ES2902901T3 - Anticuerpos de unión a APRIL modificados - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo humanizado de unión a APRIL humano que comprende un par de región variable de cadena pesada, región variable de cadena ligera que es VH14_1G.VL15, en donde la secuencia de aminoácidos VH es SEQ ID NO:40 y en donde la secuencia de aminoácidos de VL es SEQ ID NO: 30.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos de unión a APRIL modificados
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con anticuerpos aislados, incluyendo fragmentos de los mismos, que se unen a APRIL humano, con polinucleótidos que codifican tales anticuerpos y con células hospedadoras que producen dichos anticuerpos. Los anticuerpos pueden usarse para tratar cánceres e inhibir la proliferación de células inmunitarias y padecimientos que pueden beneficiarse de tal inhibición de la proliferación de células inmunitarias tales como enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias o enfermedades asociadas con la sobreproducción de inmunoglobulina. Además, los anticuerpos pueden usarse como herramienta de diagnóstico y agentes in vitro para inhibir la proliferación y/o supervivencia de células inmunitarias.
Antecedentes de la invención
APRIL es expresado como una proteína transmembrana de tipo II, pero a diferencia de la mayoría de los otros miembros de la familia TNF, es procesado principalmente como una proteína secretada y escindido en el aparato de Golgi donde es escindido por una furina convertasa para liberar una forma activa soluble (López Fraga Et al., 2001, EMBO Rep 2: 945-51). APRIL se ensambla como un homotrímero enlazado de manera no covalente con homología estructural en el pliegue de proteínas similar a varios otros ligandos de la familia TNF (Wallweber et al., 2004, Mol Biol 343, 283-90). APRIL se une a dos receptores de TNF: Antígeno de maduración de células B (BCMA) y activador transmembrana y modulador de calcio y interactor de ligando de ciclofilina (TACI) (revisado en Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218(1 ):l-8). Además, recientemente se ha demostrado que APRIL se une a proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) (Hendriks et al., 2005, Cell Death D iffer 12, 637-48). Se ha demostrado que APRIL juega un papel en la comunicación de células B e impulsa tanto la proliferación como la supervivencia de células B humanas y murinas in vitro (reseñado en Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218(1): 1 — 8).
APRIL es expresada predominantemente por subconjuntos de células inmunitarias tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células B y células T, muchas de las cuales también expresan BAFF. Además, APRIL puede expresarse por células no inmunes tales como osteoclastos, células epiteliales y una variedad de tejidos tumorales (reseñado en Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218(1) :1 — 8). De hecho, APRIL fue identificada originalmente a base de su expresión en células cancerosas (Hahne et al., 1998, J. Exp. Med. 188, 1185-90). Se encontraron altos niveles de expresión de ARNm de APRIL en un panel de líneas celulares tumorales así como en tumores primarios humanos tales como de colon y carcinoma linfoide.
Un estudio retrospectivo en 95 pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) mostró niveles elevados de APRIL en el suero, los cuales se correlacionaron con la progresión de la enfermedad y la supervivencia general de pacientes, con un peor pronóstico para pacientes con altos niveles séricos de APRIL (Planelles et al., 2007, Haematologica 92, 1284-5). De manera similar, se demostró que (niveles elevados de) APRIL se expresaban en linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (LNH) y mieloma múltiple (Mm ) (reseñado en Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218(1): 1-8). Un estudio retrospectivo en pacientes con DLBCL (LNH) demostró que la alta expresión de APRIL en lesiones de cáncer correlacionaba con una baja tasa de supervivencia (Schwaller et al., 2007, Blood 109, 331-8). Recientemente, se ha demostrado que los niveles séricos de APRIL en suero de pacientes que padecían cáncer colorrectal tienen un valor diagnóstico positivo (Ding et al., 2013, Clin. Biochemistry, http://dx.doi.org/10.1016/¡. clinbiochem.2013.06.008).
Debido a su papel en la biología de células B, APRIL también juega un papel en muchas enfermedades autoinmunes. Se han reportado niveles séricos elevados de APRIL en muchos pacientes con LES (Koyama et al., 2005, Ann Rheum Dis 64, 1065-7). Un análisis retrospectivo reveló que los niveles séricos de APRIL tendieron a correlacionar con los títulos de anticuerpos anti-ADNbc. También en el líquido sinovial de los pacientes con artritis inflamatoria se detectaron niveles significativamente elevados de APRIL en comparación con los pacientes con artritis no inflamatoria como la osteoartritis (Stohl et al., 2006, Endocr Metab Immune DisordDrug Targets 6, 351-8; Tan et al., 2003, Arthritis Rheum 48, 982-92).
Varios estudios se enfocaron en la presencia de APRIL en el suero de los pacientes que sufrían de una gama más amplia de enfermedades reumáticas sistémicas inmunológicas (que ahora incluyen también el síndrome de Sjogren, síndrome de Reiter, artritis psoriásica, polimiositis y espondilitis anquilosante) y encontraron niveles elevados de APRIL en estos pacientes, sugiriendo que APRIL jugaba un papel importante también en estas enfermedades (Jonsson et al., 1986, Scand J Rheumatol Suppl 61, 166-9; Roschke et al., 2002, J Immunol 169, 4314-21). Además, se detectaron niveles séricos elevados de APRIL en el suero de los pacientes que padecían de dermatitis atópica (Matsushita et al., 2007, Exp. Dermatology 17, 197-202). Además, los niveles séricos de APRIL están elevados en la sepsis y pronostican la mortalidad en pacientes críticamente enfermos (Roderburg et al., J. Critical Care, 2013, http://dx.doi.org/10.1016/Mcrc.2012.11.007) Además, se descubrió que los niveles séricos de APRIL estaban elevados en los pacientes que padecían nefropatía por IgA (McCarthy et al., 2011, J. Clin. Invest. 121(10) :3991-4002).
Por último, el aumento en la expresión de APRIL también se ha vinculado a la esclerosis múltiple (MS). Se ha descubierto que la expresión de APRIL estaba elevada en los astrocitos de los pacientes con EM en comparación con los controles normales. Esto está en consonancia con la expresión descrita de APRIL en glioblastomas y en el suero de pacientes con glioblastoma (Deshayes et al., 2004, Oncogene 23, 3005-12; Roth et al., 2001, Cell Death D iffer 8, 403-10).
APRIL juega un papel crucial en la supervivencia y capacidad proliferativa de varias neoplasias de células B, y potencialmente también algunos tumores sólidos. APRIL también está emergiendo como un actor clave en las enfermedades inflamatorias o la autoinmunidad. Por lo tanto, las estrategias para antagonizar APRIL son una meta terapéutica para varias de estas enfermedades. De hecho, los estudios clínicos que usan TACI-Fc (Atacicept) dirigido a APRIL están actualmente en curso para el tratamiento de varias enfermedades autoinmunes. Sin embargo, TACI-Fc también se dirige a BAFF, un factor implicado en el mantenimiento normal de células B. Los anticuerpos dirigidos contra APRIL se han descrito en WO9614328, WO2001/60397 WO2002/94192, WO9912965, WO2001/196528, WO9900518 y WO2010/100056. WO2010/100056 describe anticuerpos dirigidos específicamente a APRIL. Los anticuerpos de WO2010/100056 bloquean por completo la unión de APRIL a TACI y al menos parcialmente a BCMA. El anticuerpo hAPRIL.01A bloquea por completo la unión tanto a BCMA como TACI. El anticuerpo hAPRIL.01A inhibió la proliferación de células B, la supervivencia y la secreción de inmunoglobulina específica de antígeno in vitro e in vivo (Guadagnoli et al., 2011, Blood 117(25):6856-65). Además, hAPRIL.01A inhibió la proliferación y la supervivencia de células malignas representativas de las enfermedades LLC y MM humanas in vitro e in vivo (Guadagnoli et al., 2011, Blood 117 (25): 6856-65; Lascano et al., 2013, Blood 122(24): 3960-3; Tai et al., 2014, ASH poster 2098). Finalmente, hAPRIL.01A inhibió la secreción de la IgA específica de antígeno (Guadagnoli et al., 2011, Blood 117 (25): 6856-65). En vista de estas características de unión únicas, este anticuerpo murino tiene una utilidad farmacéutica única. Sin embargo, en vista de su origen murino existen también ciertos inconvenientes en la utilidad farmacéutica de este anticuerpo en medicina humana. Por lo tanto, la presente invención tiene por objeto proporcionar anticuerpos hAPRIL.01A alterados más adecuados para su uso en medicina humana.
Breve descripción de la invención
La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une a APRIL humano que comprende un par de región variable de cadena pesada, región variable de cadena ligera que es VH14_1G.VL15, en donde la secuencia de aminoácidos Vh se selecciona de SEQ ID NO: 40 y en donde la secuencia de aminoácidos de Vl se selecciona de SEQ ID NO: 30. Se ha descubierto, sorprendentemente, que cuando en un sitio de unión a antígeno de hAPRIL.01A las regiones estructurales del dominio Vh de hAPRIL.01A se sustituyen por regiones estructurales de una secuencia de aminoácidos Vh seleccionada de la SEQ ID NO 40 Y las regiones estructurales del dominio Vl de hAPRIL.01A se sustituyen por las regiones estructurales de una secuencia de aminoácidos de V l seleccionada de la SEQ ID NO 30, se obtienen análogos funcionales de hAPRIL.01A. Esto es sorprendente a la vista del hecho de que la investigación realizada por los inventores de la presente invención ha demostrado que sólo combinaciones reducidas de secuencias estructurales de Vh y Vl alternativas de origen humano pueden tolerar una unión adecuada de las CDR de hAPRIL.01A a APRIL humano y por lo tanto pueden resultar en análogos funcionales de hAPRIL.01A. Además, los inventores de la presente invención han demostrado que se pueden obtener mejoras adicionales en los análogos de hAPRIL.01 introduciendo ciertas sustituciones de aminoácidos específicas. En particular, la sustitución R72S de aminoácidos y/o la sustitución doble R67K en combinación con V68A en una secuencia de aminoácidos V h seleccionada.
Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto, la invención se relaciona con un anticuerpo de unión a APRIL que comprende un par de región variable de cadena pesada, región variable de cadena ligera que es VH14_1G.VL15, en donde la secuencia de aminoácidos Vh se selecciona de SEQ ID NO: 40 y en donde la secuencia de aminoácidos de Vl se selecciona de SEQ ID NO: 30.
Aspectos adicionales de la divulgación se relaciona con polinucleótidos, en forma aislada, que codifican la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo de la invención, una unidad de expresión que comprende varios polinucleótidos y una célula hospedadora que comprende la unidad de expresión y/o varios de los polinucleótidos.
Un aspecto aún adicional de la divulgación se relaciona con un método para la producción de un anticuerpo de la invención, el método comprende:
a) cultivar una célula hospedadora en medio de cultivo en condiciones en las cuales se expresan varios polinucleótidos, produciendo de este modo polipéptidos que comprenden las regiones variables de cadena ligera y pesada; y
b) recuperar los polipéptidos de la célula hospedadora o del medio de cultivo.
Una composición que comprende un anticuerpo de la invención en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente una serie de otros compuestos activos es el objeto de otro aspecto de la divulgación.
El uso terapéutico y diagnóstico del anticuerpo de la invención es otro aspecto más de la presente divulgación.
Breve descripción de las secuencias
Las secuencias presentadas en el listado de secuencias se refieren a las secuencias de aminoácidos y secuencias codificantes de ADN de los dominios Vh y Vl y de cadenas pesada y ligera a partir de las cuales pueden emplearse secuencias estructurales. Además, se presentan las secuencias de aminoácidos de las CDR de los dominios V h y Vl de hAPRIL.01A y de las cadenas pesada y ligera. De acuerdo con ciertas modalidades en el anticuerpo de la invención se emplean las CDR de hAPRIL.01A. La Tabla 1 a continuación correlaciona los ID de secuencias con sus respectivas secuencias.
Tabla 1: Listado de secuencias:
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
SEQ ID NO: 11-52 se refieren a secuencias modificadas de VH, VL, cadena pesada o ligera de inmunoglobulina como se indica.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados del uso de hAPRIL.01A o el análogo 14_1G.15 dirigido a APRIL en una prueba in vivo para la respuesta de células B independientes de células T. Ratones transgénicos (APRIL-Tg) fueron desafiados con 250 pg de NP-Ficoll (día 0) y tratados con hAPRIL.01A o 14_1G.15 en el día -1 y 3. Se usaron ratones PBS y nativos (WT) como controles negativos. Los títulos de la inmunoglobulina (IgA1 (Panel A) e IgA2 (Panel B), IgG (Panel C) e IgM (Panel D)) fueron medidos por ELISA. 14_1G.15 inhibió la respuesta inmune independiente de células T a NP-Ficoll más eficazmente que su análogo hAPRIL.01A.
Descripción detallada
La divulgación se relaciona por tanto a anticuerpos que se unen al mismo epítopo de APRIL humano como un anticuerpo, incluyendo un análogo de anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo, que tiene un sitio de unión al antígeno de hAPRIL.01A. El anticuerpo hAPRIL.01A se ha descrito en WO2010/100056 con secuencias de los dominios Vh y Vl, y las CDR. Los inventores de la presente invención han descubierto que las posibilidades para sustituir la región estructural de los dominios Vh y Vl de hAPRIL.01A de ratón por alternativas humanas, son limitadas. Además, las secuencias estructurales alternativas seleccionadas dan lugar a anticuerpos anti-APRIL humano alternativos que tienen características inesperadas. Se cree que las secuencias estructurales seleccionadas manifiestan sus características especiales dentro del contexto de unión al epítopo de APRIL humano para hAPRIL.01A y por lo tanto, tienen una amplia utilidad dentro de este contexto. Por lo tanto, la presente invención está dirigida a cualquier anticuerpo (incluyendo fragmentos y/o derivados y/o análogos) que se une al mismo epítopo que hAPRIL.01A y que comprende las secuencias estructurales seleccionadas en sus dominios Vh y Vl. En ciertas modalidades, dicho anticuerpo comprenderá CDR diferentes a las CDR de hAPRIL.01A. Sin embargo, de acuerdo con otras modalidades, el anticuerpo comprenderá CDR similares o incluso idénticas a las de hAPRIL.01A. De acuerdo con ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio V h y CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio Vl de hAPRIL.01A o variantes de cualquiera de dichas secuencias debe considerarse un anticuerpo, que se une al mismo epítopo de APRIL humano como el anticuerpo monoclonal hAPRIL.01A. Esto en particular, cuando se une a APRIL humano con un Kd de aproximadamente 100 nM o menos y/o bloquea la unión de APRIL humano a BCMA y TACI humano con una IC50 de aproximadamente 100 nM o menos. Dentro de la presente invención, los anticuerpos preferidos se unen a APRIL humano con un valor Kd de aproximadamente 100 nM o menos, tal como dentro de un intervalo seleccionado de 100-0,001 30 nM, por ejemplo 100-0,010, 100-0,050, 100-0,100, 100-0,150, 100- 0,200, 100-0,250, 100-0,300, 100-0,350, 100-0,400, 100- 0,450, 90- 0,500, 80-0,550, 70-0,600, 60-0,650, 50­ 0,700, 40- 0,750, 30-0,800, 20-0,850, 10-0,900 o 1,0-0,950 nM. Como lo entenderá el técnico en la materia, se prefieren valores más bajos para la Kd, tales como valores por debajo de 50, 20, 10, 1,00 nM. Anticuerpos con valores de Kd dentro de tales intervalos son adecuados para las aplicaciones clínicas (véase, por ejemplo, Presta, et al., 2001, Thromb. Haemost. 85:379-389; Yang, et al., 2001, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38:17-23; Carnahan, et al., 2003, Clin. Cancer Res. (Suppl.) 9:3982s-3990s). Las afinidades de anticuerpos se pueden determinar usando un análisis estándar conocido por el técnico en la materia, por ejemplo, como se ejemplifica en la sección experimental.
Se prefiere además que un anticuerpo de la invención bloquee la unión de APRIL humano a BCMA y TACI humano con un valor de IC50 de aproximadamente 100 nM o menos, tal como dentro de un intervalo seleccionado de 100­ 0,001 nM, por ejemplo 100-0,010, 100-0,050, 100-0,100, 100-0,150, 100- 0,200, 100-0,250, 100-0,300, 100-0,350, 100-0,400, 100- 0,450, 90-0,500, 80-0,550, 70-0,600, 60-0,650, 50-0,700, 40- 0,750, 30-0,800, 20-0,850, 10-0,900 o 1.0- 0,950 nM. Como lo entenderá el técnico en la materia, se prefieren valores más bajos para la IC50, tales como valores por debajo de 50, 20, 10, 1,00 nM.
La unión del anticuerpo al mismo epítopo que hAPRIL.01A se puede determinar evaluando la competencia de unión a APRIL humano de un anticuerpo de la presente invención y un anticuerpo de referencia que tiene un sitio de unión a antígeno de hAPRIL.01A de acuerdo con los métodos presentados en el Ejemplo 2 o 5 de WO2010/100056 u otras técnicas de bloqueo cruzado o de mapeo de epítopos conocidas por el técnico en la materia, como se describe a continuación. El sitio de unión a antígeno de hAPRIL.01A está definido por los dominios V h y Vl tal como se presentan en SEQ ID NO: 3 y 4. De este modo, cualquier anticuerpo, incluyendo un análogo de anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo que comprende los dominios Vh y Vl como se presenta en SEQ ID NO: 3 y 4 puede usarse como anticuerpo de referencia para evaluar la unión al mismo epítopo de APRIL humano que hAPRIL.01A. El anticuerpo hAPRIL.01A, divulgado en WO2010/100056 es un ejemplo de un anticuerpo que tiene un sitio de unión a antígeno de hAPRIL.01A y es un anticuerpo de referencia adecuado dentro del contexto de la presente invención. Sin embargo, también pueden usarse como anticuerpo de referencia fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, F(ab)2 o Fv derivados de hAPRIL.01A. Basándose en las secuencias de ADN de SEQ ID NO: 1 y 2 y las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y 4, el técnico en la materia podrá construir y producir tales fragmentos de anticuerpo derivados de hAPRIL.01A. Basándose en las secuencias proporcionadas, el técnico en la materia también podrá producir análogos de hAPRIL.01A para ser usados como anticuerpos de referencia, uniendo la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 (codificada por SEQ ID NO: 1) a la región constante de IgG1 (de ratón o de una especie diferente, preferiblemente de ratón) y uniendo la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 4 (codificada por SEQ ID NO: 2) a la región constante de k (de ratón o de una especie diferente, preferiblemente de ratón).
Al ser evaluados con tales métodos, los anticuerpos que se unen al mismo epítopo de APRIL humano que hAPRIL.01A pueden bloquear la unión de un anticuerpo de referencia que tiene un sitio de unión a antígeno de hAPRIL.01A a APRIL humano con una IC50 de aproximadamente 100 nM o menos, tal como dentro de un intervalo seleccionado de 100-0,001 nM, por ejemplo 100-0,010, 100-0,050, 100-0,100, 100-0,150, 100- 0,200, 100-0,250, 100-0,300, 100-0,350, 100-0,400, 100- 0,450, 90-0,500, 80-0,550, 70-0,600, 60-0,650, 50-0,700, 40- 0,750, 30-0,800, 20-0,850, 10-0,900 o 1.0- 0,950 nM. Como lo entenderá el técnico en la materia, se prefieren valores más bajos para la IC50, tales como valores por debajo de 50, 20, 10, 1,00 nM.
El anticuerpo de la invención puede por lo tanto tener una o más de las siguientes características:
(i) se une a APRIL humano con una Kd de aproximadamente 100 nM o menos;
(ii) bloquea la unión de APRIL humano a BCMA y TACI humano con una IC50 de aproximadamente 100 nM o menos;
(iii) bloquea la unión de hAPRIL.01A a APRIL humano con una IC50 de aproximadamente 100 nM o menos.
Estas características pueden combinarse en las siguientes combinaciones: (i) o (ii) o (iii); (i) y (ii); (i) y (iii); (ii) y (iii); (i) y (ii) y (iii).
De acuerdo con la presente descripción, las secuencias estructurales del dominio Vh de un sitio de unión a antígeno del anticuerpo se seleccionan de tal manera que tienen una similitud de secuencia de al menos el 70% con las secuencias estructurales de una secuencia de aminoácidos Vh seleccionada de la SEQ ID NO. 12, 14, 16 o 18. De acuerdo con una modalidad preferida, las secuencias estructurales de un dominio V h del anticuerpo se seleccionan de tal manera que tienen una similitud de secuencia de al menos el 70% con las secuencias estructurales de una secuencia de aminoácidos Vh seleccionada de la SEQ ID NO. 14 o 18 años, y lo más preferiblemente con SEQ ID NO: 18. Las secuencias estructurales del dominio Vl en dicho sitio de unión a antígeno del anticuerpo se seleccionan de tal manera que tienen una similitud de secuencia de al menos el 70% con las secuencias estructurales de una secuencia de aminoácidos Vl seleccionada de la SEQ ID NO.30.
La secuencia de aminoácidos Vh seleccionada de las SEQ ID NO. 12, 14, 16 o 18 y la secuencia de aminoácidos V l seleccionada de la SEQ ID NO. 30, comprenden tanto las secuencias estructurales como secuencias de CDR. Las secuencias de CDR incorporadas en estas secuencias de aminoácidos Vh y Vl son las de hAPRIL.0lA y corresponden a la SEQ ID NO. 5 (hAPRIL.01A Vh CDR1), 6 (hAPRIL.01A Vh CDR2), 7 (hAPRIL.01A Vh CDR3), 8 (hAPRIL.01A Vl CDR1), 9 (hAPRIL.01A Vl CDR2), 10 (hAPRIL.01A Vl CDR3). Sin embargo, como ya se ha indicado anteriormente, el uso de las secuencias estructurales Vh y Vl, seleccionadas dentro de la presente invención, no está restringida a la combinación con las CDR específicas de hAPRIL.01A. Por lo tanto, la similitud de secuencia de al menos el 70% de acuerdo con ciertas modalidades debe considerarse solamente para las secuencias estructurales y no para la secuencia completa de aminoácidos Vh seleccionada de las SEQ ID NO. 12, 14, 16, 18 o la secuencia de aminoácidos Vl completa seleccionada de la SEQ ID NO. 30. Las secuencias estructurales para las secuencias de aminoácidos V h tal como se presentan en las SEQ ID NO. 12, 14, 16 o 18 son las partes de estas secuencias fuera de las CDR de Vh , es decir, las partes fuera de las partes de la secuencia idénticas a la SEQ ID NO. 5 (hAPRIL.01A Vh CDR1), 6 (hAPRIL.01A Vh CDR2), 7 (hAPRIL.01A Vh CDR3). Las secuencias estructurales para la secuencia de aminoácidos Vl tal como se presenta en la SEQ ID NO. 30 son las partes de esta secuencia fuera de las CDR de V l, es decir, las partes fuera de las partes de la secuencia idénticas a la SEQ ID NO. 8 (hAPRIL.01A Vl CDR1), 9 (hAPRIL.01A Vl CDR2), 10 (hAPRIL.01A Vl CDR3).
De acuerdo con las modalidades alternativas, la similitud de secuencia de al menos el 70% debe considerarse para la secuencia completa de aminoácidos Vh seleccionada de las SEQ ID NO. 12, 14, 16 o 18 y la secuencia de aminoácidos Vl completa seleccionada de la SEQ ID NO. 30.
Dentro de la descripción al menos el 70% de similitud de secuencia debe entenderse como al menos el 80%, tal como al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, tal como al menos el 99% de similitud de secuencia.
Como entenderá el técnico en la materia, "similitud de secuencia" se refiere a la medida en que las secuencias individuales de nucleótidos o péptidos son iguales. El grado de similitud entre dos secuencias se basa en el grado de identidad combinado con el grado de cambios conservadores. El porcentaje de "similitud de secuencia" es el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que es idéntico o cambiado de manera conservadora, a saber: "similitud de secuencia" = (% identidad de secuencia) (% cambios conservadores).
Para el propósito de esta descripción, "cambios conservadores" e "identidad" se consideran especies del término más amplio "similitud". Por lo tanto, siempre que se utiliza el término "similitud de secuencia", abarca la "identidad de secuencia" y "cambios conservadores". De acuerdo con ciertas modalidades, los cambios conservadores no se toman en cuenta y el % de similitud de secuencia se refiere al % de identidad de secuencia.
El término "identidad de secuencia" es conocido por el técnico en la materia. Con el fin de determinar el grado de identidad de secuencia compartida por dos secuencias de aminoácidos o por dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean con el propósito de una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). Tal alineación puede realizarse a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Alternativamente, la alineación puede realizarse a lo largo de una longitud de comparación más corta, por ejemplo, de aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos/bases nucleicos o aminoácidos.
A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o los nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El grado de identidad compartida por secuencias se expresa típicamente en términos de porcentaje de identidad entre las dos secuencias y es una función del número de posiciones idénticas compartidas por residuos idénticos en las secuencias (es decir, % de identidad = número de residuos idénticos en las posiciones/número total de posiciones x 100). Preferiblemente, las dos secuencias que se comparan son de la misma o esencialmente la misma longitud.
El porcentaje de "cambios conservadores" puede ser determinado de manera similar al porcentaje de identidad de secuencia. Sin embargo, en este caso, los cambios en una localización específica de un aminoácido o de una secuencia de nucleótidos que son susceptibles de preservar las propiedades funcionales del residuo original se puntúan como si no hubiese ocurrido ningún cambio.
Para las secuencias de aminoácidos, las propiedades funcionales relevantes son las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos. Una sustitución conservadora de un aminoácido en un polipéptido de la invención puede seleccionarse de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica de la bioquímica de proteínas que un aminoácido perteneciente a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica particular (tal como carga, hidrofobicidad e hidrofilicidad) puede sustituirse por otro aminoácido sin alterar sustancialmente la actividad de una proteína, en particular en las regiones de la proteína que no están directamente asociadas con la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al., Molecular Biology o f the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a edición 1987)). Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones conservadoras incluyen, por ejemplo, Lys por Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu por Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser por Thr y viceversa, para mantener un -OH libre; y Gln por Asn y viceversa para mantener un -NH2 libre.
Sustituciones conservadoras ejemplares en la secuencia de aminoácidos de los péptidos de unión CD70 de la invención pueden prepararse de acuerdo con las que se exponen a continuación como sigue:
Tabla 2: i i n n r r min i jemplares
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Para las secuencias de nucleótidos, las propiedades funcionales relevantes son principalmente la información biológica que un cierto nucleótido lleva dentro del marco de lectura abierto de la secuencia en relación con la maquinaria de transcripción y/o traducción. Es comúnmente sabido que el código genético tiene degeneración (o redundancia) y que múltiples codones pueden llevar la misma información con respecto al aminoácido para el que codifican. Por ejemplo, en ciertas especies el aminoácido leucina está codificado por los codones UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, Cu G (o TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG para el ADN) y el aminoácido serina está especificado por UCA, UCG, UCC, UCU, AGU, AGC (o TCA, TCG, TCC, Tc T, AGT, Ag C para el ADN). Los cambios de nucleótidos que no alteran la información traducida se consideran cambios conservadores.
El técnico en la materia tendrá en cuenta el hecho de que varios programas informáticos diferentes, utilizando diferentes algoritmos matemáticos, están disponibles para determinar la identidad entre dos secuencias. Por ejemplo, se puede usar un programa informático que emplea el algoritmo Needleman y Wunsch (Needleman et al. (1970)). De acuerdo con una modalidad, el programa informático es el programa GAP en el paquete de software de Accelrys GCG (Accelrys Inc., San Diego EE.UU.). Las matrices de sustitución que se pueden utilizar son, por ejemplo, una matriz BLOSUM 62 o una matriz PAM250, con un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. El técnico en la materia apreciará que todos estos diferentes parámetros producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.
De acuerdo con una modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software de Accelrys GCG (Accelrys Inc., San Diego EE.UU.) una matriz CMP de NWSgapdna y un peso hueco de 40, 50, 60, 70 o 80 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.
En otra modalidad la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Meyers et al. (1989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en la consulta ALIGN usando datos de secuencia del servidor Genestream IGH Montpellier Francia http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando una tabla de peso residuo PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.
Lo más preferido para la presente invención es usar BLAST (Basic Local Alignment Tool) para determinar el porcentaje de identidad y/o similitud entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos.
Consultas que utilizan los programas BLASTn, BLASTp, BLASTx, tBLASTn y tBLASTx de Altschul et al. (1990) pueden publicarse por medio de las versiones en línea de BLAST a través de http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Alternativamente, se puede usar una versión autónoma de BLAST (por ejemplo, la versión 2.2.29 (publicada el 3 de enero de 2014)) descargable también a través del sitio web de NCBI. Preferiblemente, las consultas BLAST se realizan con los siguientes parámetros. Para determinar el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias de aminoácidos: algoritmo: blastp; tamaño de palabra: 3; matriz de puntuación: BLOSUM62; costos de hueco: Existencia: 11, Extensión: 1; ajustes de composición: ajuste de matriz de puntuación compositiva condicional; filtro: apagado; máscara: apagada. Para determinar el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias de nucleótidos: algoritmo: blastn; tamaño de palabra: 11; coincidencias máximas en intervalo de consulta: 0; puntuaciones de coincidencia/discrepancia: 2, -3; costos de hueco: Existencia: 5, Extensión: 2; filtro: regiones de baja complejidad; máscara: máscara para tabla de búsqueda solamente.
El porcentaje de "cambios conservadores" puede ser determinado de manera similar al porcentaje de identidad de secuencia con la ayuda de los algoritmos y programas informáticos indicados. Algunos programas informáticos, por ejemplo, BLASTp, presentan el número/porcentaje de positivos (= similitud) y el número/porcentaje de identidad. El porcentaje de cambios conservadores puede deducirse del mismo, restando el porcentaje de identidad del porcentaje de positivos/similitud (porcentaje de cambios conservadores = porcentaje de similitud - porcentaje de identidad).
Como comprenderá el técnico en la materia, el anticuerpo de la invención comprenderá un número de sitios de unión a antígeno. Las secuencias estructurales de las secuencias de aminoácidos de los dominios V h y Vl seleccionados junto con las secuencias de las CDR se combinan en un sitio de unión al antígeno. Las combinaciones específicas de secuencias estructurales de los dominios Vh y Vl previstos por la presente invención son como se presentan en la Tabla 3 a continuación, en donde una "X" aparece en una posición de una combinación de un dominio V h y Vl previsto.
Tabla 3: combinación de Vh Vl de las secuencias estructurales.
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La combinación de secuencias estructurales de estos dominios Vh y Vl da como resultado anticuerpos que tienen unión funcional a APRIL humano. Cabe señalar, como se presenta adicionalmente en la sección experimental, que en las pruebas realizadas por los inventores de la presente invención sólo se obtuvieron anticuerpos que tenían funcionalidad de unión a APRIL al combinar las secuencias VH de la invención con la secuencia VL de s Eq ID NO: 30 (VL15). En las combinaciones de las secuencias VH seleccionadas con otras secuencias VL ensayadas (VL10-VL14), los anticuerpos obtenidos no tenían propiedades de unión a APRIL funcionales. Otro efecto sorprendente de la combinación de las secuencias VH y VL utilizadas de acuerdo con la presente invención es una (termo)estabilidad mejorada en comparación con los anticuerpos que tienen las secuencias VH y VL de hAPRIL.01A como se presenta en la sección experimental.
Existe una preferencia por combinar las secuencias estructurales VL de SEQ ID NO: 30 con las secuencias estructurales VH de las secuencias estructurales Vh de SEQ ID NO: 40. Esta combinación más preferida de las secuencias estructurales VL de SEQ ID NO: 30 con las secuencias estructurales VH de SEQ ID NO: 40 se presenta en la Tabla 3 como una letra "X" en negrita (y subrayada). Se ha descubierto sorprendentemente que estas combinaciones de secuencias estructurales Vl y Vh dan lugar a anticuerpos que tienen características beneficiosas adicionales, incluyendo características de estabilidad beneficiosas y/o unión mejorada a APRIL humano diana.
De acuerdo con ciertas modalidades en el dominio Vh, al menos uno de CDR1, CDR2, CDR3 se selecciona del grupo que consiste, respectivamente, en la SEQ NO 5, 6, 7, o en una variante de cualquiera de dichas secuencias. Preferiblemente, en el dominio Vh, las CDR1, CDR2 y CDR3 se seleccionan de la SEQ NO 5, 6, 7, respectivamente, o en una variante de cualquiera de dichas secuencias. Estas secuencias de las CDR del dominio V h corresponden a las CDR del dominio Vh de hAPRIL.01A.
De acuerdo con ciertas modalidades en el dominio Vl, al menos uno de CDR1, CDR2, CDR3 se selecciona del grupo que consiste, respectivamente, en la SEQ NO 8, 9, 10, o en una variante de cualquiera de dichas secuencias. Preferiblemente, en el dominio Vl, las CDR1, CDR2 y CDR3 se seleccionan de la SEQ NO 8, 9, 10, respectivamente, o en una variante de cualquiera de dichas secuencias. Estas secuencias de las CDR del dominio V l corresponden a las CDR del dominio Vl de hAPRIL.01A.
De acuerdo con ciertas modalidades en un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, las CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio Vh se seleccionan de la SEQ NO 5, 6, 7, respectivamente, o de una variante de cualquiera de dichas secuencias, y las CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio Vl se seleccionan de la SEQ NO 8, 9, 10, respectivamente, o de una variante de cualquiera de dichas secuencias.
Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que pueden realizarse mejoras adicionales en los anticuerpos que combinan las secuencias estructurales VH y VL utilizadas en la presente invención. En particular, la sustitución R72S en la secuencia de aminoácidos Vh da como resultado una unión mejorada a APRIL humano.
Además, la sustitución R67K-V68A en la secuencia de aminoácidos VH también da como resultado una unión mejorada a APRIL humano. Por lo tanto, la invención de acuerdo con ciertas modalidades, se relaciona con anticuerpos en los cuales en la secuencia de aminoácidos V h el aminoácido en la posición 72 es S. Las secuencias amino VH de las SEQ ID NO. 40 es un ejemplo de una secuencia tal de aminoácidos VH que tienen un residuo S en la posición 72. De acuerdo con otras modalidades, la invención se relaciona con anticuerpos en los cuales en la secuencia de aminoácidos Vh el aminoácido en la posición 67 es K y el aminoácido en la posición 68 es A. Dentro de la presente invención también se prevé la combinación de las tres sustituciones de aminoácidos R72S, R67K y V68A. Por lo tanto la invención se relaciona con anticuerpos en los cuales en la secuencia de aminoácidos Vh el aminoácido en la posición 72 es S, el aminoácido en la posición 67 es K y el aminoácido en la posición 68 es A.
Aparte de los dominios Vh y Vl, el anticuerpo puede comprender dominios adicionales tales como un número adecuado de dominios Ch y un número adecuado de dominios Cl. Los dominios Ch y los dominios Cl pueden ser de origen humano. Tales dominios incluyen además dominios que proporcionan anticuerpos con las regiones Fc modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses No.
5.624.821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; Presta, 2006, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656; Vincent y Zurini, Biotechnol. J., 2012, 7:1444-50; Kaneko y Niwa, Biodrugs, 2011, 25: 1-11. Dicha modificación puede usarse para mejorar o suprimir diversas reacciones del sistema inmunitario, con posibles efectos beneficiosos en el diagnóstico y la terapia. Las alteraciones de la región Fc incluyen cambios de aminoácidos (sustituciones, deleciones e inserciones), glicosilación o desglicosilación, y adición de múltiples Fc. De acuerdo con ciertas modalidades, es preferible usar regiones Fc que muestren funciones efectoras Fc reducidas. Los anticuerpos de la presente invención de acuerdo con ciertas modalidades pueden tener además regiones Fc procedentes de las regiones IgG4 y/o Fc humanas que portan un mutante deficitario de la glicosilación de N297Q. Los dominios Cl pueden seleccionarse de los dominios constantes Kappa o Lambda humanos. Preferiblemente, se utiliza el dominio Cl Kappa humano.
De acuerdo con ciertas modalidades de la descripción, se proporcionan anticuerpos que comprenden dominios Fc y Cl, en los cuales la secuencia de aminoácidos del dominio Vh está en una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene al menos el 70% de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 42, 44, 46, 48, 52 preferiblemente SEQ ID NO: 48 o 52, lo más preferiblemente SEQ ID NO: 52, y la secuencia de aminoácidos del dominio Vl está en una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene al menos el 70% de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 50. 1090
Combinaciones específicas de estas cadenas pesada y ligera son como se presentan en la Tabla 4 a continuación, en donde aparece una "X" en la posición de una combinación de una cadena pesada y ligera prevista.
Tabla 4
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Las combinaciones preferidas se indican con una "X" subrayada. Las combinaciones más preferidas se indican con una "X" en negrita (y subrayada).
De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se relaciona con un polinucleótido aislado que codifica un dominio Vh y/o un dominio Vl de un anticuerpo de acuerdo con la invención. Una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vh preferiblemente es una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 70% de similitud de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 39. Una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio V l preferiblemente es una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 70% de similitud de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 29.
La invención se relaciona además con una unidad de expresión que comprende una serie de vectores de expresión, que comprende una serie de polinucleótidos de acuerdo con la invención bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas, en donde la serie de polinucleótidos codifican el dominio Vh y el dominio Vl de un anticuerpo de acuerdo con la invención. La unidad de expresión puede diseñarse de manera que la secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vh y la secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vl puedan estar sobre el mismo vector de expresión. De esta manera, la unidad de expresión puede comprender un solo vector. Alternativamente, la secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vh y la secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vl puedan estar sobre un vector de expresión diferente. En tales modalidades, la unidad de expresión comprenderá una pluralidad tal como, por ejemplo 2, vectores de expresión.
Un aspecto adicional de la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende una serie de polinucleótidos de la invención y/o una unidad de expresión de la invención. La unidad de expresión preferiblemente es una unidad de expresión que comprende un vector de expresión que comprende tanto una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vh como una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vl.
El anticuerpo de la invención puede ser cualquiera de los siguientes:
- un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo;
- un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo; o
- un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, mAb biespecífico y un diacuerpo (diabody). Se prefieren los anticuerpos humanizados que comprenden una serie de sitios de unión a antígenos basados en las CDR de APRIL.01A. Puede observarse que las regiones estructurales seleccionadas de acuerdo con la invención son de origen humano y, por lo tanto, pueden utilizarse adecuadamente para obtener anticuerpos humanizados, en particular cuando se combinan con regiones constantes de origen humano.
De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la invención se relaciona con un método para la producción de un anticuerpo de la invención, el método comprende:
a) cultivar una célula hospedadora que comprende de polinucleótidos de la invención y/o una unidad de expresión de la invención en medio de cultivo en condiciones en las cuales se expresa el polinucleótido, produciendo de este modo polipéptidos que comprenden las regiones variables de cadena ligera y pesada; y
b) recuperando los polipéptidos de la célula hospedadora o del medio de cultivo.
La invención se relaciona además con una composición que comprende un anticuerpo de la invención en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tal composición en una modalidad puede comprender más de un anticuerpo. En una modalidad, la composición comprende uno o más otros compuestos activos además de los uno o más anticuerpos de la invención. Dichas composiciones de combinación pueden utilizarse para la terapia de combinación, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer. En ese caso, el anticuerpo puede combinarse con uno o más de los fármacos anticancerosos habituales. Para otras terapias de combinación pueden utilizarse otros compuestos activos adicionales. Para la terapia de combinación no es obligatorio tener los dos o más compuestos activos en la misma composición. Por lo tanto, también es parte de la invención el uso combinado o subsiguiente de los anticuerpos y el otro compuesto activo, en donde el anticuerpo y el otro compuesto activo son administrados simultáneamente o subsiguientemente.
Como es evidente a partir de la descripción anterior, el anticuerpo de la invención puede ser para uso en la terapia y el diagnóstico y para otros fines no terapéuticos. Por lo tanto, la invención se relaciona además con métodos de uso de los anticuerpos en la terapia y el diagnóstico y para otros fines no terapéuticos.
En una modalidad, la terapia comprende la inhibición de la proliferación de células inmunitarias y/o de la supervivencia de células inmunitarias. En otra modalidad el tratamiento está dirigido a tratar el cáncer. En una modalidad, la terapia comprende el tratamiento de una enfermedad autoinmune. En una modalidad, la terapia comprende el tratamiento de una enfermedad inflamatoria. En una modalidad, la terapia comprende el tratamiento de una enfermedad mediada por la secreción de Ig, en particular una enfermedad mediada por la secreción de IgA. Los usos terapéuticos del anticuerpo de la invención se discutirán a más detalle a continuación.
El anticuerpo de la invención al ser usado en aplicaciones no terapéuticas puede ser aplicado, por ejemplo, en las técnicas in vitro o ex vivo, tales como citometría de flujo, Western blot, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) e inmunohistoquímica.
Terapia
En vista de que los anticuerpos de la presente invención se unen a APRIL humano análogo a hAPRIL.01A, los anticuerpos de la presente invención son adecuados para su uso en terapia análoga a hAPRIL.01A, con las mejoras expuestas anteriormente y en la sección experimental. Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invención son adecuados para el tratamiento de un padecimiento del que se sabe o se espera que mejore bloqueando la interacción de APRIL humano con BCMA y/o TACI. Como ya se sabe en la técnica, el bloqueo de la interacción de APRIL humano con BCMA y/o TACI inhibe la proliferación y/o supervivencia de células inmunitarias y por lo tanto puede ser de valor para el tratamiento de padecimientos en los cuales tal bloqueo de la proliferación y/o supervivencia de células inmunitarias es beneficioso, tal como enfermedades inflamatorias, enfermedades mediadas por la secreción de Ig y/o enfermedades autoinmunes. El bloqueo de la interacción de APRIL humano con BCMA y/o TACI puede además ser beneficioso en el tratamiento del cáncer.
Las enfermedades autoinmunes para las que puede ser beneficioso un anticuerpo de la invención pueden seleccionarse de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes tipo 1, psoriasis, enfermedad de Crohn y otras enfermedades inflamatorias intestinales tales como colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), encefalomielitis autoinmune, La miastenia gravis (MG), tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, pénfigo, enfermedad de Graves, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, esclerodermia con anticuerpos anti­ colágeno, enfermedad mixta del tejido conectivo, polipositis, anemia perniciosa, enfermedad idiopática de Addison, infertilidad asociada con autoinmunidad, glomerulonefritis, glomerulonefritis crescentica, glomerulonefritis proliferativa, penfigoide ampolloso, síndrome de Sjogren, artritis psoriásica, resistencia a la insulina, diabetes mellitus autoinmune, hepatitis autoinmune, hemofilia autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), hepatitis autoinmune, hemofilia autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune, uveoretinitis autoinmune, síndrome de Guillain-Bare, arteriesclerosis y enfermedad de Alzheimer.
Además, los anticuerpos de la invención también pueden ser beneficiosos en el tratamiento de otros padecimientos asociados cuando la reducción de las respuestas inmunes es beneficiosa, tal como rechazo de injerto (trasplante) o padecimientos alérgicos.
Además, los anticuerpos de la invención pueden ser beneficiosos en el tratamiento de otros padecimientos en los cuales es beneficioso reducir los niveles de inmunoglobulina, tales como IgA, incluyendo IgA1 o IgA2, IgG, IgM, tales como padecimientos asociados con la secreción de Ig, en particular la secreción de IgA, la sobreproducción de Ig, tal como IgA, incluyendo la sobreproducción IgA1 o IgA2, IgG, IgM, en particular la sobreproducción de IgA, o la deposición de Ig, en particular la deposición de IgA. Ejemplos de tales padecimientos incluyen, pero no se limitan a, nefropatía por IgA y otras formas de glomerulonefritis, enfermedad celíaca, enfermedades penfigoide, púrpura de Henoch-Schonlein y otras enfermedades autoinmunes que están asociadas con la deposición de Ig.
Dentro de la presente invención, el tratamiento del "padecimiento" incluye cualquier uso terapéutico, incluyendo usos profilácticos y curativos del anticuerpo anti-APRIL humano. Por lo tanto, el término "padecimiento" puede referirse a estados de enfermedad, pero también a estados fisiológicos en el entorno profiláctico en el que la fisiología no está alterada en un grado perjudicial.
Los cánceres dentro de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, mieloblastos promielocíticos, eritroleucemia monocítica mielomonocítica, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia linfocítica crónica, linfoma de células del manto, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de Burkitt y linfoma de células B marginales, linfoma policitemia vera, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, tumores sólidos, sarcomas y carcinomas, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, chrondrosarcoma, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer de útero, tumor de testículo, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma esofágico, carcinoma de células basales, cáncer del conducto biliar, cáncer de la vejiga, cáncer de hueso, cáncer del cerebro y del sistema nervioso central (CNS), cáncer cervical, coriocarcinoma, cánceres colorrectales, cáncer del tejido conectivo, cáncer del sistema digestivo, cáncer endometrial, cáncer de esófago, cáncer de ojo, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, neoplasia intraepitelial, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (células pequeñas, células grandes), melanoma, neuroblastoma; cáncer de cavidad oral (por ejemplo labio, lengua, boca y faringe), cáncer de ovario, cáncer de páncreas, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de recto; cáncer de sistema respiratorio, sarcoma, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer tiroideo, cáncer uterino y cáncer del sistema urinario. Los cánceres que son de interés particular son los cánceres que tienen células que expresan APRIL, tales malignancias derivadas de células B, linfoides o carcinomas de pulmón o colon o mieloma múltiple (MM) o células B de leucemia linfocítica crónica (LLC).
Para el tratamiento de cualquiera de los padecimientos mencionados anteriormente, el anticuerpo de la invención puede ser dosificado directamente a los sujetos, solo o en combinación con otros agentes terapéuticos. Por lo tanto, de acuerdo con ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo de la invención en su uso y/o en una composición se puede combinar con una serie de agentes quimioterapéuticos, que se usan para tratar mieloma múltiple (MM), síndrome mielodisplásico (MDS), macroglobinemia de Waldenstrom, B-CLL, linfoma difuso de células B de células grandes, linfoma no Hodgkin y granulomatosis de Wegener, tales como melfalán, vincristina, fludarabina, clorambucilo, bendamustina, etopósido, doxorrubicina, ciclofosfamida, cisplatino. Además, un anticuerpo de la invención en su uso y/o composición se puede combinar con una serie de agentes inmunomoduladores tales como corticosteroides (dexametasona, prednisolona), análogos de talidomida (talidomida, lenalidomida, pomalidomida). También un anticuerpo de la invención en su uso y/o composición se puede combinar con una serie de inhibidores de quinasa dirigidos tales como ibrutinib, idelalisib. Además, un anticuerpo de la invención en su uso y/o composición se puede combinar con una serie de terapias de anticuerpos dirigidas a CD20 tales como rituximab, ofatumumab, obinotuzumab; o terapias de anticuerpos dirigidas a CD52 tales como alemtuzumab; o terapias de anticuerpos dirigidas a CD38 tales como daratumumab; o terapias de anticuerpos dirigidas a IL-6 o al receptor de IL-6 (tales como sarilumab, tocilizumab); o terapias de anticuerpos dirigidas a CS-1 (tales como elotuzumab); o terapias de anticuerpos dirigidas a BCMA (tales como GSK2857916); o terapias de anticuerpos dirigidas a BAFF o BLyss (tales como tabalumab). Además, un anticuerpo de la invención en su uso y/o composición se puede combinar con una serie de bisfosfonatos (tales como pamidronato, ácido zolendrónico). Se describe anteriormente que APRIL protege a las células MM de la privación de IL-6, el tratamiento con dexametasona y bortezomib (Moreaux et al, 2004, Blood 103(8) : 3148-57; Li et al., 2010, Med Oncol. 27:439-45). Se ha demostrado que hAPRIL.01A invierte la supervivencia de las células MM mediada por APRIL en el tratamiento con lenalidomida y dexametasona (Tai et al., 2014, ASH poster 2098). En vista de estos descubrimientos en la técnica, el anticuerpo de la presente invención se puede combinar en particular en su uso y/o composición con otro agente terapéutico seleccionado de corticosteroides, por ejemplo, dexametasona, prednisolona, preferiblemente dexametasona, o análogos de talidomida, por ejemplo talidomida, lenalidomida, pomalidomida, en particular lenalidomida, o con bortezomid.
Diagnóstico
En vista de que APRIL representa un importante marcador de enfermedades, tales como, pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y neoplasias malignas, la detección de APRIL en el suero y/o tejido de sujetos humanos es importante. Para aplicaciones de diagnóstico, los anticuerpos típicamente se etiquetarán (directa o indirectamente) con una fracción detectable. Existen numerosas etiquetas que se pueden agrupar generalmente en las siguientes categorías: biotina, fluorocromos, radionucleótidos, enzimas, yodo y etiquetas biosintéticas.
Se ha demostrado que el APRIL soluble presente en el suero y otros fluidos y/o tejidos corporales de una gama de pacientes diferentes se correlaciona con la gravedad de la enfermedad de los pacientes. Por ejemplo, los pacientes que padecen de leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (LNH) y mieloma múltiple (MM), pacientes de DLBCL (LNH), cáncer colorrectal, LES, una gama más amplia de enfermedades reumáticas sistémicas con trasfondo inmunológico (ahora incluyendo además síndrome de Sjogren, síndrome de Reiter, artritis psoriásica, polimiositis y espondilitis anquilosante) y dermatitis atópica demostraron niveles séricos elevados de APRIL soluble. Además, los niveles séricos de APRIL en pacientes que padecen nefropatía por IgA están elevados (McCarthy et al., 2011, J. Clin. Invest. 121(10):3991-4002). Además, los niveles séricos de APRIL se elevan en la sepsis y pronostican la mortalidad en pacientes críticamente enfermos (Jonsson et al., 1986, Scand J Rheumatol Suppl 61, 166-9; Roschke et al., 2002, J Immunol 169, 4314-21). Basándose en las características de unión de APRIL.01A demostradas, los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden utilizar como una herramienta de diagnóstico para detectar APRIL soluble en los fluidos y/o tejidos corporales.
Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies. A Manual of Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar también para los ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo es etiquetado con un radionúclido de manera que se pueda localizar el antígeno o las células que lo expresan, utilizando inmunoencintigrafía o tomografía por emisión de positrones.
Aplicaciones no terapéuticas
De acuerdo con otro aspecto de la descripción, los anticuerpos tienen otros usos no terapéuticos. Los usos no terapéuticos de los anticuerpos de la invención incluyen citometría de flujo, Western blot, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) e inmunohistoquímica.
Los anticuerpos de esta invención pueden usarse, por ejemplo, como un reactivo de purificación por afinidad a través de inmovilización a una columna de proteína A-Sefarosa.
Definiciones generales
El término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que exhibe la actividad biológica deseada, tal como la inhibición de la unión de un ligando a su receptor, o inhibiendo la señalización inducida por un ligando de un receptor. En el presente caso la actividad biológica comprende el bloqueo de la unión de APRIL a sus receptores BCMA y/o TACI. Por lo tanto, el término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente abarca, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa) y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) tales como basados en la tecnología Duobody® (Genmab) O la tecnología Hexabody® (Genmab) o un fragmento de anticuerpo.
"Fragmento de anticuerpo" y "fragmento de unión de anticuerpo" significan fragmentos y análogos de unión a antígenos de un anticuerpo, incluyendo típicamente al menos una porción de las regiones de unión a antígeno o variables (por ejemplo, una o más CDR) del anticuerpo parental. Un fragmento de anticuerpo retiene al menos una parte de la especificidad de unión del anticuerpo parental. Típicamente, un fragmento de anticuerpo retiene al menos el 10% de la actividad de unión parental cuando dicha actividad se expresa sobre una base molar. Preferiblemente, un fragmento de anticuerpo retiene al menos el 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% o más de la afinidad de unión del anticuerpo parental al destino. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, por ejemplo, sc-Fv, unicuerpos (unibodies)(tecnología de Genmab); nanoanticuerpos (nanobodies)(tecnología de Ablynx); anticuerpos de dominio (domain antibodies)(tecnología de Domantis); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Variantes de anticuerpos modificados se reseñan en Hollinger y Hudson, 2005, Nat. Biotechnol.
23:1126-1136.
Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y las regiones variables y CH1 de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada.
Una región "Fc" contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios Ch1 y Ch2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen unidas por dos o más enlaces de disulfuro y por interacciones hidrofóbicas de los dominios Ch3.
Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio Vh y el dominio Ch1 y también la región entre los dominios Ch1 y Ch2, de manera que se puede formar un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2.
Un "fragmento F(ab')2 contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios Ch1 y Ch2, de manera que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')2 está por tanto compuesto de dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos por un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.
La "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras, pero carece de las regiones constantes.
Un "anticuerpo Fv de cadena sencilla" (o "anticuerpo scFv") se refiere a los fragmentos de anticuerpo que comprenden dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en los cuales estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios V h y Vl, lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun, 1994, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, ediciones Rosenburg y Moore. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315. Véase también, solicitud de patente internacional no. de publicación WO 88/01649 y patentes estadounidenses Nos. 4.946.778 y 5.260.203.
Un "diacuerpo" es un pequeño fragmento de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl o Vl-Vh). Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, p.ej., EP 404.097; WO 93/11161; y Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 6444­ 6448.
"Duobodies" son anticuerpos biespecíficos con las estructuras de IgG normales (Labrijn et al., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 110 (13): 5145-5150).
"Hexabodies" son anticuerpos que, manteniendo la estructura regular y la especificidad, tienen una capacidad de matar aumentada (Diebolder et al., 2014, Science 343 (6176):1260-3).
Un "fragmento de anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones Vh están unidas covalentemente con un enlazador peptídico para crear un fragmento de anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un fragmento de anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse a los mismos o diferentes antígenos.
Como se usa en la presente, el anticuerpo hAPRIL.01A es un anticuerpo de ratón en el que la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
Un fragmento de anticuerpo puede comprender una porción suficiente de la región constante para permitir la dimerización (o multimerización) de cadenas pesadas que tienen una capacidad de enlace disulfuro reducida, por ejemplo, cuando al menos una de las cisteínas de bisagra normalmente implicadas en enlace disulfuro de cadena inter-pesada es alterada como se describe en la presente. En otra modalidad, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la región Fc, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, la modulación de media vida de anticuerpo, ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo), y/o la unión del complemento (por ejemplo, cuando el anticuerpo tiene un perfil de glicosilación necesario para la función de ADCC o la unión al complemento).
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a anticuerpos en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica o homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o las cadenas son idénticas o homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4,816,567 y Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81:6851-6855).
Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) así como anticuerpos humanos. Dichos anticuerpos contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente todos de al menos uno y, típicamente, dos dominios variables, en los que todos o esencialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o esencialmente todas las regiones FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de manera óptima también comprende al menos una porción de una región constante (Fc) de la inmunoglobulina, normalmente de una inmunoglobulina humana. Las formas humanizadas de anticuerpos de roedor comprenderán esencialmente las mismas secuencias CDR de los anticuerpos parentales de roedor, aunque pueden incluirse ciertas sustituciones de aminoácidos para aumentar la afinidad, aumentar la estabilidad del anticuerpo humanizado o por otras razones.
Los anticuerpos de la presente invención incluyen además anticuerpos con las regiones Fc modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 5.624.821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; Presta, 2006, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Dicha modificación puede usarse para mejorar o suprimir diversas reacciones del sistema inmunitario, con posibles efectos beneficiosos en el diagnóstico y la terapia. Las alteraciones de la región Fc incluyen cambios de aminoácidos (sustituciones, deleciones e inserciones), glicosilación o desglicosilación, y adición de múltiples Fc. Los cambios en la Fc también pueden alterar la vida media de los anticuerpos en los anticuerpos terapéuticos, y una semivida más larga daría lugar a una dosificación menos frecuente, con la concomitante mayor comodidad y uso disminuido del material. Véase Presta, 2005, J. Allergy Clin. Immunol.116:731 at 734-35.
Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos con las regiones Fc intactas que proporcionan funciones efectoras completas, por ejemplo, anticuerpos del isotipo IgG1, que inducen citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) en una célula diana.
Los anticuerpos también se pueden conjugar (por ejemplo, unir covalentemente) a moléculas que mejoran la estabilidad del anticuerpo durante el almacenamiento o aumentan la vida media del anticuerpo in vivo. Ejemplos de moléculas que aumentan la semivida son albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano) y polietilenglicol (PEG). Los derivados de anticuerpos enlazados con albúmina y PEGilados pueden prepararse usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Chapman, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:531 -545; Anderson y Tomasi, 1988, J. Immunol. Methods 109:37-42; Suzuki et al., 1984, Biochim. Biophys. Acta 788:248-255; y Brekke y Sandlie, 2003, Nature Rev. 2:52-62.
El término "región hipervariable", como se utiliza en la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR", definida por la alineación de secuencia, por ejemplo, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (h 2) y 95­ 102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada (véase Kabat et al., 1991, Sequences of proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md.) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (HVL), como se define estructuralmente, por ejemplo, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada (véase Chothia y Leskl, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917).
Los residuos o secuencias de "estructurales" o "FR" son aquellos residuos o secuencias del dominio variable distintos de los restos CDR como se define en la presente.
El anticuerpo de la invención de acuerdo con ciertas modalidades puede ser un anticuerpo aislado. Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas modalidades, el anticuerpo será purificado (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry y más preferiblemente hasta más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por medio del uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, normalmente el anticuerpo aislado será preparado usando al menos una etapa de purificación.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está normalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico en la forma en la que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo, donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de aquella de las células naturales.
El término "anticuerpo monoclonal" cuando se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter de anticuerpo como obtenido a partir de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por medio del método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., 1975, Nature 256:495, o se pueden preparar por medio de métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos fágicos usando las técnicas descritas en Clackson et al., 1991, Nature 352:624-628 y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597, por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos".
Como se utiliza en la presente, el término "célula inmunitaria" incluye células que son de origen hematopoyético y que desempeñan un papel en la respuesta inmune. Las células inmunitarias incluyen linfocitos, tales como células B y células T, células asesinas naturales, células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.
Como se usa en la presente, un "inmunoconjugado" se refiere a un anticuerpo anti-APRIL humano, o un fragmento del mismo, conjugado a una fracción terapéutica, tal como una toxina bacteriana, un fármaco citotóxico o una radiotoxin. Las fracciones tóxicas se pueden conjugar a anticuerpos de la invención usando métodos disponibles en la técnica.
Como se usa en la presente, "variante" de una secuencia o una "secuencia variante" se refiere a una secuencia que difiere de la secuencia divulgada en uno o más residuos de aminoácidos pero que retiene la actividad biológica de la molécula parental. La invención incluye las variantes de anticuerpos explícitamente divulgadas por las diversas secuencias. Para las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio V h, de acuerdo con algunas modalidades, las secuencias variantes pueden comprender hasta 6 sustituciones de aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, para las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 tomadas en conjunto. De manera similar, para las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio Vl, de acuerdo con algunas modalidades, las secuencias variantes pueden comprender hasta 6 sustituciones de aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, para las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 tomadas en conjunto.
"Variantes modificadas conservativamente" o "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere a sustituciones de aminoácidos que son conocidas por los técnicos en esta materia y pueden hacerse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los técnicos en la materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al., M olecularBiology o f the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a edición 1987)). Tales sustituciones ejemplares se hacen preferiblemente conforme a las establecidas anteriormente en la Tabla 2.
Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" se refiere a un valor que está dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular, según lo determinado por un técnico en la materia, lo cual dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar por la práctica en la técnica. Alternativamente, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" puede significar un intervalo de hasta el 20%. Además, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces de un valor. Cuando se proporcionan valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe suponer que el significado de "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor particular.
El término "una serie de" debe entenderse en el sentido de uno o más. Dependiendo en el contexto de su uso "una serie de" puede referirse a cualquier número adecuado seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. De acuerdo con ciertas modalidades, "una serie de" puede tener el significado de "una pluralidad". Dependiendo en el contexto de su uso "una pluralidad" puede referirse a cualquier número adecuado seleccionado de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
Se une "específicamente", al referirse a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indica una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, por ejemplo, APRIL, en una población heterogénea de proteínas y/u otros productos biológicos. Así, en condiciones designadas, un ligando/antígeno especificado se une a un receptor/anticuerpo particular y no se une en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra.
"Administración", "terapia" y "tratamiento", como se aplica a un animal, humano, sujeto experimental, célula, tejido, órgano o fluido biológico, se refieren al contacto de un agente o una composición farmacéutico, terapéutico, de diagnóstico exógeno con el animal, ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico. "Administración", "terapia" y "tratamiento" pueden referirse, por ejemplo, a métodos de investigación, terapéuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico y experimentales. El tratamiento de una célula comprende el contacto de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un fluido, donde el fluido está en contacto con la célula. "Administración", "terapia" y "tratamiento" también significan tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, por medio de un reactivo, una composición de diagnóstico, de unión, u por medio de otra célula. Dentro de la presente descripción de la invención, los términos "in vitro" y "ex vivo" tienen un significado similar y pueden usarse indistintamente.
El ADN del anticuerpo también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EE.UU. No. 4.816.567; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851), o uniendo covalentemente a la secuencia que codifica la inmunoglobulina todo o una parte de la secuencia codificante para material no inmunoglobulínico (por ejemplo, dominios proteicos). Típicamente, dicho material no inmunoglobulínico se sustituye por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituye por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad para un antígeno diferente.
Las variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-APRIL humano de la invención se preparan introduciendo cambios adecuados de nucleótidos en los ADN codificantes, o por medio de síntesis de péptidos. Tales variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos mostradas para los anticuerpos anti-APRIL. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales de los anticuerpos anti-APRIL, tales como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilación.
Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones de los polipéptidos de anticuerpos anti-APRIL que son las ubicaciones preferidas para la mutagénesis se llama "mutagénesis por escaneo de alanina", como describen Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085. En este caso, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituye por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferiblemente, alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno APRIL. Los residuos de aminoácidos que demuestran la sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. De este modo, aunque el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario predeterminar la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutación en un sitio dado, se realiza un escaneo de Ala o una mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes de anticuerpos anti-APRIL expresadas se analizan para la actividad deseada.
Normalmente, las variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-APRIL tendrán una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud de secuencia de aminoácidos de al menos el 75% con las secuencias de aminoácidos de anticuerpo originales de la cadena pesada o ligera, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95%, 98% o 99%. La similitud u homología con respecto a esta secuencia es como se definió anteriormente.
Los anticuerpos que tienen las características identificadas en la presente como deseables pueden ser rastreados para aumentar la actividad biológica in vitro o la afinidad de unión adecuada. Para la detección de anticuerpos que se unen al mismo epítopo sobre APRIL humano que hAPRIL.01A, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Es probable que los anticuerpos que se unen al mismo epítopo entren en bloqueo cruzado en tales ensayos, pero no necesariamente todos los anticuerpos de bloqueo cruzado se unirán precisamente al mismo epítopo, puesto que el bloqueo cruzado puede resultar del impedimento estérico de la unión del anticuerpo por anticuerpos se unen a epítopos superpuestos, o incluso epítopos no superpuestos próximos.
Alternativamente, se puede realizar el mapeo de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al., 1995, J. Biol Chem. 270:1388-1394, para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés. "Mutagénesis por escaneo de alanina", como se describe por Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085, o alguna otra forma de mutagénesis puntual de residuos de aminoácidos en APRIL humano, también puede usarse para determinar el epítopo funcional para los anticuerpos anti-APRIL de la presente invención.
Otro método para mapear el epítopo de un anticuerpo es estudiar la unión del anticuerpo a los péptidos sintéticos lineales y CLIPS que pueden ser examinados usando tarjetas PEPSCAN de formato de tarjeta de crédito como se describe por Slootstra et al. (Slootstra et al., 1996, Mol. Diversity 1: 87-96) y Timmerman et al. (Timmerman et al., 2007, J. Mol. Recognit. 20: 283-299). La unión de anticuerpos a cada péptido se determina en un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas basado en PEPSCAN (ELISA).
Pueden obtenerse anticuerpos adicionales que se unen al mismo epítopo que hAPRIL.01A, por ejemplo, por medio de análisis de anticuerpos producidos contra APRIL para la unión al epítopo, o por medio de inmunización de un animal con un péptido que comprende un fragmento de APRIL humano que comprende las secuencias de epítopo. Se podría esperar que los anticuerpos que se unen al mismo epítopo funcional exhiban actividades biológicas similares, tales como una actividad de unión a APRIL y de bloqueo de BCMA y TACI similar, y tales actividades pueden ser confirmadas por ensayos funcionales de los anticuerpos.
El anticuerpo se puede seleccionar en cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Puede usarse cualquier isotipo de IgG, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. También se contemplan variantes de los isotipos de IgG. El anticuerpo puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. La optimización de las secuencias de dominio constante necesarias para generar la actividad biológica deseada se consigue fácilmente analizando los anticuerpos en los ensayos biológicos descritos en los Ejemplos.
Del mismo modo, cualquier clase de cadena ligera se puede usar en las composiciones y métodos de la presente invención. Específicamente, kappa, lambda o variantes de las mismas son útiles en los presentes métodos y composiciones.
Los anticuerpos de la invención también pueden conjugarse con cargas útiles citotóxicas tales como agentes citotóxicos o radionucleótidos tales como 99Tc, 90Y,111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, and 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr y 56Fe. Tales conjugados de anticuerpos pueden usarse en inmunoterapia para selectivamente dirigirse a y matar células que expresan una diana (el antígeno para ese anticuerpo) en su superficie. Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen ricina, alcaloide de vinca, metotrexato, exotoxina de Psuedomonas, saporina, toxina de difteria, cisplatino, doxorrubicina, toxina de abrina, proteína antiviral de gelonina y fitolaca.
Los anticuerpos de la invención también pueden conjugarse con etiquetas fluorescentes o quimioluminiscentes, incluyendo fluoróforos tales como quelatos de tierras raras, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, isotiocianato, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaladehído, fluorescamina, 152Eu, dansil, umbeliferona, luciferina, etiqueta luminal, etiqueta isoluminal, etiqueta de éster de acridinio aromático, etiqueta de imidazol, etiqueta de sal de acridimio, etiqueta de éster de oxalato, etiqueta de aequorina, 2,3-dihidroftalazinedionas, biotina/avidina, etiquetas espín y radicales libres estables.
Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para conjugar las moléculas de anticuerpo o moléculas de proteína de la invención a las diversas fracciones, incluyendo los métodos descritos por Hunter et al., 1962, Nature 144: 945; David et al., 1974, Biochemistry 13: 1014; Pain et al., 1981, J. Immunol. Meth. 40:219; y Nygren, J., 1982, Histochem. and Cytochem. 30:407. Los métodos para conjugar anticuerpos y proteínas son convencionales y conocidos en la técnica.
Purificación de anticuerpos
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido intracelularmente, en el espacio periplásmico, o ser secretado directamente en el medio. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, como primera etapa, los restos particulados, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados en el espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se derrite en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares se pueden eliminar por centrifugación. Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente son concentrados en primer lugar utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.
La composición de anticuerpos preparada a partir de las células puede ser purificada usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y isotipo de cualquier región Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas Ig.gamma1, Ig.gamma2 o Ig.gamma4 humanas (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62:1-13). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para human.gamma.3 (Guss et al., 1986, EMBO J 5: 1567-1575). La matriz a la que está unido el ligando de afinidad es más a menudo agarosa, pero hay otras matrices disponibles.
Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenedivinil)benceno permiten tasas de flujo más altas y tiempos de procesamiento más cortos de los que se pueden lograr con agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio Ch3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) es útil para la purificación. Otras técnicas de purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE™, cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a ser recuperado.
En una modalidad, la glicoproteína puede ser purificada usando adsorción sobre un sustrato de lectina (por ejemplo, una columna de afinidad de lectina) para eliminar la glicoproteína que contiene fucosa de la preparación y de ese modo enriquecer para obtener la glicoproteína libre de fucosa.
Formulaciones farmacéuticas
La invención comprende formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-APRIL humano. Para preparar las composiciones farmacéuticas o estériles, el anticuerpo se mezcla con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y Farmacopea de EE.UU.: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mezclando con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, suspensiones espesas, soluciones o suspensiones acuosas (véase, por ejemplo, Hardman et al., 2001, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis o f Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY, Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice o f Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, NY; Avis, et al. (eds.), 1993, Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.), 1990, Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.), 1990, Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie, 2000, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).
La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpos, administradas solas o en combinación con otro agente, tales como los fármacos anticancerígenos habituales, se pueden determinar a través de procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación entre LD50 y ED50. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y los estudios en animales se pueden utilizar en la formulación de un rango de dosificación para el uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada.
Las vías de administración adecuadas incluyen administración parenteral, tal como administración intramuscular, intravenosa o subcutánea y administración oral. La administración de anticuerpos, utilizados en la composición farmacéutica o para practicar el método de la presente invención, puede llevarse a cabo en una variedad de formas convencionales, tales como ingestión oral, inhalación, aplicación tópica o cutánea, subcutánea, intraperitoneal, parenteral, inyección intraarterial o intravenosa. En una modalidad, el anticuerpo de la invención se administra intravenosamente. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra por vía subcutánea.
Alternativamente, se puede administrar el anticuerpo de una manera local en vez de sistémica, por ejemplo, por medio de la inyección del anticuerpo directamente en el sitio de acción, a menudo en una formulación en depósito o de liberación sostenida. Además, se puede administrar el anticuerpo en un sistema de administración de fármacos dirigido.
Se dispone de orientación para seleccionar las dosis adecuadas de anticuerpos, citoquinas y moléculas pequeñas (véase, por ejemplo, Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Bach (ed.), 1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky, et al., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594-1602).
La determinación de la dosis apropiada es hecha por el medico clínico, por ejemplo, utilizando parámetros o factores de los cuales se sabe o se sospecha en la técnica que afectan el tratamiento o de los cuales se pronostica que afectan el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y después se incrementa en pequeños incrementos hasta que se consigue el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas diagnósticas importantes incluyen las de los síntomas de, por ejemplo, inflamación o nivel de citoquinas inflamatorias producidas.
Un protocolo de dosis preferido es uno que implica la dosis máxima o frecuencia de dosis que evita efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total es generalmente de al menos 0,05 pg/kg de peso corporal, más generalmente de al menos 0,2 pg/kg, lo más generalmente de al menos 0,5 pg/kg, típicamente de al menos 1 pg/kg, más típicamente de al menos 10 pg/kg, lo más típicamente al menos 100 mg/kg, preferiblemente al menos 0,2 mg/kg, más preferiblemente al menos 1,0 mg/kg, lo más preferiblemente al menos 2,0 mg/kg, óptimamente al menos 10 mg/kg, más óptimamente al menos 25 mg/kg y lo más óptimamente al menos 50 mg/kg (véase, por ejemplo, Yang, et al., 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al., 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al., 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al., 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144). La dosis deseada de un agente terapéutico de molécula pequeña, por ejemplo, un mimético peptídico, producto natural, o químico orgánico, es aproximadamente la misma que para un anticuerpo o polipéptido, sobre una base de moles/kg.
Como se usa en la presente, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye un aplazamiento del desarrollo de los síntomas asociados con la enfermedad y/o una reducción en la gravedad de tales síntomas que se desarrollarán o de los que se espera que se desarrollen en dicha enfermedad. Los términos incluyen además la mejora de los síntomas existentes, la prevención de síntomas adicionales, y la mejora o prevención de las causas subyacentes de tales síntomas. Por lo tanto, los términos indican que se ha conferido un resultado beneficioso a un sujeto vertebrado con una enfermedad.
El anticuerpo de la presente invención con fines terapéuticos se administra en una cantidad terapéuticamente eficiente. Tal como se utiliza en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficiente" o "cantidad eficiente" se refiere a una cantidad de un anticuerpo anti-APRIL o fragmento del mismo, que cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto es eficiente para prevenir o mejorar la enfermedad o padecimiento a tratar. Una dosis terapéuticamente eficiente se refiere adicionalmente a esa cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado la mejora de los síntomas, por ejemplo, el tratamiento, cicatrización, prevención o mejora del padecimiento relevante, o un aumento en la velocidad de tratamiento, cicatrización, prevención o mejora de tales padecimientos. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficiente se refiere únicamente a ese ingrediente. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficiente se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan lugar al efecto terapéutico, ya sea administrados en combinación, en serie o simultáneamente. Una cantidad eficiente de agente terapéutico disminuirá los síntomas típicamente en al menos el 10%; por lo regular en al menos el 20%; preferiblemente en al menos aproximadamente el 30%; más preferiblemente en al menos el 40%, y lo más preferiblemente en al menos 50%.
Los métodos para la coadministración o tratamiento con un segundo agente terapéutico son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Hardman, et al. (eds.), 2001, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw- Hill, Nueva York, NY; Poole y Peterson (eds.), 2001, Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner y Longo (eds.), 2001, Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA.
La composición farmacéutica de la invención puede contener también otros agentes, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes citotóxicos, quimioterapéuticos, citostáticos, agentes antiangiogénicos o antimetabolitos, un agente dirigido contra tumores, un agente estimulador de inmunidad o modulador de inmunidad o un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, citostático, o de otro modo tóxico. La composición farmacéutica también se puede emplear con otras modalidades terapéuticas tales como cirugía, quimioterapia y radiación.
A continuación, la invención será ilustrada y apoyada adicionalmente con referencia a los siguientes experimentos no limitantes.
EXPERIMENTOS
EXPERIMENTO 1
Diseño de anticuerpo anti-APRIL humanizado
Injerto de CDR
Se identificó previamente un anticuerpo único, hAPRIL.01A que se une a APRIL humano (WO2010/100056). El anticuerpo hAPRIL.01A de ratón se humanizó por medio de la tecnología de injerto de CDR (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.225.539 y Williams, D.G. et al., 2010, Antibody Engineering, volumen 1, capítulo 21).
Se diseñó una estrategia en la que primero se identificaron las secuencias de la línea germinal humana usando IgBLAST (Ye J. et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41:W34-40). Para la Vh de hAPRIL.01A, se identificó la secuencia de la línea germinal humana IGHV1-3*01 (70,4% de identidad), y para la Vl de hAPRIL.01A, se identificó la secuencia de la línea germinal humana IGKV1-16*01 (65,3% de identidad).
A continuación, se construyó una base de datos que contenía todas las secuencias maduradas humanas disponibles en la base de datos IMGT (publicación 201222-4: 161905 entradas, indexadas el 04-Jun-2012) (Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acid Res. 27:209-212) identificando 90,401 secuencias individuales. Estas secuencias fueron consultadas utilizando TBLASTN (2.2.26+) para identificar las secuencias de plantilla que demostraban la más alta identidad con las secuencias VH y VL de hAPRIL.01A (SEQ IDs. 3 y 4, respectivamente). Se seleccionaron tres secuencias VH y siete Vl que demostraban una puntuación de similitud del 80% o más y que mostraban longitudes de CDR similares, preferiblemente idénticas a aquellas en las CDR1, CDR2, CDR3 de v H (SEQ ID. 5-7) y CDR1, CDR2 y CDR3 de VL de hAPRIL.01A (SEQ ID. 8-10, respectivamente.
Para la cadena pesada, las estructuras codificadas por GenBank (Benson, D.A. et al., 2013, Nucleic Acids Res.
41(D1):D36-42) se seleccionaron nos. de acceso AF022000, AB363149 y AB063827 para el injerto directo de las CDR de VH de hAPRIL.01A, dando como resultado las siguientes construcciones de ADNc: s Eq ID. 11, 13, and 15, respectivamente. Para la cadena ligera, se seleccionaron los armazones codificados por los nos. de acceso de GenBank AX375917, DD272023, AB363267, AJ241396, DI152527 y DQ840975 para el injerto directo de las CDR de VL de hAPRIL.01A, dando como resultado las siguientes construcciones de ADNc: SEQ iD. 19, 21, 23, 25, 27 y 29.
Se diseñó una secuencia de cadena pesada adicional con base en la secuencia de consenso a partir de la alineación de las 25 secuencias con mejor coincidencia (valores de E 5e-46 a 9e-43) del resultado de TBLASTN, dando como resultado la siguiente construcción de ADNc: SEQ ID 17.
Para determinar los efectos estructurales de la humanización de residuos estructurales, se realizó un modelo de homología del anticuerpo hAPRIL.01A utilizando WHATIF (Krieger E. et al., 2003, Methods Biochem Anal. 44:509-23). Las plantillas para la cadena VH y VL, 2GKI (Kim Y.R. et al., 2006, J.Biol.Chem. 281: 15287-15295) y 2AEQ (Venkatramani L. et al. 2006, J.Mol.Biol. 356: 651-663), respectivamente, fueron identificadas por una búsqueda BLASTP (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) usando el Banco de Datos de Proteínas (Protein Databank) (www.rcsb.org, puiblicación del junio de 2012; Berman H.M. et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:235-242). Las cadenas VH y VL se combinaron como fragmento Fab utilizando una alineación MUSTANG (Konagurthu A. S. et al., 2006, Proteins 64: 559-574), la cual fue guiada por la plantilla 2AEQ. El modelo de homología de hAPRIL.01A construido se utilizó para seleccionar los residuos que se ven afectados por la humanización y que podrían afectar la funcionalidad de la construcción humanizada, y se evaluó si reemplazar o no los residuos seleccionados: para la sexta plantilla de VL (VL15) se decidió reemplazar los residuos de VL Y49 e Y87 por más pequeños S49 y F87.
Identificación del péptido señal
Utilizando NCBI IgBlast (BLASTN) (Ye J. et. al., 2013, Nucleic Acids Res. 41(Web Server issue):W34-40) el repertorio de la línea germinal humana que coincide con la VH y VL de hAPRIL.01A de ratón se identificó y se utilizó para seleccionar el líder de secreción para la VH y VL: VH, con base en la línea germinal IGHV1-3*01 (no. de acceso de NCBI X62107) y VL, con base en la línea germinal IGKV16*01 (no. de acceso de NCBI X62109). La siguiente secuencia de líder de secreción de VH "MDWTWRILFLVAAATGAh S" (SEQ ID NO: 58) codificada por Se Q ID NO: 57 y la secuencia de líder de secreción de VL "MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC" (SEQ ID NO: 60) codificada por SEQ ID NO: 59 se usaron para expresar todos los constructos de VH y VL humanizados.
Se produjo una versión IgG4 de anticuerpos humanizados, con la mutación estabilizadora de Adair (Angal S. et al., 1993, Mol Immunol. 30: 105-108), donde Serina 241 se convierte (numeración de Kabat) en Prolina.
EXPERIMENTO 2
Síntesis, subclonación, expresión, unión
Síntesis
Los ADNc que codifican los constructos de VH y VL humanizados, SEQ ID 11, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27, 29 se optimizaron con codones utilizando el software OptGene (versión 2.0.6.0) y sintetizados químicamente por Baseclear. A continuación, las secuencias se clonaron al vector pUC57 (BaseClear), usando un sitio de escisión de endonucleasa de restricción 5'-HindIII y 3'-ApaI (VH) o 3'-BsiWI (v L).
Subclonación
Los constructos de VH humanizados se clonaron a un vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen) que contenía dominios constantes de IgG4 humanos (CH1 - CH3, no. de acceso de GenBank K01316) que había sido clonado a sitios de escisión de la endonucleasa de restricción EcoRI y HindIII, utilizando los sitios de escisión de la endonucleasa de restricción mencionados. Los constructos de VL humanizados se clonaron a un vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) que contenía un dominio CL (kappa) humano (no. de acceso de GenBank J00241) que habían sido clonado a sitios de escisión de la endonucleasa de restricción HindIII y EcoRI, utilizando los sitios de escisión de la endonucleasa de restricción mencionados. Los constructos fueron transformados en células competentes de DH5a de eficiencia en subclonación (Subcloning Efficient DH5a Competent Cells) (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico fue aislado usando el Qiagen Plasmid Midi Kit (QIAGEN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La integridad de los constructos fue confirmada por medio de secuenciación de ADN (Macrogen).
Expresión y unión
Los plásmidos que codifican los constructos VH y VL se mezclaron en una proporción 1:3 (4 pg en total) y se expresaron transitoriamente a través de transfección en células de riñón embrionarias humanas HEK293T (HEK293T/17, ATCC-CRL-11268), usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes de células se recogieron después de 5 días y se ensayaron para detectar la expresión del anticuerpo y unión a APRIL usando un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). En estos ensayos ELISA, todas las etapas de incubación fueron seguidas por una etapa de lavado con PBST (PBS con Tween 20 al 0,01%). Placas de 96 pocillos Maxisorb (Nunc) se recubrieron con 0,5 pg/ml de anti-FLAG (Sigma) o anti-IgG4 (Jackson Laboratories) y se incubaron durante la noche a 4°C. Posteriormente, las placas de 96 pocillos recubiertas con anti-FLAG se incubaron con APRIL humano marcado con FLAG durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, los sobrenadantes y las diluciones de los mismos se incubaron durante 1 hora, a lo que siguió una incubación de 1 hora con el conjugado de HRP anti-IgG humano de ratón (mouse anti-human IgG h RP-conjugate) (Southern Biotechnology).
La inmunoreactividad se visualizó con 100 pl de cromógeno estabilizado TMB (TMB Stabilized Chromagen)(lnvitrogen). Las reacciones fueron inactivadas con 100 pl de 0,5 M de H2SO4 y las absorbancias se midieron a 450 y 620 nm.
EXPERIMENTO 3
Purificación y estabilidad
Purificación
Un subconjunto de anticuerpos humanizados descritos anteriormente fue seleccionado para análisis adicionales. Una vez más, los plásmidos que codifican los constructos de VH y VL se mezclaron en una proporción 1:3 (32 pg) y se expresaron transitoriamente a través de transfección en células de riñón embrionarias humanas (8*106) HEK293T (HEK293T), usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recogieron los sobrenadantes (10 ml) y se purificaron los anticuerpos usando la resina MabSelect Sure Protein A de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). El tampón se cambió por PBS usando columnas de desalinización Zeba (Thermo Scientific). La concentración de anticuerpos purificados se determinó sobre la base de OD280 (Nanodrop ND-1000). La unión de los anticuerpos purificados a APRIL se estableció utilizando el ensayo APRIL ELISA descrito anteriormente. La capacidad de bloqueo de los anticuerpos humanizados con receptores BCMA y TACI fue ensayada en un ELISA de competencia. En estos ensayos ELISA, todas las etapas de incubación fueron seguidas por una etapa de lavado con PBST (PBS con Tween 20 al 0,01%). Placas Maxisorb de 96 pocillos (Nunc) se recubrieron con 0,5 pg/ml de Fc-BCMA (R&D Systems) o Fc-TACI (R&D Systems) y se incubaron durante la noche a 4°C. A continuación, los anticuerpos humanizados y las diluciones de los mismos se incubaron, se premezclaron con APRIL marcado con FLAG, durante 1 hora, a lo que siguió una incubación de 1 hora con el conjugado de HRP anti-FLAG (anti-FLAG HRP-conjugate)(S\gma). La inmunoreactividad se visualizó con 100 pl de cromógeno estabilizado TMB (TMB Stabilized Chromagen)(lnvitrogen). Las reacciones fueron inactivadas con 100 pl de 0,5 M de H2SO4 y las absorbancias se midieron a 450 y 620 nm. La EC50 calculada y la IC50 que representan la concentración a la que se observa el 50% de la señal de unión total o del bloqueo se representan en la Tabla 5. Tabla 5: Valores de EC50, unión a APRIL. Valores de IC50, bloqueo de unión de APRIL a BCMA-Fc. C4-hAPRIL.01A se utilizó como referencia experimental en cada ELISA. n.c. indica la inhibición, pero no se pudo calcular ninguna IC50 debido a un ajuste inadecuado.
Figure imgf000023_0003
Para el bloqueo de unión de APRIL a TACI-Fc se observaron efectos de bloqueo similares.
Sorprendentemente, las combinaciones de VH11-VH14 con VL10-VL14 no mostraron valores de EC50 nano- ni micromolares y sólo la combinación de las secuencias estructurales de VH seleccionadas con las secuencias estructurales de VL15 dio como resultado anticuerpos que tenían propiedades de unión a APRIL funcionales.
Estabilidad
Para determinar el efecto de la humanización sobre la estabilidad de los anticuerpos, los anticuerpos humanizados se expusieron a un intervalo de temperaturas durante 10 minutos. Los anticuerpos purificados se diluyeron a 3,16 pg/ml y diluciones de los mismos en PBS. A continuación, estas disoluciones se expusieron a 65°C o 70°C y la unión residual después del tratamiento térmico de los anticuerpos se midió usando el ensayo APRIL ELISA marcado con FLAG como se describió anteriormente (véase Tabla 6).
Tabla 6: La unión residual de anticuerpos (humanizados) a FLAG-APRIL según lo determinado por ELISA. La unión se mide a tres concentraciones: 3,16, 1 y 0,316 pg/ml. %Unión a 65 o 70°C se expresa como %unión observada para cada uno de los anticuerpos a temperatura ambiente (=100%).
Figure imgf000023_0001
70°C
Figure imgf000023_0002
EXPERIMENTO 4
Mejora de unión, bloqueo y estabilidad por retromutaciones y residuos Vernier
Mejora de unión y bloqueo por retromutaciones
Se realizaron análisis a nivel de secuencia y estructural para entender la base molecular de las diferencias en la unión y bloqueo de las diferentes combinaciones VH/VL. Se preparó un modelo de homología del anticuerpo humanizado, como se describió anteriormente. La plantilla seleccionada tanto para VH como VL fue 3HC4 (Jordan J.L. et al., 2009, Proteins 77: 832-841). Sobre la base de un análisis cuidadoso del modelo creado, los inventores de la presente invención postularon que el residuo S72 en las cadenas de VH seleccionadas es importante para la orientación del bucle de CDR2. Con el fin de investigar este postulado, la mutación R72S fue introducida en Vh 14, que dio lugar a VH 14_1, SEQ ID 32 codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 31. El anticuerpo 14_1.15 fue ensayado para determinar la unión y bloqueo como se describió anteriormente. Como se representa en la Tabla 7, la unión y el bloqueo del anticuerpo 14_1.15 están mejorados en comparación con la unión del anticuerpo 14.15 como se muestra en la Tabla 5.
Tabla 7 : La unión a APRIL y el bloqueo de la unión de APRIL a BCMA-Fc del anticuerpo 14_1.15. hAPRIL.01A y C4-hAPRIL.01A fueron usados como referencia experimental en cada ELISA.
Figure imgf000024_0001
Para el bloqueo de la fijación de APRIL a TACI-Fc se obtuvieron valores de IC50 similares.
Residuos Vernier
Se realizaron análisis a nivel de secuencia y estructural para mejorar aún más la unión y el bloqueo del anticuerpo 14_1.15. Se preparó un modelo de homología de este análogo de hAPRIL.01A, como se describió anteriormente. La plantilla seleccionada para la cadena VH fue 2GKI y para la cadena VL 4GMT (Lee P.S. et al., 2012, PNAS 109: 17040­ 17045), combinado como fragmento Fab guiado por la plantilla 2AEQ.
Los residuos cercanos a las CDR se estudiaron a detalle, ya que podrían afectar la conformación del bucle. En el análisis, los inventores identificaron una serie de residuos Vernier potencialmente relevantes (Foote J. et al., 1992, J. Mol. Biol. 224:487-499). Con el fin de evaluar su relevancia, se sustituyeron por el aminoácido de ratón.
La introducción de la mutación M70I dio como resultado VH14_1C (SEQ ID 33, 34) la mutación T74K está presente en VH14_1D (SEQ ID 35, 36), y la mutación Q1E dio como resultado VH14_1E (SEQ ID 37, 38). La mutación combinada de R67K y V68A dio como resultado VH 14_1G, SEQ ID 39, 40. Los anticuerpos se ensayaron para determinar la unión, bloqueo y estabilidad como se describió anteriormente. Como se representa en la Tabla 8, sorprendentemente la unión y el bloqueo están mejorados, con un factor de 2 a 3. En particular, las mutaciones introducidas en el anticuerpo VH14_1G.VL15 sorprendentemente presentan una mejora considerable.
Tabla 8: La unión y bloqueo del anticuerpo 14_1.15 y mutantes de la zona vernier. hAPRIL.01A se utilizó como referencia experimental en cada ELISA.
Figure imgf000024_0002
Además, la estabilidad de los anticuerpos humanizados sustituidos fue mejorada según se determinó usando estudios de termoestabilidad, como se describe en el Ejemplo 3 (véase Tabla 9).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado de unión a APRIL humano que comprende un par de región variable de cadena pesada, región variable de cadena ligera que es VH14_1G.VL15, en donde la secuencia de aminoácidos V h es SEQ ID NO: 40 y en donde la secuencia de aminoácidos de Vl es SEQ ID NO: 30.
2. Polinucleótidos aislados que codifican un dominio Vh y un dominio Vl de un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1.
3. Una unidad de expresión que comprende una serie de vectores de expresión, que comprende una serie de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 2 bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas, en donde la serie de polinucleótidos codifica el dominio Vh y el dominio Vl de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y en donde la secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vh puede estar sobre el mismo o diferente vector de expresión que la secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio V l.
4. Una célula hospedadora que comprende una serie de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 2 y/o una unidad de expresión de conformidad con la reivindicación 3.
5. Una célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 4, que comprende una unidad de expresión que comprende un vector de expresión que comprende tanto una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio V h como una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Vl.
6. Un método para la producción de un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, el método comprende:
a) cultivar una célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 4 o 5 en medio de cultivo en condiciones en las cuales se expresan varios polinucleótidos, produciendo de este modo polipéptidos que comprenden las regiones variables de cadena ligera y pesada; y
b) recuperando los polipéptidos de la célula hospedadora o del medio de cultivo.
7. Una composición que comprende un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1 en combinación con un portador o diluyente.
8. Una composición de conformidad con la reivindicación 7, en donde el portador o diluyente es un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
9. Una composición de conformidad con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde la composición comprende una serie de compuestos terapéuticamente activos seleccionados de melfalano, vincristina, fludarabina, clorambucilo, bendamustina, etopósido, doxorrubicina, ciclofosfamida, cisplatino, agentes inmunomoduladores tales como corticosteroides, por ejemplo dexametasona, prednisolona, análogos de talidomida, por ejemplo talidomida, lenalidomida, pomalidomida, inhibidores de quinasa, por ejemplo, ibrutinib, idelalisib, terapias de anticuerpos dirigidas a CD20, tales como rituximab, ofatumumab, obinotuzumab, terapias de anticuerpos dirigidas a CD52, tales como alemtuzumab, terapias de anticuerpos dirigidas a CD38, tales como daratumumab, terapias de anticuerpos dirigidas a IL-6 o receptor de IL-6 tales como sarilumab, tocilizumab, terapias de anticuerpos dirigidas a CS-1, tales como elotuzumab, terapias de anticuerpos dirigidas a BCMA, tales como GSK2857916, terapias de anticuerpos dirigidas a BAFF o BLyss, tales como tabalumab, bifosfonatos, tales como pamidronato o ácido zolendrónico, o bortezomid.
10. Un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1 para uso en terapia.
11. Un anticuerpo humanizado para su uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicha terapia está dirigida a uno o más seleccionados de:
a. tratamiento del cáncer;
b. tratamiento de una enfermedad autoinmune;
c. tratamiento de una enfermedad inflamatoria; o
d. tratamiento de una nefropatía por IgA y otras formas de glomerulonefritis, enfermedad celíaca, enfermedades penfigoide, púrpura de Henoch-Schonlein y otras enfermedades autoinmunes que están asociadas con la deposición de Ig.
12. Uso de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 en un método de diagnóstico, preferiblemente un método de diagnóstico ex vivo o in vitro, tal como un método de diagnóstico seleccionado de citometría de flujo, Western blot, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) O inmunohistoquímica.
13. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1.
14. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1 unido operativamente a secuencias reguladoras configuradas para proporcionar la expresión del anticuerpo humanizado.
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