JP2007314468A

JP2007314468A - 小胞体ストレス制御化合物とそれを有効成分とする医薬組成物

Info

Publication number: JP2007314468A
Application number: JP2006145935A
Authority: JP
Inventors: Osamu Hori; 修堀; Satoshi Ogawa; 智小川; Munekazu Iinuma; 宗和飯沼; Masashi Yamada; 昌司山田; Hirohito Suzuki; 啓仁鈴木; Rika Murakami; 里香村上
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd; Kanazawa University NUC
Current assignee: Kanazawa University NUC; Meiji Dairies Corp
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2006-05-25
Publication date: 2007-12-06
Also published as: WO2007139036A1

Abstract

【課題】小胞体ストレス制御化合物を提供する。
【解決手段】下記一般式Ｉにて表される小胞体ストレス制御化合物。

【選択図】なし

Description

本発明は、小胞体ストレス制御物質に関し、特に小胞体ストレス由来の細胞死抑制効果を有する化合物とそれを有効成分とする医薬組成物に関する。

近年、加齢に伴いヒトの体内で起こる変化、或いは癌・心疾患・脳卒中（いわゆる３大疾病）に代表される多くの疾患の発症過程で、細胞内ストレスが重要な役割を担っている事が明らかになってきている。細胞内に存在する小器官のうち、呼吸を司るミトコンドリアの機能障害が細胞死に結びつくことは以前より言われてきた。しかし、最近になって、分泌系蛋白質の生合成の場である小胞体に障害が起こった場合も、ストレスに対して応答が出来ずに、小胞体の機能障害や細胞死を引き起こすことが明らかになってきた（非特許文献１及び２）。

小胞体は、分泌系蛋白質や膜蛋白質が規則正しく折りたたまれ、その立体構造を整える場であるとともに、細胞内カルシウムの貯蔵庫として、また脂質代謝の主要器官として、多岐にわたる生理作用を有している。しかし、虚血、低酸素、熱ショック、遺伝子変異などの物理化学的ストレスにより、小胞体内に正常な折りたたみ構造を持たない蛋白質（ｕｎｆｏｌｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）が増加してしまい、小胞体の機能障害を引き起こすことが知られている（小胞体ストレス、非特許文献１参照）。これに対抗するために小胞体においては、その内部にある分子シャペロン等を増加することで蓄積された蛋白質を保護したり、流入蛋白質を減らして負荷を軽減させたり、蛋白質を分解することで対応している。しかしそれにもかかわらずこの強い小胞体ストレスの状態が継続してしまうと、細胞がストレスに抵抗しきれず、自ら細胞死（アポトーシス）を選択することが明らかになってきている（小胞体ストレス由来細胞死、非特許文献２参照）。

このような小胞体ストレス・小胞体ストレス由来細胞死は、脳虚血あるいはアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病のような神経変性疾患、多発性硬化症などの炎症性神経疾患、躁鬱病などの精神疾患、緑内障などの眼疾患、動脈硬化や虚血性心疾患、胃潰瘍、ウイルス性肝炎、脂肪肝、糖尿病、糖尿病合併症、糸球体腎炎や腎不全などの腎疾患、癌等、様々な疾患の発症・病態進行に関与していることが指摘されている。

その為に、これらの小胞体ストレスを抑制・制御することにより小胞体ストレス由来の細胞死を制御する為のシステムの開発が進んでいる。

例えば、特許文献１（特開２００５−２４７７２８号公報）においては、特定構造を有するジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（脂肪酸として２つのリノール酸を含む）が、細胞死誘導抑制活性、特に小胞体ストレス抑制活性を有することが示され、これを有効成分として含有する医薬組成物が提案されている。

また特許文献２（特開２００５−０８２５５７号公報）においては、ある特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドが小胞体ストレス誘導性の細胞死抑制作用を有することが示されている。

また特許文献３（特開２００３−２１２７９０号公報）においては、ヤマブシダケ由来の脂溶性抽出成分が小胞体ストレス誘導性の細胞死抑制作用を有することが示されている。

さらに本発明者等は、これら小胞体ストレス・小胞体ストレス由来細胞死を制御することによる新たな創薬及び機能性食品の開発を目的として、Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞を用いた評価系を見出し提案した（特許文献４参照）。Ｈｅｒｐは小胞体におけるユビキチン様ドメインを持つ遺伝子で、小胞体内に蓄積した不要なタンパクの除去に関連していると考えられている。

モリ（Ｍｏｒｉ，Ｋ．），Ｃｅｌｌ．，２０００年，第１０１巻，：ｐ．４５１−４５４オヤドマリ等（Ｏｙａｄｏｍａｒｉ，Ｓ，ａｎｄＭ．Ｍｏｒｉ），ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ．，２００４年，第１１巻，ｐ．３８１−３８９特開２００５−２４７７２８号公報特開２００５−０８２５５７号公報特開２００３−２１２７９０号公報特開２００５−２４５２４７号公報

しかし、いずれの特許文献に開示されているシステムや化合物等についても未だ十分な小胞体ストレス制御に対する効果を得ることが出来ていないのが現状である。したがって、より効果が高く且つ簡便に入手可能な化合物の開発が期待されている。

上記の従来技術における現状を踏まえ、本発明者等はまず予備実験の結果から、小胞体からのＣａ⁺⁺流出を抑制するダントロレンや、α−トコフェロールやβ−カロテン等の一部の抗酸化剤にも同細胞に於ける小胞体ストレス由来細胞死を抑制する効果を認めたため、これらの化合物をポジティブコントロールとして、スクリーニングを行った（１次スクリーニング）。その結果、一部のカルコン系化合物及びフラボノイド系化合物に小胞体ストレス由来細胞死抑制効果を認めた。これにより本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば、ある特定構造を有するメトキシカルコン、メトキシフラボノイド及びフラボン系化合物を提供することで、上記課題を解決することが可能となった。
本発明のある態様によれば、下記一般式Ｉにて表される小胞体ストレス制御化合物を提供する。

（上記一般式Ｉにおいて、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈は、水素原子、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等のアルコキシ基、フェノキシ基等のアリールオキシ基、アセチルオキシ基などのアシルオキシ基、ベンジルオキシ基等から選ばれる、それぞれ同一または異なる置換基である。）

上記一般式Ｉにおいて、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈のうち、少なくとも３以上の置換基がアルコキシ基であることが好ましく、またアルコキシ基としては特にメトキシ基であることが好ましい。

また、本発明により、特に下記構造式１にて示される化合物が提供される。

（上記式においてＢｚｌはベンジル基を示す。）

また、本発明により、特に下記構造式２にて示される化合物が提供される。

（上記式においてＢｚｌはベンジル基を示す。）

本発明の別の態様によれば、下記一般式ＩＩにて表される小胞体ストレス制御化合物を提供する。

（上記一般式ＩＩにおいて、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄は、水素原子、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等のアルコキシ基、フェノキシ基等のアリールオキシ基、アセチルオキシ基などのアシルオキシ基、ベンジルオキシ基等から選ばれる、それぞれ同一または異なる置換基である。）

上記一般式ＩＩにおいて、前記Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄のうち、少なくとも４以上の置換基がアルコキシ基であることが好ましく、またアルコキシ基としては特にメトキシ基であることが好ましい。

さらに、上記一般式ＩＩにおいて、前記Ｒ₉およびＲ₁₄がアルコキシ基であることが好ましく、またアルコキシ基としては特にメトキシ基であることが好ましい。

また本発明により、特に下記構造式３にて示される化合物が提供される。

（上記式においてＡｃはアセチル基を示す。）

また本発明により、特に下記構造式４にて示される小胞体ストレス制御化合物が提供される。小胞体ストレス制御作用としては、特に神経保護作用及び／又は腎臓尿細管保護作用を得ることが出来る。

本発明のさらに別の態様によれば、上記したいずれかの化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物が提供される。

本発明によれば、ある特定構造を有するメトキシカルコン、メトキシフラボノイド及びフラボン系化合物に基づく小胞体ストレス制御化合物を提供することで、従来不十分であった小胞体ストレス制御について、高い効果を簡便に提供することが出来る。

また本発明による小胞体ストレス制御化合物は、植物由来あるいはその誘導体などであることから、簡便に入手可能であり、高い工業性も達成しうる。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。

本発明の小胞体ストレス制御化合物は、特に小胞体ストレス由来細胞死抑制効果を有するメトキシカルコン、メトキシフラボノイド及びフラボン系化合物である。

また本発明の小胞体ストレス制御化合物は、特に下記一般式Ｉにて表されるカルコン系化合物である。

上記一般式Ｉにおいて、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈は、水素原子、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等のアルコキシ基、フェノキシ基等のアリールオキシ基、アセチルオキシ基などのアシルオキシ基、ベンジルオキシ基等から選ばれる、それぞれ同一または異なる置換基であることが好ましい。

上記一般式Ｉにおいては、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈のうち、少なくとも３以上の置換基がアルコキシ基であることが好ましく、この場合メトキシ基であることが特に好ましい。

また、好ましくは本発明の小胞体ストレス制御化合物は、下記構造式１にて示される化合物が挙げられる。

（上記式においてＢｚｌはベンジル基を示す。）

また、好ましくは本発明の小胞体ストレス制御化合物は、下記構造式２にて示される化合物が挙げられる。

（上記式においてＢｚｌはベンジル基を示す。）

また本発明の小胞体ストレス制御化合物は、特に下記一般式ＩＩにて表されるメトキシフラボノイド系化合物である。

上記一般式ＩＩにおいて、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄は、水素原子、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等のアルコキシ基、フェノキシ基等のアリールオキシ基、アセチルオキシ基などのアシルオキシ基、ベンジルオキシ基等から選ばれる、それぞれ同一または異なる置換基であることが好ましい。

上記一般式ＩＩにおいては、前記Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄のうち、少なくとも４以上の置換基がアルコキシ基であることが好ましく、この場合にはメトキシ基であることが特に好ましい。

また特に上記一般式ＩＩにおいては、前記Ｒ₉およびＲ₁₄がアルコキシ基であることが好ましく、この場合にはメトキシ基であることが特に好ましい。

また、好ましくは本発明の小胞体ストレス制御化合物は、下記構造式３にて示される化合物が挙げられる。

（上記式においてＡｃはアセチル基を示す。）

また、好ましくは本発明の小胞体ストレス制御化合物は、下記構造式４にて示される化合物が挙げられる。この化合物による小胞体ストレス制御作用としては、特に神経保護作用及び／又は腎臓尿細管保護作用を得ることが出来る。

本発明の上記一般式ＩまたはＩＩ、構造式１〜４にて示される小胞体ストレス制御化合物の製造方法は特に特定されず、一般的な化学合成によって得ることが出来る。また天然物由来（例えば植物由来）の化合物及び／またはその誘導体として得ることもできる。

本発明の小胞体ストレス制御化合物を有効成分とする医薬組成物の投与量は、投与経路、ヒトを含む投与対象動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜設定することができる。本発明はこれに限定されないが、好ましくは、有効成分として０．００１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが適当である。
また本発明の小胞体ストレス制御化合物を有効成分とする医薬組成物は、経口投与又は非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、坐薬、経皮等）のいずれでも投与できる。

本発明による小胞体ストレス制御化合物を有効成分とする医薬組成物の投与形態としては、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、溶液、シロップ剤、乳液等による経口投与をあげることができるが、他の形態や投与経路であってもよい。これらの各種製剤は、常法に従って主薬である本発明の小胞体ストレス制御化合物を有効成分とする医薬組成物に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。

本発明の小胞体ストレス制御化合物を有効成分とする医薬組成物の量は、その目的、用途（食品組成物、予防剤、治療剤等の医薬品組成物）に応じて任意に定めることができ、本発明はこれに限定されないが、その含量としては、全体量に対して通常、０．００１〜１００％（ｗ／ｗ）、特に０．１〜１００％（ｗ／ｗ）が好ましい。

以下、本発明について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

ａ）１次スクリーニング（Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞）
ホリ等の文献（ＨｏｒｉＯ，ｅｔ．ａｌ，ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ．，２００４年，第９巻（５），ｐ．４５７−４６９）及び上記特許文献４に記された方法に基づいて、Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞の作製及び培養を行った。

次に予備実験として、ダントロレン、α−トコフェロール及びβ−カロテンの、Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞に於ける小胞体ストレス由来細胞死抑制効果を判定し、それらがポジティブコントロールとして使用できることを確認した。以下の実施例では、Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞における小胞体ストレス由来細胞死抑制効果のポジティブコントロールとして、ダントロレンは３０μＭ，α―トコフェロールは１２０μＭ，及びβ−カロテンは１００μＭの濃度で用いた。

本実験としては、主として天然物を中心に、Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞に於ける、小胞体ストレス由来細胞死抑制効果を測定した。
具体的には、以下のプロトコールで進めた。
１）９６穴、或いは２４穴培養皿をゼラチンコートした後、野生型Ｆ９細胞及びＨｅｒｐ欠損Ｆ９細胞を播種する。
２）２日間、細胞が培養面積の５０−６０％を占めるまで培養を行う（ＤＭＥＭ培地＋２０％ＦＢＳ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
３）上記細胞に、ツニカマイシン０．８μｇ／ｍＬと被験物質を同時に加えて４８時間培養した後、細胞生存率をｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇ−８ａｓｓａｙ（生存細胞数を評価する方法：同仁化学研究所、熊本）にて評価する。

ｂ）２次スクリーニング（ＭＩＮ６細胞、ＰＣ１２細胞）
１次スクリーニングの結果、ダントロレン以上の細胞保護効果を認めた化合物について、マウス・インスリン産生細胞株（ＭＩＮ６）細胞及びラット神経系細胞株ＰＣ１２細胞を用いて、同様の小胞体ストレス由来細胞死抑制効果、及び酸化ストレス由来細胞死抑制効果を測定した。

小胞体ストレス誘導方法としてはツニカマイシン（Ｔｍ：１．５μｇ／ｍＬ（ＭＩＮ６細胞），０．７５μｇ／ｍＬ（ＰＣ１２細胞）、４８時間）を用い、酸化ストレス誘導方法としてはＨ₂Ｏ₂（６６μＭ，２４時間）を用いた。前者において、被験化合物はツニカマイシンと同時投与、後者においてはＨ₂Ｏ₂投与の２４時間前からの前投与及びＨ₂Ｏ₂投与と同時投与の条件で行った。細胞生存率の判定は、ＭＴＴアッセイより行った（ホリ等（ＨｏｒｉＯ，ｅｔ．ａｌ），ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ．，２００４年，第９巻（５），ｐ．４５７−４６９を参照）。また、酸化ストレスのポジティブコントロールとして知られているＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（１０００μＭ）も合わせて用いた。

ｃ）小胞体ストレスに対する、作用メカニズムの解析
２次スクリーニングの結果、ダントロレン以上の細胞保護効果を認めた化合物を用いて、その作用メカニズムについて、以下の方法により検討した。
１）細胞内蛋白質合成量の変化：ＭＩＮ６細胞を、被験化合物存在下で２４時間培養し、その後³⁵Ｓ−Ｍｅｔ（アマルシャムファルマシアバイオテック社製）で３時間メタボリックラベリングを行い、抽出した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより判定する。
２）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２α（ｅＩＦ２α）のリン酸化：ＭＩＮ６細胞を、被験化合物存在下で０−４８時間培養し、蛋白質抽出を行った後、ウェスタンブロット法を用いて判定する。抗体は、ａｎｔｉ−Ｐ−ｅＩＦ２α ａｎｔｉｂｏｄｙ（セルシグナリングテクノロジー社製），ａｎｔｉ−ｅＩＦ２α ａｎｔｉｂｏｄｙ（セルシグナリングテクノロジー社製），ａｎｔｉ−β ａｃｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ（シグマ社製）を使用する。
３）ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット法による、小胞体ストレス関連遺伝子の発現：ＭＩＮ６細胞を、被験化合物存在下で２４時間培養し、細胞内よりＲＮＡを抽出する。さらに、ｃＤＮＡ合成を行い（タカラバイオ株式会社）、ＸＢＰ１特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行う（シャンＪラーマン（ＳｈａｎｇＪ，ＬｅｈｒｍａｎＭＡ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４年４月３０日，第３１７巻（２），ｐ．３９０−３９６参照）。また、ｈｅｍｅ−ｏｘｙｇｅｎａｓｅ１（ＨＯ−１），ＧＲＰ７８，ＣＨＯＰ，β−ａｃｔｉｎ特異的なプローブを用いて、ノーザンブロットを行う（ホリ等（ＨｏｒｉＯ，ｅｔ．ａｌ），ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ．，２００４年，第９巻（５），ｐ．４５７−４６９を参照）。

ｄ）３次スクリーニング（マウス小胞体ストレスモデル）
マウス腹腔内にツニカマイシン（１ｍｇ／ｋｇ）を投与すると、投与後数時間より腎臓の（近位）尿細管細胞で小胞体ストレスが誘導され、投与後３−４日には、同部位において小胞体ストレス由来細胞死が引き起こされることが知られている（例えば以下ジンツナー等の文献参照：Ｚｉｎｓｚｎｅｒｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．，１９９８年，第１２巻：ｐ．９８２−９９５）。本発明においては、この系を利用して、以下のようにｉｎｖｉｖｏにおける被験物質（ＩＮ１９）の細胞保護効果を判定した。まず、被験物質（ＩＮ１９）をツニカマイシン投与４日前からマウス腹腔内に連日投与し（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙにて４日間）、その後、ツニカマイシン（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。ツニカマイシン投与後４日目に、マウスの潅流固定、腎臓の摘出、パラフィン包埋を行い、５μｍ厚で腎臓切片を作製した。作製した切片で、腎臓組織の状態をＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色により、また腎臓尿細管における細胞死の程度をＴＵＮＥＬアッセイ（ＡｐｏｐＴａｇＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＤｉｒｅｃｔＩｎＳｉｔｕＡｐｏｐｔｏｓｉｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）により比較検討した。

［結果］
図１及び図２には、上記一般式Ｉにおける置換基を表のように変化させた複数のカルコン系化合物の効果を示した。図からも分かるように、Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞を用いた評価系で、いくつかのカルコン系化合物に非常に強い細胞死抑制効果を認めた。なお図１の表において、−は細胞死抑制効果無し、＋＋はダントロレンの細胞死抑制効果と同程度である事を示す。これらの結果より、本発明による上記一般式Ｉで示される小胞体ストレス制御化合物としてのカルコン系化合物における置換基の数や位置に関しては、１分子あたり少なくとも３つ以上のメトキシ基が存在することが重要であることが分かった。

図３及び図４には、上記一般式ＩＩにおける置換基を表のように変化させた複数のメトキシフラボノイド系化合物の効果を示した。図からも分かるように、Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞を用いた１次スクリーニングで、図３の表に示すような構造を有する化合物の中でいくつかのメトキシフラボノイド系化合物に非常に強い細胞死抑制効果が認められた。なお図３の表において、−は細胞死抑制効果無し、＋＋はダントロレンの細胞死抑制効果と同程度である事を示す。
メトキシフラボノイド系化合物の中でも特に、ＩＮ１９（ｔａｎｇｅｒｅｔｉｎ），ＩＮ６９（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ），ＩＮ７２，ＩＮ８８（ｓｉｎｅｎｓｅｔｉｎ）、さらにフラボンにおいて強い細胞死抑制効果が認められた（＋＋＋）。

次に、１次スクリーニングにおいて＋＋＋の細胞死抑制効果を認めた化合物について、インスリン産生細胞株であるＭＩＮ６細胞を用いて、上記に記載した方法により２次スクリーニングを行った（図５（サマリー）、図６及び７参照）。
図６においては、Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞と同様に、ＭＩＮ６細胞において小胞体ストレス・小胞体ストレス由来細胞死抑制効果を有するかどうかについての結果を示した。また図７では、被験化合物が酸化ストレス由来細胞死抑制効果を併せ持つか否かについて検討した結果を示した。なお、図５の表において、ツニカマイシン（Ｔｍ）欄に於ける−は細胞死抑制効果無し、＋はダントロレンの細胞死抑制効果と同程度の効果を有する事を示す。Ｈ₂Ｏ₂欄に於ける−は細胞死抑制効果無し、＋はα−トコフェロールやβ−カロテンの細胞死抑制効果と同程度の効果を有する事を示す。なお、Ｎ−アセチルシステインの細胞死抑制効果は＋＋＋である。

その結果、上記の５種化合物のいずれにおいてもダントロレン以上の小胞体ストレス由来細胞死抑制効果が認められた。酸化ストレス由来細胞死抑制効果については、ＩＮ１９（ｔａｎｇｅｒｅｔｉｎ）、ＩＮ８８（ｓｉｎｅｎｓｅｔｉｎ）及びフラボンにおいてはα−トコフェロールやβ−カロテンと同程度の効果が認められたが、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の作用に比べると効果はやや小さかった。更に、ＩＮ６９（ｎｏｂｏｌｅｔｉｎ）においては軽度のレベルで認められるのみ（±）であり、ＩＮ７２において効果は認められなかった（−）。

これらのことから、上記の５種化合物の小胞体ストレス由来細胞死抑制効果は、抗酸化作用とは異なるメカニズムにより起こっている可能性が示唆された。

実際に、ＭＩＮ６細胞にＩＮ１９を加えて２４時間以上インキュベートすると、細胞内蛋白質合成が約６０％まで低下し（図８のＡ参照）、小胞体ストレス応答の一つである、ｅＩＦ２αのリン酸化（１）が亢進していた（図８のＢＩ参照）。また、ｅＩＦ２αのリン酸化により、その発現が誘導される事が知られている下流遺伝子群のうち、ｈｅｍｅ−ｏｘｙｇｅｎａｓｅ１（ＨＯ−１）やＣＨＯＰの発現も増加していた（図８のＣ参照）。

逆に、その他の小胞体ストレス応答経路のうちＸＢＰ１の活性化は、ＩＮ１９を投与することにより、低下していた（図８のＢＩＩにおいて、上のバンドが非活性型、下のバンドが活性型ＸＢＰ１を示す）。そして、その下流遺伝子ＧＲＰ７８の発現は少なくとも増加していなかった。これらのことより、ＩＮ１９はｅＩＦ２αのリン酸化の系路を選択的に活性化し、小胞体ストレスを軽減する事により、小胞体ストレス由来細胞死を抑制していることが示唆された。
また、ＩＮ１９の小胞体ストレス由来細胞死抑制効果は、神経系細胞株ＰＣ１２細胞でも同様に認められた（図９）。

次に、小胞体ストレスに対するメトキシフラボノイドの細胞保護効果をｉｎｖｉｖｏモデルにて検討した。マウスにツニカマイシン（１ｍｇ／ｋｇ）を投与すると、投与後数時間より腎臓の（近位）尿細管細胞で小胞体ストレスが誘導され、投与後３−４日には、同部位において小胞体ストレス由来細胞死が引き起こされる（図１０のＢ及びＥ、また例えばジンツナー等の文献参照：Ｚｉｎｓｚｎｅｒｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．，１９９８年，第１２巻：ｐ．９８２−９９５）。この時、あらかじめＩＮ１９をツニカマイシン投与４日前からマウス腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙにて４日間、連日投与しておくと、腎臓尿細管での組織障害及び細胞死は、ほぼ完全に抑制された（図１０のＣ及びＦ）。この事から、メトキシフラボノイドの小胞体ストレス制御効果・小胞体ストレス由来細胞死抑制効果はｉｎｖｉｖｏにおいても認められることが明らかになった。

メトキシフラボノイド系化合物は柑橘類の果皮に多く含まれ、これまでに、腫瘍転移抑制効果、腫瘍細胞増殖抑制効果、コレステロール低下作用、動脈硬化抑制作用（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）、抗真菌作用、抗肝炎ウイルス作用（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）、ラットＰａｒｋｉｎｓｏｎ病モデル（ｔａｎｇｅｒｅｔｉｎ）やその他のモデル（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）に於ける神経保護作用、抗炎症作用（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）、メラニン減少作用（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）、紫外線保護作用（ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）等のような生理活性が報告されている。

今回の結果から、メトキシカルコン、メトキシフラボノイド及びフラボン系化合物に強力な小胞体ストレス制御作用・小胞体ストレス由来細胞死抑制作用が存在する事が判明した。興味深いことに、その作用メカニズムとして考えられる、ｅＩＦ２αのリン酸化（活性化）が恒常的に起こった場合、ＣＨＯＰ遺伝子の発現誘導や細胞内蛋白合成抑制を介して、細胞増殖抑制、或いは細胞死（アポトーシス）を引き起こすことがすでに明らかにされている（非特許文献２）。この事から、メトキシフラボノイド系化合物の上記生理作用のうち、少なくとも腫瘍細胞増殖抑制効果において、やはりｅＩＦ２αのリン酸化（活性化）が大きな役割を担っている可能性があることを示唆している。また、抗真菌作用、抗肝炎ウイルス作用、抗炎症作用などその他の生理作用についても、ｅＩＦ２αのリン酸化を介した、小胞体ストレス制御により行われている可能性が十分考えられる。

本発明による特定のメトキシカルコン、メトキシフラボノイド及びフラボン系化合物に基づく小胞体ストレス制御化合物は、従来不十分であった小胞体ストレス制御について、高い効果を簡便に提供することが出来る。また本発明による小胞体ストレス制御化合物は、植物由来あるいはその誘導体などであることから、簡便に入手可能であり、高い工業性も達成しうる。

Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞を用いた１次スクリーニングにおけるカルコン系化合物の細胞死抑制効果を示した表である。表中の−は細胞死抑制効果無し、＋＋はダントロレンの細胞死抑制効果と同程度、＋はその中間程度の抑制効果を有する事を示す。Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞を用いた１次スクリーニングにおけるカルコン系化合物の細胞死抑制効果を平均±標準偏差で示したグラフ図である。グラフ図中の−はツニカマイシン０．８μｇ／ｍＬ非添加、＋はツニカマイシン０．８μｇ／ｍＬ添加である事を示す。Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞を用いた１次スクリーニングにおけるメトキシフラボノイド及びフラボン系化合物の細胞死抑制効果を示した表である。表中の−は細胞死抑制効果無し、＋＋はダントロレンの細胞死抑制効果と同程度、＋はその中間程度の抑制効果有り、＋＋＋はダントロレンの細胞死抑制効果以上の効果を有する事を示す。Ｆ９Ｈｅｒｐ欠損細胞を用いた１次スクリーニングにおけるメトキシフラボノイド及びフラボン系化合物の細胞死抑制効果を平均±標準偏差で示したグラフ図である。グラフ図中の−はツニカマイシン０．８μｇ／ｍＬ非添加、＋はツニカマイシン０．８μｇ／ｍＬ添加である事を示す。ＭＩＮ６細胞を用いた２次スクリーニングにおけるメトキシフラボノイド及びフラボン系化合物の細胞死抑制効果を示した表である。表において、ツニカマイシン（Ｔｍ）欄に於ける＋＋はダントロレンの細胞死抑制効果以上の効果を有する事を示す。Ｈ₂Ｏ₂欄に於いて、−は細胞死抑制効果無し、＋はα−トコフェロールやβ−カロテンの細胞死抑制効果と同程度の効果、±はその中間程度の抑制効果を有する事を示す。ＭＩＮ６細胞を用いた２次スクリーニングにおけるメトキシフラボノイド及びフラボン系化合物の小胞体ストレス（ツニカマイシンにて誘導）細胞死抑制効果を平均±標準偏差で示したグラフ図である。ＭＩＮ６細胞を用いた２次スクリーニングにおけるメトキシフラボノイド及びフラボン系化合物の酸化ストレス細胞死抑制効果を平均±標準偏差で示したグラフ図である。ＭＩＮ６細胞を用いた小胞体ストレス由来細胞死抑制に関するＩＮ１９化合物の効果を示し、Ａはメタボリックラベリングの結果を、Ｂはウェスタンブロット法による結果を、Ｃはノーザンブロット法による結果を示す。図中Ｔｍはツニカマイシンを示す。ＡＩＩは平均±標準偏差。神経系細胞ＰＣ１２細胞を用いたメトキシフラボノイド系化合物（ＩＮ１９）の小胞体ストレス（ツニカマイシンにて誘導）細胞死抑制効果を平均±標準偏差で示したグラフ図である。ＰＣ１２細胞を用いたＩＮ１９の小胞体ストレス（ツニカマイシンにて誘導）細胞死抑制効果を示す写真であり、マウス腎臓尿細管の組織状態を示す。

Claims

下記一般式Ｉにて表される小胞体ストレス制御化合物。

（上記一般式Ｉにおいて、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈は、水素原子、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等のアルコキシ基、フェノキシ基等のアリールオキシ基、アセチルオキシ基などのアシルオキシ基、ベンジルオキシ基等から選ばれる、それぞれ同一または異なる置換基である。）
前記Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈のうち、少なくとも３以上の置換基がアルコキシ基であることを特徴とする請求項１に記載の小胞体ストレス制御化合物。
前記アルコキシ基がメトキシ基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の小胞体ストレス制御化合物。
下記構造式１にて示される化合物。

（上記式においてＢｚｌはベンジル基を示す。）
下記構造式２にて示される化合物。

（上記式においてＢｚｌはベンジル基を示す。）
下記一般式ＩＩにて表される小胞体ストレス制御化合物。

（上記一般式ＩＩにおいて、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄は、水素原子、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子、水酸基、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等のアルコキシ基、フェノキシ基等のアリールオキシ基、アセチルオキシ基などのアシルオキシ基、ベンジルオキシ基等から選ばれる、それぞれ同一または異なる置換基である。）
前記Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃、Ｒ₁₄のうち、少なくとも４以上の置換基がアルコキシ基であることを特徴とする請求項６に記載の小胞体ストレス制御化合物。
前記アルコキシ基がメトキシ基であることを特徴とする請求項６又は７に記載の小胞体ストレス制御化合物。
前記Ｒ₉およびＲ₁₄がアルコキシ基であることを特徴とする請求項６に記載の小胞体ストレス制御化合物。
前記アルコキシ基がメトキシ基であることを特徴とする請求項９に記載の小胞体ストレス制御化合物。
下記構造式３にて示される化合物。

（上記式においてＡｃはアセチル基を示す。）
下記構造式４にて示される小胞体ストレス制御化合物。
小胞体ストレス制御作用が神経保護作用及び／又は腎臓尿細管保護作用であることを特徴とする請求項１２に記載の小胞体ストレス制御化合物。
少なくとも請求項１から１２のいずれかに記載の化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物。