ES2881576T3

ES2881576T3 - Anticuerpo humano específico de C-MET y procedimiento de preparación del mismo

Info

Publication number: ES2881576T3
Application number: ES15829801T
Authority: ES
Inventors: Jinsang Yoo; Ju Ryoung Nam; Jin San Yoo; Sung-Woo Kim; Weon Sup Lee; Sang Ryeol Shim; Sang Soon Byun; Miju Park; Hyuk Joon Lee; Do Yun Kim; Yeon Ju Kim; Mi Ae Jeon; Jinhee Choi; Youngae Lee; Kyoung Hee Nahm; Boyoung Jeong; Seon Young Lee; Jong Geun Jeong; Jae Bong Yoon; Nam Ye Kim
Original assignee: Pharmabcine Inc
Current assignee: Pharmabcine Inc
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2021-11-29
Anticipated expiration: 2035-07-28
Also published as: CN107108737A; WO2016021864A9; EP3196211B1; EP3196211A1; EP3196211A4; JP2017523812A; US20170233492A1; US10106622B2; WO2016021864A1; JP6434147B2; CN107108737B; KR101615619B1; KR20160017918A

Abstract

Un anticuerpo específico de c-Met o fragmentos de unión a antígeno del mismo que comprenden: una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:7; y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:8.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo humano específico de C-MET y procedimiento de preparación del mismo

[Campo técnico]

La presente divulgación se refiere a un anticuerpo específicamente unido a c-Met (en lo sucesivo, denominado anticuerpo específico de c-Met) o fragmentos del mismo, y más específicamente, a un anticuerpo totalmente humano que tiene alta afinidad y especificidad por c-Met aislado de una biblioteca de fagos Fv(ScFv) humanos, un polinucleótido que codifica el anticuerpo, un vector recombinante que contiene el polinucleótido, una célula transformada con el vector recombinante, y un procedimiento para producir el anticuerpo específico de c-Met cultivando la célula.

[Técnica antecedente]

Se encontró que el c-Met (factor de transición mesenquimal-epitelial) es un receptor de la superficie celular y un gen del cáncer (oncogén) de la familia de los receptores tirosina quinasa, y está configurado por la subunidad alfa (a), que consiste en 50 kD de dominios extracelulares, y la subunidad beta (p), que consiste en un total de 145 kD de motivos de tirosina relacionados con la permeación de la membrana celular, el dominio tirosina quinasa y la fosforilación (Dean et al., Nature, 4;318(6044):385, 1985; Park et al., PNAS, 84(18):6379, 1987, Maggiora et al., J. Cell Physiol, 173:183, 1997). Se ha informado de que la expresión de c-Met o HGF inadecuada está relacionada con diversos tipos de tumores malignos, y cuando se sobreexpresa, el pronóstico no es bueno (www.vai.org/met, Eder et al., Clin. Cancer Res.,15:2207, 2009).

La c-Met responde al HGF y estimula diversas vías de transducción de señales a través de la fosforilación de la c-Met para promover la transformación, es decir, para promover la mitogénesis de las células tumorales y las células de los vasos sanguíneos y la motilidad de las células, inhibe la muerte celular, e induce la angiogénesis, y la invasión y la metástasis a una matriz extracelular (ECM), etc. (Jeffers et al., J. Mol. Med., 74:505, 1996 Amicone et al., EMBO J.,16:495, 1997 Matsumoto and Nakamura, Biochem. Biophys. Res. 239:639, 1997 Corps et al., Int.J. Cáncer, 73:151, 1997). En particular, se ha informado de que la c-Met y el h Gf se sobreexpresan simultáneamente en diversos tejidos y células cancerosas, tales como glioma (Koochekpour et al., Cancer Res., 57:5391, 1997), el cáncer de mama (Nagy et al., Surg. Oncol, 5:15,1996 Tuck et al., Am. J. Pathol., 148:225, 1996), cáncer de páncreas (Ebert et al., Cancer Res., 54:5775, 1994), mesotelioma pleural (Tolpay et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol, 124:291, 1998); (Klominek et al. Intl. J. Cancer, 76: 240, 1998), etc. Sin embargo, se han observado con frecuencia casos en los que el desarrollo hacia el cáncer progresa por la sobreexpresión de c-Met independientemente del HGF. Por ejemplo, hay cáncer de hígado (carcinoma hepatocelular, Suzuki et al., Hepatology, 20 (5): 1231, 1996), cáncer gástrico (Taniguchi et al., Cancer, 82^:2112-2122 ^{(1998)), cáncer de pulmón (Harvey et al., J. Pathol, 180:. 389, 1996), cáncer de riñón (Natali et al., Intl.}J. Cancer, 69:212, 1996), cáncer de ovario (Nagy et al, J. Surg. Oncol, 60:95, 1995), cáncer colorrectal (Hiscox et al., Cancer Invest., 15:513, 1997), etc., como buenos ejemplos. Cuando c-Met se activa o se sobreexpresa, se promueve la transformación como se ha descrito anteriormente, de tal manera que se han desarrollado diversos procedimientos para inhibir la activación de c-Met como estrategia terapéutica prometedora contra el cáncer. Como ejemplos de ello, existen compuestos de bajo peso molecular que están diseñados para interferir con la unión del ATP (adenosín trifosfato) a la c-Met. Los compuestos de bajo peso molecular incluyen K252a (Fermentek Biotechnology), SU11274 (Sugen), PHA-665752 (Pfiza), etc., (Morotti et al., Oncogene, 21(32):4885, 2002 Berthou et al., Oncogene, 23(31):5387, 2004 Pfizer, Christensen et al., Cancer Res., 63(21):7345, 2003), y estos ejemplos fueron diseñados para interferir con la fosforilación de c-Met, de tal manera que las proteínas de transferencia de señales que se encuentran corriente abajo no se activan. Sin embargo, los compuestos de bajo peso molecular tienen la desventaja de que no son capaces de inhibir específicamente la fosforilación por c-Met.

Además, como segundo procedimiento para neutralizar el mecanismo de transferencia de señalización de HGF/c-Met, existe un procedimiento para inhibir la unión de c-Met y HGF que es un ligando de c-Met. El procedimiento de inhibición de la unión de c-Met y h Gf incluye un procedimiento de uso de fragmentos perdidos de HGF (Matsumoto & Nakamura, Cancer Sci., 94(4):321,2003), anticuerpos que neutralizan el HGF (Cao et al., PNAS., 98(13):7443, 2001; Kim et al., Clin. Cancer Res.,12:1292, 2006 Burgess et al., Cancer Res., 66(3): 1721, 2006), o precursores de1HGF (pro-HGF, Mazzone et al., J. Clin. Invest, 114(10):1418, 2004) que no activan la c-Met pero se unen a la c-Met con mayor afinidad que el HGF original. Además, se seleccionan secuencias peptídicas capaces de inhibir la actividad de c-Met mediante un procedimiento de visualización de fagos y una técnica de selección, de tal manera que los péptidos correspondientes se utilizan para impedir la activación de c-Met (Kim et al., Biochem Biophys Res Commun, 354: 115, 2007). Los péptidos seleccionados se aplican a la obtención de imágenes moleculares para la búsqueda in vivo de tejidos u órganos en los que se sobreexpresa c-Met (Cao et al., Clin. Cancer Res., 13(20);6049, 2007). Los péptidos seleccionados tienen la limitación de que la activación de c-Met dependiente de1HGF sólo se inhibe, pero los efectos anticancerígenos se muestran realmente in vitro o in vivo, por lo que se cree que los péptidos seleccionados se utilizan eficazmente mediante aplicaciones tales como la combinación con la quimioterapia existente, etc. Además, el gefitinib y el erlotinib, que son inhibidores de la quinasa de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), se utilizan como agentes terapéuticos eficaces contra el cáncer, pero con frecuencia presentan resistencia a los fármacos, y se ha informado de que la razón de ello es una intensa amplificación del receptor c-Met (Engelman et al., Science, 316(5827):1039, 2007), y en consecuencia, se espera que cuando los inhibidores de c-Met se fusionen, se amplifiquen los efectos anticancerígenos.

Además, es bien sabido que la c-Met es activada por el HGF para contribuir a la angiogénesis por sí misma, y estimula la angiogénesis a través de la interacción con el VEGFR-2, que es el principal receptor de la angiogénesis. Aquí se pudo observar que cuando se logra la inhibición dirigiéndose simultáneamente a c-Met y a VEGFR-2, el crecimiento del tumor se inhibe sinérgicamente en un modelo de xenoinjerto humano (Zhang et al.,IDrugs, 13:112, 2010).

Se sabe que la desregulación entre HGF y c-Met y la sobreexpresión de c-Met desempeñan un papel importante en la progresión del cáncer metastásico y, en consecuencia, el anticuerpo para c-Met se ha desarrollado en gran medida como antagonista en los agentes contra el cáncer.

Los anticuerpos humanos que se unen a c-Met se divulgan en los documentos US2013/129731, WO2005/016382, US2014/193431 y WO2011/110642.

Por lo tanto, los presentes inventores se esforzaron por desarrollar un anticuerpo humano de c-Met capaz de unirse específicamente a c-Met con alta afinidad y que consistiera en secuencias derivadas de humanos para tener un bajo potencial inducido por la respuesta inmune tras la administración in vivo, y como resultado, separaron un anticuerpo totalmente humano unido a c-Met con alta afinidad y especificidad de la biblioteca de fagos Fv(ScFv) de cadena única utilizando un procedimiento de visualización de fagos, y completaron la presente divulgación.

[Divulgación]

[Problema técnico]

Todavía otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un anticuerpo específico de c-Met que incluya la región variable de la cadena pesada del anticuerpo específico de c-Met; y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo específico de c-Met o fragmentos de la misma.

Todavía otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un polinucleótido que codifique la región variable de la cadena pesada del anticuerpo específico de c-Met o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo específico de c-Met.

Todavía otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un vector recombinante que contenga el polinucleótido y una célula recombinante transformada con el vector recombinante.

Todavía otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un procedimiento para producir el anticuerpo específico de c-Met utilizando la célula recombinante.

[Solución técnica]

Con el fin de lograr los objetos anteriores, la presente divulgación proporciona una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo específico de c-Met que incluye una región variable de la cadena pesada CDR1 representada por una secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 1; una región variable de la cadena pesada CDR2 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y una región variable de la cadena pesada CDR3 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, y preferentemente, proporciona una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo específico de c-Met que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.

Además, la presente divulgación proporciona una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo específico de c-Met que incluye una región variable de la cadena ligera CDR1 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; una región variable de la cadena ligera CDR2 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y una región variable de la cadena ligera CDR3 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, y preferentemente, proporciona una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo específico de c-Met que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

Además, la presente divulgación proporciona un anticuerpo específico de c-Met que incluye: una región variable de la cadena pesada del anticuerpo específico de c-Met que incluye una región variable de la cadena pesada CDR1 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; una región variable de la cadena pesada CDR2 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y una región variable de la cadena pesada c DR3 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo específico de c-Met que incluye una región variable de la cadena ligera CDR1 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; una región variable de la cadena ligera CDR2 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y una región variable de la cadena ligera CDR3 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o sus fragmentos.

El anticuerpo específico de c-Met o los fragmentos del mismo de acuerdo con la presente invención incluyen la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO: 7 y la región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 8.

Además, la presente divulgación proporciona un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo específico de c-Met o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo específico de c-Met.

Además, la presente divulgación proporciona un vector recombinante que contiene el polinucleótido, y una célula recombinante transformada con el vector recombinante.

Además, la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo específico de c-Met que incluye producir el anticuerpo específico de c-Met cultivando la célula recombinante; y recuperar el anticuerpo específico de c-Met producido.

[Descripción de los dibujos]

La FIG. 1 muestra una capacidad de unión a c-Met, de la ScFv específica de c-Met que se examina en la presente divulgación.

La FIG. 2 muestra una capacidad de unión a c-Met, de 1E4-ScFv de acuerdo con la presente divulgación.

La FIG. 3 muestra un mapa de pIgGHD-1E4Hvy que es un vector que incluye una región constante de cadena pesada y una región variable de la cadena pesada de 1E4-IgG.

La FIG. 4 muestra un mapa de pIgGLD-1E4Lgt que es un vector que incluye una región constante de cadena ligera y una región variable de la cadena ligera de 1E4-IgG.

La FIG. 5 muestra los resultados de SDS-PAGE de la 1E4-IgG purificada.

La FIG. 6 muestra los resultados obtenidos al confirmar la dispersión del anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación, a través de una línea celular MDCK-2.

La FIG. 7 muestra los resultados obtenidos al confirmar la capacidad de fosforilación del anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación, mediante transferencia western .

La FIG. 8 muestra las capacidades de unión a c-Met de ratón y a c-Met humano, del anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación.

[Mejor modo]

En la medida en que no se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que generalmente aprecian los expertos en la técnia a la que pertenece la presente divulgación. En general, la nomenclatura utilizada en la presente memoria descriptiva y los procedimientos experimentales que se describirán a continuación son bien conocidos y generalmente utilizados en el presente campo técnico.

Un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación es capaz de unirse específicamente a c-Met con alta afinidad y consiste en secuencias derivadas de humanos.

En un aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo específico de c-Met que incluye: una región variable de la cadena pesada CDR1 representada por una secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 1, una región variable de la cadena pesada CDR2 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y una región variable de la cadena pesada CDR3 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

En otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo específico de c-Met que incluye: una región variable de la cadena ligera CDR1 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, una región variable de la cadena ligera CDR2 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, y una región variable de la cadena ligera CDR3 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo específico de c-Met que incluye: una región variable de la cadena pesada del anticuerpo específico de c-Met que incluye una región variable de la cadena pesada CDR1 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, una región variable de la cadena pesada CDR2 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y una región variable de la cadena pesada CDR3 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo específico de c-Met que incluye una región variable de la cadena ligera CDR1 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, una región variable de la cadena ligera CDR2 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, y una región variable de la cadena ligera CDR3 representada por una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o sus fragmentos.

Específicamente, la presente divulgación obtuvo un anticuerpo totalmente humano unido a c-Met con alta afinidad y especificidad a partir de una biblioteca de fagos de cadena única Fv(ScFv) utilizando un procedimiento de visualización de fagos. La biblioteca de fagos y la visualización de fagos pueden prepararse mediante las siguientes Patentes conocidas de EE.UU. n° 7.063.943, Patente de EE.UU.n° 6.172.197, etc.

El anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación obtenido y proporcionado por el procedimiento tiene la región variable de la cadena pesada que incluye la región variable de la cadena pesada CDR1 (HCDR1), la región variable de la cadena pesada CDR2 (HCDR2) y la región variable de la cadena pesada CDR3 (HCDR3) que tienen secuencias de la SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, respectivamente, y la región variable de la cadena ligera que incluye la región variable de la cadena ligera CDR1 (LCDR1), la región variable de la cadena ligera CDR2 (LCDR2) y la región variable de la cadena ligera CDR3 (LCDR3) que tienen secuencias de la SEQ ID NOS: 4, 5 y 6, respectivamente.

El anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente invención es el anticuerpo 1E4 que consiste en una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 8.

Además, la presente divulgación proporciona la región variable de la cadena pesada que incluye HCDR1, HCDR2 y HCDR3 representada por la SEQ ID NOS: 1, 2 y 3, respectivamente, y la región variable de la cadena ligera que incluye LCDR1, LCDR2 y LCDR3 representada por la s Eq ID NOS: 4, 5 y 6, respectivamente. Preferentemente, la presente divulgación proporciona la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO: 7 del anticuerpo 1E4 y la región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 8 del anticuerpo 1E4.

Tabla 1] Secuencias de la CDR y la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación

continuación

El fragmento del anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación, como se ha descrito anteriormente, es utilizable con el mismo propósito. El fragmento del anticuerpo de la presente divulgación incluye anticuerpos de cadena simple, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fd, ScFv, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, scab, anticuerpos IgD, anticuerpos IgM, anticuerpos IgG1, anticuerpos IgG2, anticuerpos IgG3, anticuerpos IgG4, derivados de la región constante del anticuerpo, anticuerpos artificiales basados en andamios proteicos, etc. que tienen la capacidad de unión a c-Met, pero la presente divulgación no se limita a ellos. Es obvio para un experto en la técnica que el fragmento del anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación también tiene las mismas características que el anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación siempre que se mantenga la función de unión a c-Met.

El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede producirse cortando el anticuerpo completo o expresando el ADN que codifica el fragmento. El fragmento de anticuerpo puede producirse por el procedimiento descrito en el documento conocido (Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235, 1983; Parham, J. Immunol, 131: 2895, 1983).

En el ScFv de la presente divulgación, las secuencias de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera pueden estar unidas entre sí a través de un enlazador, en el que el enlazador es preferentemente un enlazador de aminoácidos, y la secuencia de aminoácidos del enlazador en el ScFv del anticuerpo 1E4 de acuerdo con la presente invención puede ser una secuencia de la SEQ ID NO: 9, y todos los ScFv pueden ser una secuencia de la SEQ ID NO: 10.

En una realización ejemplar de la presente divulgación, en el caso de 1E4 que es el anticuerpo humano específico de c-Met, se confirmó que c-Met estaba fosforilado sin tratamiento de HGF, y como resultado obtenido al confirmar la dispersión celular utilizando una célula MDCK-2 que es una célula epitelial de riñón de perro, se confirmó el mismo nivel de dispersión celular que un grupo de células tratadas con HGF que es un grupo de control positivo (FIG. 6).

Además, los anticuerpos que se modifican en la región variable también se incluyen en el ámbito de la presente divulgación siempre que se mantengan las características del anticuerpo de la presente divulgación. Como ejemplo de ello, se puede incluirla sustitución conservadora de aminoácidos en la región variable. La sustitución conservadora significa la sustitución con otro residuo de aminoácido que tenga características similares a la secuencia original de aminoácidos, y por ejemplo, la lisina, la arginina y la histidina tienen características similares en cuanto a que tienen cadenas laterales básicas, y el ácido aspártico y el ácido glutámico tienen características similares en cuanto a que tienen cadenas laterales ácidas. Además, la glicina, la asparagina, la glutamina, la serina, la treonina, la tirosina, la cisteína y el triptófano tienen características similares por tener cadenas laterales polares no cargadas, y la alanina, la valina, la leucina, la treonina, la isoleucina, la prolina, la fenilalanina y la metionina tienen características similares por tener cadenas laterales no polares, y la tirosina, la fenilalanina, el triptófano y la histidina tienen características similares por tener cadenas laterales aromáticas. Por lo tanto, es obvio para un experto en la técnica que, aunque se produzcan sustituciones de aminoácidos en el grupo descrito anteriormente con características similares, no se muestran cambios característicos significativos, de tal manera que los anticuerpos que se modifican debido a sustituciones conservadoras en la región variable también se incluyen en el ámbito de la presente divulgación siempre que se mantengan las características del anticuerpo de la presente divulgación.

Además, el anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación incluye anticuerpos con afinidad y especificidad mejoradas por procedimientos tales como la mutación directa, la maduración por afinidad, la visualización de fagos, la combinación aleatoria de cadenas, etc. La afinidad y la especificidad pueden modificarse o mejorarse mediante la mutación de CDR y el cribado de los CDR con respecto a los sitios de unión a antígeno que tengan las características deseadas (Yang et al., J. Mol. Bio., 254: 392,1995). La CDR puede mutar de diversas maneras. Por ejemplo, como un procedimiento del mismo, el residuo de desarrollo o la combinación de residuos puede ser aleatorizado de tal manera que todos los 20 aminoácidos se encuentran en posiciones específicas en grupos en los mismos sitios de unión al antígeno, y los mutantes pueden ser inducidos a través de un intervalo de residuos CDR por un procedimiento de PCR propenso a errores que causan los mutantes (Hawkins et al., J. Mol. Bio., 226: 889, 1992). Un vector de visualización de fagos (phagemid) que contiene la región variable de la cadena pesada y el gen de la región variable de la cadena ligera se reproduce en una cepa mutante de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250:359, 1996). El procedimiento de mutagénesis es un procedimiento comúnmente utilizado en la técnica.

Además, el anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación o un fragmento del mismo es utilizable en forma de un conjugado que se combina con otros materiales. En consecuencia, la presente divulgación proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco en el que se combinan el anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación y un fármaco terapéutico. El fármaco terapéutico utilizable para el conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la presente divulgación es utilizable sin limitación siempre que cumpla el objeto de la presente divulgación.

La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que incluye el anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la presente divulgación. La composición farmacéutica puede incluir además portadores convencionales farmacéuticamente aceptables, excipientes, etc.

En todavía otro aspecto, la presente divulgación proporciona un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo específico de c-Met, un vector recombinante que contiene el polinucleótido, un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo específico de c-Met y un vector recombinante que contiene el polinucleótido.

La secuencia polinucleotídica que codifica la región variable del anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la presente divulgación tiene preferentemente una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 12, pero la presente divulgación no se limita a ello. Además, es obvio para un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación (en adelante, denominado experto en la técnica) que es posible tener una secuencia degenerada, es decir, una secuencia que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO: 7 y la región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 8, pero que tienen una secuencia polinucleotídica diferente, y la secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia CDR de cada una de la cadena pesada y de la cadena ligera proporcionada por la presente divulgación también es capaz de ser deducida aparentemente de las respectivas secuencias CDR representadas por la SEQ ID NOS: 1 a 6 por un experto en la técnica.

Tabla 2] Secuencia polinucleotídica que codifica la región variable del anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación

La presente divulgación proporciona un vector recombinante que contiene la secuencia polinucleotídica, una célula huésped que incluye la misma, y un procedimiento para producir el anticuerpo específicamente unido a c-Met (anticuerpo específico de c-Met) de la presente divulgación utilizando el vector recombinante o la célula huésped. En particular, el anticuerpo específico de c-Met de la presente divulgación se produce preferentemente incluyendo procesos de expresión y purificación en un procedimiento recombinante de genes, y específicamente, se produce preferentemente expresando por separado cada una de las regiones variables que codifican el anticuerpo específico de c-Met de la presente divulgación, o expresando simultáneamente las regiones variables que codifican el anticuerpo específico de c-Met de la presente divulgación en una célula huésped. Además, se permite posicionar el polinucleótido que codifica una secuencia líder en el N-terminal del anticuerpo de la presente divulgación, que es utilizable en la producción del anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación. Además, para facilitar la separación y purificación, y el análisis del anticuerpo producido, se puede adjuntar una etiqueta. Una etiqueta his es una etiqueta representativa, pero la presente divulgación no se limita a ella.

Un término: "vector recombinante" en la presente divulgación es un vector de expresión capaz de expresar una proteína diana en una célula huésped adecuada, e indica un constructo genético que incluye elementos de control esenciales unidos de forma operativa entre sí para expresar inserciones genéticas.

Un término: "operativamente enlazado" en la presente divulgación significa que las secuencias de control de la expresión del ácido nucleico y las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína deseada están funcionalmente enlazadas entre sí para realizar funciones generales. Un enlace operable con el vector recombinante puede llevarse a cabo mediante el uso de tecnologías de recombinación de genes bien conocidas en la técnica, y la escisión y el enlace del ADN en un sitio específico pueden llevarse a cabo fácilmente mediante el uso de enzimas generalmente conocidas en la técnica.

Los vectores de expresión apropiados de la presente divulgación pueden incluir secuencias de señalización para el direccionamiento a la membrana o la secreción, además de un promotor, un codón de iniciación, un codón de terminación y elementos de control de la expresión, tales como la señal de poliadenilación y un potenciador. El codón de iniciación y el codón de terminación se consideran generalmente como porciones de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína diana inmunológica, y cuando se administra un constructo genético, la función debe exhibirse en un sujeto inyectado y debe estar presente en el marco de las secuencias codificantes. Un promotor general puede ser constitutivo o inducible. Las células procariotas tienen promotores lac, tac, T3 y T7, pero la presente divulgación no se limita a ellos. Las células eucariotas tienen el promotor del virus del mono 40 (SV40), el promotor del virus del tumor mamario del ratón (MMTV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), por ejemplo, el promotor de las repeticiones terminales largas (LTR) del VIH, el virus de Moloney, el citomegalovirus (CMV), el virus de Epstein-Barr (EBV), el promotor del virus del sarcoma de rous (RSV), y también el promotor de la p-actina, la hemoglobina humana, la creatina muscular humana, los promotores derivados de la metalotioneína humana, pero la presente divulgación no se limita a ellos.

El vector de expresión puede incluir un marcador selectivo para seleccionar una célula huésped que contenga un vector. El marcador selectivo es para cribar una célula transformada con el vector, en la que se pueden utilizar marcadores que proporcionan un fenotipo de marcador seleccionable, tal como la resistencia a los fármacos, la auxotrofia, la resistencia a un agente citotóxico o la expresión de una proteína de superficie. Dado que sólo las células que expresan el marcador seleccionable sobreviven en el entorno tratado con el agente selectivo, es posible seleccionar la célula transformada. Además, en el caso de que el vector sea un vector de expresión replicable, el vector puede incluir un origen de replicación que es una secuencia de ácido nucleico específica que inicia la replicación.

Como vector de expresión recombinante para la inserción de genes extraños, pueden utilizarse diversos vectores, tales como plásmidos, virus, vectores cósmidos y similares. El vector recombinante no está específicamente limitado en vista de los tipos, siempre que exprese el gen deseado en diversas células huésped de células procariotas y eucariotas, y produzca las proteínas deseadas, pero se prefiere un vector capaz de producir una gran cantidad de proteínas forasteras que conserve una fuerte expresión con un promotor que tenga una fuerte actividad y que tenga una forma similar a la natural.

Con el fin de expresar un anticuerpo de doble diana de acuerdo con la presente divulgación, pueden utilizarse diversas combinaciones de huésped/vector de expresión. Ejemplos de un vector de expresión apropiado para un huésped eucariota incluyen secuencias de control de expresión derivadas del SV40, el virus del papiloma bovino, el adenovirus, el virus adeno-asociado, el citomegalovirus, el baculovirus y el retrovirus, pero la presente divulgación no se limita a ellos.

Ejemplos de un vector de expresión capaz de ser utilizado en un huésped bacteriano incluyen plásmidos bacterianos obtenidos de Escherichia coli, tales como pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, vector pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9, y sus derivados, plásmido que tiene un mayor intervalo de hospedadores, tales como RP4, ADN de fago ejemplificado como significativamente diversos derivados del fago lambda, tales como Agt10 y Agt11, NM989, y otros fagos de ADN tales como M13 y fagos filamentosos de ADN monocatenario. En particular, para la expresión en E. coli, puede incluirse la secuencia de ADN que codifica una antranilato sintasa (TrpE) y un polienlazador en el terminal carboxi, y otros sistemas de vectores de expresión se basan en la beta-galactosidasa (pEX); la proteína de unión a maltosa lambda PL (pMAL); y la glutatión S-transferasa (pGST) (Gene 67:31,1988 Peptide Research 3:167, 1990).

Cuando se requiere realizar la expresión en la levadura, un gen adecuadamente seleccionado para ser utilizado en la levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura Yrp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, 1979 Kingsman et al, gene, 7: 141, 1979). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de capacidad de crecimiento en triptófano, tal como la ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12, 1977). En consecuencia, la presencia de daños trpl en el genoma de la célula huésped de la levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. Del mismo modo, la cepa de levadura defectuosa para Leu2 (ATCC n° 20.622 o n° 38.626) se complementa con plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2. El vector de expresión útil en la célula de levadura es el plásmido 2|j y sus derivados, y un vector útil en una célula de insecto es pVL941.

El vector de expresión de la presente divulgación puede incluir una o más secuencias de control de la expresión que están enlazadas de forma operable a una secuencia de ADN que debe expresarse o a fragmentos de la misma. Las secuencias de control de expresión se insertan en el vector para regular o controlar la expresión de la secuencia de ADN que se va a clonar. Ejemplos de secuencias de control de expresión útiles pueden ser el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, el operador principal y las regiones promotoras del fago lambda, las regiones de control de la proteína de cubierta fd, un promotor glicolítico de levadura tal como un promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa un promotor de la fosfatasa ácida de la levadura, tal como un promotor de Pho5 y del factor de apareamiento alfa de la levadura, y promotores derivados de poliomavirus, adenovirus, retrovirus y virus simios, tales como el promotor temprano y tardío de SV40, y otras secuencias conocidas para controlar la expresión génica de células procariotas o eucariotas y de sus virus, y combinaciones de las mismas.

En todavía otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una célula recombinante transformada con el vector recombinante.

En la presente divulgación, la célula recombinante es una célula transformada con un vector recombinante que contiene el polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo específico de c-Met y un vector recombinante que contiene el polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo específico de c-Met.

En todavía otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir el anticuerpo específico de c-Met utilizando la célula recombinante, o el fragmento de la misma, en el que el procedimiento incluye cultivar la célula recombinante y separar el anticuerpo específico de c-Met de la célula recombinante cultivada.

Preferentemente, el anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la presente divulgación se obtiene preferentemente por expresión y purificación de acuerdo con un procedimiento de recombinación de genes. Específicamente, la secuencia genética que codifica la región variable de la cadena pesada o toda la región de la cadena pesada del anticuerpo y la secuencia genética que codifica la región variable de la cadena ligera o toda la región de la cadena ligera pueden expresarse en un vector o en dos vectores, respectivamente, pero la presente divulgación no se limita a ello.

Específicamente, el procedimiento de producción del anticuerpo específico de c-Met puede incluir: producir un vector recombinante insertando una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo específico de c-Met de la presente divulgación en un vector; transformar y cultivar el vector recombinante en una célula huésped; y separar y purificar el anticuerpo específico de c-Met del transformante cultivado.

Además, el anticuerpo específico de c-Met puede producirse en masa cultivando el transformante en un medio nutritivo, teniendo el transformante el vector recombinante expresado en el mismo, en el que el medio y la condición de cultivo pueden seleccionarse y utilizarse adecuadamente dependiendo de las células huésped. Las condiciones, tales como la temperatura, el pH del medio, el tiempo de cultivo y otras similares, pueden controlarse adecuadamente para que sean apropiadas para el crecimiento celular y la producción masiva de proteínas en el momento del cultivo.

El anticuerpo específico de c-Met que se produce recombinantemente como se ha descrito anteriormente puede recuperarse a partir de medios o lisados celulares. En el caso de un tipo acoplado a la membrana, la membrana puede ser aislada mediante el uso de una solución tensioactiva adecuada (por ejemplo: tritona-X 100) o la escisión enzimática. Las células utilizadas para expresar el anticuerpo específico de c-Met pueden destruirse por diversos medios físicos o químicos, tales como la purificación por congelación-descongelación, el tratamiento sónico, el daño mecánico y el agente de descomposición celular, y pueden aislarse y purificarse mediante la tecnología general de aislamiento bioquímico (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). La electroforesis, la centrifugación, la filtración en gel, la precipitación, la diálisis, la cromatografía (cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoabsorción, cromatografía de exclusión por tamaño y similares), el enfoque isoeléctrico y diversos cambios y procedimientos complejos están disponibles, pero la presente divulgación no se limita a ellos.

En lo sucesivo, la presente divulgación se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo, los siguientes Ejemplos son sólo para ejemplificar la presente invención y será obvio para los expertos en la técnica que el ámbito de la presente invención que se define por las reivindicaciones, no se interpreta como limitado a estos Ejemplos.

Ejemplo 1: Bioselección

Una biblioteca de visualización de fagos de anticuerpos de cadena simple no inmunes (ScFv) totalmente humanos utilizada en la bioselección fue una biblioteca de visualización de fagos establecida en la patente registrada anteriormente (Patente de Corea N° 10-0883430). Con el fin de recuperar el fago en el que se visualiza la cadena única, se cultivó una solución madre de la biblioteca de fagos hasta la fase logarítmica, y se rescató con el fago ayudante M13K07 (GE Healthcare, EE.UU.), y luego se amplificó durante la noche añadiendo 1 mM de IPTG al medio 2x YT (2x YT/Cm+, Kan+) que contenía 34 pg/ml de cloranfenicol (Cm) y 70 pg/ml de kanamicina (Kan) a 30 °C.

El fago que muestra el Fc ScFv antihumano se eliminó utilizando Fc humano. Con el fin de bloquear otras uniones inespecíficas, las preparaciones de fagos se dejaron precipitar en PEG6000 al 4 %/0,5 M de NaCl, y se volvieron a suspender en leche desnatada al 2 %/PBS que contenía 500pg/ml de proteína Fc humana, seguido de una incubación a 37 °C durante 1 hora.

La placa NUNC-IMMUNO de 96 pocilios (Nunc, Dinamarca) recubierta con 5 jg /m l de c-Met-Fc (R&D systems, Recombinant human HGF R/c-Met Fc chimera (cat no. 358-MT/CF) se bloqueó primero con leche desnatada/PBS al 2 % durante 2 horas a temperatura ambiente, y se inocularon 3X 1011pfu de la preparación de fagos a temperatura ambiente durante 1 hora. El tubo se lavó con PBST (PBS que contiene 0,1 % de Tween 20) cinco veces y luego se lavó con PBS cinco veces. El fago para la combinación se eluyó utilizando una solución de trietilamina 100 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente. El fago eluido se mantuvo junto con 10 ml de células XL1-Blue en fase media a 37 °C durante 30 minutos, y se cultivó con agitación durante 30 minutos. A continuación, las células XL1-Blue infectadas se cultivaron durante toda la noche a 30 °C en una placa 2x YT/Cm+ que contenía un 1 % de glucosa. Después de la primera bioselección, se practicaron la segunda, tercera y cuarta bioselección aumentando secuencialmente el número de procesos de lavado hasta 10, 15 y 20 veces, respectivamente. Después de practicar la cuarta selección, se confirmó de nuevo la capacidad de unión a c-Met del fago asegurado mediante el ensayo de unión a c-Met.

Para realizar el ensayo de unión a c-Met, una microplaca recubierta con 100 ng de c-Met (R&D system) reaccionó durante la noche con leche desnatada al 2 %/PBS a 37 °C durante 2 horas. La microplaca se lavó con PBS, y los fagos obtenidos en cada selección reaccionaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se lavó con PBS, y el anticuerpo anti-M13 de ratón conjugado con HRP (Peroxidasa de rábano picante) (GE healthcare) reaccionó a temperatura ambiente durante 1 hora. Una vez completada la reacción, se indujo el desarrollo del color del pocillo utilizando una solución de TMB (BD) y se midió la absorbancia a 450 nm (FIG. 1).

Como resultado, se confirmó que 1E4, 1A5, 1D9, 2H3, 3D1 y 3F1 tenían capacidad de unión a c-Met.

Ejemplo 2: Producción y purificación de ScFv solubles

Con el fin de fabricar 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv y 3F1-ScFv solubles con respecto a 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv y 3F1-ScFv que se confirmó que tenían la capacidad de unión a c-Met en el Ejemplo 1, pET21b-1E4, pET21b-1A5, pET21b-1D9, pET21b-2H3 pET21b-3D1 y pET21b-3F1 se produjeron cortando pAK-1E4, pAK-1A5, pAK-1D9, pAK-2H3, pAK-3D1 y pAK-3F1 asegurados mediante bioselección con Xbal y EcoRI para asegurar el fragmento que tenía las secuencias 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv y 3F1-ScFv, e insertando el fragmento en un vector de expresión de E. coli asegurado usando la misma enzima de restricción (pET21b-6A6, Novagen, EE.UU.). Los pET21b-1E4, pET21b-1A5, pET21b-1D9, pET21b-2H3, pET21b-3D1 y pET21b-3F1 producidos se transformaron en E. coli BL21 (DE3) para la expresión de la proteína, y la proteína ScFv soluble se expresó a través de los transformantes, y las células se centrifugaron. A continuación, se aseguró la fracción periplásmica de la célula utilizando una solución de Tris (pH 8,0) de 50 mM que contenía un 20 % de sacarosa, 200 jg/m l de lisozima y un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche, Suiza). La fracción asegurada se trató con el kit de centrifugado Ni-NTA (QIAGEN, Alemania) para purificar la proteína ScFv.

Ejemplo 3: Ensayo de unión a c-Met utilizando ScFv

Se confirmó si los 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv y 3F1-ScFv solubles purificados en el Ejemplo 2 tenían la capacidad de unión a c-Met. Para la confirmación, se recubrió c-Met 100ng en una placa NUNC-IMMUNO de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca) a 4 °C durante la noche, seguida de una reacción con leche desnatada/PBS al 2 % a 37 °C durante 2 horas. Una vez completada la reacción, se lavó la placa con PBS y se le añadió el ScFv purificado, seguido de una reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Una vez completada la reacción, se lavó la placa con PBS y se añadió el anticuerpo de ratón anti-Myc conjugado con HRP (Sigma, EE.UU.) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, el producto reaccionó con la solución de TMB y se midió la absorbancia a 450 nm.

Como resultado, como se muestra en la FIG. 2, se confirmó que todos los 1E4-ScFv, 1A5-ScFv, 1D9-ScFv, 2H3-ScFv, 3D1-ScFv y 3F1-ScFv purificados tenían capacidad de unión a c-Met.

Ejemplo 4: Expresión y purificación de IgG

Con el fin de expresarse en la forma completa de IgG, se produjo un vector de expresión de la cadena pesada y un vector de expresión de la cadena ligera que incluía toda la región constante. Para la cadena pesada, pIgGHD-1E4Hvy, pIgGHD-1A5Hvy, pIgGHD-1D9Hvy, pIgGHD-2H3Hvy, pIgGHD-3D1Hvy y pIgGHD-3F1Hvy, que son vectores de expresión que incluyen toda la región constante de la cadena pesada y la región variable de la cadena pesada, se produjeron por ligadura con un fragmento obtenido al tratar un vector pIgGHD (Aprogen, Korea) que tiene la cadena pesada constante de 4-1 bb humano con SfiI, y tratando una región variable de la cadena pesada de pAKScFv con SfiI (FIG. 3).

Para la cadena ligera, pIgGLD-1E4Lgt, pIgGLD-1A5Lgt, pIgGLD-1D9Lgt, pIgGLD-2H3Lgt, pIgGLD-3D1Lgt y pIgGLD-3F1Lgt, que son vectores de expresión que incluyen toda la región constante de la cadena ligera y la región variable de la cadena ligera, se produjeron por ligadura con un fragmento obtenido al tratar un vector pIgGLD (Aprogen, Korea) que tiene el esqueleto de la cadena ligera de 4-1 bb humano con BstXI, y tratando una región variable de la cadena ligera de pAK-ScFv con BstXI (FIG. 4).

Para la expresión de IgG, la misma cantidad de vector de expresión de la cadena ligera y el vector de expresión de la cadena pesada fueron co-transfectados en la célula HEK-293T. Las células transfectadas se cultivaron en medio libre ^{de suero Freestyle 293 (37 °C, 5 % deCO}2^{), y luego se recolectó el medio. De acuerdo con el protocolo descrito por}el fabricante, se purificaron 1E4-IgG, 1A5-IgG, 1D9-IgG, 2H3-IgG, 3D1-IgG y 3F1-IgG a partir del sobrenadante combinado mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de proteína A (GE Healthcare, USA). El sobrenadante se inyectó en la columna de proteína A equilibrada con una solución de fosfato sódico 20 mM (pH 7,0) y 100 mM de NaCl, y se lavó con fosfato sódico 20 mM (pH 7,0) y una solución que contenía 1 mM de EDTA y 500 mM de NaCl, y luego se eluyó con una solución de Glicina-HCl 0,1 M (pH 3,3) que contenía 100 mM de NaCl. La proteína eluida se neutralizó con Tris 1M. La proteína eluida se mezcló con un tampón de fosfato sódico (pH 6,0) de 5 mM en una relación de 1:1, y se inyectó en una columna de SP-sefarosa preenvasada (GE healthcare) que se equilibró con 5 mM de fosfato de sodio (pH 6,0) que contenía 50 mM de NaCl. La proteína unida a la columna se eluyó con un tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) que contenía 50 mM de NaCl y se inyectó en una Q-sefarosa preenvasada (GE healthcare) equilibrada con un tampón de elución, obteniéndose así la proteína no unida. La proteína obtenida se concentró con 30 Kd vivaspin20 (Sartorius) y se dializó con PBS. Los resultados de SDS-PAGE de algunas de las proteínas 1E4-IgG, 1A5-IgG, 1D9-IgG, 2H3-IgG, 3D1-IgG y 3F1-IgG purificadas por el procedimiento descrito anteriormente se muestran en la FIG. 5.

Ejemplo 5: Análisis de la dispersión del anticuerpo específico de c-Met

Con el fin de evaluar la dispersión de seis tipos de anticuerpos específicos de c-Met, se cultivó MDCK-2 (Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells-2) que es una célula epitelial de riñón de perro. La célula se cultivó con DMEM al que se añadió un 5 % de suero bovino fetal, en placa de 24 pocillos a una concentración de 2 x104 células/pocillo. Después de cultivarlas durante un día, una vez que las células crecieron adhiriéndose bien a la placa, las células fueron tratadas con 10 |jg/ml de anticuerpo o 30 ng/ml o 50 ng/ml de HGF. Tras el cultivo durante 16 horas, se evaluó la dispersión y el crecimiento de las células mediante la tinción con violeta de cristal (Sigma-Aldrich, EE.UU.) y la toma de imágenes (FIG. 6).

Como resultado, como se muestra en la FIG. 6, se pudo confirmar que sólo en el caso de tratar 1E4 entre los seis tipos de anticuerpos, las células se dispersaron y crecieron, igual que el grupo tratado con HGF que es un grupo de control positivo.

Ejemplo 6: Análisis de la fosforilación de c-Met in vivo mediante transferencia Western

Con el fin de reconfirmar la actividad de 1E4 como agonista mostrada en el Ejemplo 5, se midieron las actividades de fosforilación a c-Met, de 1A5 y 1E4 que son anticuerpos específicos de c-Met mediante transferencia Western. Las células HT29, que son líneas celulares de cáncer de recto que sobreexpresan c-Met, se cultivaron en una placa de 6 pocillos por 2X105 durante 24 horas, y se trataron en medio libre de suero durante 6 horas en condiciones de medio RPMI sin incluir suero bovino fetal, y luego se pretrataron 10yg/mlde anticuerpos hIgG y c-Met durante 30 minutos. A continuación, se trataron 30 ng/ml de HGF humano en el grupo de tratamiento durante 15 minutos.

Para el análisis por transferencia western, se utilizó un tampón de lisis (1 %(p/v) SDS, 10 mM Tris(pH 7,4), 1 mM de Na3VO4 (ortovanadato de sodio), 2 mM de EGTA, 2 mM de EDTA, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mM de fluoruro de sodio y 1 X cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma) se trató para obtener un lisado y éste se hirvió, seguido de una centrifugación a 4 °C a 10, 000 g durante 5 minutos para eliminar el precipitado insoluble. El sobrenadante se mezcló con tampón de muestra SDS y se hirvió durante 10 minutos para su preparación. El SDS-PAGE y la transferencia Western se realizaron por procedimientos generalmente conocidos en la técnica, y las muestras utilizadas se proporcionaron como sigue: Gel de poliacrilamida SDS al 4-20 % (BioRad, EE.UU.), membrana de PVDF (Millipore #IPVH00010, EE.UU.), un anticuerpo anti-c-Met (Santa Cruz, EE.u U.) y un anticuerpo anti-fosfoc-Met (Cell Signaling Technology, EE.UU.) como anticuerpos primarios para analizar la actividad de fosforilación de c-Met; un anticuerpo anti-p-Erk (Cell Signaling Technology, EE.UU.), y un anticuerpo IgG de cabra anti-ratón conjugado con HRP (Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.).S.A.), y un anticuerpo IgG antiratón de cabra conjugado con HRP (Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.) y un IgG anti-conejo de cabra conjugado con HRP (Cell Signaling technology, U.S.A.) como anticuerpo secundario unido al anticuerpo primario para la quimioluminiscencia (FIG. 7).

Como resultado, como se muestra en la FIG. 7, se pudo confirmar que 1E4 tenía capacidad de fosforilación a c-Met incluso con un único tratamiento.

Ejemplo 7: Análisis de la capacidad de unión de la IgG anti-c-Met (lE4-IgG)

La capacidad de unión a c-Met del anticuerpo se midió mediante BIAcore (GE Healthcare). De acuerdo con el manual del fabricante, los sensorgramas se aseguraron inmovilizando c-Met de ratón y c-Met humano (R&D system) en un chip CM5 (GE Healthcare, Suecia), y haciendo fluir diversas cantidades de anticuerpos. Las constantes de velocidad kactivo y kinactivo se midieron sobre la base de los sensorgramas asegurados en cada concentración, y Kd se calculó a partir de la relación de las constantes de velocidad (kinactivo/kactivo) (Tabla 3). Como resultado, la 1E4-IgG tenía una alta capacidad de unión con la c-Met de ratón, así como una capacidad de unión con la c-Met humana (FIG. 8).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo específico de c-Met o fragmentos de unión a antígeno del mismo que comprenden:

una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:7; y

una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:8.

2. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la reivindicación 1.

3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12.

4. Un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido que codifica el anticuerpo específico de c-Met de acuerdo con la reivindicación 2.

5. Una célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un procedimiento para producir un anticuerpo específico de c-Met que comprende: cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, y recuperar el anticuerpo específico de c-Met del cultivo.