WO2015170683A1 - メトキシフラボンを含むＮＯＸ阻害剤及びＮＦκＢ阻害剤 - Google Patents

メトキシフラボンを含むＮＯＸ阻害剤及びＮＦκＢ阻害剤 Download PDF

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hydroxy
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大輔 竹本
佳子 小野
浅見　純生
里実 下吉
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Definitions

  • the present invention relates to a NOX inhibitor and NF ⁇ B inhibitor containing a specific methoxyflavone, and use thereof.
  • NADPH oxidase is an enzyme that is present in neutrophils and the like and is known to produce O 2 ⁇ . Therefore, inhibition of NOX is considered useful for the prevention or treatment of various diseases related to in vivo oxidation.
  • NF ⁇ B is a transcription of genes encoding molecules such as pro-inflammatory cytokines (eg TNF ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6), chemokines (eg IL-8, MIP1 ⁇ ), inducible effector enzymes (iNOS and COX-2). Is a transcription factor that regulates and plays an important role in the inflammatory response. It has been shown that activation of the NF ⁇ B pathway can lead to various inflammatory diseases.
  • pro-inflammatory cytokines eg TNF ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6
  • chemokines eg IL-8, MIP1 ⁇
  • iNOS and COX-2 inducible effector enzymes
  • Non-Patent Documents 1 to 3 Some of the methoxyflavones contained in plant extracts have been reported to have antioxidant activity. Many of such methoxyflavones have a hydroxy group (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Black ginger (Kaempferia parviflora) is a kind of plant belonging to the family Ginger, and is also called black turmeric in Japan. Black ginger is a kind of traditional herb that is also called Kra chadam in Thailand. It is known that black ginger contains not only a methoxyflavone having a hydroxy group but also a methoxyflavone having no hydroxy group (Non-patent Document 4).
  • An object of the present invention is to provide a NOX inhibitor and an NF ⁇ B inhibitor having an excellent action, and a preventive or therapeutic agent for diseases caused by NOX and NF ⁇ B.
  • R 1 , R 4 , and R 5 are each independently hydrogen or a methoxy group, and R 2 and R 3 are methoxy groups
  • the at least one methoxyflavone is 5,7,3 ′, 4′-tetramethoxyflavone, 3,5,7,3 ′, 4′-pentamethoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone, and
  • the NOX inhibitor according to [1] which is selected from group A consisting of 5,7,4′-trimethoxyflavone.
  • a preventive or therapeutic agent for diseases caused by NOX comprising at least one methoxyflavone described in [1] or [2].
  • the prophylactic or therapeutic agent according to [4] selected from the group consisting of sarcopenia (muscle weakness), mitochondrial dysfunction, dementia, and Alzheimer's disease.
  • R 1 , R 4 , and R 5 are each independently hydrogen or a methoxy group, and R 2 and R 3 are methoxy groups
  • the at least one methoxyflavone comprises 5,7,3 ′, 4′-tetramethoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone, and 5,7,4′-trimethoxyflavone.
  • the NF ⁇ B inhibitor according to [7] which is selected.
  • a preventive or therapeutic agent for a disease caused by NF ⁇ B comprising at least one methoxyflavone described in [7] or [8].
  • the disease is rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, osteoarthritis, osteolysis, tendonitis, sciatica, herniated disc, stenosis, myelopathy, low back pain, facet joint pain, carpal tunnel syndrome , Tarsal tunnel syndrome, post-lumbar pain syndrome, AIDS, arteriosclerosis, asthma, arthritis, diabetes, inflammatory bowel disease, hepatitis, stroke, dementia, muscle wasting, virus infection, skin aging including photoaging,
  • the prophylactic or therapeutic agent according to [10] selected from the group consisting of cancer and aging.
  • the disease is allergic disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, cataract, epilepsy, spinal cord injury, arteriosclerosis, retinopathy of prematurity, nephropathy, peptic ulcer, pancreatitis, ulcerative colitis, myocardial infarction, adult breathing Collagen diseases such as tightness syndrome, emphysema, rheumatoid arthritis, vasculitis, edema, diabetic complications, UV disorders, altitude sickness, porphyria, burns, frostbite, contact dermatitis, shock, multiple organ failure, DIC, cancer
  • the prophylactic or therapeutic agent according to [14] selected from the group consisting of: aging, fatigue, sarcopenia (muscular weakness), mitochondrial dysfunction, dementia, and Alzheimer's disease.
  • the present invention can provide an NOX inhibitor and an NF ⁇ B inhibitor having an excellent action. Moreover, the preventive or therapeutic agent of the disease resulting from NOX and NF (kappa) B can also be provided using it.
  • the methoxy flavone used in the present invention unlike the methoxy flavone that has been found to have an antioxidant effect or the like, exhibits an excellent action such as NOX inhibition despite having no hydroxy group.
  • R 1 , R 4 and R 5 are each independently hydrogen or a methoxy group
  • R 2 and R 3 are methoxy groups, preferably at least one Is at least 2, more preferably at least 3, more preferably at least 4, more preferably at least 5, more preferably at least 6, more preferably at least 7, more preferably at least 8 methoxyflavones. Use.
  • the at least one methoxyflavone is 5,7,3 ′, 4′-tetramethoxyflavone, 3,5,7 , 3 ′, 4′-pentamethoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone, and 5,7,4′-trimethoxyflavone.
  • NOX inhibitors or agents for treating or preventing diseases caused by NOX include not only group A methoxyflavones but also other compounds such as 3,5,7-trimethoxyflavone, 3,5 derived from black ginger , 7,4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,3 ′, 4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-7-methoxyflavone, 5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavone, 5, It may contain at least one methoxyflavone selected from the group B consisting of -hydroxy-3,7-dimethoxyflavone and 5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone.
  • the ratio (A / (A + B)) of the total content of group A methoxyflavones to the total content of group A and group B methoxyflavones is preferably 0.65 on a molar basis (or weight basis). More preferably 0.66 or more, more preferably 0.67 or more, more preferably 0.68 or more, more preferably 0.69 or more, more preferably 0.70 or more, more preferably 0.71 or more. is there. There is no upper limit for the ratio, and the ratio may be 1.00 or less.
  • the at least one methoxyflavone is 5,7,3 ′, 4′-tetramethoxyflavone, 5,7-dimethoxy. Selected from the group A ′ consisting of flavones and 5,7,4′-trimethoxyflavones.
  • NF ⁇ B inhibitors or therapeutic or preventive agents resulting from NF ⁇ B are not only methoxyflavones of group A ′ but also other compounds such as 3,5,7,3 ′, 4′-pentamethoxy derived from black ginger Flavone, 3,5,7-trimethoxyflavone, 3,5,7,4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,3 ′, 4′-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-7-methoxy At least selected from the group B ′ consisting of flavone, 5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone, and 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone
  • One methoxyflavone may be included.
  • the ratio of the total content of methoxyflavone in group A ′ to the total content of methoxyflavone in group A ′ and group B ′ is based on moles (or on a weight basis) Preferably more than 0.48, more preferably 0.49 or more, more preferably 0.50 or more, more preferably 0.51 or more, more preferably 0.52 or more, more preferably 0.53 or more, more Preferably it is 0.54 or more, More preferably, it is 0.55 or more, More preferably, it is 0.60 or more. There is no upper limit for the ratio, and the ratio may be 1.00 or less.
  • methoxyflavone is 3 ', 4'-dimethoxyflavone.
  • methoxyflavones can be obtained from, for example, black ginger (Kaempferia parviflora) according to the method described in Non-Patent Document 4. Alternatively, it can be obtained, for example, according to the method detailed in Example 1 herein. Black ginger is a kind of plant belonging to the family Ginger, and since it grows naturally in Southeast Asia, it can be easily obtained. It is known that 3 ', 4'-dimethoxyflavone can be extracted from, for example, Lawsonia alba (henna) using a solvent. See, for example, Phytochemistry Letters, 2011, 4, 454-458.
  • the type and amount of methoxyflavone contained in the inhibitor and the therapeutic or preventive agent can be adjusted based on a known method as necessary. For example, a specific methoxyflavone can be removed using a known purification method, or a specific purified methoxyflavone can be added to the inhibitor or therapeutic or prophylactic agent.
  • an oil and fat extract containing methoxyflavone of the formula (I) can be obtained from black ginger and used.
  • the said fat and oil extract is an extract obtained through fat and oil extraction from black ginger.
  • the extract contains methoxyflavone and has a reduced dark purple intensity characteristic of black ginger extract.
  • the said extract may further contain fats and oils, especially the fats and oils used for extraction.
  • the oil or fat extract is considered not to be obtained from black ginger, or from black ginger as a raw material but obtained through oil or fat extraction in terms of the types and ratios of the components contained. It is done.
  • an extract obtained from a plant other than black ginger can also contain methoxyflavone, but its type and ratio are considered to be different from the oil or fat extract.
  • black ginger is a raw material
  • the kind and ratio of methoxyflavone in the extract obtained by methods other than fat extraction, for example, hydrous alcohol extraction differ from the said fat extract.
  • oil extraction may be performed directly on black ginger or indirectly, for example, by using a solvent other than oil from black ginger, such as water, a hydrophilic solvent, or a mixture thereof. You may carry out with respect to the extracted liquid.
  • the oil and fat extract contains at least one methoxyflavone of formula (I).
  • the methoxyflavone is preferably selected from group A.
  • the extract may further contain a methoxyflavone selected from group B.
  • the fat extract is preferably at least one selected from 11 methoxyflavones of groups A and B, more preferably at least 2, more preferably at least 3, more preferably at least 4, more preferably Includes at least 5, more preferably at least 6, more preferably at least 7, more preferably at least 8, more preferably at least 9, more preferably at least 10, more preferably 11 types.
  • the fats and oils that can be used in the production of the fat and oil extract and can be contained in the extract are not particularly limited as long as methoxyflavone can be dissolved.
  • the fat is at least one selected from medium-chain fatty acid triglycerides, diacylglycerols, sesame salad oil, olive oil, soybean oil, rapeseed oil, corn oil, rice germ oil, sunflower seed oil, perilla oil, and sesame oil. It is.
  • the term “medium chain fatty acid” used for medium chain fatty acid triglycerides means a fatty acid having 8 to 12 carbon atoms.
  • the fatty acid moieties constituting the triglyceride at least one, preferably two, more preferably three are medium chain fatty acids.
  • a solution having a total content of eleven methoxyflavones of Groups A and B of 5.0 mg / ml is prepared from the extract, and the absorbance of the solution at a wavelength of 660 nm is measured.
  • the absorbance measured in this manner is 0.10 or less in the oil or fat extract.
  • the absorbance is preferably 0.07 or less, more preferably 0.05 or less.
  • the absorbance in this specification means the absorbance when the cell length (optical path length) is 10 mm. When the cell length of the apparatus used for the measurement is not 10 mm, the obtained absorbance value is converted into a value when the cell length is 10 mm.
  • an appropriate blank is used for absorbance measurement.
  • the production method includes extracting one or more methoxyflavones by bringing oil and fat into contact with a plant body of black ginger.
  • a typical example of this method is described below.
  • a black ginger plant prepared by bringing the plant body or its site
  • extraction is performed by bringing the plant body or its part into contact with fats and oils.
  • the extraction conditions are not particularly limited as long as methoxyflavone can be extracted. Typical extraction temperatures are 50-180 ° C, 70-170 ° C, 70-150 ° C, 100-150 ° C, or 120-150 ° C.
  • the extraction time is typically 1 minute to 1 day, 10 minutes to 10 hours, or 15 minutes to 5 hours.
  • the volume of oil used is typically 0.1 to 30 times, or 0.5 to 15 times the weight of black ginger. Examples of the fats and oils used are as described above.
  • the oil and fat extract may be produced by bringing black ginger plant into contact with water, a hydrophilic solvent, or a mixture thereof to extract one or more methoxyflavones, and an intermediate extract obtained by the extraction. And extracting the methoxyflavone by contacting the oil with fat.
  • a typical example of this method is described below.
  • a black ginger plant is prepared in the same manner as described above.
  • extraction is performed by bringing the plant or its part into contact with water, a hydrophilic solvent, or a mixture thereof.
  • the extraction conditions are not particularly limited as long as methoxyflavone can be extracted. Typical extraction temperatures are room temperature to reflux temperature, 40 ° C. to reflux temperature, 50 ° C. to reflux temperature, reflux temperature, with 50 ° C. to reflux temperature or reflux temperature being preferred.
  • the extraction time is typically 1 minute to 1 day, 10 minutes to 10 hours, or 15 minutes to 5 hours.
  • the volume of water, hydrophilic solvent or mixture thereof used is typically 0.1 to 30 times, or 0.5 to 15 times the weight of black ginger.
  • the hydrophilic solvent used is preferably C 1-3 alcohol and / or acetone, more preferably ethanol.
  • extraction is performed using 50 to 100 v / v% ethanol.
  • the intermediate extract obtained in this extraction step is subjected to the fat and oil extraction step.
  • extraction is performed by bringing the intermediate extract into contact with the fat and oil.
  • the extraction conditions are not particularly limited as long as methoxyflavone can be extracted.
  • Extraction temperature is not specifically limited, For example, 5 degreeC or more, 10 degreeC or more, 20 degreeC or more, 30 degreeC or more, 40 degreeC, or 50 degreeC or more is performed.
  • the upper limit of the extraction temperature is not particularly limited as long as it is not higher than the reflux temperature of water, a hydrophilic solvent, or a mixture thereof.
  • the extraction time is typically 1 minute to 1 day, 10 minutes to 10 hours, or 15 minutes to 5 hours.
  • the volume of fat used is typically 0.01 to 30 times, or 0.1 to 15 times the weight of black ginger. Examples of the fats and oils used are as described above.
  • water, a hydrophilic solvent, or a mixture thereof is evaporated from the intermediate extract before and / or while the oil or fat is contacted with the intermediate extract.
  • Evaporation may be performed under normal pressure or under reduced pressure.
  • the extraction time is not very important. If evaporation progresses and the amount of water, hydrophilic solvent or a mixture thereof decreases, it is considered that methoxyflavone migrates into the oil and fat, possibly with the hydrophilic solvent.
  • methoxyflavone migrates to fats and oils during oil and fat extraction, but the components that produce black purple color of black ginger are considered not to move to fats and oils.
  • an oil-containing extract can be obtained. This may be used without further purification, but may be purified if necessary.
  • the fat and oil-containing extract may be subjected to a further extraction step to remove the fat and oil. Specifically, water or a hydrophilic solvent or a mixture thereof is brought into contact with the oil / fat-containing extract to extract one or more methoxyflavones.
  • a low polarity solvent such as a C 1-8 hydrocarbon such as n-hexane may be added to the oil-containing extract.
  • Extraction temperature is not specifically limited, For example, 5 degreeC or more, 10 degreeC or more, 20 degreeC or more, 30 degreeC or more, 40 degreeC, or 50 degreeC or more is performed.
  • the upper limit of the extraction temperature is not particularly limited, but may be any temperature below the reflux temperature of water, a hydrophilic solvent or a mixture thereof.
  • the extraction time is typically 1 minute to 1 day, 10 minutes to 10 hours, or 15 minutes to 5 hours.
  • the volume of water, hydrophilic solvent or mixture thereof used is typically 0.01 to 30 times, or 0.1 to 15 times the weight of the oil or fat extract.
  • a two-phase mixture of an oil-and-fat phase derived from the oil-and-fat-containing extract and a phase derived from the water, a hydrophilic solvent, or a mixture thereof is obtained, and this mixture is liquid-liquid separated. Attached.
  • the water, hydrophilic solvent, or mixture thereof phase (which is an extract containing methoxyflavone and solvent) can be separated from the fat phase.
  • the two-phase mixture may be left still or subjected to centrifugation. A separated extract is then obtained.
  • the separated extract contains methoxyflavone and is in the form of a liquid containing a solvent.
  • This liquid may be used as it is, or a solvent (water, a hydrophilic solvent, or a mixture thereof) may be removed to obtain an extract in a powder form containing methoxyflavone.
  • the method for removing the solvent is not particularly limited, and examples thereof include distillation under normal pressure or reduced pressure, and lyophilization.
  • the extract from which the fats and oils have been removed in this way contains a methoxyflavone peculiar to black ginger at a relatively high concentration. This extract may be further purified as necessary.
  • the ratio of A / (A + B) and A ′ / (A ′ + B ′) described above is relatively high as compared with the extract obtained using a hydrophilic solvent such as ethanol.
  • the preferable range of the ratio in the oil and fat extract is as described above.
  • the present invention in one aspect, is a NOX inhibitor or a composition for inhibiting NOX, comprising at least one methoxyflavone of formula (I) (herein, “NOX inhibitor” “A composition for inhibiting NOX” is used interchangeably, and unless otherwise specified, when one is used, it means the other.
  • This invention in another aspect, is also a method for inhibiting NOX comprising administering to a subject at least one methoxyflavone of formula (I).
  • 3 ′, 4′-dimethoxyflavone can be used instead of or in addition to the methoxyflavone of formula (I).
  • the present invention in another aspect, is a preventive or therapeutic agent for a disease caused by NOX, or a composition for the prevention or treatment, which comprises at least one methoxyflavone of formula (I) (this book)
  • a preventive or therapeutic agent for a disease caused by NOX and “a composition for preventing or treating a disease caused by NOX” are used interchangeably, and unless otherwise specified, one of them is used. In the case, it shall mean the other).
  • the present invention is a method for preventing or treating the disease, comprising administering to the subject at least one of the methoxyflavones.
  • Such diseases include atopic dermatitis, allergic rhinitis (hay fever), allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis, bronchial asthma, childhood asthma, food allergies, drug allergies, urticaria etc., Parkinson's disease , Cerebral infarction, cataract, epilepsy, spinal cord injury, arteriosclerosis, retinopathy of prematurity, nephropathy, peptic ulcer, pancreatitis, ulcerative colitis, myocardial infarction, adult respiratory distress syndrome, emphysema, rheumatoid arthritis, etc.
  • Vasculitis edema, diabetic complications, UV damage, altitude sickness, porphyria, burn, frostbite, contact dermatitis, shock, multiple organ failure, DIC, cancer, aging, fatigue, sarcopenia (muscular weakness) Mitochondrial dysfunction, dementia, and Alzheimer's disease.
  • 3 ', 4'-dimethoxyflavone can be used instead of or in addition to the methoxyflavone of formula (I).
  • the present invention is an antioxidant (more specifically, an in vivo antioxidant, suppressor or reducer) comprising at least one methoxyflavone of formula (I), or in vivo oxidation.
  • an antioxidant more specifically, an in vivo antioxidant, suppressor or reducer
  • It is a composition for preventing, suppressing or reducing (in this specification, “antioxidant”, “in vivo oxidation preventing, suppressing or reducing agent”, “composition for preventing, suppressing or reducing in vivo oxidation”) “Thing” is used interchangeably, and unless stated otherwise, when describing one of these three, it means the other two).
  • the present invention is a method for preventing, suppressing or reducing in-vivo oxidation comprising administering to a subject at least one methoxyflavone of formula (I).
  • in-vivo oxidation means various oxidation reactions caused by active oxygen in vivo.
  • 3 ', 4'-dimethoxyflavone can be used instead of or in addition to the methoxyflavone of formula (I).
  • the total content of the methoxyflavone of the formula (I) in the NOX inhibitor of the present invention, the preventive or therapeutic agent for diseases caused by NOX, and the antioxidant is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, but preferably 0.01 to 50 w / w%, more preferably 0.1 to 40 w / w%, more preferably 0.5 to 30 w / w%.
  • the total intake amount of methoxyflavone of formula (I) per day for adults to exert the above desired effects such as NOX inhibitory action, prevention or treatment of diseases caused by NOX, antioxidant, etc. is preferably 1 to 500 mg More preferably, it is 3 to 200 mg, and further preferably 5 to 100 mg.
  • the above amount can also be applied to 3 ', 4'-dimethoxyflavone.
  • the present invention is an NF ⁇ B inhibitor or a composition for inhibiting NF ⁇ B, which contains at least one methoxyflavone of formula (I) (herein referred to as “NF ⁇ B inhibitor”).
  • NF ⁇ B inhibitor a composition for inhibiting NF ⁇ B, which contains at least one methoxyflavone of formula (I)
  • composition for inhibiting NF ⁇ B is used interchangeably, and unless otherwise specified, when one is used, the other is also meant).
  • This invention in another aspect, is a method for inhibiting NF ⁇ B comprising administering to a subject at least one methoxyflavone of formula (I).
  • 3 ′, 4′-dimethoxyflavone can be used instead of or in addition to the methoxyflavone of formula (I).
  • the present invention in another aspect, is a preventive or therapeutic agent for a disease caused by NF ⁇ B, or a composition for the prevention or treatment, comprising at least one methoxyflavone of formula (I) (this book)
  • a prophylactic or therapeutic agent for a disease caused by NF ⁇ B and “a composition for a prophylactic or therapeutic agent for a disease caused by NF ⁇ B” are used interchangeably, and unless otherwise specified, If used, it shall mean the other).
  • the present invention relates to a method for preventing or treating the disease, which comprises administering to a subject at least one of the methoxyflavones.
  • diseases include rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, osteoarthritis, osteolysis, tendonitis, sciatica, herniated disc, stenosis, myelopathy, low back pain, facet joint pain, carpal tunnel syndrome , Tarsal tunnel syndrome, post-lumbar pain syndrome, AIDS, arteriosclerosis, asthma, arthritis, diabetes, inflammatory bowel disease, hepatitis, stroke, dementia, muscle wasting, virus infection, skin aging including photoaging, And aging.
  • 3 ', 4'-dimethoxyflavone can be used instead of or in addition to the methoxyflavone of formula (I).
  • the total content of the methoxyflavone of formula (I) in the NF ⁇ B inhibitor and the preventive or therapeutic agent for diseases caused by NF ⁇ B of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, but is preferably 0.01 to 50 w / w%, more preferably 0.1 to 40 w / w%, more preferably 0.5 to 30 w / w%.
  • the total intake of methoxyflavone of formula (I) per day for adults to exert the above desired effects such as NF ⁇ B inhibitory action, prevention or treatment of diseases caused by NF ⁇ B is preferably 1 to 500 mg, More preferably, it is 3 to 200 mg, and further preferably 5 to 100 mg.
  • the above amount can also be applied to 3 ', 4'-dimethoxyflavone.
  • the NOX or NF ⁇ B inhibitor of the present invention, the preventive or therapeutic agent for diseases caused by NOX or NF ⁇ B, and the antioxidant, in addition to the methoxyflavone of the formula (I), are combined with any component as long as the effect is not impaired. May be.
  • vitamins such as vitamin E and vitamin C, minerals, hormones, nutritional ingredients, physiologically active ingredients such as fragrances, emulsifiers, tonicity agents (isotonic agents), buffers, Solubilizing agents, preservatives, stabilizers and the like can be appropriately blended.
  • the NOX or NF ⁇ B inhibitor, the preventive or therapeutic agent for diseases caused by NOX or NF ⁇ B, and the antioxidant of the present invention are food and drink (functional food, health supplement, nutritional functional food, special purpose food, food for specified health use) , Nutritional supplements, dietary foods, health foods, supplements, etc.), pharmaceuticals, or cosmetics, or as raw materials thereof.
  • the food and drink and medicine may be pet food or animal feed processed as pet food, and animal medicine.
  • the form of the food or drink is not particularly limited.
  • soft drinks for example, sports drinks, carbonated drinks, fruit juice drinks
  • confectionery for example, cakes, biscuits, bread, strawberries
  • noodles for example, udon, Soba, ramen, pasta
  • miso soy sauce
  • vinegar salad oil
  • sesame oil soy milk
  • milk milk
  • it may be in the form of tablets, granules, powders, capsules (including soft capsules) and the like.
  • the form of the said pharmaceutical is not specifically limited,
  • external preparations for example, lotion, emulsion, patch, ointment
  • oral preparations tablets, granules, powders, capsules (including soft capsules), solutions) , Suspensions), injections, and infusions.
  • the form of the cosmetic is not particularly limited, and examples thereof include lotion, gel, lotion, cream, pack, emulsion, foundation, lipstick, powder, face wash, and hair tonic.
  • Example 1 Isolation and purification of methoxyflavone
  • To 150 g of black ginger 1500 ml of 50% ethanol aqueous solution was added, followed by extraction with heating under reflux for 2 hours. The extract obtained after cooling was filtered, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to obtain 25.7 g of a black ginger extract. 9 g of the obtained extract was subjected to column chromatography using Diaion HP20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and four fractions (30% ethanol elution part, 50% ethanol elution part, 70% ethanol elution part) Fraction, 100% ethanol elution part).
  • the 50% ethanol eluate was subjected to high performance liquid chromatography, and 5,7,3 ′, 4′-tetramethoxyflavone (64 mg), 3,5,7,3 ′, 4′-pentamethoxyflavone ( 464 mg), 5,7-dimethoxyflavone (145 mg), 5,7,4′-trimethoxyflavone (188 mg), 3,5,7-trimethoxyflavone (35 mg), 3,5,7,4′-tetra Methoxyflavone (96 mg) was isolated.
  • Example 2 Manufacture of oil and fat extract
  • 30 g of olive oil was added to 3 g and 15 g of black ginger, respectively, extracted at 120 ° C. for 30 minutes, cooled, and then filtered to obtain two pale yellow black ginger oil extracts.
  • the total content of 11 kinds of methoxyflavones described in Example 1 in the two obtained oil and fat extracts was quantified, and the value was 6.2 mg / mL (from 3 g of black ginger). ), 22.4 mg / mL (from 15 g black ginger).
  • all of these extracts contained all 11 types of methoxyflavones described in Example 1.
  • Example 3 Method for measuring NOX inhibitory activity
  • HL-60 cells Although human myeloid leukemia cells HL-60 cells repeat proliferation in an undifferentiated state, they are differentiated into mature granulocytes by adding DMSO (dimethylsulfoxide), retinoic acid, etc.
  • NOX NADPH oxidase
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • NOX NADPH oxidase
  • undifferentiated HL-60 cells cultured in 10% FBS-containing RPMI1640 medium were added to 10% FBS-containing RPMI1640 medium containing 1% DMSO at 5 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the suspension was dispensed in 15 ml portions in a petri dish having an inner diameter of 10 cm and cultured in a CO 2 incubator (37 ° C.) for 3 days, and then 10 ml of 10% FBS containing 1% DMSO.
  • RPMI1640 medium contained in each dish and further culturing for 3 days differentiated HL-60 cells expressing NOX could be obtained.
  • NOX activity was measured using a cell lysate of differentiated HL-60 cells or living cells as they were.
  • HL-60 cells differentiated by DMSO treatment are collected by centrifugation, washed once with PBS (phosphate buffered saline), and then buffered for cell disruption (8 mM phosphate containing 131 mM NaCl and 340 mM sucrose). Buffer solution (pH 7.0) was used to suspend at 1 ⁇ 10 8 cells / ml. After cooling with ice, using an ultrasonic crusher (Bioruptor UCD-250HSA, manufactured by Cosmo Bio), the process of “crushing at maximum output 20 seconds / interval cooling 30 seconds” is repeated 3 times at 4 ° C. or lower. A cell lysate was obtained.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the supernatant obtained by removing debris by centrifuging the disrupted solution at 1000 g for 4 minutes was added to a 9-fold volume of a reaction buffer solution (65 mM phosphate buffer containing 1 mM EGTA, 10 ⁇ M FAD and 170 mM sucrose). Solution pH 7.0) was added to prepare a cell disruption supernatant (corresponding to 1 ⁇ 10 7 cells / ml) for NOX measurement.
  • a reaction buffer solution 65 mM phosphate buffer containing 1 mM EGTA, 10 ⁇ M FAD and 170 mM sucrose.
  • Solution pH 7.0 was added to prepare a cell disruption supernatant (corresponding to 1 ⁇ 10 7 cells / ml) for NOX measurement.
  • the NOX reaction was performed by pouring 50 ⁇ l of the cell disruption solution per well onto a 96-well microplate, adding 25 ⁇ l of 0.5 mM SDS solution as a NOX activator, and 25 ⁇ l of 0.4 mM NADPH solution as a substrate. This was carried out at 30 ° C for 30 to 90 minutes.
  • the NOX activity was determined by measuring the consumption rate of NADPH by fluorescence measurement (Ex: 355 nm / Em: 460 nm).
  • HL-60 cells differentiated by DMSO treatment were collected by centrifugation, and suspended in D-MEM medium containing no FBS and phenol red so as to have a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the NOX reaction was performed by pouring 25 ⁇ l of the cell suspension per well onto a 96-well microplate, and further using a 0.8 mg / ml WST-1 solution prepared using the D-MEM, a test sample prepared to a predetermined concentration.
  • the obtained inhibitory activity was shown as an IC 50 value ( ⁇ M, in the case of an extract, ⁇ g / ml).
  • Example 4 Comparison of NOX inhibitory activity of methoxyflavonoids
  • Example 3 the NOX inhibitory activity of several methoxyflavonoids was compared by measuring the NOX activity with a cell-free system using cell lysate. The results are shown in Table 1.
  • Example 5 NOX inhibitory activity of black ginger-derived compounds
  • the NOX inhibitory activity of methoxyflavonoids extracted and fractionated from black ginger was compared by measuring NOX activity using a cell-free system using cell disruption solution. All flavonoids obtained from black ginger have the feature of having a methoxy group. Among these, strong NOX inhibitory activity was observed for flavones having a methoxy group at the 5-position and 7-position of the A ring, but NOX inhibitory activity was not observed for flavonoids having a hydroxy group at the 5-position. The methoxy group at position 3 was not fatal, but there was a tendency to attenuate the activity. Therefore, the methoxyflavone represented by the formula (I) is considered to have excellent NOX inhibitory activity. Further, IC 50 of VAS2870 (NOX inhibitor) in this system was 6.3MyuM.
  • Example 6 In order to confirm the difference in the composition of the fat and oil extract depending on the lot of black ginger, 200 g of two black ginger were prepared, 1000 mL of ethanol was added to each, and heating and reflux extraction was performed for 1 hour. The resulting liquid was cooled and suction filtered to separate the residue and the extract. The residue was again added with 1000 mL of ethanol, extracted by heating under reflux for 1 hour, filtered, and combined with the previously obtained extract. Subsequently, 100 mL of medium chain fatty acid triglyceride was added to the extract, ethanol was distilled off by concentration under reduced pressure, and the precipitated insoluble matter was removed by suction filtration to obtain two black ginger oil extracts.
  • extract A The methoxyflavone content in these extracts was analyzed according to Example 2, and the total amount of methoxyflavone was 90.4 mg / mL (hereinafter, this extract is referred to as “extract A”), 54. 9 mg / mL (hereinafter, this extract is referred to as “extract B”). Further, the total amount of methoxyflavone in these two extracts was adjusted to 5 mg / ml with olive oil to obtain two solutions, and the absorbance at 660 nm of the solutions was measured to find 0.036 (extract A). 0.030 (extract B) (methanol was used as a blank). These extracts all contained all 11 kinds of methoxyflavones described in Example 1.
  • Example 7 (Sample preparation for measuring NOX inhibitory activity: production of black ginger ethanol extract) To 200 g of dried black ginger, 1000 mL of 50% aqueous ethanol solution was added, and extraction under heating was performed for 1 hour. The resulting liquid was cooled and suction filtered to separate the residue and the extract. The residue was again added with 1000 mL of 50% aqueous ethanol solution, extracted with heating under reflux for 1 hour, filtered, and combined with the previously obtained extract. After cooling to room temperature and concentration under reduced pressure, lyophilization was performed to obtain 49 g (yield 24.5%) of black ginger ethanol extract-1.
  • Example 8 (Sample preparation for measuring NOX inhibitory activity: production of black ginger oil extract) Ten times the amount of ethanol was added to 10 g, 20 g, 30 g, and 40 g of black ginger, respectively, followed by heating under reflux extraction for 1 hour. After cooling the obtained liquid, suction filtration was performed, 15 mL of medium chain fatty acid triglyceride was added to the extract, ethanol was distilled off by concentration under reduced pressure, and suction filtration was performed again for the purpose of removing insoluble matter. An oil and fat extract was obtained.
  • the obtained four black ginger oil extracts were analyzed for the total content of 11 methoxyflavones according to Example 2, and the values were 23.9 mg / mL, 46.3 mg / mL, and 69, respectively. 4 mg / mL and 78.1 mg / mL. Moreover, when the fat and oil extract containing 46.3 mg / mL or more of the total amount of methoxyflavone was allowed to stand at room temperature, precipitation of methoxyflavones was confirmed. These extracts all contained all 11 kinds of methoxyflavones described in Example 1.
  • Example 9 Comparison of black ginger extraction method using NOX inhibitory activity as an index
  • black ginger oil extract-1 having a total methoxyflavone amount of 22.4 mg / ml (obtained in Example 2)
  • black ginger oil extract-2 having a total methoxyflavone amount of 69.4 mg / ml NOx inhibitory activity of ethanol extract (obtained in Example 8)
  • black ginger ethanol extract-1 and 2 obtained in Example 7 (NOX inhibitory activity using differentiated HL-60 live cells) Measurement).
  • Two types of black ginger were examined to see the difference in the intensity of activity between lots of black ginger.
  • IC 50 values shown below indicate NOX inhibitory activity based on the total amount of methoxyflavone.
  • the oil and fat extract showed a higher action (lower IC 50 ) than the ethanol extract. From this, it was suggested that methoxyflavone having a higher inhibitory effect on NOX was efficiently extracted by extraction with oil and fat as in the present invention.
  • Example 10 (NF ⁇ B inhibitory action) When macrophage-like RAW264.7 cells are stimulated with LPS (lipopolysaccharide), NF ⁇ B is activated, thereby increasing the expression of iNOS (inducible NO synthase), and subculture caused by iNOS enzyme activity in the culture medium. It is known that nitric acid accumulates, and NF ⁇ B activation can be evaluated by measuring the amount of nitrous acid in the culture solution.
  • LPS lipopolysaccharide
  • RAW264.7 cells were cultured in 10% FBS-containing RPMI1640 medium. The obtained cells were suspended in the above culture solution to 4 ⁇ 10 5 cells / ml, dispensed 100 ⁇ l per well on a 96-well microplate, and cultured in advance (in a CO 2 incubator) for 24 hours.
  • LPS LPS-containing culture solution per well
  • 25 ⁇ l of 6 ⁇ g / ml LPS-containing culture solution per well LPS is derived from Escherichia coli, final concentration is 1 ⁇ g / ml
  • 25 ⁇ l of a test sample solution with a predetermined concentration were added to each well, and after further incubation for 24 hr, 75 ⁇ l of each
  • the cell culture solution was collected and a color reaction was performed by adding an equal amount of Griess reagent (manufactured by Fluka), and the production of nitrous acid was measured based on the absorbance at 540 nm.
  • NF ⁇ B inhibitory activity of the test sample was carried out using a 3-fold dilution series solution in which the DMSO solution of the sample was dissolved in the above culture solution to a DMSO concentration of 1% or less. Absorbance at addition / addition conditions was measured. Table 4 shows the concentration at which nitrite production caused by LPS stimulation was inhibited by 50%, ie, IC 50 value ( ⁇ M). As shown in Table 4, the methoxyflavone of the formula (I) showed an excellent NF ⁇ B inhibitory action.
  • Example 11 (Relationship between extraction method and composition)
  • oil and fat extraction extraction only with oil and fat, or ethanol extraction followed by oil and fat extraction
  • ethanol extraction was performed according to Example 7.
  • olive oil or a mixture of olive oil and medium-chain fatty acid glycerides in this example, medium-chain fatty acid triglycerides, which are also referred to as “MCT”
  • MCT medium-chain fatty acid triglycerides

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Abstract

本発明の課題は、優れた作用を有するＮＯＸ阻害剤及びＮＦκＢ阻害剤、及びそれを利用した、ＮＯＸやＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤を提供することにある。このために、特定のメトキシフラボンを用いる。

Description

メトキシフラボンを含むＮＯＸ阻害剤及びＮＦκＢ阻害剤
　本発明は、特定のメトキシフラボンを含むＮＯＸ阻害剤及びＮＦκＢ阻害剤、及びその利用に関する。
　ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）は、好中球などに存在し、Ｏ２－を生成することが知られている酵素である。従って、ＮＯＸの阻害は、生体内酸化に関連する種々の疾患の予防又は治療に有用であると考えられる。
　ＮＦκＢは、炎症促進性サイトカイン（例えばＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６）、ケモカイン（例えばＩＬ－８、ＭＩＰ１α）、誘導性エフェクター酵素（ｉＮＯＳおよびＣＯＸ－２）等の分子をコードする遺伝子の転写を調節する転写因子であり、炎症反応において重要な役割を果たしている。ＮＦκＢ経路の活性化は、種々の炎症性疾患につながり得ることが示されている。
　植物の抽出物に含まれているメトキシフラボンのいくつかは、抗酸化作用を有することが報告されている。そのようなメトキシフラボンの多くは、ヒドロキシ基を有する（非特許文献１～３）。
　黒ショウガ（Ｋａｅｍｐｆｅｒｉａ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ）は、ショウガ科に属する植物の一種であり、日本では黒ウコンとも呼ばれている。黒ショウガはタイではクラチャダム（Ｋｒａ　ｃｈａｉ　ｄａｈｍ）とも呼ばれる伝統的なハーブの一種である。黒ショウガには、ヒドロキシ基を有するメトキシフラボンだけでなく、ヒドロキシ基を有さないメトキシフラボンも含まれていることが知られている（非特許文献４）。
Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒａｍａｃｏｌ．，２０１２，８４（２），１８２－１９１ Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ．，１９９９，２７（１－２），９５－９９ Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３６（５），７１７－７２０ 大阪市立大学生活科学研究科　東鋭明氏博士論文「ショウガ科植物Ｋａｅｍｐｆｅｒｉａ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒａに含まれる成分の構造とα－グルコシダーゼ阻害活性および抗変異原性」
　本発明の課題は、優れた作用を有するＮＯＸ阻害剤及びＮＦκＢ阻害剤、及びＮＯＸやＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤を提供することにある。
　本発明者は、かかる課題について鋭意検討した結果、黒ショウガから得られる特定のメトキシフラボンが、優れたＮＯＸ阻害作用及び／又はＮＦκＢ阻害作用を有することを見出した。
　すなわち、本発明は以下のものに関するが、これらに限定されない。
［１］以下の式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１、Ｒ４、及びＲ５は、各々独立して水素又はメトキシ基であり、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基である）で表される構造を有する少なくとも１種のメトキシフラボンを含む、ＮＯＸ阻害剤。
［２］前記少なくとも１種のメトキシフラボンが、５，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、３，５，７，３’，４’－ペンタメトキシフラボン、５，７－ジメトキシフラボン、及び５，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ａから選択される、［１］に記載のＮＯＸ阻害剤。
［３］群Ａのメトキシフラボンと、３，５，７－トリメトキシフラボン、３，５，７，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７－メトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７，４’－ジメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７－ジメトキシフラボン、及び５－ヒドロキシ－３，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ｂのメトキシフラボンとの総含有量に対する、群Ａのメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ／（Ａ＋Ｂ））が、モル基準で０．６５を超える、［２］に記載のＮＯＸ阻害剤。
［４］前記［１］又は［２］に記載された少なくとも１種のメトキシフラボンを含む、ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療剤。
［５］アレルギー疾患、パーキンソン病、脳梗塞、白内障、てんかん、脊髄損傷、動脈硬化、未熟児網膜症、腎障害、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、肺気腫、慢性関節リウマチなどの膠原病、血管炎、浮腫、糖尿病合併症、紫外線障害、高山病、ポルフィリン血症、熱傷、凍傷、接触性皮膚炎、ショック、多臓器不全、ＤＩＣ、癌、老化、疲労、サルコぺニア（筋力低下）、ミトコンドリア機能障害、認知症、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、［４］に記載の予防又は治療剤。
［６］前記［２］に記載の群Ａのメトキシフラボンと、［３］に記載の群Ｂのメトキシフラボンとの総含有量に対する、群Ａのメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ／（Ａ＋Ｂ））が、モル基準で０．６５を超える、［４］又は［５］に記載の予防又は治療剤。
［７］以下の式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｒ１、Ｒ４、及びＲ５は、各々独立して水素又はメトキシ基であり、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基である）で表される構造を有する少なくとも１種のメトキシフラボンを含む、ＮＦκＢ阻害剤。
［８］前記少なくとも１種のメトキシフラボンが、５，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５，７－ジメトキシフラボン、及び５，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ａ’から選択される、［７］に記載のＮＦκＢ阻害剤。
［９］群Ａ’のメトキシフラボンと、３，５，７，３’，４’－ペンタメトキシフラボン、３，５，７－トリメトキシフラボン、３，５，７，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７－メトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７，４’－ジメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７－ジメトキシフラボン、及び５－ヒドロキシ－３，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ｂ’のメトキシフラボンとの総含有量に対する、群Ａ’のメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ’／（Ａ’＋Ｂ’））が、モル基準で０．４８を超える、［８］に記載のＮＦκＢ阻害剤。
［１０］前記［７］又は［８］に記載された少なくとも１種のメトキシフラボンを含む、ＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤。
［１１］前記疾患が、関節リウマチ、炎症性大腸炎、変形性関節症、骨溶解症、腱炎、坐骨神経痛、椎間板ヘルニア、狭窄症、脊髄症、腰痛、椎間関節痛、手根管症候群、足根管症候群、腰椎術後疼痛症候群、エイズ、動脈硬化、喘息、関節炎、糖尿病、炎症性大腸炎、肝炎、脳卒中、認知症、筋消耗、ウイルス感染、光老化を含めた皮膚老化、がん、及び老化からなる群から選択される、［１０］に記載の予防又は治療剤。
［１２］前記［８］に記載の群Ａ’のメトキシフラボンと、［９］に記載の群Ｂ’のメトキシフラボンとの総含有量に対する、群Ａ’のメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ’／（Ａ’＋Ｂ’））が、モル基準で０．４８を超える、［１０］又は［１１］に記載の予防又は治療剤。
［１３］３’，４’－ジメトキシフラボンを含む、ＮＯＸ阻害剤。
［１４］３’，４’－ジメトキシフラボンを含む、ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療剤。
［１５］前記疾患が、アレルギー疾患、パーキンソン病、脳梗塞、白内障、てんかん、脊髄損傷、動脈硬化、未熟児網膜症、腎障害、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、肺気腫、慢性関節リウマチなどの膠原病、血管炎、浮腫、糖尿病合併症、紫外線障害、高山病、ポルフィリン血症、熱傷、凍傷、接触性皮膚炎、ショック、多臓器不全、ＤＩＣ、癌、老化、疲労、サルコぺニア（筋力低下）、ミトコンドリア機能障害、認知症、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、［１４］に記載の予防又は治療剤。
　本発明は、優れた作用を有するＮＯＸ阻害剤及びＮＦκＢ阻害剤を提供することができる。また、それを利用して、ＮＯＸやＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤も提供することができる。
　本発明において使用されるメトキシフラボンは、従来抗酸化作用等が見出されていたメトキシフラボンと異なり、ヒドロキシ基を有さないにも拘らず、優れたＮＯＸ阻害等の作用を示す。
　（メトキシフラボン）
　本発明においては、以下の式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ１、Ｒ４、及びＲ５は、各々独立して水素又はメトキシ基であり、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基である）で表される構造を有する少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種、より好ましくは少なくとも５種、より好ましくは少なくとも６種、より好ましくは少なくとも７種、より好ましくは少なくとも８種のメトキシフラボンを用いる。
　本発明のＮＯＸ阻害、又はＮＯＸに起因する疾患の治療又は予防においては、好ましくは、前記少なくとも１種のメトキシフラボンは、５，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、３，５，７，３’，４’－ペンタメトキシフラボン、５，７－ジメトキシフラボン、及び５，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ａから選択される。ＮＯＸ阻害剤、又はＮＯＸに起因する疾患の治療又は予防剤は、群Ａのメトキシフラボンだけでなく、他の化合物、例えば、黒ショウガ由来の、３，５，７－トリメトキシフラボン、３，５，７，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７－メトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７，４’－ジメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７－ジメトキシフラボン、及び５－ヒドロキシ－３，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ｂから選択される少なくとも１種のメトキシフラボンを含んでもよい。しかしながら、群Ａのメトキシフラボンは、群Ｂのメトキシフラボンよりも高いＮＯＸ阻害作用を示す。従って、群Ａのメトキシフラボンの含有率は高い方が良い。例えば、群Ａ及び群Ｂのメトキシフラボンの総含有量に対する、群Ａのメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ／（Ａ＋Ｂ））は、モル基準(又は重量基準）で好ましくは０．６５を超え、より好ましくは０．６６以上、より好ましくは０．６７以上、より好ましくは０．６８以上、より好ましくは０．６９以上、より好ましくは０．７０以上、より好ましくは０．７１以上である。当該割合に上限値はなく、当該割合は１．００以下であってもよい。
　本発明のＮＦκＢ阻害、又はＮＦκＢに起因する疾患の治療又は予防においては、好ましくは、前記少なくとも１種のメトキシフラボンは、５，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５，７－ジメトキシフラボン、及び５，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ａ’から選択される。ＮＦκＢ阻害剤、又はＮＦκＢに起因する治療又は予防剤は、群Ａ’のメトキシフラボンだけでなく、他の化合物、例えば、黒ショウガ由来の、３，５，７，３’，４’－ペンタメトキシフラボン、３，５，７－トリメトキシフラボン、３，５，７，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７－メトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７，４’－ジメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７－ジメトキシフラボン、及び５－ヒドロキシ－３，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ｂ’から選択される少なくとも１種のメトキシフラボンを含んでもよい。しかしながら、群Ａ’のメトキシフラボンは、群Ｂ’のメトキシフラボンよりも高いＮＦκＢ阻害作用を示す。従って、群Ａ’のメトキシフラボンの含有率は高い方が良い。例えば、群Ａ’及び群Ｂ’のメトキシフラボンの総含有量に対する、群Ａ’のメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ’／（Ａ’＋Ｂ’））は、モル基準(又は重量基準）で好ましくは０．４８を超え、より好ましくは０．４９以上、より好ましくは０．５０以上、より好ましくは０．５１以上、より好ましくは０．５２以上、より好ましくは０．５３以上、より好ましくは０．５４以上、より好ましくは０．５５以上、より好ましくは０．６０以上である。当該割合に上限値はなく、当該割合は１．００以下であってもよい。
　或いは、メトキシフラボンは、３’，４’－ジメトキシフラボンである。
　これらのメトキシフラボンの大部分は、例えば、非特許文献４に記載の方法に従って、黒ショウガ（Ｋａｅｍｐｆｅｒｉａ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ）から得ることができる。或いは、例えば本明細書の実施例１に詳述された方法に従って得ることもできる。黒ショウガは、ショウガ科に属する植物の一種であり、東南アジアを中心に自生しているため、容易に入手できる。３’，４’－ジメトキシフラボンは、例えば、Ｌａｗｓｏｎｉａ　ａｌｂａ（ヘナ）のから溶媒を用いて抽出できることが知られている。例えば、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１１，４，４５４－４５８を参照されたい。
　前記阻害剤及び治療又は予防剤に含まれるメトキシフラボンの種類及び量は、必要に応じて公知の方法に基づいて調整することができる。例えば、特定のメトキシフラボンを公知の精製方法を使用して除去することもできるし、特定の精製されたメトキシフラボンを前記阻害剤、又は治療もしくは予防剤に添加することもできる。
　また、本発明においては、黒ショウガから、式（Ｉ）のメトキシフラボンを含む油脂抽出物を得て利用することもできる。当該油脂抽出物は、黒ショウガから油脂抽出を経て得られる抽出物である。当該抽出物は、メトキシフラボンを含有し、そして黒ショウガ抽出物に特有の黒紫色の強度が低減されている。当該抽出物は、さらに油脂、特に抽出に用いられた油脂を含んでもよい。
　当該油脂抽出物は、黒ショウガから得られていないものや、黒ショウガを原料としていても油脂抽出を経て得られていないものとは、含有される成分の種類及び比率等の点で異なると考えられる。例えば、黒ショウガ以外の植物から得られた抽出物もメトキシフラボンを含みうるが、その種類や比率は、当該油脂抽出物と異なると考えられる。また、黒ショウガが原料であっても、そこから、油脂抽出以外の方法、例えば、含水アルコール抽出により得られた抽出物中のメトキシフラボンの種類や比率は、当該油脂抽出物と異なる。一方で、油脂抽出は、黒ショウガに対して直接行われてもよいし、間接的に、例えば、黒ショウガから油脂以外の溶媒、例えば水、親水性溶媒、又はそれらの混合物を用いて得られた抽出液に対して行ってもよい。
　当該油脂抽出物は、少なくとも１種の式（Ｉ）のメトキシフラボンを含有する。当該メトキシフラボンは、好ましくは、群Ａから選択される。当該抽出物は、さらに、群Ｂから選択されるメトキシフラボンを含有してもよい。当該油脂抽出物は、好ましくは、群Ａ及びＢの１１種のメトキシフラボンから選択される少なくとも１種、より好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種、より好ましくは少なくとも５種、より好ましくは少なくとも６種、より好ましくは少なくとも７種、より好ましくは少なくとも８種、より好ましくは少なくとも９種、より好ましくは少なくとも１０種、より好ましくは１１種を含む。
　当該油脂抽出物の製造に用いられ得る、そして当該抽出物に含まれ得る油脂は、メトキシフラボンを溶解できる限り特に限定されない。典型的には、当該油脂は、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ジアシルグリセロール、ゴマサラダ油、オリーブ油、大豆油、ナタネ油、コーン油、米胚芽油、ヒマワリ種子油、シソ油、エゴマ油から選ばれる少なくとも１種である。中鎖脂肪酸トリグリセリドに関して用いられる「中鎖脂肪酸」とは、炭素数８～１２の脂肪酸を意味する。当該トリグリセリドを構成する脂肪酸部分の内の少なくとも一つ、好ましくは二つが、より好ましくは三つが、中鎖脂肪酸である。
　当該油脂抽出物においては、黒紫色の強度が低減されている。このことを確認するために、当該抽出物の吸光度を測定することが有効である。
　具体的には、当該抽出物から、群Ａ及びＢの１１種のメトキシフラボンの総含有量が５．０ｍｇ／ｍｌである溶液を調製し、当該溶液の、波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。このようにして測定される吸光度は、当該油脂抽出物においては、０．１０以下である。当該吸光度は、好ましくは０．０７以下、より好ましくは０．０５以下である。特に断りがない限り、本明細書における吸光度は、セル長（光路長）が１０ｍｍの場合の吸光度を意味する。測定に用いた装置のセル長が１０ｍｍでない場合には、得られた吸光度の値をセル長が１０ｍｍである場合の値に換算する。また、吸光度測定のためには、適切なブランクを使用する。
　以下に、当該油脂抽出物の製造方法を説明する。
　例えば、当該製造方法は、黒ショウガの植物体に油脂を接触させて１種以上のメトキシフラボンを抽出することを含む。この方法の典型例を以下に記載する。
　先ず、黒ショウガの植物体を準備する。当該植物体又はその部位を、必要に応じて、乾燥し、粉砕する。次いで、当該植物体又はその部位を油脂と接触させて、抽出を行う。抽出条件は、メトキシフラボンを抽出できる限り特に限定されない。典型的な抽出温度は、５０～１８０℃、７０～１７０℃、７０～１５０℃、１００～１５０℃、又は１２０～１５０℃である。抽出時間は、典型的には、１分～１日、１０分～１０時間、又は１５分～５時間である。また、使用される油脂の容量は、典型的には、黒ショウガの重量の０．１～３０倍、又は０．５～１５倍である。用いられる油脂の例は、上記した通りである。
　理論に拘束されないが、この抽出中に、メトキシフラボンが油脂に移行するが、黒ショウガの黒紫色を生じる成分は、黒ショウガの植物体中に留まると考えられる。また、黒ショウガに特有の香味を生じる成分も、油脂に移行せずに当該植物体中に留まると考えられる。
　次いで、抽出を行った後には、必要に応じて、当該抽出により得られた油脂含有抽出物から濾過又は遠心分離により不溶性固形物を除く。
　或いは、油脂抽出物の製造は、黒ショウガの植物体に水、親水性溶媒、又はそれらの混合物を接触させて、１種以上のメトキシフラボンを抽出し、そして当該抽出により得られた中間抽出物に油脂を接触させて当該メトキシフラボンを抽出することを含む。この方法の典型例を以下に記載する。
　先ず、上記と同様にして黒ショウガの植物体を準備する。次いで、当該植物体又はその部位に、水、親水性溶媒、又はそれらの混合物を接触させて、抽出を行う。抽出条件は、メトキシフラボンを抽出できる限り特に限定されない。典型的な抽出温度は、室温～還流温度、４０℃～還流温度、５０℃～還流温度、還流温度であるが、５０℃～還流温度、又は還流温度が好ましい。抽出時間は、典型的には、１分～１日、１０分～１０時間、又は１５分～５時間である。また、使用される水、親水性溶媒又はそれらの混合物の容量は、典型的には、黒ショウガの重量の０．１～３０倍、又は０．５～１５倍である。用いられる親水性溶媒は、好ましくはＣ１－３アルコール及び／又はアセトンであり、より好ましくは、エタノールである。例えば、５０～１００ｖ／ｖ％エタノールを用いて抽出を行う。この抽出工程で得られる中間抽出物を、油脂抽出工程に付す。
　油脂抽出工程では、当該中間抽出物と油脂とを接触させて抽出を行う。抽出条件は、メトキシフラボンを抽出できる限り特に限定されない。抽出温度は特に限定されず、例えば、５℃以上、１０℃以上、２０℃以上、３０℃以上、４０℃、又は５０℃以上で行われる。抽出温度の上限値は特に制限されず、水、親水性溶媒又はそれらの混合物の還流温度以下であればよい。抽出時間は、典型的には、１分～１日、１０分～１０時間、又は１５分～５時間である。また、使用される油脂の容量は、典型的には、黒ショウガの重量の０．０１～３０倍、又は０．１～１５倍である。用いられる油脂の例は、上記した通りである。
　さらに、場合により、当該中間抽出物に油脂を接触させる前に、及び／又はそれらが接触している間に、当該中間抽出物から水、親水性溶媒、又はそれらの混合物を蒸発させる。蒸発は、常圧下で行ってもよいし、減圧下で行ってもよい。このように積極的な蒸発を行う場合には、抽出時間はあまり重要でない。蒸発が進み、水、親水性溶媒又はそれらの混合物の量が低下すれば、メトキシフラボンは油脂中に、場合によって当該親水性溶媒等と共に、移行すると考えられる。
　理論に拘束されないが、油脂抽出中に、メトキシフラボンが油脂に移行するが、黒ショウガの黒紫色を生じる成分は、油脂に移行しないと考えられる。
　次いで、抽出を行った後には、必要に応じて、当該抽出により得られた油脂含有抽出物から濾過又は遠心分離により不溶性固形物を除く。これは、中間抽出物についても同様である。
　前記の２つの方法によると、油脂含有抽出物を得ることができる。これは、さらなる精製をすることなく使用してもよいが、必要に応じて精製してもよい。例えば、当該油脂含有抽出物をさらなる抽出工程に付して、油脂を除去してもよい。具体的には、当該油脂含有抽出物に、水、親水性溶媒、又はそれらの混合物を接触させて、１種以上のメトキシフラボンを抽出する。この際、必要であれば、当該油脂含有抽出物に低極性の溶媒、例えば、ｎ－ヘキサンのようなＣ１－８の炭化水素を加えてもよい。
　用いる親水性溶媒や親水性溶媒と水との混合物の例は、上記した通りである。抽出温度は特に限定されず、例えば、５℃以上、１０℃以上、２０℃以上、３０℃以上、４０℃、又は５０℃以上で行われる。抽出温度の上限値は特に制限されないが、水、親水性溶媒又はそれらの混合物の還流温度以下であればよい。抽出時間は、典型的には、１分～１日、１０分～１０時間、又は１５分～５時間である。また、使用される水、親水性溶媒又はそれらの混合物の容量は、典型的には、油脂抽出物の重量の０．０１～３０倍、又は０．１～１５倍である。
　さらに、メトキシフラボンの抽出中に、当該油脂含有抽出物由来の油脂相と、当該水、親水性溶媒、又はそれらの混合物由来の相との２相混合物が得られ、この混合物を液－液分離に付す。結果として、当該水、親水性溶媒、又はそれらの混合物の相（これは、メトキシフラボンと溶媒を含む抽出物である）を、油脂相から分離させることができる。液－液分離のためには、例えば、当該２相混合物を単に静置してもよいし、遠心分離に付してもよい。次いで、分離された抽出物を得る。
　分離された抽出物は、メトキシフラボンを含み、そして溶媒を含む液の形態にある。この液をそのまま利用してもよいし、溶媒（水、親水性溶媒、又はその混合物）を除去して、メトキシフラボンを含む粉末形態の抽出物を得てもよい。溶媒を除去する方法は特に限定されず、常圧又は減圧下での蒸留、凍結乾燥等が挙げられる。
　このようにして油脂が除去された抽出物は、黒ショウガに特有のメトキシフラボンを比較的高い濃度で含有する。この抽出物も、必要に応じてさらに精製してもよい。
　油脂抽出物においては、エタノール等の親水性溶媒を用いて得られた抽出物と比較して、上述したＡ／（Ａ＋Ｂ）及びＡ’／（Ａ’＋Ｂ’）の割合が比較的高い。油脂抽出物における当該割合の好ましい範囲は、上記した通りである。
　（ＮＯＸ阻害剤）
　本発明者は、式（Ｉ）のメトキシフラボンが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）阻害剤として有効であることを見出した。従って、本発明は、一つの側面では、式（Ｉ）のメトキシフラボンを少なくとも一種含む、ＮＯＸ阻害剤、又はＮＯＸを阻害するための組成物である（本明細書では、「ＮＯＸ阻害剤」と「ＮＯＸを阻害するための組成物」は、相互交換的に用い、特に断りがない限り、一方を用いる場合には、他方をも意味するものとする）。この発明は、別の態様では、式（Ｉ）のメトキシフラボンの少なくとも一種を対象に投与することを含むＮＯＸを阻害するための方法でもある。或いは、式（Ｉ）のメトキシフラボンの代わりに、又はそれに追加して、３’，４’－ジメトキシフラボンを用いることもできる。
　ＮＯＸの阻害は、ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療につながる。従って、本発明は、別の側面では、式（Ｉ）のメトキシフラボンの少なくとも１種を含む、ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療剤、又は当該予防若しくは治療のための組成物である（本明細書では、「ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療剤」と「ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療のための組成物」は、相互交換的に用い、特に断りがない限り、一方を用いる場合には、他方をも意味するものとする）。この発明は、別の態様では、当該メトキシフラボンの少なくとも１種を対象に投与することを含む、当該疾患の予防又は治療のための方法である。そのような疾患には、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹などのアレルギー疾患、パーキンソン病、脳梗塞、白内障、てんかん、脊髄損傷、動脈硬化、未熟児網膜症、腎障害、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、肺気腫、慢性関節リウマチなどの膠原病、血管炎、浮腫、糖尿病合併症、紫外線障害、高山病、ポルフィリン血症、熱傷、凍傷、接触性皮膚炎、ショック、多臓器不全、ＤＩＣ、癌、老化、疲労、サルコぺニア（筋力低下）、ミトコンドリア機能障害、認知症、及びアルツハイマー病が含まれる。或いは、式（Ｉ）のメトキシフラボンの代わりに、又はそれに追加して、３’，４’－ジメトキシフラボンを用いることもできる。
　本発明は、別の側面では、式（Ｉ）のメトキシフラボンを少なくとも一種含む、抗酸化剤（より具体的には、生体内酸化防止、抑制又は低減剤）であるか、又は生体内酸化を防止、抑制又は低減するための組成物である（本明細書では、「抗酸化剤」、「生体内酸化防止、抑制又は低減剤」、「生体内酸化を防止、抑制又は低減するための組成物」は、相互交換的に用い、特に断りがない限り、これら三者の一つを記載する場合には、残りの二者をも意味するものとする）。この発明は、別の態様では、式（Ｉ）のメトキシフラボンの少なくとも一種を対象に投与することを含む、生体内酸化を防止、抑制又は低減するための方法である。本明細書においては、生体内酸化とは、生体内で活性酸素によって生じる種々の酸化反応を意味する。或いは、式（Ｉ）のメトキシフラボンの代わりに、又はそれに追加して、３’，４’－ジメトキシフラボンを用いることもできる。
　本発明のＮＯＸ阻害剤、ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療剤、抗酸化剤中の式（Ｉ）のメトキシフラボンの総含有量は、所望の効果が得られる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１～５０ｗ／ｗ％、より好ましくは０．１～４０ｗ／ｗ％、より好ましくは０．５～３０ｗ／ｗ％である。
　ＮＯＸ阻害作用、ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療、抗酸化等の前記の所望の効果を発揮するための成人１日当たりの式（Ｉ）のメトキシフラボンの総摂取量は、好ましくは１～５００ｍｇであり、より好ましくは３～２００ｍｇであり、さらに好ましくは５～１００ｍｇである。
　上記の量は、３’，４’－ジメトキシフラボンにも適用できる。
　（ＮＦκＢ阻害剤）
　本発明者は、式（Ｉ）のメトキシフラボンが、ＮＦκＢ阻害剤として有効であることを見出した。従って、本発明は、別の側面では、式（Ｉ）のメトキシフラボンを少なくとも一種含む、ＮＦκＢ阻害剤、又はＮＦκＢを阻害するための組成物である（本明細書では、「ＮＦκＢ阻害剤」と「ＮＦκＢを阻害するための組成物」は、相互交換的に用い、特に断りがない限り、一方を用いる場合には、他方をも意味するものとする）。この発明は、別の態様では、式（Ｉ）のメトキシフラボンの少なくとも一種を対象に投与することを含むＮＦκＢを阻害するための方法である。或いは、式（Ｉ）のメトキシフラボンの代わりに、又はそれに追加して、３’，４’－ジメトキシフラボンを用いることもできる。
　ＮＦκＢの阻害は、ＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療につながる。従って、本発明は、別の側面では、式（Ｉ）のメトキシフラボンの少なくとも１種を含む、ＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤、又は当該予防又は治療のための組成物である（本明細書では、「ＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤」と「ＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤のための組成物」は、相互交換的に用い、特に断りがない限り、一方を用いる場合には、他方をも意味するものとする）。当該発明は、別の態様では、当該メトキシフラボンの少なくとも１種を対象に投与することを含む、当該疾患の予防又は治療のための方法に関する。そのような疾患には、関節リウマチ、炎症性大腸炎、変形性関節症、骨溶解症、腱炎、坐骨神経痛、椎間板ヘルニア、狭窄症、脊髄症、腰痛、椎間関節痛、手根管症候群、足根管症候群、腰椎術後疼痛症候群、エイズ、動脈硬化、喘息、関節炎、糖尿病、炎症性大腸炎、肝炎、脳卒中、認知症、筋消耗、ウイルス感染、光老化を含めた皮膚老化、がん、及び老化が含まれる。或いは、式（Ｉ）のメトキシフラボンの代わりに、又はそれに追加して、３’，４’－ジメトキシフラボンを用いることもできる。
　本発明のＮＦκＢ阻害剤、ＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤中の式（Ｉ）のメトキシフラボンの総含有量は、所望の効果が得られる限り特に限定されないが、好ましくは０．０１～５０ｗ／ｗ％、より好ましくは０．１～４０ｗ／ｗ％、より好ましくは０．５～３０ｗ／ｗ％である。
　ＮＦκＢ阻害作用、ＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療等の前記の所望の効果を発揮するための成人１日当たりの式（Ｉ）のメトキシフラボンの総摂取量は、好ましくは１～５００ｍｇであり、より好ましくは３～２００ｍｇであり、さらに好ましくは５～１００ｍｇである。
　上記の量は、３’，４’－ジメトキシフラボンにも適用できる。
　（他の成分）
　本発明のＮＯＸ又はＮＦκＢ阻害剤、ＮＯＸ又はＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤、抗酸化剤は、その効果を損なわない限り、式（Ｉ）のメトキシフラボンの他に、任意の成分を配合してもよい。例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣ等のビタミン類、ミネラル類、ホルモン、栄養成分、香料などの生理活性成分のほか、製剤化において配合される乳化剤、緊張化剤（等張化剤）、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤等を適宜配合することができる。
　（適用）
　本発明のＮＯＸ又はＮＦκＢ阻害剤、ＮＯＸ又はＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤、抗酸化剤は、飲食品（機能性食品、健康補助食品、栄養機能食品、特別用途食品、特定保健用食品、栄養補助食品、食事療法用食品、健康食品、サプリメント等）、医薬品、又は香粧品として、又はその原料として使用することができる。飲食品及び医薬品は、ペットの餌として加工したペットフードや動物飼料等、並びに動物用医薬品でもよい。
　当該飲食品の形態は、特に限定されないが、例えば、清涼飲料水（例えば、スポーツドリンク、炭酸飲料、果汁飲料）、菓子類（例えば、ケーキ、ビスケット、パン、飴）、麺類（例えば、うどん、そば、ラーメン、パスタ）、みそ、醤油、酢、サラダ油、ごま油、豆乳、牛乳である。或いは、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセルも含む）等の形態であってもよい。
　当該医薬品の形態は、特に限定されないが、例えば、外用剤（例えば、ローション、乳液剤、貼付剤、軟膏剤）、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセルも含む）、溶液剤、懸濁液剤）、注射剤、注入剤である。
　当該香粧品の形態は、特に限定されないが、例えば、化粧水、ジェル、ローション、クリーム、パック剤、乳液、ファンデーション、口紅、パウダー、洗顔料、ヘアートニックである。
　（数値範囲）
　明確化のために記載すると、本明細書において下限値と上限値によって表されている数値範囲、即ち「下限値～上限値」は、それら下限値及び上限値を含む。例えば、「１～２」により表される範囲は、１及び２を含む。
　[実施例１]
　（メトキシフラボンの単離精製）
　黒ショウガ１５０ｇに５０％エタノール水溶液１５００ｍｌを加え、２時間加熱還流抽出を行った。冷後得られた抽出液をろ過し、減圧下にて濃縮し、凍結乾燥を行い、黒ショウガ抽出物２５．７ｇを得た。得られた抽出物のうち９ｇをＤｉａ　ｉｏｎ　ＨＰ２０（三菱化学株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーに付し、４つの画分（３０％エタノール溶出部、５０％エタノール溶出部、７０％エタノール溶出部、１００％エタノール溶出部）へ分画した。このうち５０％エタノール溶出部を高速液体クロマトグラフィーに付して、５，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン（６４ｍｇ）、３，５，７，３’，４’－ペンタメトキシフラボン（４６４ｍｇ）、５，７－ジメトキシフラボン（１４５ｍｇ）、５，７，４’－トリメトキシフラボン（１８８ｍｇ）、３，５，７－トリメトキシフラボン（３５ｍｇ）、３，５，７，４’－テトラメトキシフラボン（９６ｍｇ）を単離した。続いて１００％エタノール溶出部についても同様に液体クロマトグラフィーによる分離精製を行い５－ヒドロキシ－３，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン（１５ｍｇ）、５－ヒドロキシ－７－メトキシフラボン（８４ｍｇ）、５－ヒドロキシ－７，４’－ジメトキシフラボン（５６ｍｇ）、５－ヒドロキシ－３，７－ジメトキシフラボン（１００ｍｇ）、５－ヒドロキシ－３，７，４’－トリメトキシフラボン（１１０ｍｇ）を単離した。単離した化合物は、そのスペクトルデータを文献（大阪市立大学生活科学研究科　東鋭明氏博士論文「ショウガ科植物Ｋａｅｍｐｆｅｒｉａ　ｐａｒｖｉｆｌｏｒａに含まれる成分の構造とα－グルコシダーゼ阻害活性および抗変異原性」）に記載の各種スペクトルデータと比較の上、同定した。
　[実施例２]
　（油脂抽出物の製造）
　３ｇ及び１５ｇの黒ショウガに、それぞれオリーブオイル３０ｍＬを加え、１２０℃で３０分間抽出を行った後、冷却してからろ過し、２つの淡黄色の黒ショウガ油脂抽出物を得た。以下の分析条件で、得られた２つの油脂抽出物中の実施例１に記載のメトキシフラボン１１種の総含有量を定量したところ、その値は、６．２ｍｇ／ｍＬ（３ｇの黒ショウガより）、２２．４ｍｇ／ｍＬ（１５ｇの黒ショウガより）であった。尚、これらの抽出物は、いずれも、実施例１に記載のメトキシフラボン１１種を全て含んでいた。
　（メトキシフラボンの分析定量）
　黒ショウガ油脂抽出物１．０ｍＬにｎ－ヘキサン１．０ｍＬを加え希釈した後、２．０ｍＬの８０％メタノール水溶液にて３回メトキシフラボンの抽出を行った。得られた８０％メタノール抽出液をＭｅｇａ　Ｂｏｎｄ　Ｅｌｕｔｅ　Ｃ１８（アジレントテクノロジー社製）に通した後、Ｍｅｇａ　Ｂｏｎｄ　Ｅｌｕｔｅ　Ｃ１８に吸着したメトキシフラボンを洗い出す目的で、８０％メタノール２．０ｍＬを通した。得られた液をあわせた後、最終的に１０ｍＬへメスアップし、ＨＰＬＣ用の分析試料とした。
　（ＨＰＬＣ分析条件）
　　カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　Ｃ３０　ＵＧ５（４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ、野村化学株式会社製）
　　検出：２８０ｎｍ（ＰＤＡは２００～６００ｎｍ）
　　カラム温度：４０℃
　　移動相Ａ：０．０５％トリフロロ酢酸水溶液
　　移動相Ｂ：９０％アセトニトリル水溶液中のトリフロロ酢酸０．０５％溶液
　　グラジェント：移動相Ｂ　５０%－５０％－７０％－７０％（０ｍｉｎ－７．５ｍｉｎ－２０ｍｉｎ－２５ｍｉｎ）
　　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　　試料注入量：１０μＬ
　[実施例３]
　（ＮＯＸ阻害活性測定方法）
　分化させたＨＬ－６０細胞の調製：
　ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ－６０細胞は未分化状態で増殖を繰り返すが、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やレチノイン酸などを添加することにより成熟顆粒球に分化し、増殖能を失うとともに、分化の指標ともなっているＮＯＸ（ＮＡＤＰＨ　ｏｘｉｄａｓｅ）が細胞内に発現することが知られており、そのＮＯＸは、ＮＯＸ阻害活性を評価するための酵素源として利用することができる。
　ＮＯＸを発現する顆粒球へと分化させるために、１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した未分化ＨＬ－６０細胞を、１％　ＤＭＳＯを含有する１０％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁させ、その懸濁液を内径１０ｃｍのシャーレに１５ｍｌずつ分注してＣＯ２インキュベータ（３７℃）において３日間培養させた後、１０ｍｌの１％ＤＭＳＯを含有する１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を各シャーレに追加して、さらに３日間培養させることにより、ＮＯＸの発現した分化したＨＬ－６０細胞を得ることができた。以下に記すように、分化させたＨＬ－６０細胞の細胞破砕液あるいは生細胞をそのまま用いてＮＯＸ活性を測定した。
　細胞破砕液を用いたｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ系によるＮＯＸ活性測定：
　ＤＭＳＯ処理により分化させたＨＬ－６０細胞を遠心処理により集め、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で一回洗浄した後に、細胞破砕用の緩衝液（１３１ｍＭ　ＮａＣｌおよび３４０ｍＭ　ｓｕｃｒｏｓｅを含有する８ｍＭ　リン酸緩衝液　ｐＨ７．０）を用いて１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁させた。氷冷させた後に、超音波破砕機（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ　ＵＣＤ－２５０ＨＳＡ、Ｃｏｓｍｏ　Ｂｉｏ製）を用い、４℃以下の条件において「最大出力での破砕２０秒／インターバル冷却３０秒」のプロセスを３回繰り返すことにより細胞破砕液を得た。破砕液を１０００ｇ、４分間の遠心処理することによってｄｅｂｒｉｓを除去して得られた上清に、９倍容の反応用の緩衝液（１ｍＭ　ＥＧＴＡ，１０μＭ　ＦＡＤおよび１７０ｍＭ　ｓｕｃｒｏｓｅを含有する６５ｍＭリン酸緩衝液　ｐＨ７．０）を加え、ＮＯＸ測定用の細胞破砕上清液(１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ相当)を調製した。
　ＮＯＸの反応は、９６ｗｅｌｌのマイクロプレートにｗｅｌｌあたり５０μｌの上記細胞破砕液を注ぎ、さらにＮＯＸ活性化剤である０．５ｍＭ　ＳＤＳ溶液を２５μｌ、基質である０．４ｍＭ　ＮＡＤＰＨ溶液を２５μｌ添加して２５℃において３０～９０分間行った。ＮＯＸ活性はＮＡＤＰＨの消費速度を蛍光測定（Ｅｘ：３５５ｎｍ／Ｅｍ：４６０ｎｍ）することにより求めた。
　被験サンプルのＮＯＸ阻害活性は、サンプルのＤＭＳＯ溶液（試薬の場合は通常１０ｍＭ）を調製し、ＤＭＳＯによって３倍希釈系列の溶液を調製し、これを上記の反応液に各々１μｌ/ｗｅｌｌずつ添加して酵素反応を行い、得られた阻害活性をＩＣ５０値（μＭ、抽出物の場合はμｇ／ｍｌ）として示した。
　分化したＨＬ－６０生細胞を用いたＮＯＸ活性測定：
　ＤＭＳＯ処理により分化させたＨＬ－６０細胞を遠心処理により集め、ＦＢＳおよびフェノールレッドを含まないＤ－ＭＥＭ培地に５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁させた。ＮＯＸの反応は、９６ｗｅｌｌのマイクロプレートにｗｅｌｌあたり２５μｌの上記細胞懸濁液を注ぎ、さらに上記のＤ－ＭＥＭを用いて調製した０．８ｍｇ/ｍｌ　ＷＳＴ－１溶液、所定濃度に調製した被験サンプル溶解液（サンプルのＤＭＳＯ溶液（試薬の場合は通常１０ｍＭ）を調製し、ここからＤＭＳＯを用いて３倍希釈系列の溶液を調製し、これを上記のＤ－ＭＥＭに１ｖ／ｖ%以下になるように溶解させて、当該被験サンプル溶解液を調製した）をそれぞれ２５μｌずつ添加し攪拌させた後に、２５μｌの４μＭ　ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ　１２－Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　１３－ａｃｅｔａｔｅ、終濃度は１μＭ）Ｄ－ＭＥＭ溶液を添加してＮＯＸの活性化を行い、３７℃、４５分間の反応を行い、ＮＯＸ酵素生成物であるスーパーオキシドと反応液中のＷＳＴ－１が反応して生成する黄色フォルマザンを４５０ｎｍの吸光度として測定した。なお、このＮＯＸ活性測定系では、ＰＭＡを添加しない限りＮＯＸは活性化しないことが確認されている。
　得られた阻害活性をＩＣ５０値（μＭ、抽出物の場合はμｇ／ｍｌ）として示した。
　[実施例４]
　（メトキシフラボノイドのＮＯＸ阻害活性の比較）
　実施例３に従い、細胞破砕液を用いたｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ系によるＮＯＸ活性測定によりいくつかのメトキシフラボノイドのＮＯＸ阻害活性を比較した。結果を表１に示す。
　表１に示されるように、ルテオリンのメトキシ体である５，７，３’，４’－テトラメトキシフラボンや、ケルセチンのメトキシ体である３，５，７，３’，４’－ペンタメトキシフラボンなどに強いＮＯＸ阻害活性が認められた。これらの５，７－ジメトキシフラボノイド類は黒ショウガなどに含まれている。他方、柑橘類に存在することが知られているノビレチンなどのヘキサメトキシフラボンには、強いＮＯＸ阻害活性は認められなかった。尚、ＮＯＸ阻害剤であるＶＡＳ２８７０の、この細胞破砕液を用いたｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ系におけるＩＣ５０値は、３．３μＭであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　[実施例５]
　（黒ショウガ由来化合物のＮＯＸ阻害活性）
　実施例３に従い、細胞破砕液を用いたｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ系によるＮＯＸ活性測定により黒ショウガから抽出・分画したメトキシフラボノイドのＮＯＸ阻害活性を比較した。黒ショウガから得られたフラボノイドはいずれもメトキシ基をもつという特徴を有する。このうち、Ａ環の５位と７位にメトキシ基を有するフラボンに、強いＮＯＸ阻害活性が認められたが、５位にヒドロキシ基を有するフラボノイドにはＮＯＸ阻害活性が認められなかった。３位のメトキシ基は、致命的ではないが、活性を減弱させる傾向が見られた。従って、式（Ｉ）に表されるメトキシフラボンは、優れたＮＯＸ阻害活性を有すると考えられる。また、この系におけるＶＡＳ２８７０（ＮＯＸ阻害剤）のＩＣ５０は６．３μＭであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　[実施例６]
　黒ショウガのロットによる油脂抽出物の組成の違いを確認するため２つの黒ショウガ２００ｇを用意し、それぞれについてエタノール１０００ｍＬを加えて、１時間加熱還流抽出を行った。得られた液を冷却後、吸引ろ過して、残渣と抽出液に分けた。再度残渣にエタノール１０００ｍＬを加えて、１時間加熱還流抽出を行い、ろ過し、先に得られた抽出液とあわせた。続いて抽出液に中鎖脂肪酸トリグリセリド１００ｍＬを加え、減圧濃縮によりエタノールを留去したのち、析出した不溶物を吸引ろ過にて除去し、２つの黒ショウガ油脂抽出物を得た。実施例２に準じてそれらの抽出物中のメトキシフラボンの含有量を分析したところ、メトキシフラボン総量は、９０．４ｍｇ／ｍＬ（以下、この抽出物を「抽出物Ａ」と呼ぶ）、５４．９ｍｇ／ｍＬ（以下、この抽出物を「抽出物Ｂ」と呼ぶ）であった。またこれら２つの抽出物中のメトキシフラボン総量を５ｍｇ／ｍｌにオリーブオイルにて調節して２つの溶液を得て、その溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定したところ、それぞれ０．０３６（抽出物Ａ）、０．０３０（抽出物Ｂ）であった（ブランクとしてメタノールを用いた）。尚、これらの抽出物は、いずれも、実施例１に記載の１１種のメトキシフラボンを全て含んでいた。
　[実施例７]
　（ＮＯＸ阻害活性測定のためのサンプル調製：黒ショウガエタノール抽出物の製造）
　黒ショウガ乾燥物２００ｇに５０％エタノール水溶液１０００ｍＬを加えて、１時間加熱還流抽出を行った。得られた液を冷却後、吸引ろ過して、残渣と抽出液に分けた。再度残渣に５０％エタノール水溶液１０００ｍＬを加えて、１時間加熱還流抽出を行い、ろ過し、先に得られた抽出液とあわせた。室温まで冷後、減圧濃縮したのち、凍結乾燥を行い黒ショウガエタノール抽出物－１を４９ｇ（収率２４．５％）得た。黒ショウガのロット間による差を確認する目的で、上述と同様の方法にて操作を行ったところ、黒ショウガエタノール抽出物－２を２３ｇ（収率１５．２％）得た。続いて、本抽出物中の１１種のメトキシフラボン総含有量は実施例２の方法に準じて測定したところ、それぞれ２６４ｍｇ／ｇ、２６７ｍｇ／ｇであった。黒ショウガエタノール抽出物－１中のメトキシフラボン総量を５ｍｇ／ｍｌにメタノールにて調節して溶液を得て、その溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定したところ、０．９５（ブランクはメタノール）であった。尚、これらの抽出物は、いずれも、実施例１に記載の１１種のメトキシフラボンを全て含んでいた。
　[実施例８]
　（ＮＯＸ阻害活性測定のためのサンプル調製：黒ショウガ油脂抽出物の製造）
　黒ショウガ１０ｇ、２０ｇ、３０ｇ、４０ｇに、１０倍量のエタノールをそれぞれ加えて、１時間加熱還流抽出を行った。得られた液を冷却後、吸引ろ過し、その抽出液に中鎖脂肪酸トリグリセリド１５ｍＬを加え、減圧濃縮によりエタノールを留去したのち、不溶物を除く目的で再度吸引ろ過を行い、それぞれの黒ショウガ油脂抽出物を得た。得られた４つの黒ショウガ油脂抽出物について、実施例２に準じて１１種のメトキシフラボンの総含有量を分析したところ、その値は、それぞれ２３．９ｍｇ／ｍＬ、４６．３ｍｇ／ｍＬ、６９．４ｍｇ／ｍＬ、７８．１ｍｇ／ｍＬであった。また、総メトキシフラボン量を４６．３ｍｇ／ｍＬ以上を含む油脂抽出物は、室温で放置するとメトキシフラボン類の析出が確認された。尚、これらの抽出物は、いずれも、実施例１に記載の１１種のメトキシフラボンを全て含んでいた。
　[実施例９]
　（ＮＯＸ阻害活性を指標にした黒ショウガ抽出法の比較）
　実施例３に従い、総メトキシフラボン量２２．４ｍｇ／ｍｌの黒ショウガ油脂抽出物－１（実施例２で得られたもの）、総メトキシフラボン量６９．４ｍｇ／ｍｌの黒ショウガ油脂抽出物－２（実施例８で得られたもの）、エタノール抽出物(実施例７で得られた黒ショウガエタノール抽出物－１および２）のＮＯＸ阻害活性（分化したＨＬ－６０生細胞を用いたＮＯＸ阻害活性測定）を測定した。黒ショウガのロット間の活性の強さの違いを見るために２種の黒ショウガについて検討した。また油脂抽出物は、そのままでは活性を測定できなかったため、脱脂処理を行った。具体的には油脂抽出物０．５ｍLに同量のｎ－ヘキサン０．５ｍＬを加え希釈した後、０．５ｍＬの８０％メタノール水溶液にて３回メトキシフラボンの抽出を行った。得られた抽出液をＳｅｐ－Ｐａｋ　ＰＬＵＳ　Ｃ８　１２５Å　Ｃａｔｒｔｒｉｇｅｓ（ウォーターズ社製）に吸着させ、さらに８０％メタノール３．０ｍＬを通して油分を除いた。その後、Ｓｅｐ－Ｐａｋ　ＰＬＵＳ　Ｃ８　１２５Å　Ｃａｔｒｔｒｉｇｅｓを溶媒で洗浄して得られた液を減圧濃縮、凍結乾燥し、評価試料を調製した。測定されたＩＣ５０値を以下の表３に示す。
　以下に示すＩＣ５０値は、総メトキシフラボン量に基づくＮＯＸ阻害活性を示す。それらの値を比較したところ、いずれにおいても、エタノール抽出物より油脂抽出物の方が高い作用（低いＩＣ５０）を示した。このことから、本発明のように油脂で抽出することによって、ＮＯＸに対して阻害作用がより高いメトキシフラボンが効率的に抽出されていることが示唆された。
　[実施例１０]
　（ＮＦκＢ阻害作用）
　マクロファージ様のＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳ（リポ多糖）によって刺激すると、ＮＦκＢが活性化され、それによってｉＮＯＳ（誘導型ＮＯ合成酵素）の発現が亢進し、培養液中にｉＮＯＳ酵素活性に起因する亜硝酸が蓄積することが知られており、培養液中の亜硝酸量を測定することによりＮＦκＢ活性化を評価することが可能である。
　ＲＡＷ２６４．７細胞は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培養液において培養したものを用いた。得られた細胞を４×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように上記培養液に懸濁させ、９６ｗｅｌｌのマイクロプレートにｗｅｌｌあたり１００μｌずつ分注し、あらかじめ（ＣＯ２インキュベーターにて）２４ｈｒ培養した。これにｗｅｌｌあたり２５μｌの６μｇ／ｍｌ　ＬＰＳ含有培養液（ＬＰＳは大腸菌由来、終濃度は１μｇ／ｍｌ）および２５μlの所定濃度の被験標品溶液をそれぞれ添加し、さらに２４ｈｒ培養した後に、それぞれ７５μｌの細胞培養液を分取し、等量のＧｒｉｅｓｓ試薬（Ｆｌｕｋａ製）を添加することにより呈色反応を行い、亜硝酸の生成を５４０ｎｍの吸光度に基づいて測定した。被験サンプルのＮＦκＢ阻害活性の測定は、サンプルのＤＭＳＯ溶液を上記の培養液にＤＭＳＯ濃度として１%以下になるように溶解させた３倍希釈系列の溶液を用いて行い、刺激剤であるＬＰＳ無添加／添加条件における吸光度を測定した。ＬＰＳ刺激に起因した亜硝酸生成を５０％阻害した濃度、すなわちＩＣ５０値（μＭ）を、表４に示した。表４に示されているように、式（Ｉ）のメトキシフラボンは、優れたＮＦκＢ阻害作用を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　[実施例１１]
　（抽出方法と組成の関係）
　実施例９の結果に鑑み、黒ショウガからの油脂抽出物と親水性溶媒抽出物の組成を比較した。具体的には、実施例２、６及び８に準じて、油脂抽出（油脂のみでの抽出、又はエタノール抽出とそれに続く油脂抽出）を行い、実施例７に準じてエタノール抽出を行った。油脂抽出においては、油脂として、オリーブオイル、又はオリーブオイルと中鎖脂肪酸グリセリド（本実施例では、中鎖脂肪酸トリグリセリドが用いられ、これを「ＭＣＴ」とも示す）との混合物を用いた。得られた抽出物は、実施例２に記載の方法に基づいてＨＰＬＣで分析され、得られたＨＰＬＣ面積値を以下に示す。以下の表では、便宜上、油脂を単に「Ｏｉｌ」とも示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表５Ａ及び５Ｂに示されているように、油脂抽出物における、ＮＯＸ阻害活性やＮＦκＢ阻害活性の高いメトキシフラボンの割合、即ち、Ａ／（Ａ＋Ｂ）及びＡ’／（Ａ’＋Ｂ’）は、エタノール抽出物よりも高かった。このような組成の違いは、ＮＯＸ阻害活性やＮＦκＢ阻害活性に影響し得る。

Claims (15)

  1. 　以下の式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１、Ｒ４、及びＲ５は、各々独立して水素又はメトキシ基であり、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基である）で表される構造を有する少なくとも１種のメトキシフラボンを含む、ＮＯＸ阻害剤。
  2. 　前記少なくとも１種のメトキシフラボンが、５，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、３，５，７，３’，４’－ペンタメトキシフラボン、５，７－ジメトキシフラボン、及び５，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ａから選択される、請求項１に記載のＮＯＸ阻害剤。
  3. 　群Ａのメトキシフラボンと、３，５，７－トリメトキシフラボン、３，５，７，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７－メトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７，４’－ジメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７－ジメトキシフラボン、及び５－ヒドロキシ－３，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ｂのメトキシフラボンとの総含有量に対する、群Ａのメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ／（Ａ＋Ｂ））が、モル基準で０．６５を超える、請求項２に記載のＮＯＸ阻害剤。
  4. 　請求項１又は２に記載された少なくとも１種のメトキシフラボンを含む、ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療剤。
  5. 　アレルギー疾患、パーキンソン病、脳梗塞、白内障、てんかん、脊髄損傷、動脈硬化、未熟児網膜症、腎障害、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、肺気腫、慢性関節リウマチなどの膠原病、血管炎、浮腫、糖尿病合併症、紫外線障害、高山病、ポルフィリン血症、熱傷、凍傷、接触性皮膚炎、ショック、多臓器不全、ＤＩＣ、癌、老化、疲労、サルコぺニア（筋力低下）、ミトコンドリア機能障害、認知症、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項４に記載の予防又は治療剤。
  6. 　請求項２に記載の群Ａのメトキシフラボンと、請求項３に記載の群Ｂのメトキシフラボンとの総含有量に対する、群Ａのメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ／（Ａ＋Ｂ））が、モル基準で０．６５を超える、請求項４又は５に記載の予防又は治療剤。
  7. 　以下の式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１、Ｒ４、及びＲ５は、各々独立して水素又はメトキシ基であり、Ｒ２及びＲ３は、メトキシ基である）で表される構造を有する少なくとも１種のメトキシフラボンを含む、ＮＦκＢ阻害剤。
  8. 　前記少なくとも１種のメトキシフラボンが、５，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５，７－ジメトキシフラボン、及び５，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ａ’から選択される、請求項７に記載のＮＦκＢ阻害剤。
  9. 　群Ａ’のメトキシフラボンと、３，５，７，３’，４’－ペンタメトキシフラボン、３，５，７－トリメトキシフラボン、３，５，７，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７，３’，４’－テトラメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７－メトキシフラボン、５－ヒドロキシ－７，４’－ジメトキシフラボン、５－ヒドロキシ－３，７－ジメトキシフラボン、及び５－ヒドロキシ－３，７，４’－トリメトキシフラボンからなる群Ｂ’のメトキシフラボンとの総含有量に対する、群Ａ’のメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ’／（Ａ’＋Ｂ’））が、モル基準で０．４８を超える、請求項８に記載のＮＦκＢ阻害剤。
  10. 　請求項７又は８に記載された少なくとも１種のメトキシフラボンを含む、ＮＦκＢに起因する疾患の予防又は治療剤。
  11. 　前記疾患が、関節リウマチ、炎症性大腸炎、変形性関節症、骨溶解症、腱炎、坐骨神経痛、椎間板ヘルニア、狭窄症、脊髄症、腰痛、椎間関節痛、手根管症候群、足根管症候群、腰椎術後疼痛症候群、エイズ、動脈硬化、喘息、関節炎、糖尿病、炎症性大腸炎、肝炎、脳卒中、認知症、筋消耗、ウイルス感染、光老化を含めた皮膚老化、がん、及び老化からなる群から選択される、請求項１０に記載の予防又は治療剤。
  12. 　請求項８に記載の群Ａ’のメトキシフラボンと、請求項９に記載の群Ｂ’のメトキシフラボンとの総含有量に対する、群Ａ’のメトキシフラボンの総含有量の割合（Ａ’／（Ａ’＋Ｂ’））が、モル基準で０．４８を超える、請求項１０又は１１に記載の予防又は治療剤。
  13. 　３’，４’－ジメトキシフラボンを含む、ＮＯＸ阻害剤。
  14. 　３’，４’－ジメトキシフラボンを含む、ＮＯＸに起因する疾患の予防又は治療剤。
  15. 　前記疾患が、アレルギー疾患、パーキンソン病、脳梗塞、白内障、てんかん、脊髄損傷、動脈硬化、未熟児網膜症、腎障害、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、肺気腫、慢性関節リウマチなどの膠原病、血管炎、浮腫、糖尿病合併症、紫外線障害、高山病、ポルフィリン血症、熱傷、凍傷、接触性皮膚炎、ショック、多臓器不全、ＤＩＣ、癌、老化、疲労、サルコぺニア（筋力低下）、ミトコンドリア機能障害、認知症、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項１４に記載の予防又は治療剤。
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