ScFv를 나타내는 파아지를 제거하고, 다른 비특이적 결합을 차단시키기 위해 파아지 제제를 4% PEG6000/0.5 M NaCl 중에서 침전시키고, 500μg/ml의 인간 Fc 단백질을 함유하는 2% 탈지유/PBS 내에 재현탁시키고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
c-Met-Fc(R&D systems사, Recombinant human HGF R/c-Met Fc chimera (cat no. 358-MT/CF) 5㎍/㎖로 코팅된 96 well NUNC-IMMUNO plate (Nunc, Denmark)를 실온에서 2시간 동안 2% 탈지우유/PBS로 먼저 차단시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 3X 1011pfu의 파아지 제제를 접종하였다. 상기 튜브를 PBST(0.1% Tween 20을 함유하는 PBS)로 5회 세척한 다음 PBS로 5회 세척하였다. 결합형 파아지를 실온에서 10분 동안 100 mM 트리에틸아민의 용액을 사용하여 용출시켰다. 용출된 파아지를 10ml의 미드로그(mid-log)기 XL1-Blue 세포와 함께 37℃에서 30분 동안 정치시킨 후, 30분 동안 진탕배양하였다. 이어서 감염된 XL1-Blue 세포를 1% glucose가 함유된 2x YT/Cm+ 플레이트에서 30℃ 하룻밤 배양하였다. 1차 패닝 이후 2차, 3차, 4차의 패닝은 세척횟수를 10회, 15회, 20회로 순차적으로 증가시켜 실시하였다. 4차 패닝을 실시한 후 확보된 파아지의 c-Met 결합능력을 c-Met 결합에세이를 통하여 다시 한번 확인하였다.
Met 결합에세이를 위하여 100 ng의 c-Met (R&D system)을 하룻밤 동안 코팅한 마이크로플레이트에 2% 탈지우유/PBS로 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 상기 마이크로플레이트를 PBS로 세척한 후 패닝별로 얻어진 파아지를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액을 PBS 세척후, HRP(Horse radish peroxidase) conjugated mouse anti-M13 항체(GE healthcare)를 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 well을 TMB 용액 (BD)을 이용하여 발색을 시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 1).
그 결과, 1E4, 1A5, 1D9, 2H3, 3D1 및 3F1이 c-Met에 결합능력을 갖고 있음이 확인되었다.
실시예 2: 가용성 ScFv의 생산 및 정제
실시예 1에서 c-Met 결합능이 확인된 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv 및 3F1-ScFv에 대하여, 가용성 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv 및 3F1-ScFv를 제조하기 위하여, biopanning을 통해서 확보한 pAK-1E4, pAK-1A5, pAK-1D9, pAK-2H3, pAK-3D1 및 pAK-3F1를 XbaI과 EcoRI으로 절단하여 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv 및 3F1-ScFv 서열을 가지는 단편을 확보하였고, 상기 단편을 동일한 제한효소를 이용하여 확보한 대장균 발현벡터(pET21b-6A6, Novagen, 미국)에 삽입함으로써 pET21b-1E4, pET21b-1A5, pET21b-1D9, pET21b-2H3, pET21b-3D1 및 pET21b-3F1 제작을 마쳤다. 상기 제작된 pET21b-1E4, pET21b-1A5, pET21b-1D9, pET21b-2H3, pET21b-3D1 및 pET21b-3F1는 단백질 발현을 위하여 E.coli BL21(DE3)에 형질전환시켰으며, 이를 통해서 가용성 ScFv 단백질을 발현시킨 후, 세포를 원심분리하여, 20% 수크로오스와 200 μg/ml의 라이소자임 및 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche, 스위스)이 함유된 50 mM Tris (pH 8.0) 용액을 이용하여 세포의 페리플라스믹 분획(periplasmic fraction)을 확보하였다. 확보된 분획을 Ni-NTA spin Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 ScFv 단백질을 정제하였다.
실시예 3 : ScFv를 이용한 c-Met 결합 어세이
실시예 2에서 정제된 가용성 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv 및 3F1-ScFv가 c-Met에 대한 결합 능력이 있는지를 확인하였다. 이를 위하여 c-Met 100ng을 96well NUNC-IMMUNO plate (Nunc, Denmark)에서 4℃에서 하룻밤 동안 코팅한 다음, 2% 탈지우유/PBS를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트를 PBS로 세척한 후, 정제된 ScFv를 넣은 후 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트를 PBS를 이용하여 세척한 후 HRP conjugated anti-Myc 마우스 항체(Sigma, USA)를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 다음, TMB 용액으로 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 정제된 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv 및 3F1-ScFv 모두 c-Met에 결합능력을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 4: IgG 발현 및 정제
전체 IgG의 형태로 발현시키기 위하여 전체 불변영역을 포함하는 중쇄및 경쇄 발현 벡터를 제조하였다. 중쇄의 경우는 human 4-1 bb의 중쇄골격을 가지고 있는 pIgGHD 벡터 (Aprogen, 한국)를 SfiI으로 처리한 후 pAKScFv의 중쇄 가변영역을 SfiI으로 처리한 단편과 라이게이션하여 전체 중쇄불변영역과 중쇄가변영역을 포함하는 발현벡터인 pIgGHD-1E4Hvy, pIgGHD-1A5Hvy, pIgGHD-1D9Hvy, pIgGHD-2H3Hvy, pIgGHD-3D1Hvy 및 pIgGHD-3F1Hvy를 제작하였다 (도 3).
경쇄의 경우는 human 4-1 bb의 경쇄골격을 가지고 있는 pIgGLD 벡터 (Aprogen, 한국)를 BstXI으로 처리한 후pAK-ScFv의 경쇄 가변영역을 BstXI으로 처리한 단편과 라이게이션하여 전체 경쇄불변영역과 경쇄가변영역을 포함하는 발현벡터인 pIgGLD-1E4Lgt, pIgGLD-1A5Lgt, pIgGLD-1D9Lgt, pIgGLD-2H3Lgt, pIgGLD-3D1Lgt 및 pIgGLD-3F1Lgt를 제작하였다 (도 4).
IgG 발현을 위해 동량의 경쇄 발현벡터와 중쇄 발현벡터를 HEK-293T세포에 공동 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시킨 세포는 serum free medium Free sytle 293에서 배양시킨(37℃, 5% CO2)후 배지를 수집하였다. 제조자에 의해 기술된 프로토콜에 따라 protein A 컬럼 (GE healthcare, USA)을 사용하여 친화 크로마토그래피에 의해 합한 상청액으로부터 1E4-IgG, 1A5-IgG, 1D9-IgG, 2H3-IgG, 3D1-IgG 및 3F1-IgG를 정제하였다. 상청액을 20mM sodium phosphate(pH 7.0)과 100mM NaCl 용액으로 평형화시킨 protein A 칼럼에 주입하고 20mM sodium phosphate (pH 7.0) 과 1mM EDTA, 500mM NaCl가 포함된 용액으로 세척한 다음, 100mM NaCl이 포함된 0.1M Glycine-HCl (pH 3.3)용액으로 용출하였다. 용출된 단백질은 1M Tris로 중화시켰다. 용출된 단백질을 5 mM sodium phosphate (pH 6.0) 버퍼와 1:1로 섞은 후 50 mM NaCl가 함유된 5 mM sodium phosphate (pH 6.0)로 평형화시킨 prepacked SP-sepharose (GE healthcare) 칼럼 주입하였다. 컬럼에 결합된 단백질은 50mM NaCl가 함유된 sodium phosphate (pH 7.0) 버퍼로 용출하고 용출버퍼로 평형화시킨 prepacked Q-sepharose (GE healthcare)에 주입하여 결합하지 않은 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질은 30 Kd vivaspin20 (Sartorius)으로 농축하고 PBS로 투석하였다. 상기 방법으로 정제된 1E4-IgG, 1A5-IgG, 1D9-IgG, 2H3-IgG, 3D1-IgG 및 3F1-IgG 단백질 중 일부의 SDS-PAGE 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 5: c-Met 특이적 항체의 분산능(scattering) 분석
상기 6 종의 c-Met 특이적 항체의 분산능(scattering)을 알아보기 위하여, 개의 신장상피세포인 MDCK-2(Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells-2)을 배양하였다. 2 ×104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 5% 우태혈청이 첨가된 DMEM으로 배양하였다. 하룻동안 배양 후 세포가 플레이트에 잘 붙어서 자랐을 때, 10μg/ml의 항체 또는 30ng/ml 또는 50ng/ml HGF를 처리하였다. 16시간 배양 후 Chrystal violet (Sigma-aldrich, 미국)으로 염색하여, 사진을 찍어 세포가 얼마나 분산되어 성장하는지를 평가하였다(도 6).
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 6종의 항체 중 1E4를 처리한 경우는에만 양성대조군인 HGF 처리군과 마찬가지로 세포가 분산되어 자라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 웨스턴 블로팅법을 통한 세포내 c-Met 인산화 분석
실시예 5에서 보인 1E4의 작용제(agonist)로서의 활성을 재확인하기 위하여 웨스턴 블로팅법을 통해 c-Met 특이적 항체인 1A5와 1E4의 c-Met에 대한 인산화 활성을 측정하였다. c-Met을 과발현하는 직장암 세포주인 HT29 세포를 2×105 씩 6웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하여, 우태혈청을 포함하지 않는, RPMI 배지 조건에서 6시간 무혈청배지 처리후, 10 ㎍/ml의 hIgG와 c-Met 항체들을 30분간 선 처리하였다. 이후, 처리군에 30 ng/ml의 인간 HGF를 15분간 처리하였다.
웨스턴 블로팅법을 통한 분석을 위해서, 용균완충액(1%(w/v) SDS, 10 mM Tris(pH 7.4), 1 mM Na3VO4 (sodium orthovanadate), 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and 1 mM sodium fluoride, 1 X protease inhibitor cocktail(Sigma))을 처리하여 용해질을 얻어 끓인 후, 4℃에서 10,000 g로 5분간 원심분리하여 비용해성 침전물을 제거하였다. 상층액을 SDS 샘플 버퍼와 섞어 10분간 끓여 준비하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법을 준용하였으며, 사용된 시료는 다음과 같다: 4-20% SDS-polyacrylamide Gel(BioRad, 미국), PVDF 멤브레인(Millipore #IPVH00010, 미국), c-Met 인산화 활성 분석을 위한 1차 항체로 anti-c-Met 항체(Santa Cruz, 미국)와 anti-phospho-c-Met 항체(Cell Signaling technology, 미국); anti-p-Erk 항체(Cell Signaling technology, 미국)와 그리고 화학발광법을 위해 1차 항체와 결합할 2차 항체로써 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG 항체(Santa Cruze Biotechnology, 미국) 및 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG(Cell Signaling technology, 미국)(도 7).
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 1E4의 경우는 단독처리 시에도 c-Met에 대한 인산화능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 항 c-Met IgG(1E4-IgG)의 결합력 분석
c-Met에 대한 항체의 결합력을 분석하기 위하여 BIAcore (GE healthcare)를 이용하여 측정하였다. 제조자의 매뉴얼에 따라 CM5 칩 (GE healthcare, 스웨덴)상에 mouse-c-Met 과 human-c-Met (R&D system)을 고정한 후 다양한 양의 항체를 흘려줌으로써 센서그램을 확보하였다. 각각의 농도에서 확보된 센서그램을 바탕으로 속도상수 kon 및 koff를 측정하고 속도상수의 비 koff/kon으로부터 Kd를 계산하였다 (표 3). 그 결과, 1E4-IgG는 human-c-Met 뿐만 아니라 mouse-c-Met과도 높은 결합력을 나타내었다 (도 8).
본 발명에 따른 항체의 ka, kd 및 Kd 값
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
mouse c-Met-Fc 2.58×106 1.59×10-3 6.15×10-10
human c-Met-Fc 2.71×106 8.07×10-4 2.98×10-10
본 발명에 따른 c-Met 특이적 항체는 c-Met에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합할 수 있을 뿐 아니라, 작용제(agonist) 기능을 가지고 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역.
  2. 제1항에 있어, 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역.
  3. 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 c-Met 특이적 항체의 경쇄 가변영역;
    을 포함하는 c-Met 특이적 항체 또는 이의 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 cMet 특이적 항체 또는 이의 단편.
  7. 제5항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 cMet 특이적 항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 cMet 특이적 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제8항에 따른 cMet 특이적 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  11. 제11항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  12. 제11항에 따른 숙주세포를 배양하고, 이의 배양물로부터 cMet 특이적 항체를 분리하는 것을 특징으로 하는 cMet 특이적 항체의 제조방법.
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