WO2015125820A1 - ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用 - Google Patents

ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用 Download PDF

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WO2015125820A1
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暁 杉山
土居　洋文
児玉　龍彦
井上　豪
栄一 溝端
達矢 川戸
友洋 飯塚
金井　求
洋平 清水
典明 高須
まり 高津
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サヴィッド・セラピューティックス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a compound composed of a dimer of a biotin variant, a streptavidin mutant, and use thereof.
  • the avidin / streptavidin-biotin interaction is widely applied in the fields of biochemistry, molecular biology, and medicine (Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67).
  • Avidin is a basic glycoprotein derived from egg white and has an isoelectric point of more than 10.
  • streptavidin is derived from Streptomyces avidinii, has an isoelectric point near neutral and does not contain sugar chains. Both proteins form a tetramer and bind to one molecule of biotin per subunit.
  • the molecular weight is about 60 kDa.
  • the above-mentioned low immunogenic streptavidin has a characteristic that immunogenicity to the human body is reduced, but it has an affinity for biotin inherent in the human body, so it is not suitable for diagnostic applications. There is a concern that the ground will be high and that there may be a possibility that the drug effect cannot be exhibited specifically in the case of therapeutic use. Therefore, the present invention provides a streptavidin variant with reduced affinity for natural biotin, and further provides a biotin variant having a high affinity for the low affinity streptavidin variant for natural biotin. This was a problem to be solved.
  • the present invention provides a diagnostic agent / therapeutic agent using a combination of the above streptavidin variant and a biotin variant, and a diagnostic kit / therapeutic kit using a combination of the above streptavidin variant and a biotin variant.
  • the present inventor has intensively studied in order to solve the above-mentioned problems, and further introduces a predetermined amino acid mutation into the low immunogenic streptavidin mutant described in International Publication WO 2010/095455, whereby affinity for natural biotin is obtained.
  • a biotin-modified dimer compound in which a part of the biotin structure was modified was synthesized.
  • a combination having an affinity was found, and the present invention was completed.
  • a compound represented by the following formula (1) (Wherein, X1a, X1b, X2a and X2b represents O or NH are each independently, Y 1 and Y 2 is each independently C or S, Z 1 and Z 2 each independently represent O, S or NH V 1 and V 2 each independently represent S or S + —O ⁇ , n1 and n2 each independently represent an integer of 0 or 1, m1 and m2 each independently represents an integer of 1 to 10 L represents a linking group.
  • L is -CONH-, -NHCO-, -O-, an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, an optionally substituted phenylene group, or a combination thereof, [1] or The compound according to [2].
  • L is —CONH— (CH 2 ) p —CONH— (CH 2 ) q —O— (CH 2 ) r —NHCO— (CH 2 ) s —NH—CO—, —CONH— (CH 2 P -CONH- (CH 2 ) q -NHCO- (CH 2 ) s -NH-CO-, -CONH- (CH 2 ) p -CONH- (phenylene group optionally having substituent) -NHCO — (CH 2 ) s —NH—CO—, —CONH—CH (COOCH 3 ) — (CH 2 ) p —NHCO— (optionally substituted phenylene group) —CONH— (CH 2 ) s —CH (COOCH 3 ) —NH—CO—, or —CONH— (CH 2 ) p —O— (CH 2 ) t —NHCO— (an optionally substituted phenylene group)
  • [6] A compound in which a chelating group for capturing a radioisotope is bonded to the compound according to any one of [1] to [5].
  • [7] A compound in which a fluorescent compound or a drug compound is bound to the compound according to any one of [1] to [5].
  • a streptavidin variant comprising an amino acid sequence in which Asn, the 37th amino acid residue, is substituted with another amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • a streptavidin variant comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • a streptavidin mutant-molecular probe conjugate obtained by binding a molecular probe to the streptavidin mutant according to [9] or [10].
  • the streptavidin mutant-molecular probe conjugate according to [12] wherein the molecular probe is an anti-human CD20 antibody.
  • the combination of the streptavidin variant and the biotin variant dimer compound of the present invention is useful in diagnostic methods and therapeutic methods based on the pretargeting method.
  • FIG. 1 shows the results of crystal structure analysis.
  • FIG. 2 shows the results of crystal structure analysis.
  • FIG. 3 shows the measurement results of the rewind efficiency by the dilution method.
  • FIG. 4 shows the ITC interaction between V2122 and each compound.
  • FIG. 5 shows the results of an immunogenicity test using cynomolgus monkeys.
  • FIG. 6 shows the results of crystal structure analysis.
  • the third diagram in FIG. 6 shows the crystal structure of the complex of V2122 and compound C.
  • FIG. 7 shows the results of crystal structure analysis.
  • FIG. 8 shows the results of recognition analysis of CD20 on RAMOS cells using a flow cytometer.
  • FIG. 9 shows a performance comparison with wild type streptavidin mutants Y43A and S45A.
  • FIG. 10 shows a performance comparison with wild type streptavidin mutants Y43A and S45A.
  • FIG. 11 shows the results of SDS-PAGE after purification of the expressed anti-epiregulin scFv by gel filtration.
  • FIG. 12 shows the results of structural analysis of a complex of anti-epiregulin scFv and epiregulin.
  • FIG. 13 shows the results of purification of anti-epiregulin scFv-V2122 protein.
  • FIG. 14 shows the results of confirming the antigen binding property of anti-epiregulin scFv-V2122-FITC by SPR (Biacore T200).
  • FIG. 15 shows the results of cell staining and internalization analysis using anti-epiregulin scFv-V2122-FITC.
  • FIG. 16 shows the results of FACS analysis using anti-epiregulin scFv-V2122-FITC.
  • FIG. 17 shows the results of purification of the Rituximab-scFv-V2122 protein using a “Protein” L column.
  • FIG. 18 shows the results of a flow cytometer using Rituximab-scFv-V2122.
  • FIG. 19 shows the results of in vivo imaging using Rituximab-scFv-V2122.
  • FIG. 20 shows the results of purification of anti-epiregulin scFv-V2122 using a Protein L column.
  • FIG. 21 shows the results of in vivo imaging using anti-epiregulin scFv-V2122.
  • Biotin-modified dimer compound The biotin-modified dimer compound of the present invention is a compound represented by the following formula (1), and preferably n1 and n2 are 0 in formula (1). It is a compound represented by a certain formula (2).
  • X1a, X1b, X2a and X2b represents O or NH are each independently, Y 1 and Y 2 is each independently C or S, Z 1 and Z 2 each independently represent O, S or NH V 1 and V 2 each independently represent S or S + —O ⁇ , n1 and n2 each independently represent an integer of 0 or 1, m1 and m2 each independently represents an integer of 1 to 10 L represents a linking group.
  • n1 and m2 represent an integer of 1 to 10, preferably an integer of 2 to 10, more preferably an integer of 2 to 8, more preferably an integer of 2 to 6.
  • L is preferably a linking group composed of —CONH—, —NHCO—, —O—, an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, an optionally substituted phenylene group, or a combination thereof.
  • L is —CONH— (CH 2 ) p —CONH— (CH 2 ) q —O— (CH 2 ) r —NHCO— (CH 2 ) s —NH—CO—, —CONH— (CH 2 ) p —CONH— (CH 2 ) q —NHCO— (CH 2 ) s —NH—CO—, —CONH— (CH 2 ) p —CONH— (phenylene group which may have a substituent) — NHCO— (CH 2 ) s —NH—CO—, —CONH—CH (COOCH 3 ) — (CH 2 ) p —NHCO— (phenylene group which may have a substituent) —CONH— (CH 2 ) s —CH (COOCH 3 ) —NH—CO—, or —CONH— (CH 2 ) p —O— (CH 2 ) t —NHCO— (phenylene
  • p, q, r and s each independently represent an integer of 2 to 8, more preferably an integer of 2 to 6. More preferably, t and u each independently represent an integer of 1 to 4. Examples of the substituent on the phenylene group include —COOH, —CONH 2 , an optionally substituted amide group, —CO—NH 2 and the like.
  • the compound of formula (1) or formula (2) of the present invention can be synthesized by the synthesis method described in Example 1 below.
  • Compounds 5, 7, 11, 13, 15, 22, 24, 36 and 50 in Example 1 are compounds of the formula (1) or formula (2) of the present invention.
  • N, N '-[2,2'-Oxybis (ethane-2,1-diyl)] bis (6-amino) is obtained by adding trifluoroacetic acid to a dichloromethane solution of dicarbamate 2 and reacting at room temperature for 30 minutes.
  • Hexanamide) (compound 3) is obtained.
  • N diamine 3, N-dimethylformamide and pyridine mixed solution EZ-Link R NHS-Iminobiotin added and allowed to react at room temperature.
  • N 1 , N 3 -bis ⁇ 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ -5- (4 -Iodobenzamide) isophthalamide (compound 18) is obtained.
  • N-dimethylformamide was added 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, and at room temperature.
  • (S) -1-tert-butyl 4- (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2- (tert-butoxycarbonylamino) succinoate (compound 19) is obtained.
  • Trifluoroacetic acid is added to the aqueous solution of the dicarbamate 47 obtained above under ice-cooling and stirred, and then the temperature is raised to room temperature and further stirred.
  • the solvent is distilled off under reduced pressure and then dried under vacuum to obtain a crude product containing Compound 48.
  • Add a mixed solution of trifluoroacetic acid and water to Bisinobiotin 49 raise the temperature to 50 ° C and stir. After the solvent is distilled off under reduced pressure, the compound 50 is obtained by drying under vacuum.
  • chelate groups that can be used in the present invention include DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic acid), DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid). ), TETA (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N, N ', N' ', N' ''-tetraacetic acid), N2S2, MAG3, CHX-A-DTPA, etc. it can.
  • DOTA 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic acid
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • TETA 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N, N ', N' ', N' '-tetraacetic acid
  • radioisotopes for imaging include gamma-ray nuclides ( 67 Ga, 99m Tc, 111 In, 123 I, positron emitting nuclides ( 18 F, 62 Cu, 64 Cu, 66 Ga).
  • the radioisotopes for treatment include Peter radionuclides ( 32 P, 67 Cu, 89 Sr, 90 Y) 114m In, 117m Sn, 131 I, 153 Sm, 166 Ho, 177, Lu, 186, Re, 188 Re, etc.), alpha nuclides ( 211 At, 212 Bi, 212, Pb, 213 Bi, 223 Ra, 225 Ac), Auger electron beam nuclides ( 125 I, 165 Er, etc.), preferably 64 Cu, 124 I, 76 Br, 68 Ga, 99m Tc, 123 I, 131 I, 90 Y can be used.
  • the present invention further provides a compound in which a fluorescent compound or a drug compound (for example, an anticancer drug) is bound to the above-described biotin variant dimer compound of the present invention.
  • a fluorescent compound or a drug compound for example, an anticancer drug
  • examples of the fluorescent compound that can be used in the present invention include fluorescein 5-isothiocyanate (FITC), IR Dye (registered trademark) 800, and fluorescein.
  • drugs for example, anticancer drugs
  • PBD pyrrolobenzodiazepine
  • maytansine analogs for example, DM1, DM4, etc.
  • Dolastatin analogues eg Monomethyl auristatin E (MMAE), Monomethyl auristatin F (MMAF), dolastatin 10, tubulysin etc.
  • duocarmycin analogues eg DC1, DC4, DC44 etc.
  • Camptothecin analogs eg SN-38
  • others eg methotrexate, vinblastine, calicheamicin, ⁇ -amanitin, doxorubicin, melphalan
  • Specific examples of the compound to which the compound is bonded include compounds 14, 42, 44, 51, 52 and 59 in Example 1, and can be synthesized by the synthesis method described in Example 1 below. it can.
  • Triethylamine and fluorescein 5-isothiocyanate are added to a methanol solution of bisiminobiotin 13 and reacted at room temperature to obtain (3aS, 3a'S, 4S, 4'S, 6aR, 6a'R) -4,4 '- ⁇ 5,5'-[6,6 '-(5- (2- (2- (2- (3- (3', 6'-dihydroxy-3-oxo-3H-spiro [isobenzofuran-1 , 9'-Xanthen] -5-yl) thioureido) ethoxy) ethoxy) ethylcarbamoyl) -1,3-phenylene) bis (azanediyl) bis (6-oxohexane-6,1-diyl)] bis (azanediyl) bis (5-Oxopentane-5,1-diyl) ⁇ bis (tetrahydro-1H
  • Triethylamine is added to a methanol solution of the crude product containing bisiminobiotin 50 and compound 57 and stirred at room temperature.
  • Trifluoroacetic acid is added to the aqueous solution of bisiminobiotin 58 and stirred at room temperature.
  • streptavidin mutant of the present invention has a predetermined amino acid mutation in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2, and is immunogenic compared to wild-type streptavidin. At the same time as the decrease in affinity for natural biotin or biocytin.
  • amino acid sequence of wild-type (natural) core streptavidin is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the base sequence encoding this is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the streptavidin variant of the present invention is a streptogram consisting of an amino acid sequence in which Asn, which is the 37th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is substituted with another amino acid residue.
  • Examples include avidin mutants.
  • Particularly preferred is a streptavidin variant comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is (1) Mutation in which tyrosine at the 10th amino acid residue is substituted with serine: (2) Mutation in which tyrosine at the 71st amino acid residue is substituted with serine: (3) Mutation in which arginine at the 72nd amino acid residue is substituted with lysine: (4) Mutation in which glutamic acid at the 89th amino acid residue is substituted with aspartic acid: (5) Mutation in which arginine at the 91st amino acid residue is substituted with lysine: (6) Mutation in which glutamic acid at the 104th amino acid residue is substituted with asparagine: (7) a mutation in which aspartic acid at the 11th amino acid residue is substituted with aspartic acid; (8) Mutation in which serine at the 15th amino acid residue is substituted with aspartic acid: (9) A mutation in which serine at the 33rd amino acid
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 further includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, (10) Mutation in which asparagine at the 37th amino acid residue is substituted with glycine: Is an amino acid sequence having
  • the immunogenicity is reduced compared to wild-type streptavidin means that the immunogenicity is reduced when a streptavidin variant is administered to a mammal such as a human. .
  • the reduction in immunogenicity can be confirmed, for example, by the following method. That is, with respect to the streptavidin mutant of the present invention, the reactivity to the anti-streptavidin antiserum obtained by immunizing wild type streptavidin to cynomolgus monkeys was analyzed, and the reactivity to the above anti-streptavidin antiserum was If it is lower than that of the wild type streptavidin, it can be determined that the immunogenicity is lower than that of wild type streptavidin.
  • the streptavidin variant of the present invention preferably has an immunogenicity of 80% or less, more preferably 60% or less, compared to wild-type streptavidin. It is preferably 20% or less, more preferably 15% or less, further preferably 10% or less, and particularly preferably 5% or less.
  • the affinity with natural biotin or biocytin as referred to in the present invention means that the binding between a streptavidin variant and natural biotin or biocytin is compared with the binding between streptavidin and natural biotin or biocytin. It means that it is falling.
  • the affinity / binding property between the streptavidin mutant and natural biotin or biocytin can be evaluated by SPR analysis or the like.
  • the streptavidin variant of the present invention preferably has an affinity for natural biotin or biocytin of 80% or less, more preferably 70% or less, more preferably 60% or less, more preferably compared to wild-type streptavidin. It is reduced to 50% or less, more preferably 40% or less.
  • a DNA encoding the above-described streptavidin mutant of the present invention can be prepared by site-directed mutagenesis on DNA encoding wild type (natural) streptavidin.
  • the above-described DNA encoding the streptavidin variant of the present invention can be used by being incorporated into a vector.
  • the DNA encoding the streptavidin mutant of the present invention is incorporated into an expression vector, and the expression vector is transformed into a host to thereby produce the streptavidin mutant of the present invention. Mutants can be expressed.
  • a vector used in the present invention has an origin of replication (ori) and a gene for selecting a transformed host (for example, ampicillin, tetracycline, kanamycin, or chlorampheny). It is preferable to have a drug resistance gene for a drug such as cole).
  • a promoter capable of efficiently expressing the streptavidin variant of the present invention in the host for example, a lacZ promoter or a T7 promoter.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET.
  • the host preferably uses BL21 expressing T7 RNA polymerase.
  • a signal sequence for increasing the yield of the streptavidin variant of the present invention can be added to the vector.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed using, for example, the calcium chloride method or the electroporation method.
  • a tag for improving solubility for example, a sequence encoding glutathione-S-transferase, thioredoxin, or maltose-binding protein may be added. It also encodes tags designed to facilitate purification, such as polyhistidine tags, Myc epitopes, hemagglutinin (HA) epitopes, T7 epitopes, Xpress tags and FLAG peptide tags, and other known tag sequences A sequence may be added.
  • expression vectors derived from mammals for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF, pCDM8), derived from insect cells
  • Expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), an expression vector derived from a retrovirus (for example, pZIPneo), an expression vector derived from yeast (for example, “Pichia® Expression® Kit” (manufactured by Invitrogen), pNV11®, SP-Q01), an expression vector derived from Bacillus subtilis (for example, PPL608, p
  • promoters necessary for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It is essential to have the MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., and genes for selecting transformation into cells (for example, More preferably, it has a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the host cell into which the vector is introduced is not particularly limited and may be either prokaryotic or eukaryotic.
  • E. coli and various animal cells can be used.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host.
  • animal cells mammalian cells such as CHO cells, COS cells, 3T3 cells, HeLa cells, Vero cells, or insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5 can be used.
  • CHO cells are particularly preferred for mass expression purposes.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), an electroporation method, a lipofection method, or the like.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger, are known. .
  • E. coli for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, etc.
  • Bacillus subtilis is also known.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium for animal cells.
  • a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • a growth factor for promoting cell proliferation may be added.
  • a streptavidin variant-molecular probe conjugate obtained by binding a molecular probe to the streptavidin variant of the present invention, and streptavidin are obtained.
  • a therapeutic or diagnostic agent comprising an avidin variant-molecular probe conjugate is provided.
  • the above-mentioned streptavidin variant-molecular probe conjugate is provided as a treatment or diagnostic kit in combination with a diagnostic or therapeutic substance labeled with a biotin variant having affinity for the streptavidin variant of the present invention. be able to.
  • molecular probes include antibodies, peptides, nucleic acids, aptamers, and the like.
  • antibodies, peptides, nucleic acids, aptamers, etc. that target the following antigens that are specifically expressed in cancer can be used. it can. Epiregulin, ROBO1,2,3,4,1-40- ⁇ -amyloid, 4-1BB, 5AC, 5T4, ACVR2B, adenocarcinoma antigen, ⁇ -fetoprotein, angiopoietin 2, anthrax toxin, AOC3 (VAP-1 ), B-lymphoma cells, B7-H3, BAFF, ⁇ -amyloid, C242 antigen, C5, CA-125, Carbonic anhydrase 9 (CA-IX), Cardiac myosin, CCL11 (eotaxin-1), CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (basigin), CD147 (basigin), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD154, CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD
  • a preferred specific example of the molecular probe is an anti-human CD20 antibody (eg, rituximab) or an anti-epiregulin single chain antibody.
  • Rituximab is an anti-human CD20 antibody, and human CD20 is expressed only on human B cells.
  • a therapeutic agent for cellular non-Hodgkins lymphoma and mantle cell lymphoma obtained by labeling the mouse anti-CD20 monoclonal antibody with the radioisotope 90Y is commercially available as Zevalin (registered trademark).
  • Zevalin registered trademark
  • RI is directly labeled on the anti-CD20 antibody, and it takes several days for tumor accumulation after in vivo administration. This causes serious side effects such as bone marrow suppression by RI.
  • Non-patent Document 3 Pagneli et al. Have studied a pretargeting method using a fusion protein of an anti-CD20 antibody-scfv and a streptavidin mutant and RI-labeled biotin or bisbiotin (Non-patent Document 5).
  • Epiregulin is a member of epidermal growth factor and is known to function as a cancer growth inhibitory factor that induces morphological changes in Hela cells. Yutani et al. Produced an anti-epireulin antibody (WO2008 / 047723). Lee et al. Also humanized and evaluated anti-epiregulin antibodies (Biochemical and Biophysical Research communications 444 (2013) 1011-1017).
  • a fusion of a molecular probe such as a cancer antigen-specific antibody molecule and the streptavidin variant of the present invention is prepared and administered to a patient, so that the streptogram of the present invention specifically binds to cancer cells.
  • Avidin variants can be accumulated.
  • a diagnostic or therapeutic substance fluorescent dye, chemiluminescent agent, radioisotope, sensitizer comprising a metal compound, metal compound, etc.
  • a neutron capture agent comprising, a low molecular compound such as a drug, a micro or nano bubble, a protein, etc.
  • antibody production is suppressed due to low immunogenicity, and early clearance from the body and shock such as anaphylaxis due to antibodies can be prevented. Further, in the present invention, by using it as an in vitro diagnostic agent or clinical test agent using tissue, serum or the like collected from a patient, noise derived from biotin or biotin-binding protein present in the tissue, serum or the like is reduced, and more S Diagnosis and inspection with high / N ratio becomes possible.
  • a diagnosis in which a fusion of a molecular probe such as a cancer antigen-specific antibody molecule and a streptavidin variant of the present invention and a biotin variant having an affinity for the streptavidin variant is bound.
  • therapeutic substances fluorescent dyes, chemiluminescent agents, radioisotopes, sensitizers composed of metal compounds, neutron capture agents composed of metal compounds, low molecular compounds such as drugs, micro or nanobubbles, proteins, etc.
  • antibody can be used as the antibody to be bound to the streptavidin variant. Both polyclonal and monoclonal antibodies can be used. Although subclass of the antibody is not particularly limited, preferably IgG, particularly IgG 1 is suitably used. “Antibody” includes all modified antibodies and antibody fragments. Humanized antibodies, humanized antibodies, human antibodies, antibodies derived from various animals such as mice, rabbits, rats, guinea pigs, monkeys, chimeric antibodies of human antibodies and antibodies derived from various animals, diabody, scFv, Fd, Fab, Fab ′, F (ab) ′ 2 may be mentioned, but is not limited thereto.
  • a conjugate of a streptavidin variant and an antibody can be obtained using methods known to those skilled in the art. For example, it can be obtained by a chemical binding method (US5, 608, 060), or by ligating DNA encoding a streptavidin variant and DNA encoding an antibody, and expressing it in a host cell using an expression vector or the like, It can also be obtained as a fusion protein.
  • the DNA encoding the streptavidin variant and the DNA encoding the antibody may be linked via DNA encoding an appropriate peptide called a linker. It is desirable that the streptavidin variant-antibody conjugate is produced while leaving the specific binding force between the antibody and the target molecule.
  • Low resolution mass spectra (LHMS) were measured using ESI-MS with a Waters ZQ4000 spectrometer. Column chromatography was performed using silica gel Merk 60 (230-400 mesh ASTM). The reaction was followed by thin layer chromatography (TLC) or low resolution mass spectrometry (LRMS).
  • Reversed phase high performance liquid chromatography was performed using the JASCO-HPLC system. Detection was performed using 210 nm or 254 nm ultraviolet light, and the mobile phase was a gradient solvent system (acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid MQ solution). The analysis was performed using a YMC-Pack ODS-AM (150 ⁇ 4.6 mL) or YMC-Triart-C18 (150 ⁇ 4.6 mL) column at a flow rate of 1 mL / min. For fractionation, use a YMC-Pack ODS-AM (250 x 20 mL) or YMC-Triart-C18 (250 x 10 mL) column. I went in min.
  • EZ-Link (registered trademark) NHS-Iminobiotin was purchased from Thermo Scientific. Other reagents were purchased from Aldrich, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (TCI), Kanto Chemical Co., Ltd. (Kanto), Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and Watanabe Chemical Industry Co., Ltd. All reagents and solvents were used as they were unless otherwise specified.
  • Trifluoroacetic acid (12 mL) was added to a solution of dicarbamate 2 (0.917 g, 1.73 mmol) in dichloromethane (6 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, dissolved in methanol (1 mL), passed through an Amberlite R IRA-400 column (basic resin, 20 mm ⁇ 200 mm) and eluted with methanol. After evaporating the solvent under reduced pressure, the title compound 3 (0.57 g, quant., Pale yellowish white solid) was obtained by drying under vacuum.
  • the crude product was dissolved in a mixed solvent of dioxane (1.2 mL) and water (0.8 mL), 25% aqueous ammonia solution (4.8 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hr. The aqueous layer was washed with diethyl ether, and then the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • EZ-Link R NHS-Iminobiotin (4, 10 mg, 0.0230) was added to a mixed solution of diamine 6 (3.3 mg, 0.0115 mmol) synthesized in a known manner with N, N-dimethylformamide (0.4 mL) and pyridine (0.1 mL). mmol) was added and stirred at room temperature for 6 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was dissolved in dioxane (0.5 mL), 25% aqueous ammonia solution (2.0 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hr. The aqueous layer was washed with diethyl ether, and then the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • N, N-dimethylformamide (0.6 mL) was added to ammonium salt 10 (16.6 mg, 0.0346 mmol), and then dissolved by adding triethylamine (14 ⁇ L, 0.104 mmol).
  • EZ-Link R NHS-Iminobiotin ( 4, 30 mg, 0.0691 mmol) and the mixture was stirred at room temperature for 14 hours. After evaporating the solvent under reduced pressure, the crude product was dissolved in methanol (0.5 mL), 2N aqueous sodium hydroxide solution (138 ⁇ L, 0.276 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 22 hr.
  • Triethylamine (4.3 ⁇ L, 30.7 ⁇ mol) and fluorescein 5-isothiocyanate (FITC, 1.6 mg, 4.03 ⁇ mol) were added to a solution of bisiminobiotin 13 (5 mg, 3.84 ⁇ mol) in methanol (0.2 mL). A reddish brown solid was precipitated, but the mixture was stirred at room temperature for 10 hours. Methanol (1 mL) was added and sonicated, the solid was suction filtered and washed with methanol. The solid was dissolved in a methanol solution containing 10% trifluoroacetic acid.
  • FITC fluorescein 5-isothiocyanate
  • N, N-dimethylformamide (0.23 mL) and triethylamine (4.8 ⁇ L, 0.034 mmol) are added to diamine 10 (5.5 mg, 0.011XX mmol), and then EZ-Link R NHS-Iminobiotin 4 (10 mg, 0.023 mmol) is added.
  • the mixture was further stirred at room temperature for 6 hours. After evaporating the solvent under reduced pressure, the crude product was dissolved in methanol (0.5 mL), 25% aqueous ammonia solution (2 mL) was added, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 12 hr.
  • Trifluoroacetic acid (2 mL) was added to a solution of dicarbamate 17 (0.350 g, 0.401 mmol) in dichloromethane (1 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure and washed with diethyl ether. It was dissolved in methanol (1 mL), passed through an Amberlite® IRA-400 column (basic resin, 20 mm ⁇ 200 mm) and eluted with methanol. After evaporating the solvent under reduced pressure, the title compound 18 (0.258 g, yield 96%, yellow amorphous form) was obtained by drying under vacuum.
  • Active ester 19 (33.4 mg, 0.0865 mmol) was added to a mixed solution of diamine 18 (35.9 mg, 0.0412 mmol) in dioxane (0.8 mL) and pyridine (0.1 mL). After stirring at room temperature for 14 hours, 19 (10 mg, 0.0259 mmol) was further added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. After evaporating the solvent under reduced pressure, ethyl acetate and 0.5N hydrochloric acid were added, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with 0.5N hydrochloric acid, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine.
  • Bisamino acid 21 (5 mg, 4.43 ⁇ mol) was suspended in a mixed solvent of dioxane (0.2 mL) and water (0.1 mL), and then 1N aqueous sodium hydroxide solution (18 ⁇ L, 177 ⁇ mol) was added. After dissolving by stirring at room temperature for 5 minutes, EZ-Link R NHS-Iminobiotin (4, 4.0 mg, 9.07 ⁇ mol) was added. After stirring at room temperature for 19 hours, 2N aqueous sodium hydroxide solution (150 ⁇ L) was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 4 hours. The aqueous layer was washed with diethyl ether, and then the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Biotin N-hydroxysuccinimide ester (23, 45 mg, 0.132 mmol) was added to a solution of diamine 3 (21.8 mg, 0.0659 mmol) in N, N-dimethylformamide (1.6 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. Diethyl ether was added and the resulting solid was filtered. The solid was washed with 1N hydrochloric acid, saturated aqueous sodium carbonate solution, water, cooled acetone, diethyl ether, and the solid was dried under vacuum to give the title compound 24 (46.2 mg, yield 90%, white solid) .
  • iminobiotin longtail can be synthesized by the following method.
  • a sodium hydroxide aqueous solution was added to a mixed solution of 6-aminohexanoic acid (3 mg, 0.023 mmol) in dioxane (500 ⁇ L) and H 2 O (500 ⁇ L) to adjust the pH to about 9.
  • Compound 101 (10 mg, 0.023 mmol) (commercial product) was added and stirred for 12 hours, and then ether was added to remove the organic layer.
  • the aqueous layer was neutralized with hydrochloric acid and filtered. The residue was washed with acetone, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Reverse phase high performance liquid chromatography was performed using JASCO-HPLC system. Detection was carried out using ultraviolet light of 210 nm or 254 nm, and the mobile phase was a gradient solvent system (acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid MQ solution). The analysis was performed using a YMC-Triart-C18 (150 ⁇ 4.6 mL) column with a flow rate of 1 mL / min. For the fractionation, a YMC-Triart-C18 (250 ⁇ 10 mL) column was used, and the flow rate was 3.5 mL / min.
  • EZ-Link (registered trademark) NHS-Iminobiotin was purchased from Thermo Scientific. DOTA-NHS-ester was purchased from Macrocyclics. Other reagents were purchased from Aldrich, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (TCI), Kanto Chemical Co., Ltd. (Kanto), Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and Watanabe Chemical Industry Co., Ltd. All reagents and solvents were used as they were unless otherwise specified.
  • Triphosgene (1.48 g, 4.99 mmol) was added to a toluene (20 mL) solution of dimethyl 5-aminoisophthalate (25) (1.00 g, 4.78 mmol), and the mixture was stirred for 3 hours while refluxing. Then, pyridine was added and stirred for 1 hour while refluxing.
  • Amine (27) (1.84 g, 6.52 mmol) was added to a mixed solution of crude product 26 obtained by distilling off the solvent under reduced pressure, dichloromethane (25 mL) and triethylamine (728 ⁇ L, 5.24 mmol). Stir for hours. The solvent was evaporated under reduced pressure, 1 M hydrochloric acid was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • N-hydroxysuccinimide (0.615 g, 5.34 mmol), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride in a solution of dicarboxylic acid 29 (1.09 g, 2.23 mmol) in N, N-dimethylformamide (11.1 mL) Salt (WSC ⁇ HCl, 1.03 g, 5.34 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours under an argon atmosphere. The solvent was distilled off under reduced pressure, 0.5 M hydrochloric acid was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • Disuccinimide 30 (1.21 g, 1.76 mmol) in N, N-dimethylformamide (18.1 mL) and triethylamine (1.48 mL, 10.6 mmol) mixed solution with N ⁇ -Boc-L-lysine (31) (974 mg, 3.52 mmol ) was added and stirred at room temperature for 10 hours.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, water and 1 M hydrochloric acid were added, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was washed once with saturated brine.
  • Example 1C Synthesis of biotin-modified dimer compound to which dye, chelating group or drug is bound
  • Low resolution mass spectra (ESI) were measured using an Agilent 6120 Quadrupole LC / MS (ESI) connected to a Waters ZQ4000 spectrometer or an Agilent Technologies 1290 Infinity LC.
  • Reversed phase high performance liquid chromatography was performed using the JASCO-HPLC system. Detection was performed using ultraviolet light at 210 nm or 254 nm, and the mobile phase was a gradient solvent system (acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid MQ solution or 0.1% formic acid MQ solution). The analysis was performed using a YMC-Triart-C18 (150 ⁇ 4.6 mL) column at a flow rate of 1 mL / min. The fractionation was performed using a YMC-Triart-C18 (250 ⁇ 10 mL) column at a flow rate of 3.5 mL / min. DOTA-NHS-ester was purchased from Macrocyclics.
  • IRDye R 800CW NHS Ester was purchased from LI-COR.
  • Other reagents were purchased from Aldrich, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (TCI), Kanto Chemical Co., Ltd. (Kanto), Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and Watanabe Chemical Industry Co., Ltd. All reagents and solvents were used as they were unless otherwise specified.
  • Example 2 Expression and Crystal Structure Analysis of LISA314 Mutants V21 and V212
  • the nucleotide sequence of the gene encoding wild-type core streptavidin is shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing.
  • mcSA314 also referred to herein as LISA314WT or LISA314 described in International Publication WO2010 / 09455 was used as a low immunogenicity (modified) streptavidin.
  • mcSA314 is a streptavidin variant having all of the following mutations in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2.
  • the oligo DNA used for the preparation of each mutant was designed according to the instructions of the Primer STAR Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio) so that the 5 ′ side overlaps by 15 bases.
  • the pCold TF vector into which LISA314 was inserted was used as a template, and the amino acid sequence was converted by changing the codon sequence by substitution of the base sequence by Site-Directed Mutagenesis method. Thereafter, the template plasmid was cleaved with the restriction enzyme DpnI, and E. coli was transformed.
  • LISA314 V21 Fw TGGAGCgatCAGCTGGGCgatACCTTT (SEQ ID NO: 5)
  • LISA314 V21 Rv CAGCTGatcGCTCCAGGTGCCGGTAAT (SEQ ID NO: 6)
  • LISA314 V21 (hereinafter also referred to as V21), which is a LISA314 mutant, has mutations N23D and S27D in addition to LISA314.
  • N23D means a mutation in which the asparagine (N) of the 11th amino acid residue is substituted with aspartic acid (D) in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2.
  • S27D means a mutation in which serine (S) at the 15th amino acid residue is substituted with aspartic acid (D) in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2.
  • V21 is the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2, (1) Mutation in which tyrosine at the 10th amino acid residue is substituted with serine: (2) Mutation in which tyrosine at the 71st amino acid residue is substituted with serine: (3) Mutation in which arginine at the 72nd amino acid residue is substituted with lysine: (4) Mutation in which glutamic acid at the 89th amino acid residue is substituted with aspartic acid: (5) Mutation in which arginine at the 91st amino acid residue is substituted with lysine: (6) Mutation in which glutamic acid at the 104th amino acid residue is substituted with asparagine: (7) a mutation in which aspartic acid at the 11th amino acid residue is substituted with aspartic acid; (8) Mutation in which serine at the 15th amino acid residue is substituted with aspartic acid: It is a mutant streptavidin having
  • the oligo DNA used for the construction of a further variant of V21 was designed according to the instructions of Primer STAR Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio) so that the 5 ′ side overlaps 15 bases.
  • the following primers were used, and the amino acid sequence was converted by changing the codon sequence by base sequence substitution by the Site-Directed Mutagenesis method using the above-mentioned vector with V21 inserted as a template. Thereafter, the template plasmid was cleaved with the restriction enzyme DpnI, and E. coli was transformed.
  • Primer S45N Fw TATGAAAACGCCGTGGGTAATGCGGAA (SEQ ID NO: 7)
  • S45N Rv CACGGCGTTTTCATAGGTGCCGGTCAG (SEQ ID NO: 8)
  • S45N indicates that serine at the 33rd amino acid residue is substituted with asparagine (N) in the amino acid sequence of core streptavidin described in SEQ ID NO: 2. That is, a mutant LISA314 V212 (hereinafter also referred to as V212) in which an amino acid mutation of S45N is further introduced into V21 is produced.
  • the amino acid sequence of this mutant is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • V212 protein is expressed in E. coli (BL21 (DE3) strain), recovered as an inclusion body, unwound by a dilution method, and subjected to affinity purification and gel filtration purification to form a tetramer. A fraction was obtained. Specifically, the purified inclusion body was dissolved overnight in a denaturing buffer (6M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 at 4 ° C.).
  • a denaturing buffer 6M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 at 4 ° C.
  • n 280 and found to be 50 mg / mL
  • 100 microliters (equivalent to 5 mg) of the dissolved liquid was mixed with 50 mL of refolding buffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 400 mM Arginine- HCl, pH 8.0 at 4 ° C.) with stirring, and left at 4 ° C. for storage.
  • the storage time was 2 days for stable rewinding.
  • affinity purification was performed using Ni-NTA resin (cOmplete His-Tag Purificaiton Resin; Roche). Thereafter, the tetramer fraction was fractionated by gel filtration purification (HiLoad 16/60 Superdex 200pg GE Healthcare).
  • Example 3 Design, expression and purification of V2122
  • N45 and N49 amino acids 33 and 37 in Sequence Listing 3
  • Asparagine (N) corresponding to position 37 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 was modified to alanine (A), glycine (G), and serine (S). These mutations are referred to as N49A, N49G, and N49S.
  • the expression method was the same as described above, and a mutant expression vector was constructed by release at the site directed mutagenesis method using the following primer set.
  • N49A Fw GTGGGTgcgGCGGAAAGCCGTTATGTT (SEQ ID NO: 9)
  • N49A Rv TTCCGCcgcACCCACGGCattTTCATA (SEQ ID NO: 10)
  • N49G Fw GTGGGTggtGCGGAAAGCCGTTATGTT (SEQ ID NO: 11)
  • N49G Rv TTCCGCaccACCCACGGCattTTCATA (SEQ ID NO: 12)
  • N49S Fw GTGGGTagcGCGGAAAGCCGTTATGTT (SEQ ID NO: 13)
  • N49S Rv TTCCGCgctACCCACGGCattTTCATA (SEQ ID NO: 14)
  • the expression and purification of the mutant protein was performed by denaturing the inclusion body and rewinding by a dilution method as described above.
  • the glycine mutant had the highest tetramer formation rate, and other alanine and serine mutants had 4 It was found that the formation rate of the polymer was low. Therefore, in the future, the glycine mutant (N49G) was used, and this mutant was designated LISA314-V2122 (hereinafter V2122).
  • the amino acid sequence of V2122 is set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • Example 4 ITC binding analysis between V2122 and a compound Measurement was performed using Microcal iTC200 (MicroCal, Northampton, MA). The purified V2122 was dialyzed overnight at 4 ° C. in PBS, and Compound C, biotin, and stock solution were prepared using the dialyzed external solution. At the time of measurement, the stock solution was used after adjusting the concentration so as to be 10 times the concentration of V2122 to be measured. 25 ⁇ M V2122 was introduced into the calorimeter cell, and each solution was added dropwise at a stirring speed of 1000 rpm and 25 ° C. The obtained data was analyzed using ORIGIN, and the titration curve was fitted with one-site binding isotherm.
  • Example 5 Immunogenicity test (1) Preparation of protein The protein expression vector for immunogenicity test was added to the N-terminus by the site directed mutagenesis method using the following primer set with respect to the aforementioned expression vector. A modified version so that T7-tag is not expressed was used.
  • T7tagRemove Fw tacatatgGCCGAAGCAGGTATTACC (SEQ ID NO: 15)
  • T7tagRemove Rv CTTCGGCcatatgtatatctccttc (SEQ ID NO: 16)
  • the target protein was expressed in E. coli (BL21 (DE3) strain), recovered as an inclusion body, unwound by a dilution method, and subjected to affinity purification and gel filtration purification to obtain a tetramer-forming fraction. Specifically, the purified inclusion body was dissolved overnight in a denaturing buffer (6 M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 at 4 ° C.).
  • a denaturing buffer (6 M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 at 4 ° C.).
  • the immunogenicity test was performed using 4 cynomolgus monkeys. 1 mg of purified protein was administered 3 times. Before administration, blood was collected for negative control serum, and 1 mg of purified protein was administered three times. Specifically, when the first administration day is day 0, the second administration day is day 21, and the third administration day is day 42. For V2122, blood samples were collected on days 7, 14, 28, and 35, and serum samples were prepared. For other samples, blood samples were collected on days 7, 14, 28, 35, 49, and 56, and serum samples were collected. Prepared. Analysis of antibodies against V2122 in serum samples was performed by surface plasmon resonance (SPR). Specifically, the measurement was performed in a mode using the Biacore T200 (GE Healthcare), immunogenicity package.
  • SPR surface plasmon resonance
  • CM5 was used as the sensor chip, and V2122 protein (10 ⁇ g / mL) was immobilized on the CM5 sensor chip using an amine coupling kit according to the manual.
  • Serum was diluted 10-fold with running buffer (HBS-EP, GE Healthcare Bioscience) and analyzed for interaction. Specifically, 10-fold diluted serum was loaded into the running buffer at 10 ⁇ L / min for 5 minutes. The obtained sensorgram was analyzed with analysis software Biacore T200 Evaluation Software.
  • Example 6 Affinity analysis between V2122 and compound Using LISA314 variant protein V2122 purified by the method described above, interaction with compound C was performed by surface plasmon resonance (SPR). Specifically, Biacore T200 (GE Healthcare) is used as a measuring instrument, and sensor chip NTA (GE Healthcare) is used as the sensor chip, and His-Tag fused to the nuclear protein is used on the sensor chip. The protein was immobilized on.
  • the running buffer was prepared using HBS-P (+) as described in the manual.
  • the compound dilution series was adjusted from 1600 nM to 2-fold diluted 9 series with running buffer. Affinity measurements were acquired in kinetic mode.
  • the parallel value analysis of the acquired data was performed with Biacore T200 Evaluation Software to determine the affinity.
  • the dissociation constant (M) between V2122 and biotin was not detected, and the dissociation constant (M) from bisiminobiotin (compound 7) was 3.15 ⁇ 10 ⁇ 9 .
  • Example 7 Co-crystal structure analysis of V2122 and a compound
  • a protein from which the same T7-Tag as in the immunogenicity test was removed was used.
  • Escherichia coli BL21-codonplus RIL was used and cultured in 2xYT medium, and the inclusion body was recovered.
  • the collected inclusion body is dissolved in 6M GdnHCl, pH 1.5, and the refolding buffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 400 mM Arginine-HCl, pH 8.0 at 4 ° C.) is used for the dilution method described above.
  • the sample was rewound and allowed to stand at 4 ° C.
  • Compound C or Compound D was added at a molar ratio of 1: 8 to the purified tetramer fraction and incubated for 1 hour. Thereafter, the solution was concentrated to a concentration of 10 mg / mL with an ultrafiltration column (VIVASPIN20) while exchanging the buffer with an ultrafiltration column (VIVASPIN20) to 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, and 200 mM NaCl.
  • VIVASPIN20 ultrafiltration column
  • VIVASPIN20 ultrafiltration column
  • Example 8 Recognition analysis of CD20 on RAMOS cells by flow cytometry
  • the Rituximab-scFv-V2122 gene sequence was obtained by artificial gene synthesis (Life Technologies). Specifically, the amino acid sequences of light chain (VL) and heavy chain (VH) are extracted from the amino acid sequences of rituximab registered in the DrugBank database (www.drugbank.ca), and VL and VH are linked to a linker (GGGS x 4 ) In the order of VL-VH. Furthermore, LV-LH and V2122 linked by a linker (SSGSGSA) were optimized to the codon sequence of E. coli and artificially synthesized.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of Rituximab-scFv-V2122 are shown in SEQ ID NOs: 27 and 28.
  • the position of each sequence in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 is shown below.
  • pelB signal sequence amino acid number 1-23
  • VL sequence amino acid number 24-130
  • Linker sequence 1 amino acid numbers 131-148
  • VH sequence amino acid number 149-269
  • Linke sequence 2 amino acid number 270-276
  • V2122 sequence amino acid number 277-405 6xHis-Tag sequence: amino acid number 406-411
  • the artificially synthesized gene as described above was incorporated into pET21a (+), protein expression was performed using E. coli BL21 (DE3), and the protein was recovered in an inclusion body.
  • the recovered inclusion body was subjected to unwinding purification according to non-patent literature (Yumura et al. 2013, Protein Science).
  • Rituximab-scFv-V2122 that had been subjected to unwinding purification was evaluated for binding using CD20 positive cells, RAMOS (Human Burkind Lymphoma) cells (JCRB cell bank).
  • Rituximab-scFv-V2122 was diluted with PBS to prepare 3 concentrations (0.05, 0.5, 5 ⁇ g / mL). 1 ⁇ 10 6 cells were collected in a 1.5 mL tube, centrifuged at 400 ⁇ g for 4 minutes, the supernatant was discarded, and the cells were collected.
  • Comparative Example 1 Performance comparison 1 with wild type streptavidin mutants Y43A and S45A (comparison of biotin binding properties)
  • a vector into which a wild-type core streptavidin sequence (amino acid sequence of Patent Document 1, Sequence Listing 2) was introduced was prepared.
  • mutants of Y43A or S45A (replacement of amino acids 31 and 33 in the amino acid sequence of Sequence Listing 2) were prepared by site directed mutagenesis using the following primer set.
  • the target protein was expressed in E.
  • coli (BL21 (DE3) strain), recovered as an inclusion body, unwound by a dilution method, and subjected to affinity purification and gel filtration purification to obtain a tetramer-forming fraction. Specifically, the purified inclusion body was dissolved overnight in a denaturing buffer (6M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 at 4 ° C.).
  • a denaturing buffer 6M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 at 4 ° C.
  • SPR Surface plasmon resonance
  • Comparative Example 2 Performance comparison with wild type streptavidin mutants Y43A and S45A 2 (Proof of specific binding between Compound C and V2122)
  • the interaction with Compound C was performed by surface plasmon resonance (SPR) using the two types of purified wild-type core streptavidin mutants (cSA-Y43A, cSA-S45A) and the purified V2122 protein described above.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Biacore T200 GE Healthcare
  • sensor chip NTA GE Healthcare
  • His-Tag fused to the nuclear protein is used on the sensor chip.
  • the protein was immobilized on.
  • the running buffer was prepared using HBS-P (+) as described in the manual.
  • the compound dilution series was adjusted to 7 series of 1.8nM, 9nM, 18nM, 90nM, 180nM, 900nM, 1800nM with the running buffer, and the data was acquired.
  • Example 9 Crystal structure analysis of epiregulin antigen and anti-epiregulin scFv antibody
  • Expression culture and purification of anti-epiregulin scFv A plasmid encoding anti-epiregulin scFv was transformed into E. coli. After pre-culturing colonies of E. coli in LB liquid medium, main culture was performed in 2 ⁇ YT medium, and IPTG was added to induce expression of anti-epiregulin scFv. The collected bacterial cells were crushed in Tris buffer, and the centrifuged supernatant was collected. This was purified sequentially with a Ni column, an anion exchange column, and a gel filtration column. The results of SDS-PAGE after gel filtration are shown in FIG.
  • Crystallization was performed at 20 ° C. by sitting drop vapor diffusion.
  • Purified protein solution (15 mg / mL anti-epiregulin scFv), 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl) in reservoir solution (2% Tacsimate (pH 7.0), 5% 2-Propanol, 0.1 M Imidazole (pH 7.0), 11% PEG 3350) was mixed to make a drop to obtain good quality crystals.
  • the crystals obtained were subjected to X-ray diffraction experiments using the SPring-8 BL44XU beam line, and diffraction data with a resolution of 2.4 mm were obtained. This was processed with the program HKL2000, the phase was determined by the molecular replacement method with Phaser, and the structure was refined with Refmac5.
  • Example 10 (1) Preparation of anti-epiregulin scFv-V2122 expression vector
  • a fusion protein scFv-SA
  • scFv-SA fusion protein of a single-chain variable region antibody and streptavidin
  • it often forms an aggregation or inclusion body and is soluble. It is generally known that state recovery is difficult. For this reason, in order to obtain the scFv-SA protein, the method of unwinding the denatured inclusion body and unwinding the protein has been regarded as a standard. However, protein production by rewinding takes time and effort. In this study, we carried out a method to recover the soluble fraction by expressing it in E. coli at the same time as the protein skp with chaperone function and anti-epiregulin scFv-V2122.
  • the gene sequence of the chaperone skp was designed based on the protein sequence (SEQ ID NO: 24) according to the codon used for E. coli (SEQ ID NO: 23).
  • the gene sequence of the fusion protein of the single-chain variable region antibody (anti-epiregulin scFv) and V2122 (anti-epiregulin scFv-V2122) of the anti-epiregulin antibody is linked to the variable region of the anti-epiregulin antibody in the order of VH and VL ( GGGGS) x4 (SEQ ID NO: 35), and protein sequence in which VL and V2122 are connected by a linker (GGGGSGGGG) (SEQ ID NO: 36) is also designed.
  • variable parts VH and VL are Lee YH, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2013 Nov29; 441 (4): 1011-7. Doi: 10.1016 / j.bbrc.2013.11.014. Epub 2013 Nov 12. PubMed Reference was made to PMID: 24239549.
  • the base sequence and amino acid sequence of the single-chain variable region antibody (anti-epiregulin scFv) of the anti-epiregulin antibody are shown in SEQ ID NOs: 21 and 22, respectively.
  • the position of each sequence in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 is shown below.
  • pelB signal sequence amino acid number 1-22
  • VH sequence amino acid number 23-140
  • Linker sequence 1 amino acid numbers 141-164
  • VL sequence amino acid number 165-273 6xHis-Tag sequence: amino acid number 274-279
  • the base sequence and amino acid sequence of the fusion protein of anti-epiregulin scFv and V2122 are shown in SEQ ID NOs: 29 and 30.
  • the two artificially synthesized genes were incorporated into the multicloning site 1 (MSC1) of the pETDuet-1 vector (Novagen) with the skp gene sequence and the anti-epiregulin scFv-V2122 gene sequence into MCS2.
  • the linearization of the vector was first performed with the restriction enzyme NcoI, and primers (MCS1_skp_Fw: AGGAGATATACCATGATGAAAAAATGGCTGCTGGC (SEQ ID NO: 37), After amplification of the skp gene sequence by PCR using SEQ ID NO: 38)) and purification by gel cutting, ligation with a linearized vector was performed using In-Fusion HD Cloning Kit, cloning was performed, and the cloned plasmid was sequenced. The target clone was selected.
  • Anti-epiregulin scFv-V2122 protein was roughly purified by a batch method using 6xHis-Tag added to the C-terminus. Specifically, cOmplete His-Tag Purification Resin equilibrated with buffer A (50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM Imidazole, pH 8.0) was added to the culture supernatant stored at 4 ° C. The mixture was stirred overnight at 4 ° C. for protein binding to the resin. Next, the resin was recovered in a column, and a 20 column volume washing operation was performed with buffer A.
  • buffer A 50 mM TrisHCl, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM Imidazole, pH 8.0
  • Epiregulin IgG was expressed and purified with reference to Lee et al. Specifically, VL and human light chain constant region described in the literature, and VH were artificially synthesized gene sequences linked to human heavy chain constant region, and used as epiregulin IgG light chain and heavy chain, respectively.
  • the base sequence and amino acid sequence of the heavy chain of epiregulin IgG are shown in SEQ ID NOs: 31 and 32, and the base sequence and amino acid sequence of the light chain of epiregulin IgG are shown in SEQ ID NOs: 33 and 34.
  • Cell culture is in accordance with the manual usage volume of Expi293®Expression®System®Kit®, using CO2 concentration 8%, shaking rotation speed 125rpm, 1L Erlenmeyer flask (Corning), high temperature shaking incubator CO2-BR-43FL for mammalian cells (Tytec Corp.) After culturing for 5 days, the cells were removed by centrifugation, and the supernatant was collected and stored at 4 ° C. Next, epiregulin IgG was purified from the culture supernatant stored at 4 ° C. using a Bio-Scale®Mini-UNOspher-SUPrA-affinity cartridge (Bio-Rad) according to the manual usage volume.
  • Bio-Scale®Mini-UNOspher-SUPrA-affinity cartridge Bio-Rad
  • Pro-EPR-mFc Expression and purification of Pro-EPR-mFc Expression and purification of a protein (Pro-EPR-mFc) in which the extracellular domain of epiregulin and the mouse IgG1 antibody heavy chain Fc region were fused were performed.
  • the base sequence and amino acid sequence of Pro-EPR-mFc are shown in SEQ ID NOs: 25 and 26.
  • a gene fused with the extracellular domain of epiregulin and the mouse IgG1 antibody heavy chain Fc region was introduced into the pcDNA3.4 vector, and protein expression purification was performed in the same manner as in “Epiregulin IgG expression and purification”. went.
  • a protein in which the epiregulin extracellular membrane, which is a ligand, is fused with the mouse Fc region (Cap-EPR-mFc) is captured on a sensor chip CM5 to which an anti-Mouse IgG antibody is immobilized.
  • Kinetics assay was performed using 20 series of dilution series of epiregulin scFv-V2122-FITC to 9 series of 2-fold dilution (FIG. 14). As a result, it was confirmed that the anti-epiregulin scFv-V2122-FITC has a binding property to the antigen even after labeling and its affinity is 2.3E-10.
  • the medium was first changed to a complete medium supplemented with Hoechst 33342 to 1 ⁇ M, and 15 minutes later, anti-epiregulin scFv-V2122-FITC, epiregulin IgG-FITC, anti-epiregulin scFv-FITC were added at a concentration of 25 nM, It added to each well so that it might become 50 nM and 100 nM.
  • IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare Bioscience) was used for analysis of antibody binding and internalization on the cell surface. Time-lapse image acquisition was performed at 5-minute intervals. As a result, staining of the cell membrane surface was confirmed in all of anti-epiregulin scFv-V2122-FITC, epiregulin IgG-FITC, and anti-epiregulin scFv-FITC. In addition, internalization was particularly observed in anti-epiregulin scFv-V2122-FITC, and internalization began to be observed about 10 minutes after antibody addition, and most of the fluorescence was transferred into the cytoplasm after 65 minutes. Was confirmed (FIG. 15).
  • Example 11 Rituximab-scFv-V2122 Biological Imaging
  • scFv Expression Vector
  • scFv single chain antibody
  • GGGGS heavy chain variable region
  • a design of binding with (GGGGS) ⁇ 4 was performed.
  • Rituximab-scFv-V2122 a design (hereinafter referred to as Rituximab-scFv-V2122) in which scFv is linked to V2122 with a linker (GGGGSGGGG) was performed (amino acid sequence: SEQ ID NO: 42).
  • a gene sequence for protein expression was prepared using an artificial gene synthesis service (gene sequence: SEQ ID NO: 41).
  • the expression vector was incorporated into Rituximab-scFv-V2122 at the multicloning site 2 (MCS2) of pETDuet-1 in the same manner as in Example 10 (1) Preparation of anti-epiregulin scFv-V2122 expression vector.
  • MCS2 multicloning site 2
  • Flow cytometer Ramos cells human Burkitt lymphoma-derived cells (JCR cell bank) that highly express human CD20 antigen were collected by centrifugation.
  • Cells were suspended in PBS (1 ⁇ 10 6 cells / mL) and incubated with test antibodies (0 nM, 0.5 nM, 5 nM, 50 nM, 100 nM) for 30 minutes at room temperature.
  • test antibodies 0. nM, 0.5 nM, 5 nM, 50 nM, 100 nM
  • 0.1 mL of anti 6xHis-tag antibody Alexa Flour 488 500 ng / mL
  • the binding mode and specificity of the test antibody was evaluated by guava easyCyte (Merck Millipore) according to the manufacturer's instructions (FIG. 18).
  • mice Female nude mice aged 5 to 6 weeks (Sankyo Lab) with 0.1 mL of a mixture of Ramos cell suspension and Matrigel matrix (Corning) 1: 1 (5 ⁇ 10 6 cells / 0.1 mL) Service) was inoculated subcutaneously into the left flank. These mice were raised for several weeks to develop tumors. One week before imaging, the animals were switched to a low-fluorescence feed (iVid # 1, Oriental Yeast Co., Ltd.). Mice with an average tumor volume of 100-600 mm 3 were used for the fluorescence imaging test.
  • FIG. 18 shows that the Rituximab-scFv-V2122 antibody is bound to the target cells in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 19 it was confirmed that the Rituximab-scFv-V2122 antibody had accumulated tumors in model mice 2 hours after administration.
  • the Rituximab-scFv-V2122 antibody and Psyche F-IRDye 800 are also bound in vivo, and can be rapidly accumulated in a location specific to the tumor. That is, the Rituximab-scFv-V2122 antibody is a useful diagnostic and therapeutic drug candidate that can quickly deliver a diagnostic drug or a therapeutic drug to a tumor site.
  • Example 12 Biological imaging using anti-epiregulin scFv-V2122 (1) Protein expression and crude purification Expression of anti-epiregulin scFv-V2122 protein using the anti-epiregulin scFv-V2122 expression vector described in (1) of Example 10 Carried out. Specifically, the plasmid vector pETDuet-epiregulin-scFvV2122_skp was introduced into BL21 (DE3) (Nippon Gene) for transformation. The transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C. in 100 mL of 2xYT medium (Difco Laboratories).
  • mice Females aged 5 to 6 weeks with 0.1 mL of a mixture of human colon cancer-derived DLD1 cell suspension and Matrigel matrix (Corning) 1: 1 (5 ⁇ 10 6 cells / 0.1 mL) Nude mice (Sankyo Lab Service) were inoculated subcutaneously into the left flank. These mice were raised for several weeks to develop tumors. One week before imaging, the animals were switched to a low-fluorescence feed (iVid # 1, Oriental Yeast Co., Ltd.). Mice with an average tumor volume of 100-600 mm 3 were used for the fluorescence imaging test.
  • a low-fluorescence feed iVid # 1, Oriental Yeast Co., Ltd.
  • the anti-epiregulin scFv-V2122 antibody and Psyche F-IRDye 800 are also bound in vivo. It has been shown.
  • the anti-epiregulin scFv-V2122 antibody label was accumulated in the tumor of the model mice earlier (2 hours after administration) than the IgG label.
  • the anti-epiregulin scFv-V2122 antibody and Psyche F-IRDye 800 are also bound in vivo and can be quickly accumulated in a location specific to the tumor. That is, the anti-epiregulin scFv-V2122 antibody is a useful diagnostic and therapeutic drug candidate because it can quickly deliver a diagnostic drug or a therapeutic drug to a tumor site.

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Abstract

　本発明の課題は、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体を提供し、更にこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体を提供することである。本発明によれば、ビオチン改変体の２量体からなる化合物、ストレプトアビジン変異体、並びにそれらの利用が提供される。

Description

ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用
　本発明は、ビオチン改変体の２量体からなる化合物、ストレプトアビジン変異体、並びにそれらの利用に関する。
　アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Kd=10-15 から10-14M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン - ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている（Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67）。アビジンは卵白由来の塩基性糖タンパクで、等電点は１０を超える。一方、ストレプトアビジンは放線菌（Streptomyces avidinii）由来で、等電点は中性付近で糖鎖は含まない。両タンパク質とも、４量体を形成し、１つのサブユニット当たり1分子のビオチンと結合する。分子量は60kDa程度である。
　近年このアビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組合わせたドラッグデリバリーの方法、プレターゲティング法が考案されている（Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302）。しかしながら、ニワトリ由来のアビジンや微生物由来のストレプトアビジンは人体に対し高い免疫原性を示すため、人体に投与後、早期に抗アビジン／ストレプトアビジン抗体が産生されることが問題となりプレターゲティング法の実用化を妨げている原因の１つとなっている（Paganelli, (1991),  Cancer Res., 51, 5960-5966）。上記問題を解決するための低免疫原性ストレプトアビジンが報告されている（国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５）。
　さらに、ビスビオチン（ビオチン２分子をリンカーで繋いだ化合物）とストレプトアビジン変異体とを使用したプレターゲティング法が報告されている（Park et al., Clin Cancer Res; 17(23); 7373-82, 2011）。この方法では、Ｓ４５Ａ又はＹ４３Ａのアミノ酸変異を有するストレプトアビジン変異体を使用することにより、内在性ビオチンの問題を解消することが提唱されている。すなわち、Ｓ４５Ａ又はＹ４３Ａを有するストレプトアビジン変異体とビオチンとの結合は、野生型ストレプトアビジンよりも劣るものであるが、ビス化することによりストレプトアビジン変異体はビスビオチンと強固に結合する。
国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５
Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67 Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302 Paganelli, (1991),  Cancer Res., 51, 5960-5966）。 Park et al., Clin Cancer Res; 17(23); 7373-82, 2011
　上記したような低免疫原性ストレプトアビジンは、人体に対する免疫原性が低下しているという特徴を有するものであるが、人体に内在するビオチンに対する親和性を有するため、診断用途の場合にはバックグラウンドが高くなるという問題や、治療用途の場合にも疾患に特異的に薬効を発揮できない可能性があるという懸念がある。そこで、本発明は、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体を提供し、更にこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体を提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、上記ストレプトアビジン変異体とビオチン改変体との組み合わせを用いた診断薬・治療薬、上記ストレプトアビジン変異体とビオチン改変体との組み合わせを用いた診断キット・治療キットを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５に記載された低免疫原性ストレプトアビジン変異体に対して更に所定のアミノ酸変異を導入することにより、天然ビオチンに対する親和性が低減したストレプトアビジン変異体を得ることに成功した。同時にビオチンの構造の一部を改変したビオチン改変体の２量体化合物を合成した。そして上記ストレプトアビジン変異体と上記ビオチン改変体の２量体化合物の親和性を調べた結果、互いに親和性を有する組み合わせを見出し、本願発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　下記式（１）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、Ｌは連結基を示す。）
［２］　ｎ１及びｎ２が０である、下記式（２）で示される、［１］に記載の化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ、Ｘ２ｂ、Ｙ1、Ｙ2、Ｚ1、Ｚ2、Ｖ1、Ｖ2、ｍ１、ｍ２及びＬは、［１］と同義である）
［３］　Ｌが、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、炭素数１から１０のアルキレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、又はそれらの組み合わせである、［１］又は［２］に記載の化合物。
［４］　Ｌが、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）q－Ｏ－（ＣＨ2）r－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）q－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ3）－（ＣＨ2）p－ＮＨＣＯ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）s－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ3）－ＮＨ－ＣＯ－、又は－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－Ｏ－（ＣＨ2）t－ＮＨＣＯ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）s－Ｏ－（ＣＨ2）u－ＮＨ－ＣＯ－である（式中、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、及びｕはそれぞれ独立に１～１０の整数を示す）、［１］から［３］の何れかに記載の化合物。
［５］　以下の何れかの化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［６］　［１］から［５］の何れかに記載の化合物に、放射性同位元素を捕捉するキレート基が結合している化合物。
［７］　［１］から［５］の何れかに記載の化合物に、蛍光化合物又は薬剤化合物が結合している化合物。
［８］　以下の何れかの化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［９］　配列番号３に記載のアミノ酸配列において３７番目のアミノ酸残基であるAsnが他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる、ストレプトアビジン変異体。
［１０］　配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体。
［１１］　［９］又は［１０］に記載のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡ。
［１２］　［９］又は［１０］に記載のストレプトアビジン変異体に分子プローブを結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物。
［１３］　分子プローブが抗ヒトCD20抗体である、［１２］に記載のストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物。
［１４］　分子プローブが、リツキシマブである、［１２］に記載のストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物。
［１５］　分子プローブが、抗エピレギュリン一本鎖抗体である、［１２］に記載のストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物。
［１６］　［１２］から［１５］の何れかに記載のストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物を含む、治療剤又は体内あるいは体外診断剤。
［１７］　（ａ）［１２］から［１５］の何れかに記載のストレプトアビジン変異体―分子プローブ結合物；及び（ｂ）［１］から［５］の何れかに記載の化合物で標識した体内あるいは体外診断用又は治療用物質を含む治療又は体内あるいは体外診断キット。
　本発明によれば、免疫原性が低減すると同時に天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体と、上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体の２量体化合物との組み合わせが提供される。本発明のストレプトアビジン変異体とビオチン改変体の２量体化合物との組み合わせは、プレターゲティング法に基づく診断法・治療法において有用である。
図１は、結晶構造解析の結果を示す。 図２は、結晶構造解析の結果を示す。 図３は、希釈法による巻き戻し効率の測定結果を示す。 図４は、V2122と各化合物とのITCによる相互作用を示す。 図５は、カニクザルを用いた免疫原性試験の結果を示す。 図６は、結晶構造解析の結果を示す。図６の3番目の図は、V2122と化合物Cの複合体の結晶構造を示す。 図７は、結晶構造解析の結果を示す。 図８は、Flow cytometerによるRAMOS細胞上CD20の認識解析の結果を示す。 図９は、野生型ストレプトアビジン変異体Y43AおよびS45Aとの性能比較を示す。 図１０は、野生型ストレプトアビジン変異体Y43AおよびS45Aとの性能比較を示す。 図１１は、発現させた抗エピレギュリンscFvをゲルろ過で精製後にSDS-PAGEした結果を示す。 図１２は、抗エピレギュリンscFvとエピレギュリンとの複合体の構造解析の結果を示す。 図１３は、抗エピレギュリンscFv-V2122タンパク質の精製の結果を示す。 図１４は、抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCの抗原結合性をSPR（Biacore T200）にて確認した結果を示す。 図１５は、抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCを用いた細胞染色および内在化の解析の結果を示す。 図１６は、抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCを用いたFACS解析の結果を示す。 図１７は、Rituximab-scFv-V2122タンパク質の Protein L カラムによる精製の結果を示す。 図１８は、Rituximab-scFv-V2122を用いたフローサイトメーターの結果を示す。 図１９は、Rituximab-scFv-V2122を用いた生体内イメージングの結果を示す。 図２０は、抗エピレギュリンscFv-V2122のProtein L カラムによる精製の結果を示す。 図２１は、抗エピレギュリンscFv-V2122を用いた生体内イメージングの結果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）ビオチン改変体２量体化合物
　本発明のビオチン改変体２量体化合物は、下記式（１）で示される化合物であり、好ましくは式（１）においてｎ１及びｎ２が０である場合である式（２）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、Ｌは連結基を示す。）
　式（１）及び式（２）において、下記構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 で示される部分は好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 の何れかであるが、これらに限定はされない。
　ｍ１及びｍ２は１から１０の整数を示し、好ましくは２から１０の整数、より好ましくは２から８の整数、より好ましくは２から６の整数を示す。
　Ｌは、好ましくは、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、炭素数１から１０のアルキレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、又はそれらの組み合わせからなる連結基である。更に好ましくは、Ｌは、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）q－Ｏ－（ＣＨ2）r－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）q－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ3）－（ＣＨ2）p－ＮＨＣＯ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）s－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ3）－ＮＨ－ＣＯ－、又は－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－Ｏ－（ＣＨ2）t－ＮＨＣＯ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）s－Ｏ－（ＣＨ2）u－ＮＨ－ＣＯ－である（式中、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、及びｕはそれぞれ独立に１～１０の整数を示す）。より好ましくは、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはそれぞれ独立に２から８の整数、より好ましくは２から６の整数を示す。より好ましくはｔ、及びｕはそれぞれ独立に１～４の整数を示す。フェニレン基上の置換基としては、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ2、置換されていてもよいアミド基、－ＣＯ－ＮＨ2などが挙げられる。
　本発明の式（１）又は式（２）の化合物は、以下の実施例１に記載の合成方法により合成することができる。実施例１における化合物５、７、１１、１３、１５、２２、２４、３６及び５０は、本発明の式（１）又は式（２）の化合物である。
化合物５の合成方法
　化合物１の酢酸エチル 溶液に1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を加え、N,N-ジメチルホルムアミド を加え、クロロホルムとN,N-ジメチルホルムアミド の混合溶媒に溶解した2,2'-オキシビス(エチルアミン)を反応混合物へ加えた後、室温で反応させることにより、tert-ブチル 6,6'-[2,2'-オキシビス(エタン-2,1-ジイル)ビス(アザンジイル)]ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)ジカーボネート（化合物2 ）を得る。ジカーバメート体2のジクロロメタン溶液に、トリフルオロ酢酸を加え、室温で30分反応させることでN,N'-[2,2'-オキシビス(エタン-2,1-ジイル)]ビス(6-アミノヘキサナミド)（化合物3）を得る。ジアミン3のN,N-ジメチルホルムアミド及びピリジン混合溶液にEZ-LinkR NHS-Iminobiotinを加え、室温で反応させる。粗生成物をジオキサンと水の混合溶媒に溶解し、25%アンモニア水溶液を加え、室温で反応させることにより(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(5,12,20,27-テトラオキソ-16-オキサ-6,13,19,26-テトラアザヘントリアコンタン-1,311-ジイル)ビス[テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム]ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（化合物5）を得る。
化合物７の合成方法
　ジアミン6のN,N-ジメチルホルムアミド及びピリジンの混合溶液にEZ-LinkR NHS-Iminobiotinを加え、室温で反応させる。溶媒を減圧留去後、ジオキサンに溶解し、25%アンモニア水溶液を加え、室温で反応させることにより、 (3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(5,12,18,25-テトラオキソ-6,13,17,24-テトラアザノナコサン-1,29-ジイル)ビス[テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム]ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (化合物7) を得る。
化合物１１の合成方法
　化合物1のN,N-ジメチルホルムアミドに、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を加えた後、N,N-ジメチルホルムアミドに溶解した3,5-ジアミノ安息香酸エチル（化合物8）を加えて、室温で反応させることにより、3,5-ビス[6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサナミド]安息香酸エチル（化合物9）を得る。ジカーバメート体9のジオキサン溶液に、4規定塩化水素ジオキサン溶液を加え、室温で反応させることにより、6,6'-[5-(エトキシカルボニル)-1,3-フェニレン]ビス(アザンジイル)ビス(6-オキソヘキサン-1-アンモニウム)ジクロリド（化合物10）を得る。アンモニウム塩10にN,N-ジメチルホルムアミドを加え、次いでトリエチルアミンを加えることで溶解する。EZ-LinkR  NHS-Iminobiotinを加え、室温で反応させる。粗生成物をメタノールに溶解し、2規定水酸化ナトリウム水溶液を加え、室温で22時間攪拌する。これにより、3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{5,5'-[6,6'-(5-カルボキシ-1,3-フェニレン)ビス(アザンジル)ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)]ビス(アザンジイル)ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル)}ビス(テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート（化合物11）を得る。
化合物１３の合成方法
　ビスイミノビオチン11のN,N-ジメチルホルムアミド溶液に、N,N'-ジイソプロピルカルボジミドと1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物 を加えた後、アミン12のN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え、60℃で反応させる。これにより、、(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{5,5'-[6,6'-(5-(2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチルカルボニル)-1,3-フェニレン)ビス(アザンジイル)ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)]ビス(アザンジイル)ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル)}ビス(テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)トリ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（化合物13 ）を得る。
化合物１５の合成方法
　ジアミン10にジオキサンとピリジンを加え、次いでEZ-LinkR　NHS-Iminobiotinを加え、室温で反応させる。溶媒を減圧留去した後、粗生成物をジオキサン、水に溶解し、28%アンモニア水溶液を加え、室温で反応させることにより、 (3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{5,5'-[6,6'-(5-カルバモイル-1,3-フェニレン)ビス(アザンジイル)ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)]ビス(アザンジイル)ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル)}ビス[テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム]ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (化合物15)を得る。
化合物２２の合成方法
　5-(4-ヨードベンズアミド)イソフタル酸のN,N-ジメチルホルムアミド溶液に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物を加えた後、アミン12のN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え、室温で反応させることにより、N1,N3-ビス{2-[2-(2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)エトキシ]エチル}-5-(4-ヨードベンズアミド)イソフタルアミド（化合物17）を得る。
　ジカーバメート体17 のジクロロメタン溶液に、トリフルオロ酢酸を加え、室温で反応させることにより、N1,N3-ビス{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチル}-5-(4-ヨードベンズアミド)イソフタルアミド（化合物18）を得る。
　Boc-Asp(OtBu)-OH (化合物19a) とN-ヒドロキシスクシンイミドのN,N-ジメチルホルムアミド溶液に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を加え、室温で反応させることにより、(S)-1-tert-ブチル 4-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) 2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)スクシノエート（化合物19）を得る。
　ジアミン化合物18 のジオキサンとピリジンの混合溶液に、活性エステル19を加え、室温で反応させ、更に化合物19を加え、室温で反応させることにより、(14S,14'S)-1,1'-[5-(4-ヨードベンズアミド)-1,3-フェニレン]ビス[14-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11-ジアザペンタデカン酸]tert-ブチル（化合物20）を得る。
　化合物20にトリフルオロ酢酸を加え、室温で反応させることにより、(14S,14'S)-1,1'-[5-(4-ヨードベンズアミド)-1,3-フェニレン]ビス(14-カルボキシ-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11-ジアザテトラデカン-14-アンモニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（化合物21）を得る。
　ビスアミノ酸21をジオキサンと水の混合溶媒に懸濁させ、次いで1規定水酸化ナトリウム水溶液を加え、室温で攪拌して溶解した後、EZ-LinkR NHS-Iminobiotinを加え、室温で反応させる。2規定水酸化ナトリウム水溶液を加え、更に室温で反応させることにより、(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{(14S,14'S)-1,1'-[5-(4-ヨードベンズアミド)-1,3-フェニレン]ビス(14-カルボキシ-1,12,16-トリオキソ-5,8-ジオキサ-2,11,15-トリアザエイコサン-20,1-ジイル)}ビス(テトラヒドロ‐1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（化合物22）を得る。
化合物２４の合成方法
　ジアミン3のN,N-ジメチルホルムアミド溶液にビオチン N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (化合物23) を加え、室温で反応させることにより、N,N'-[2,2'-オキシビス(エタン-2,1-ジイル)]ビス{6-[5-((3aS, 4S, 6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド]ヘキサナミド}（化合物24）を得る。
化合物３６の合成方法
　2-イミノビオチン39 にトリフルオロ酢酸を加え、撹拌した後に過剰のトリフルオロ酢酸を減圧留去する。得られた白色固体のアセトニトリル溶液にピリジン、ジスクシンイミド 40を加え、30℃で攪拌し、溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで化合物41を得る。ジアミン34 のN,N-ジメチルホルムアミド、トリエチルアミン混合溶液に、2-イミノビオチン39より調製したエステル41を加え、室温で攪拌し、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー (水／メタノール＝2：1→1:2) で精製することで、化合物35を得る。ビスイミノビオチン35 の水溶液に、トリフルオロ酢酸を加え、50℃で4時間攪拌し、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー (水／メタノール＝2：1→1:2) で精製することで、化合物36 を得る。
化合物５０の合成方法
　ジスクシンイミド体30のN,N-ジメチルホルムアミド 溶液に、アミン45のN,N-ジメチルホルムアミド溶液加え、室温で攪拌する。さらにアミン45のN,N-ジメチルホルムアミド溶液) を加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去後、酢酸エチルを加え、1 M水酸化ナトリウム水溶液、1 M塩酸、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン／ヘキサン＝1：30→1:20→1:10→1:5) で精製することで化合物46を得る。上記で得たジカーバメート体47の水溶液にトリフルオロ酢酸を氷冷下加え、撹拌した後、室温に昇温しさらに攪拌する。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、化合物48 を含む粗生成物を得る。2-イミノビオチン39より調製した化合物41を用意した試験管に、ジアミン48のN,N-ジメチルホルムアミド溶液、ジイソプロピルエチルアミンを加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール／水＝２：１, 0.3% TFA) で精製することで、化合物49を得る。ビスイミノビオチン49にトリフルオロ酢酸と水の混合溶液を加え、50℃に昇温して撹拌する。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、化合物50 を得る。
　本発明によればさらに、上記した本発明のビオチン改変体２量体化合物に、放射性同位元素を捕捉するキレート基が結合している化合物が提供される。本発明で用いることができるキレート基としては、DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N、N'、N''、N'''-テトラ酢酸),　DTPA(ジエチレントリアミン５酢酸)、TETA(1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-N、N'、N''、N'''-テトラ酢),　N2S2、MAG3、CHX-A-DTPA、などを挙げることができる。
　本発明によればさらに、上記したキレート基が結合している化合物に放射性同位元素が捕捉されている化合物が提供される。キレート基に捕捉される放射性同位元素の内、イメージング用の放射性同位元素としてはガンマ線核種（67Ga、99mTc、111In、123I、ポジトロン放出核種（18F、62Cu、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、86Y、89Zr、4Tc、124I）,を用いることができる。治療用の放射性同位元素としては、ペーター線核種（32P、67Cu、89Sr、90Y、114mIn、117mSn、131I、153Sm、166Ho、177,Lu、186,Re、188Re等）、アルファー線核種(211At、212Bi、212,Pb、213Bi、223Ra、225Ac等)、オージェ電子線核種(125I、165Er等)、を用いることができる。上記の中でも好ましくは、64Cu、124I,76Br, 68Ga、99mTc、123I、131I、90Yを用いることができる。
　本発明によればさらに、上記した本発明のビオチン改変体２量体化合物に蛍光化合物又は薬剤化合物（例えば、抗がん剤）が結合している化合物が提供される。
　本発明で用いることができる蛍光化合物としては、フルオレセイン5-イソチオシアナート （FITC）、IR Dye（登録商標）800、又はフルオレセインなどを挙げることができる。本発明で用いることができる薬剤（例えば、抗がん剤）としては、PBD (ピロロベンゾジアゼピン)クラス（例えば、SJG-136、SG2202など）、メイタンシン（maytansine） 類縁体（例えば、DM1、DM4など）、ドラスタチン（dolastatin） 類縁体（例えば、Monomethyl auristatin E (MMAE)、Monomethyl　auristatin F (MMAF)、dolastatin 10、tubulysinなど）、デュオカルマイシン（duocarmycin）類縁体（例えば、DC1、DC4、DC44など）、カンプトテシン（ camptothecin）類縁体（例えば、SN-38など）、その他（例えば、メトトレキサート（methotrexate）、ビンブラスチン（vinblastine）、カリケアミシン（calicheamicin）、α－アマニチン（α-amanitin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、メルファラン（melphalan））などを挙げることができる。
　本発明の式（１）又は式（２）の化合物に放射性同位元素を捕捉するキレート基が結合している化合物、及び本発明の式（１）又は式（２）の化合物に蛍光化合物又は薬剤化合物が結合している化合物の具体例としては、実施例１における化合物１４、４２、４４、５１、５２及び５９を挙げることができ、以下の実施例１に記載の合成方法により合成することができる。
化合物１４の合成方法
　ビスイミノビオチン13のメタノール溶液にトリエチルアミンとフルオレセイン5-イソチオシアナートを加え、室温で反応させることにより、 (3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{5,5'-[6,6'-(5-(2-(2-(2-(3-(3',6'-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-5-イル)チオウレイド)エトキシ)エトキシ)エチルカルバモイル)-1,3-フェニレン)ビス(アザンジイル)ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)]ビス(アザンジイル)ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル)}ビス(テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（化合物14）を得る。
化合物４２の合成方法
　ビスイミノビオチン36のメタノール、トリエチルアミン 混合溶液に、DOTA-NHS-ester37を加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相HPLC (0.0-20.0-20.5-60.5-61.0-75.0 min; 5.0-5.0-17.5-57.5-100.0-100.0% CH3CN in 0.1% HCOOHMQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 31.5 min) で精製することで、化合物42を得る。
化合物４４の合成方法
　ビスイミノビオチン36のN,N-ジメチルホルムアミド、トリエチルアミン混合溶液に、IRDyeR 800CW NHS Esterを加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相HPLC (0.0-20.0-20.5-60.5-61.0-75.0 min; 5.0-5.0-17.5-57.5-100.0-100.0% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 40.9 min) で精製することで、化合物44を得る。
化合物５１の合成方法
　ビスイミノビオチン50のメタノール、トリエチルアミン混合溶液に、DOTA-NHS-ester 37(3.5 mg, 4.6 μmol) を加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相HPLC(0.0-20.0-20.5-60.5-61.0-75.0 min; 5.0-5.0-17.5-57.5-100.0-100.0% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 32.6 min) で精製することで、化合物51を得る。
化合物５２の合成方法
　ビスイミノビオチン50のメタノール、トリエチルアミン混合溶液に、5(6)-カルボキシフルオレセイン N-ヒドロキシスクシミドエステル51を加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー(メタノール／水＝1：1→2：1, 0.5% TFA) で精製し、さらにSephadex 20LH（メタノール, 1% TFA）で精製することで、化合物52を得る。
化合物５９の合成方法
　SN38 Boc保護体53、Cbz-Ala-OH 54のジクロロメタン溶液に、氷冷下1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、 ジメチルアミノピリジンを加え、徐々に室温へ昇温し攪拌する。ジクロロメタンを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液、水、0.1 M塩酸、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン／メタノール＝30：1) で精製することで、化合物55 を得る。化合物55の酢酸エチル溶液にPd/Cを加え、容器内を水素雰囲気に置換後、室温で攪拌後、40℃で撹拌し、セライト濾過する。溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を薄層クロマトグラフィー (ジクロロメタン／メタノール＝30：1) で精製することで、化合物56を得る。化合物56のジクロロメタン溶液に、氷冷下トリホスゲン、ピリジンを加え、室温に昇温して撹拌し、溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、化合物57 を含む粗生成物(褐色液体) を得る。ビスイミノビオチン50および化合物57を含む粗生成物のメタノール溶液に、トリエチルアミンを加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相薄層クロマトグラフィー（メタノール／水＝3：1,　１％TFA）で精製することで、化合物58を得る。ビスイミノビオチン58の水溶液に、トリフルオロ酢酸を加え、室温で攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相薄層クロマトグラフィー（メタノール／水＝3：1,　１％TFA）で精製することで、化合物59を得る。
（２）ストレプトアビジン変異体
　本発明のストレプトアビジン変異体は、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、所定のアミノ酸の変異を有し、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下していると同時に、天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低減していることを特徴とする。
　野生型（天然）のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示し、これをコードする塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
　本発明のストレプトアビジン変異体としては、具体的には、配列番号３に記載のアミノ酸配列において３７番目のアミノ酸残基であるAsnが他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる、ストレプトアビジン変異体が挙げられる。特に好ましくは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体である。
　配列番号３に記載のアミノ酸配列は、配列番号２に記載したアミノ酸配列を有するストレプトアビジンにおいて、
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
（７）１１番目のアミノ酸残基のアスパラギンがアスパラギン酸に置換している変異；
（８）１５番目のアミノ酸残基のセリンがアスパラギン酸に置換している変異：
（９）３３番目のアミノ酸残基のセリンがアスパラギンに置換している変異；
を有するアミノ酸配列である。
　配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列番号３に記載したアミノ酸配列においてさらに、
（１０）３７番目のアミノ酸残基のアスパラギンがグリシンに置換している変異：
を有するアミノ酸配列である。
　本発明で言う、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下しているとは、ストレプトアビジン変異体をヒトなどの哺乳動物に投与した場合における免疫原性が低下していることを言う。免疫原性が低下していることは、例えば、以下の方法で確認することができる。即ち、本発明のストレプトアビジン変異体について、野生型ストレプトアビジンをカニクイサルに免疫して取得した抗ストレプトアビジン抗血清に対する反応性を解析し、上記の抗ストレプトアビジン抗血清に対する反応性が野生型ストレプトアビジンに比べて低下していれば、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下していると判断することができる。上記した方法で免疫原性の低下を判断した場合、本発明のストレプトアビジン変異体は、野生型ストレプトアビジンと比較して、免疫原性が好ましくは８０％以下、さらに好ましくは６０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下に低下している。
　本発明で言う天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低減しているとは、ストレプトアビジン変異体と天然ビオチン又はビオシチンとの結合性が、ストレプトアビジンと天然ビオチン又はビオシチンとの結合性と比較して低下していることを意味する。ストレプトアビジン変異体と天然ビオチン又はビオシチンとの親和性・結合性は、ＳＰＲ解析などにより評価することができる。本発明のストレプトアビジン変異体は、野生型ストレプトアビジンと比較して、天然ビオチン又はビオシチンとの親和性が好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、さらに好ましくは４０％以下に低下している。
　本発明によればさらに、上記した本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡが提供される。本発明のＤＮＡは、野生型（天然）のストレプトアビジンをコードするＤＮＡに対して部位特異的変異誘発により作製することができる。
　上記した本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡは、ベクターに組み込んで使用することができる。特に、本発明のストレプトアビジン変異体を製造するためには、本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを宿主に形質転換することによって、本発明のストレプトアビジン変異体を発現させることができる。
　大腸菌を宿主とする場合には、本発明で用いるベクターとしては、複製起点（ori）を有し、さらに形質転換された宿主を選択するための遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子など）を有していることが好ましい。また、発現ベクターの場合には、宿主において本発明のストレプトアビジン変異体を効率よく発現させることができるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーターまたはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1（ファルマシア）、「QIAexpress system」（キアゲン）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21を使用することが好ましい)などが挙げられる。また、ベクターには、本発明のストレプトアビジン変異体の収量をあげるためのシグナル配列などを付加することもできる。
　宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また、可溶性を向上させるためのタグ、例えばグルタチオンーS－トランスフェラーゼやチオレドキシン、マルトース結合蛋白質をコードする配列が付加されていてもよい。また、精製を容易にすることを目的にした設計されたタグ、例えばポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃエピトープ、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、Ｔ７エピトープ、ＸｐｒｅｓｓタグやＦＬＡＧペプチドタグ、その他の既知のタグ配列をコードする配列が付加されていてもよい。
　大腸菌以外にも、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3(インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、原核生物および真核生物のいずれでもよい。例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。
　真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、HeLa細胞、Vero細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5などを用いることができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
　植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
　原核細胞を使用する場合は、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
　これらの細胞を、本発明のＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより本発明のストレプトアビジン変異体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6～8であるのが好ましい。培養は、通常、約30～40℃で約15～200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。また、細胞の増殖を促進するための成長因子の添加を行ってもよい。
（３）ストレプトアビジン変異体及びビオチン改変体の利用
　さらに本発明によれば、本発明のストレプトアビジン変異体に分子プローブを結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体―分子プローブ結合物、並びにストレプトアビジン変異体―分子プローブ結合物を含む治療剤又は診断剤が提供される。さらに、上記したストレプトアビジン変異体―分子プローブ結合物は、本発明のストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変体で標識した診断用又は治療用物質と組み合わせて、治療又は診断キットとして提供することができる。分子プローブとしては、例えば抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を挙げることができ、具体的には、癌に特異的に発現する以下抗原を標的とした抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を用いることができる。
エピレギュリン、ROBO1,2,3,4、1-40-β-アミロイド, 4-1BB, 5AC, 5T4, ACVR2B, 腺がん抗原,　α-フェトプロテイン, アンギオポエチン2, 炭疽毒素, AOC3 (VAP-1), B-リンパ腫細胞, B7-H3, BAFF, βアミロイド, C242抗原, C5, CA-125, カルボニックアンヒドラーゼ9 (CA-IX), 心臓ミオシン, CCL11 (eotaxin-1), CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (basigin), CD147 (basigin), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD154, CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE受容体), CD25(IL-2受容体のα鎖), CD28, CD3, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD37, CD38(サイクリックADPリボースヒドロラーゼ), CD4, CD40, CD41(インテグリンα-IIb), CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CFD, ch4D5, CLDN18.2, クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）,クランピング因子A, CSF2, CTLA-4, サイトメガロウイルス, サイトメガロウイルス糖タンパク質B, DLL4, DR5, E. coli 志賀毒素１型, E. coli志賀毒素２型、EGFL7, EGFR, エンドトキシン, EpCAM, エピシアリン（episialin）, ERBB3, 大腸菌（Escherichia coli）, 呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus）のFタンパク質, FAP, フィブリンIIβ鎖, フィブロネクチンエクストラドメイン-B, 葉酸受容体1, Frizzled 受容体, GD2, GD3ガングリオシド, GMCSF受容体α鎖, GPNMB, Ｂ型肝炎表面抗原, Ｂ型肝炎ウイルス、HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HIV-1, HLA-DRβ, HNGF, Hsp90, ヒトβアミロイド,ヒト分散因子（scatter factor）受容体キナーゼ, ヒトTNF, ICAM-1 (CD54), IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 領域, IGF-1受容体, IGF-I, IgG4, IGHE, IL-1β, IL-12, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-23, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6受容体, IL-9, ILGF2, インフルエンザA ヘマグルチニン, インスリン様増殖因子I受容体, インテグリンα4, インテグリンα4β7, インテグリンα5β1, インテグリンα7 β7, インテグリンαIIbβ3, インテグリンαvβ3, インテグリンγ誘導タンパク質,インターフェロン受容体, インターフェロンα/β受容体, ITGA2, ITGB2 (CD18), KIR2D, L-セレクチン(CD62L), Lewis-Y抗原, LFA-1 (CD11a), リポタイコ酸, LOXL2, LTA, MCP-1, メソテリン、MS4A1, MUC1, ムチンCanAg, ミオスタチン, N-グリコリルノイラミン酸, NARP-1, NCA-90 (顆粒球抗原), NGF, NOGO-A, NRP1, Oryctolagus cuniculus, OX-40, oxLDL, PCSK9, PD-1, PDCD1, PDGF-R α, フォスファチジルセリン,前立腺がん細胞、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）,狂犬病ウイルス糖タンパク質、RANKL, 呼吸器合胞体ウイルス, RHD, Ｒｈ（Rhesus）因子, RON, RTN4, スクレロスチン, SDC1, セレクチンP, SLAMF7, SOST, スフィンゴシン-1-ホスフェート, TAG-72, TEM1, テネイシンC, TFPI, TGFβ1, TGFβ2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 腫瘍抗原CTAA16.88,MUC1の腫瘍特異的グリコシル化, TWEAK受容体, TYRP1(グリコプロテイン75), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, ビメンチン, VWF
　分子プローブの好ましい具体例としては、抗ヒトCD20抗体（例えば、リツキシマブ）、又は抗エピレギュリン一本鎖抗体である。
　リツキシマブは抗ヒトCD20抗体であり、ヒトCD20はヒトB細胞にのみ発現する。マウス型抗CD20モノクロナール抗体に放射性同位元素９０Ｙを標識した細胞性非ホジキンスリンパ腫、マントル細胞リンパ腫治療薬が、ゼヴァリン（登録商標）として市販されている。当該医薬品は、抗CD２０抗体に直接RIが標識され、体内投与後腫瘍集積までに数日の時間を要する。そのためＲＩによる骨髄抑制などの重篤な副作用が生じる。これらの解決策として、プレターゲッティング法が提唱されている（非特許文献３）。Pagneliらは、抗CD２０抗体-scfvとストレプトアビジン変異体との融合タンパク及びRI標識ビオチンあるいはビスビオチンを用いたプレターゲッティング法の検討を行っている(非特許文献５)。
　エピレギュリン（Epiregulin）は、上皮細胞成長因子（epidermal  growth  factor）のメンバーであり、Hela細胞の形態変化を誘導する癌増殖阻害因子として機能することが知られている。油谷らは、抗epireulin抗体を作製した（WO2008/047723）。またLeeらは、抗エピレギュリン抗体のヒト化とその評価を行った（Biochemical  and　Biophysical  Research  communications  444（2013）1011-1017）。
　即ち、本発明においては、癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブと本発明のストレプトアビジン変異体との融合体を調製し、患者に投与することで、癌細胞に特異的に本発明のストレプトアビジン変異体を集積できることができる。次に、上記ストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変体に結合させた診断用もしくは治療用物質（蛍光色素、化学発光剤、放射性同位元素、金属化合物等からなる増感剤、金属化合物等からなる中性子捕捉剤、薬剤などの低分子化合物、マイクロあるいはナノバブル、タンパク質など）を患者に投与することによって、癌細胞へ的確に物質を集積させることが可能になる。本発明においては、低免疫原性化により抗体産生が抑制され、抗体による早期の体内からのクリアランス、アナフィラキシーなどのショックを防ぐことができる。また、本発明においては患者から採取した組織、血清等を用いた体外診断薬、臨床検査薬として使用することで、組織、血清等に存在するビオチン或いはビオチン結合タンパク由来ノイズが低減し、よりＳ／Ｎ比の高い診断、検査が可能となる。
　あるいはまた、本発明においては、癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブと本発明のストレプトアビジン変異体との融合体と、上記ストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変体に結合させた診断用もしくは治療用物質（蛍光色素、化学発光剤、放射性同位元素、金属化合物等からなる増感剤、金属化合物等からなる中性子捕捉剤、薬剤などの低分子化合物、マイクロあるいはナノバブル、タンパク質など）とを結合させた結合体を調製し、上記結合体を患者に投与することもできる。
　ストレプトアビジン変異体に結合させる抗体は種々の分子を用いることができる。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体はどちらも使用することができる。抗体のサブクラスは特に問わないが、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ1が好適に用いられる。また、「抗体」は改変抗体および抗体断片の全てを含む。ヒト化抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の各種動物由来抗体、ヒト抗体と各種動物由来抗体とのキメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ）’2が挙げられるが、これらに限らない。
　ストレプトアビジン変異体と抗体の結合物は、当業者に公知の方法を用いて得ることができる。例えば、化学的結合方法（US5,608,060）によって得ることもできるし、ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡを連結し、発現ベクター等を用いて宿主細胞に発現させることにより、融合タンパクとして得ることもできる。ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡとの連結は、リンカーと呼ばれる適当なペプチドをコードするＤＮＡを介しても良い。ストレプトアビジン変異体―抗体結合物は、抗体と標的分子との特異的結合力を残して作製されることが望ましい。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１Ａ：ビオチン改変体２量体化合物の合成
一般的方法
　核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは、JEOL ECX500 (1H NMR: 500MHz)、またはJEOL ECS400(1H NMR: 400MHz) スペクトロメータを用いて測定した。化学シフトは、内部参照として重溶媒中の残存溶媒ピークに対する値としてppmで記載した （CDCl3:δ= 7.26 ppm,  CD3OD:δ= 3.31 ppm）。低分解能質量スペクトル (LHMS) は、Waters ZQ4000スペクトロメータによりESI-MSを用いて測定した。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル Merk 60 (230-400 mesh ASTM) を用いて行った。反応は薄層クロマトグラフィー (TLC)、あるいは低分解能質量分析 (LRMS) によって追跡した。
　逆相高速液体クロマトグラフフィー (HPLC) は、JASCO-HPLCシステムを用いて行った。210 nm または 254 nmの紫外光を用いて検出し、移動相はグラジエント溶媒系 (アセトニトリル／0.1% トリフルオロ酢酸MQ溶液) を用いた。分析については、YMC-Pack ODS-AM (150×4.6 mL) またはYMC-Triart-C18 (150×4.6 mL) のカラムを用い、流速 1 mL/minで行った。分取については、YMC-Pack ODS-AM (250×20 mL) またはYMC-Triart-C18 (250×10 mL) のカラムを用い、前者では流速8-10 mL/min、後者では流速3 mL/minで行った。
　EZ-Link（登録商標） NHS-Iminobiotinはサーモサイエンティフィック社から購入した。その他の試薬は、Aldrich、東京化成工業株式会社 (TCI)、関東化学株式会社 (Kanto)、和光純薬工業株式会社、渡辺化学工業株式会社から購入した。全ての試薬及び溶媒は、特に明記が無い限り市販品をそのまま使用した。
tert-ブチル 6,6'-[2,2'-オキシビス(エタン-2,1-ジイル)ビス(アザンジイル)]ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)ジカーボネート (2)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　既知の手法 (Carlescuら，Carbohydr.Res. (2010) 345, 33) により合成した1 (1.40 g, 6.05 mmol) の酢酸エチル (12 mL) 溶液に1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC・HCl, 1.22 g, 6.34 mmol) を加え、N,N-ジメチルホルムアミド (6 mL) を加えた後、氷浴で冷却した。クロロホルム (24 mL) とN,N-ジメチルホルムアミド (6 mL) の混合溶媒に溶解した2,2'-オキシビス(エチルアミン) (0.30 g, 2.88 mmol) を反応混合物へ加えた後、室温で17時間攪拌した。飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を0.5規定塩酸で2度、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2度、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン／メタノール＝20：1) で精製することで、標題化合物2 (0.982 g, 収率64%, 黄色高粘性油状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.29-1.36 (m, 4H), 1.43 (s, 18H), 1.48 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.62 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 2.20 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 3.02 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 3.35 (t, 4H, J = 5.7 Hz), 3.51 (t, 4H, J = 5.7 Hz); LRMS (ESI): m/z 553 [M+Na]+.
N,N'-[2,2'-オキシビス(エタン-2,1-ジイル)]ビス(6-アミノヘキサナミド) (3)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　ジカーバメート体2 (0.917 g, 1.73 mmol) のジクロロメタン (6 mL) 溶液に、トリフルオロ酢酸 (12 mL) を加え、室温で30分攪拌した。溶媒を減圧留去後、メタノール (1mL) に溶解して、AmberliteR IRA-400カラム (塩基性樹脂、20 mm × 200 mm) に通し、メタノールで溶出した。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、標題化合物3 (0.57 g, quant., 薄黄白色固体) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.35-1.40 (m, 4H), 1.53 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.63 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 2.22 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.70 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 3.35 (t, 4H, J = 5.7 Hz), 3.51 (t, 4H, J = 5.7 Hz); LRMS (ESI): m/z 166 [M+2H]2+.
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(5,12,20,27-テトラオキソ-16-オキサ-6,13,19,26-テトラアザヘントリアコンタン-1,311-ジイル)ビス[テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム]ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (5)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ジアミン3 (7.0 mg, 0.0212 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (0.4 mL)、ピリジン (0.1 mL) の混合溶液にEZ-LinkR NHS-Iminobiotin (4, 18.4 mg, 0.0424 mmol) を加え、室温で7時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、アセトンとジエチルエーテルの混合溶媒 (1:1) を加え超音波で洗浄した。生じた固体をろ過し、同一の溶媒で洗浄した後、固体を減圧下乾燥した。粗生成物をジオキサン (1.2 mL) と水 (0.8 mL) の混合溶媒に溶解し、25%アンモニア水溶液 (4.8 mL) を加え、室温で6時間攪拌した。水層をジエチルエーテルで洗浄後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物を逆相HPLC (0-10-11-41-42-55 min; 0-0-22-52-100-100% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 30 min (22-52%), tR = 22.0 min) で精製することで、標題化合物5 (10.8 mg, 2段階収率65%, 無色アモルファス状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.35 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.46 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.52 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.55-1.72 (m, 10H), 1.78 (sext., 2H, J = 7.5 Hz), 2.21 (t, 8H, J = 7.5 Hz), 2.83 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 3.01 (dd, 2H, J = 13.2, 5.2 Hz), 3.17 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 3.32 (ddd, 2H, J = 10.3, 5.8, 4.6), 3.36 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 3.51 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 4.54 (dd, 2H, J = 7.5, 4.6 Hz), 4.73 (dd, 2H, J = 7.5 , 5.2 Hz); LRMS (ESI): m/z 391 [M+2H]2+.
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-(5,12,17,24-テトラオキソ-6,13,16,23-テトラアザオクタコサン-1,28-ジイル)ビス[テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム]ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (7)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　既知の手法により合成したジアミン6 (3.3 mg, 0.0115 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (0.4 mL)、ピリジン (0.1 mL) の混合溶液にEZ-LinkR NHS-Iminobiotin (4, 10 mg, 0.0230 mmol) を加え、室温で6時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、ジオキサン (0.5 mL) に溶解し、25%アンモニア水溶液 (2.0 mL) を加え、室温で6時間攪拌した。水層をジエチルエーテルで洗浄後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物を逆相HPLC (YMC-Pack ODS-AM, グラジエント: 0-10-11-36-37-50 min; 0-0-17-42-100-100% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 25 min (17-42%), tR = 26.7 min) で精製することで、標題化合物7 (7.9 mg, 2段階収率71%, 無色アモルファス状) を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.31-1.38 (m, 4H), 1.42-1.55 (m, 8H), 1.56-1.70 (m, 10H), 1.78 (sext., 2H, J = 8.0 Hz), 2.20 (q, 8H, J = 7.2 Hz), 2.83 (d, 2H, J = 13.4 Hz), 3.01 (dd, 2H, J = 13.4, 4.5 Hz), 3.17 (t, 4H, J = 8.0 ), 3.27 (s, 4H), 3.30-3.33 (m, 2H), 4.54 (dd, 2H, J = 8.0, 4.5 Hz), 4.73 (dd, 2H, J = 7.6 4.5 Hz); LRMS (ESI): m/z 369 [M+2H]2+.
3,5-ビス[6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサナミド]安息香酸エチル (9)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　既知の手法 (Carlescuら，Carbohydr.Res. (2010) 345, 33) により合成した1 (2.82 g, 11.2 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (25 mL) に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC・HCl, 2.66 g, 12.8 mmol) を加えた後、N,N-ジメチルホルムアミド (10 mL) に溶解した3,5-ジアミノ安息香酸エチル8 (0.96 g, 5.33 mmol) を加えて、室温で2時間攪拌した。飽和食塩水と1規定塩酸を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を0.5規定塩酸で2度、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2度、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン／酢酸エチル＝1：1→1：3) で精製することで、標題化合物9 (2.27 g, 収率59%, 黄色油状) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.30-1.35 (m, 6H), 1.35-1.50 (m, 22H), 1.66 (quint., 4H, J = 7.6 Hz), 2.31 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 3.05 (q, 4H, J = 6.7 Hz), 4.30 (q, 4H, J = 7.2 Hz), 4.76 (brs, 2H), 7.91 (s, 2H), 8.05 (s, 1H), 8.54 (s, 2H); LRMS (ESI): m/z 629 [M+Na]+.
6,6'-[5-(エトキシカルボニル)-1,3-フェニレン]ビス(アザンジイル)ビス(6-オキソヘキサン-1-アンモニウム)ジクロリド (10)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ジカーバメート体9 (2.27 g, 3.74 mmol) のジオキサン (20 mL) 溶液に、4規定塩化水素ジオキサン溶液 (20 mL) を加え、室温で2時間攪拌した。生じた固体をジエチルエーテルで洗浄し、真空下乾燥することで、アンモニウム塩10を定量的に得た。更に少量のジクロロメタンに溶解し、ジエチルエーテルを加えると生じる固体をろ過し、ジエチルエーテルで洗浄することで、高純度の23 (1.47 g, 収率82%) を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.39 (t, 3H, J = 7.5 Hz), 1.48 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.71 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.75 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 2.44 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.95 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 4.36 (q, 2H, J = 7.5 Hz), 7.97 (d, 2H, J = 1.8 Hz), 8.19 (s, 1H); LRMS (ESI): m/z 407 [M+H]+.
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{5,5'-[6,6'-(5-カルボキシ-1,3-フェニレン)ビス(アザンジル)ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)]ビス(アザンジイル)ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル)}ビス(テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (11)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　アンモニウム塩10 (16.6 mg, 0.0346 mmol) にN,N-ジメチルホルムアミド (0.6 mL) を加え、次いでトリエチルアミン (14 μL, 0.104 mmol) を加えることで溶解した。EZ-LinkR NHS-Iminobiotin (4, 30 mg, 0.0691 mmol) を加え、室温で14時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、粗生成物をメタノール (0.5 mL) に溶解し、2規定水酸化ナトリウム水溶液 (138 μL, 0.276 mmol) を加え、室温で22時間攪拌した。生じた白色懸濁液に水 (0.5 mL) を加え、ジエチルエーテルで洗浄した後、固体をろ過し、過剰のジエチルエーテルで洗浄した。得られた粗生成物を逆相HPLC (YMC-Pack ODS-AM, グラジエント: 0-10-11-36-37-50 min; 0-0-20-45-100-100% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 25 min (20-45%), tR = 24.9 min) で精製することで、標題化合物11 (26.0 mg, 収率71%, 薄黄色アモルファス状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.43 (quint., 8H, J = 7.5 Hz), 1.56 (quint., 6H, J = 7.5 Hz), 1.60-1.67 (m, 4H), 1.73 (quint., 6H, J = 7.5 Hz), 2.19 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.40 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.81 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.99 (dd, 2H, J = 13.2, 4.6 Hz), 3.19 (td, 4H, J = 6.9, 1.7 Hz), 3.27 (ddd, 2H, J = 10.3, 5.8, 4.6 Hz), 4.52 (dd, 2H, J = 8.0, 4.6 HZ), 4.71 (2H, J = 8.0, 4.6 Hz), 7.95 (d, 2H, J = 1.8 Hz), 8.17 (d, 1H, J = 1.8 Hz); LRMS (ESI): m/z 415 [M+2H]2+.
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{5,5'-[6,6'-(5-(2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチルカルボニル)-1,3-フェニレン)ビス(アザンジイル)ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)]ビス(アザンジイル)ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル)}ビス(テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)トリ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (13)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　ビスイミノビオチン11 (17 mg, 0.0161 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (0.3 mL) 溶液に、N,N'-ジイソプロピルカルボジミド (DIC, 5.0 μL, 0.0322 mmol) と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物 (HOBt・H2O, 4.9 mg, 0.0322 mmol) を加えた後、既知の手法 (Wilburら, Bioconjugate.Chem. (2010) 21, 1225) により合成したアミン12 (8.0 mg, 0.0322 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (0.15 mL) 溶液を加え、60℃で10時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、水 (1 mL) を加え、水層を酢酸エチルとジエチルエーテルの混合溶媒 (1:1) で洗浄し、溶媒を減圧留去した。2規定塩酸 (1 mL) を加え、超音波にかけて粗生成物を溶解した。水 (1 mL) を加え、水層をジエチルエーテル及び酢酸エチルで洗浄し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物を逆相HPLC (YMC-Pack ODS-AM, グラジエント: 0-10-50-51-65 min; 10-10-30-100-100% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (10-30%), tR = 43.5 min) で精製することで、標題化合物13 (11.2 mg, 収率53%, 薄黄色アモルファス状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.39-1.48 (m, 8H), 1.56 (quint, 6H, J = 7.5 Hz), 1.65 (sext., 4H, J = 6.9 Hz), 1.69-1.80 (m, 6H), 2.20 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.40 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.82 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.99 (dd, 2H, J = 13.2, 4.6 Hz), 3.10 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.18 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 3.29 (ddd, 2H, J = 10.3, 5.8, 4.6 Hz), 3.58 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.69 (quint., 8H, J = 5.2 Hz), 4.52 (dd, 2H, J = 8.0, 4.6 Hz), 4.72 (2H, dd, J = 8.0, 4.6 Hz), 7.77 (d, 2H, J = 1.7 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 1.7 Hz); LRMS (ESI): m/z 480 [M+2H]2+.
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{5,5'-[6,6'-(5-(2-(2-(2-(3-(3',6'-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-5-イル)チオウレイド)エトキシ)エトキシ)エチルカルバモイル)-1,3-フェニレン)ビス(アザンジイル)ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)]ビス(アザンジイル)ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル)}ビス(テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (14)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　ビスイミノビオチン13 (5 mg, 3.84 μmol) のメタノール (0.2 mL) 溶液にトリエチルアミン (4.3 μL, 30.7 μmol) とフルオレセイン5-イソチオシアナート (FITC, 1.6 mg, 4.03 μmol) を加えた。赤茶色の固体が析出するが、そのまま室温で10時間攪拌した。メタノール (1 mL) を加えて超音波にかけ、固体を吸引ろ過し、メタノールで洗浄した。固体を10%トリフルオロ酢酸を含むメタノール溶液に溶解した。溶媒を減圧留去し、得られた黄色の粗生成物を逆相HPLC (YMC-Triart-C18, 検出270 nm, グラジエント: 0-10-11-41-42-55 min; 20-20-30-60-100-100% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 30 min (30-60%), tR = 25.7 min) で精製することで、標題化合物14 (4.8 mg, 収率79%, 薄黄色アモルファス状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.41 (quint., 8H, J = 7.5 Hz), 1.54 (quint., 6H, J = 7.5 Hz), 1.63 (sext., 4H, J = 6.9 Hz), 1.66-1.78 (m, 6H), 2.18 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.38 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.80 (2H, d, J = 13.2 Hz), 2.97 (dd, 2H, J = 13.2, 4.6 Hz), 3.17 (t, 4H, J = 6.9 Hz), 3.26 (ddd, 2H, J = 10.3, 5.8, 4.6 Hz), 3.57 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.74 (m, 8H), 3.81 (brs, 2H), 4.50 (dd, 2H, J = 8.0, 4.6 Hz), 4.70 (d, 2H, J = 7.5, 4.6 Hz), 6.73 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.87 (s, 2H), 6.92 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.72 (s, 2H), 7.82 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.96 (s, 1H), 8.28 (s, 1H); LRMS (ESI): m/z 675 [M+2H]2+.
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{5,5'-[6,6'-(5-カルバモイル-1,3-フェニレン)ビス(アザンジイル)ビス(6-オキソヘキサン-6,1-ジイル)]ビス(アザンジイル)ビス(5-オキソペンタン-5,1-ジイル)}ビス[テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム]ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (15)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　ジアミン10 (5.5 mg, 0.011XX mmol) にN,N-ジメチルホルムアミド(0.23 mL) 、トリエチルアミン（4.8 μL, 0.034 mmol）を加え、次いでEZ-LinkR NHS-Iminobiotin 4 (10 mg, 0.023 mmol) を加え、室温で6時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、粗生成物をメタノール（0.5 mL）に溶解し、25%アンモニア水溶液 (2 mL) を加え、35℃で12時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた粗生成物を逆相HPLC (YMC-Pack ODS-AM, グラジエント: 0-10-11-36-37-50 min; 0-0-20-45-100-100% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 25 min (20-45%), tR = 23.1 min) で精製することで、標題化合物15(5.9 mg, 収率49%)を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.38-1.46 (m, 8H), 1.56 (quint., 6H, J = 7.5 Hz), 1.64 (sext., 4H, J = 6.9 Hz), 1.73 (quint., 6H, J = 7.5 Hz), 2.19 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.40 (t, 4H, J = 7.5 Hz), 2.81 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.99 (dd, 2H, J = 13.2, 4.6 Hz), 3.19 (t, 4H, J = 6.9 Hz), 3.29 (ddd, 2H, J = 10.3, 5.8, 4.6 Hz), 4.52 (dd, 2H, J = 8.0, 4.6 Hz), 4.72 (dd, 2H, J = 8.0, 4.6 Hz), 7.75 (d, 2H, J = 1.7 Hz), 8.03 (d, 2H, J = 1.7 Hz); LRMS (ESI): m/z 829 [M+H]+.
N1,N3-ビス{2-[2-(2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)エトキシ]エチル}-5-(4-ヨードベンズアミド)イソフタルアミド (17)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　既知の手法 (Wilburら, Bioconjugate.Chem. (1997) 8, 161) により合成した5-(4-ヨードベンズアミド)イソフタル酸 16 (0.50 g, 1.21 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (5 mL) 溶液に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC・HCl, 0.556 g, 2.90 mmol) と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物 (HOBt・H2O, 0.444 g, 2.90 mmol) を加えた後、既知の手法 (Wilburら, Bioconjugate.Chem. (2010) 21, 1225) により合成したアミン12 (0.663 g, 2.67 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (1 mL) 溶液を加え、室温で18時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、酢酸エチルと0.5規定塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を0.5規定塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル→ジクロロメタン／メタノール＝10：1) で精製することで、標題化合物17 (380 mg, 収率36%, 黄色高粘性油状) を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.40 (s, 18H), 3.20 (t, 4H, J = 5.4 Hz), 3.51 (t, 4H, J = 5.4 Hz), 3.58-3.71 (m, 16H), 7.73 (dt, 2H, J = 8.5, 1.8 Hz), 7.92 (dt, 2H, J = 8.5, 1.8 Hz), 8.03 (t, 1H, J = 1.4 Hz), 8.30 (d, 1H, J = 1.4 Hz); LRMS (ESI): m/z 894 [M+Na]+.
N1,N3-ビス{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチル}-5-(4-ヨードベンズアミド)イソフタルアミド (18)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　ジカーバメート体17 (0.350 g, 0.401 mmol) のジクロロメタン (1 mL) 溶液に、トリフルオロ酢酸 (2 mL) を加え、室温で1時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルで洗浄した。メタノール(1mL) に溶解して、AmberliteR IRA-400カラム (塩基性樹脂、20 mm × 200 mm) に通し、メタノールで溶出した。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、標題化合物18 (0.258 g, 収率96％, 黄色アモルファス状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 2.74 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 3.49 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 3.59 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 3.60-3.63 (m, 4H), 3.64-3.69 (m, 8H), 7.69 (dt, 2H, J = 8.6, 1.8 Hz), 7.85 (dt, 2H, J = 8.6, 1.8 Hz), 7.99 (t, 1H, J = 1.7 Hz), 8.27 (d, 2H, J = 1.7 Hz); LRMS (ESI): m/z 672 [M+H]+.
(S)-1-tert-ブチル 4-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) 2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)スクシノエート (19)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　Boc-Asp(OtBu)-OH 19a (0.50 g, 1.73 mmol) とN-ヒドロキシスクシンイミド (0.343 g, 2.08 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド (17 mL) 溶液に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC・HCl, 0.399 g, 2.08 mmol) を加え、室温で11時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、酢酸エチルと0.5規定塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を0.5規定塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去することで、標題化合物19 (0.431 g, 収率63%, 白色固体) を得た。得られた生成物は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.45 (s, 9H), 1.47 (s, 9H), 2.84 (s, 4H), 3.09 (dd, 1H, J = 17.5, 6.4 Hz), 3.18 (dd, 1H, J = 17.4, 5.8 Hz), 4.46 (t, 1H, J = 5.8 Hz); LRMS (ESI): m/z 387 [M+H]+.
(14S,14'S)-1,1'-[5-(4-ヨードベンズアミド)-1,3-フェニレン]ビス[14-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11-ジアザペンタデカン酸]tert-ブチル (20)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　ジアミン18 (35.9 mg, 0.0412 mmol) のジオキサン (0.8 mL) とピリジン (0.1 mL) の混合溶液に、活性エステル19 (33.4 mg, 0.0865 mmol) を加えた。室温で14時間攪拌した後、更に19 (10 mg, 0.0259 mmol) を加え、室温で6時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、酢酸エチルと0.5規定塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を0.5規定塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン／メタノール＝25：1→15:1) で精製することで、標題化合物20 (47.9 mg, 収率90%, 黄色アモルファス状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.42 (s, 18H), 1.43 (s, 18H), 2.53-2.67 (m, 4H), 3.32 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 3.53 (td, 4H, J = 5.2, 1.7 Hz), 3.60-3.64 (m, 8H), 3.65-3.70 (m, 8H), 4.32 (quint.,2H, J = 5.8 Hz), 7.72 (dt, 2H, J = 8.6, 1.7 Hz), 7.90 (dt, 2H, J = 8.6, 1.7 Hz), 8.03 (t, 1H, J =1.7 Hz), 8.29 (d, 2H, J = 1.7 Hz); LRMS (ESI): m/z 1236 [M+Na]+.
(14S,14'S)-1,1'-[5-(4-ヨードベンズアミド)-1,3-フェニレン]ビス(14-カルボキシ-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11-ジアザテトラデカン-14-アンモニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (21)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　化合物20 (41 mg, 0.0338 mmol) にトリフルオロ酢酸 (2.0 mL) を加え溶解し、室温で30分攪拌した。溶媒を減圧留去した後、ジエチルエーテルを加えることで白色固体が析出した。固体を吸引ろ過し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空下乾燥することで、標題化合物21 (30.4 mg, 収率80%, 白色固体) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 2.64 (dd, 2H, J = 17.2, 7.5 Hz), 2.81 (dd, 2H, J = 17.2, 4.0 Hz), 3.35 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 3.55 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 3.60-3.64 (m, 8H), 3.67-3.73 (m, 8H), 4.14 (dd, 2H, J = 7.5, 4.0 Hz), 7.74 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.92 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 8.05 (t, 1H, J = 1.2 Hz), 8.29 (d, 2H, J = 1.2 Hz); LRMS (ESI): m/z 902 [M+H]+.
(3aS,3a'S,4S,4'S,6aR,6a'R)-4,4'-{(14S,14'S)-1,1'-[5-(4-ヨードベンズアミド)-1,3-フェニレン]ビス(14-カルボキシ-1,12,16-トリオキソ-5,8-ジオキサ-2,11,15-トリアザエイコサン-20,1-ジイル)}ビス(テトラヒドロ‐1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (22)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　ビスアミノ酸21 (5 mg, 4.43 μmol) をジオキサン (0.2 mL) と水 (0.1 mL) の混合溶媒に懸濁させ、次いで1規定水酸化ナトリウム水溶液 (18 μL, 177 μmol) を加えた。室温で5分攪拌して溶解した後、EZ-LinkR NHS-Iminobiotin (4, 4.0 mg, 9.07 μmol) を加えた。室温で19時間攪拌した後、2規定水酸化ナトリウム水溶液 (150 μL) を加え、更に室温で4時間攪拌した。水層をジエチルエーテルで洗浄した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物を逆相HPLC (YMC-Pack ODS-AM, グラジエント: 0-10-11-36-37-50 min; 0-0-24-49-100-100% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 25 min (24-49%), tR = 27.2 min) で精製することで、標題化合物22 (2.3 mg, 収率33%, 白色固体) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.40-1.51 (m, 4H), 1.52-1.81 (m, 8H), 2.25 (sext., 4H, J = 7.2 Hz), 2.73 (d, 4H, J = 6.3 Hz), 2.81 (d, 2H, J = 13.4 Hz), 2.98 (dd, 2H, J = 13.4, 4.5 Hz), 3.24-3.31 (m, 2H), 3.35 (t, 4H, J = 5.4 Hz), 3.54 (t, 4H, J = 5.4 Hz), 3.60-3.65 (m, 8H), 3.66-3.72 (m, 8H), 4.53 (dd, 2H, J = 8.1, 4.5 Hz), 4.70-4.74 (m, 4H), 7.74 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.93 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 8.05 (s, 1H), 8.31 (d, 2H, J = 1.4 Hz); LRMS (ESI): m/z 677 [M+2H]+.
N,N'-[2,2'-オキシビス(エタン-2,1-ジイル)]ビス{6-[5-((3aS, 4S, 6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド]ヘキサナミド} (24)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　ジアミン3 (21.8 mg, 0.0659 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (1.6 mL) 溶液にビオチン N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (23, 45 mg, 0.132 mmol) を加え、室温で6時間攪拌した。ジエチルエーテルを加え、生じた固体をろ過した。固体を1規定塩酸、飽和炭酸ナトリウム水溶液、水、冷却したアセトン、ジエチルエーテルで洗浄し、固体を真空下乾燥することで、標題化合物24 (46.2 mg, 収率90%, 白色固体) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.32-1.38 (m, 4H), 1.44 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.52 (quint., 4H, J = 7.5 Hz), 1.58-1.69 (m, 10H), 1.69-1.78 (m, 2H), 2.20 (q, 8H, J = 7.5 Hz), 2.71 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.93 (dd, 2H, J = 12.6, 4.6 Hz), 3.17 (t, 4H, J = 6.9 Hz), 3.21 (ddd, 2H, J = 10.3, 5.8, 4.6 Hz), 3.35 (t, 4H, J = 5.8 Hz), 3.51 (t, 4H, J = 5.8 Hz), 4.31 (dd, 2H, J = 8.1, 4.6 Hz), 4.49 (dd, 2H, J = 8.1, 4.6 Hz); LRMS (ESI): m/z 805 [M+Na]+.
実施例２以降で使用した化合物のリスト:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　なお、イミノビオチンlongtailは以下の方法で合成できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　6-アミノヘキサン酸(3 mg, 0.023 mmol) の dioxane (500 μL) と H2O (500 μL) の混合溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を加え、pHが 9 程度になるよう調整した。化合物101 (10 mg, 0.023 mmol)（市販品） を加え12 時間撹拌した後、エーテルを加え有機層を除去した。水層に対し塩酸で中和し、ろ過した。残渣をアセトンで洗浄し、減圧下溶媒を留去した。得られた固体をdioxane (500μL) と H2O (500μL)に溶解し、29% アンモニア水を加え、3 時間撹拌した。減圧で溶媒を留去し、得られた結晶をジクロロメタン-メタノールの混合溶媒で洗浄することで、イミノビオチンlongtailは 4 mg (収率 49%, 白色固体) を得た。MS (ESI) m/z 357 (M+H)+
実施例１Ｂ：キレート基が結合しているビオチン改変体２量体化合物の合成
一般的方法
　核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは、JEOL ECX500 (1H NMR: 500MHz)、またはJEOL ECS400(1H NMR: 400MHz) スペクトロメータを用いて測定した。化学シフトは、内部参照として重溶媒中の残存溶媒ピークに対する値としてppmで記載した （CDCl3:δ= 7.26 ppm,  CD3OD:δ= 3.31 ppm, acetone-d6:δ= 2.05 ppm, D2O: δ= 4.79 ppm）。低分解能質量スペクトル (ESI) は、Waters ZQ4000スペクトロメータもしくはAgilent Technologies 1290 Infinity LCに接続したAgilent 6120 Quadrupole LC/MS（ESI）を用いて測定した。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル Merk 60 (230-400 mesh ASTM) を用いて行った。ゲル濾過クロマトグラフィーはSephadex LH-20  lab Packs担体を用いて行った。反応は薄層クロマトグラフィー (TLC)、あるいは低分解能質量分析によって追跡した。
　逆相高速液体クロマトグラフフィー (HPLC) は、JASCO-HPLCシステムを用いて行った。210 nm または 254 nmの紫外光を用いて検出し、移動相はグラジエント溶媒系 (アセトニトリル／0.1% トリフルオロ酢酸MQ溶液) を用いた。分析については、YMC-Triart-C18 (150×4.6 mL) のカラムを用い、流速 1 mL/minで行った。分取については、YMC-Triart-C18 (250×10 mL) のカラムを用い、流速3.5 mL/minで行った。
　EZ-Link（登録商標）NHS-Iminobiotinはサーモサイエンティフィック社から購入した。DOTA-NHS-esterはMacrocyclics社から購入した。その他の試薬は、Aldrich、東京化成工業株式会社 (TCI)、関東化学株式会社 (Kanto)、和光純薬工業株式会社、渡辺化学工業株式会社から購入した。全ての試薬及び溶媒は、特に明記が無い限り市販品をそのまま使用した。
ジメチル5-（3-（3-オキソ-1-フェニル‐2，7，10－トリオキサ‐4－アザドデカン‐12－イル）ウレイド）イソフタレート （28）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　5-アミノイソフタル酸ジメチル (25)（1.00 g, 4.78 mmol) のトルエン (20 mL) 溶液にトリホスゲン (1.48 g, 4.99 mmol)を加え、還流しながら3時間攪拌した。その後ピリジンを加え、還流しながら1時間攪拌した。溶媒を減圧留去することで得られた粗生成物26のジクロロメタン (25 mL)、トリエチルアミン (728 μL, 5.24 mmol)混合溶液にアミン (27)（1.84 g, 6.52 mmol) を加え、室温で1時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、1 M塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を1規定塩酸で3度、飽和食塩水で1度洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン／メタノール＝20：1→4:1) で精製することで、標題化合物28 (1.06 g, 収率43%, 黄白色固体) を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 3.27-3.35 (m, 2H), 3.39 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.55 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.58 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.63 (s, 4H), 3.91 (s, 6H), 5.06 (s, 2H), 7.20-7.47 (m, 5H), 8.21 (t, 1H, J = 1.4 Hz), 8.28 (d, 2H, J = 1.4 Hz); LRMS (ESI): m/z 540 [M+Na]+.
5-(3-(3-オキソ‐1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4-アザドデカン-12-イル)ウレイド)イソフタル酸 (29)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　ジエステル体28 (1.06 g, 2.05 mmol)のテトラヒドロフラン (11.7 mL) 溶液に水酸化カリウム (1.15 g, 10.5 mmol) 水 (2.07 mL) 溶液を加え、室温で8時間攪拌した。生じた沈殿が溶解するまで水を加え、ジエチルエーテルで1度洗浄した。2M塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で1度洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去することで、標題化合物29 を含む粗生成物 (白色固体) を得た。得られた粗生成物は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 3.18-3.34 (m, 2H), 3.39 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 3.56 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 3.58 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63 (s, 4H), 5.06 (s, 2H), 7.23-7.39 (m, 5H), 8.25 (brs, 1H), 8.28 (brs, 2H); LRMS (ESI): m/z 512 [M+Na]+.
ビス(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) 5-(3-(3-オキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4-アザドデカン-12-イル)ウレイド)イソフタレート (30)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　ジカルボン酸29 (1.09 g, 2.23 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (11.1 mL) 溶液にN-ヒドロキシスクシンイミド (0.615 g, 5.34 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC・HCl, 1.03 g, 5.34 mmol) を加え、アルゴン雰囲気下、室温で24時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、0.5 M塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を0.5 M塩酸で3度、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1度、飽和食塩水で1度洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、標題化合物30 (1.2 g, 収率79%, 白色固体) を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2.90 (s, 8H), 3.25-3.35 (m, 2H), 3.39 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.54 (t, 2H, J = 5.5Hz), 3.58 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.62 (s, 4H), 5.05 (s, 2H), 7.20-7.40 (m, 5H), 8.36 (brs, 1H), 8.52 (brs, 2H); LRMS (ESI): m/z 342 [M+2H]2+.
(2S,2'S)-6,6'-((5-(3-(3-オキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4-アザドデカン-12-イル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザンジイル))ビス(2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサン酸) (32)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　ジスクシンイミド体30 (1.21 g, 1.76 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (18.1 mL)、トリエチルアミン (1.48 mL, 10.6 mmol) 混合溶液にNα-Boc-L-リシン (31) (974 mg, 3.52 mmol) を加え、室温で10時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、水、1 M塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で1度洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を少量のジクロロメタンに溶解し、ジエチルエーテルにより析出させた沈殿を吸引濾過することで、標題化合物32 (1.68 g, 収率quant., 白色固体) を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.41 (s, 18H), 1.45-1.57 (m, 4H), 1.57-1.77 (m, 6H), 1.77-1.94 (m, 2H), 3.24-3.34 (m, 2H), 3.34-3.49 (m, 6H), 3.55 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 3.58 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 3.63 (s, 4H), 3.93-4.18 (m, 2H), 5.06 (s, 2H), 7.23-7.46 (m, 5H), 7.81 (brs, 1H), 7.93 (brs, 2H), 8.51 (brs, 1H).
(2S,2'S)-ジメチル 6,6'-((5-(3-(3-オキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4-アザドデカン-12-イル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザンジイル))ビス(2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサノエート)  （33）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 　ジカーバメート体32 (100 mg, 106 μmol) のメタノール (530 μL) 溶液を氷浴で冷却し、ジアゾメタン (2.0 Mジエチルエーテル溶液、350 μL, 700 μmol) を加え、氷浴上で5分間攪拌した。酢酸を加え、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン／メタノール＝20：1→10:1) で精製することで、標題化合物33 (91.8 mg, 収率89%, 黄色高粘性油状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.39-1.43 (m, 22H), 1.55-1.73 (m, 6H), 1.75-1.87 (m, 2H),3.27-3.33 (m, 2H), 3.39 (m, 6H), 3.54 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 3.57 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62 (s, 4H), 3.69 (s, 6H), 4.10 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 5.06 (s, 2H), 6.86-7.05 (m, 1H), 7.24-7.35 (m, 5H), 7.81 (s, 1H), 7.93 (s, 2H), 8.46 (brs, 1H).
 (2S,2'S)-ジメチル 6,6'-((5-(3-(3-オキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4-アザドデカン-12-イル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザンジイル))ビス(2-アミノヘキサノエート)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (34)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　ジカーバメート体33 (89.9 mg, 92.3 μmol) の水 (2 mL) 溶液にトリフルオロ酢酸 (2 mL) を加え、室温で1.5時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、標題化合物34 を含む粗生成物(黄色高粘性油状) を得た。得られた粗生成物は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 1.38-1.60 (m, 4H), 1.60-1.73 (sext., 4H, J = 7.3 Hz), 1.77-2.10 (m, 4H), 3.23-3.32 (m, 2H), 3.32-3.43 (m, 6H), 3.54 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.57 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 3.62 (s, 4H), 3.81 (s, 6H), 4.05 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 5.05 (s, 2H), 7.20-7.37 (m, 5H), 7.84 (brs, 1H), 7.96 (brs, 2H); LRMS (ESI): m/z 774 [M+H]+.
(R,S,S,2S,2'S)-ジメチル 6,6'-((5-(3-(3-オキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4-アザドデカン-12-イル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザンジイル))ビス(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)ヘキサノエート)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (35)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 　ジアミン34 (10.0 mg, 10.3 μmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (200 μL)、トリエチルアミン (14.4 μL, 10.3 μmol) 混合溶液に、EZ-LinkR NHS-Iminobiotin (4)(9.0 mg, 20.7 μmol) を加え、室温で21時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をゲル濾過クロマトグラフィー (メタノール) で精製することで、標題化合物35 (5.6 mg, 収率39%, 黄色高粘性油状)を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.32-1.53 (m, 8H), 1.53-1.69 (m, 10H), 1.69-1.79 (m, 4H), 1.83-1.93 (m, 2H), 2.25 (q, 4H, J = 6.9 Hz), 2.88 (d, 2H, J = 12.6 Hz), 3.01 (dd, 2H, J = 5.2, 12.6 Hz), 3.27-3.33 (m, 4H), 3.34-3.45 (m, 6H), 3.55 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.57 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63 (s, 4H), 3.71 (s, 6H), 4.40 (dd, 2H, J = 4.6, 9.2 Hz), 4.49 (dd, 2H, J = 4.6, 8.6 Hz), 4.75 (dd, 2H, J = 4.6, 8.6 Hz), 5.06 (s, 2H), 7.21-7.38 (m, 5H), 7.81 (brs, 1H), 7.95 (brs, 2H); LRMS (ESI): m/z 613 [M+2H]2+.
(R,S,S,2S,2'S)-ジメチル 6,6'-((5-(3-(2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザンジイル))ビス(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)ヘキサノエート)トリ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (36)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 　ビスイミノビオチン35 (5.8 mg, 4.1 μmol) の水 (50 μL) 溶液に、トリフルオロ酢酸 (1 mL) を加え、50℃で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相HPLC (0.0-20.0-20.5-60.5-61.0-75.0 min; 5.0-5.0-17.5-57.5-100.0-100.0% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 36.5 min) で精製することで、標題化合物36 (2.5 mg, 収率45%, 黄色高粘性油状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.39-1.82 (m, 22H), 1.82-1.94 (m, 2H), 2.20-2.30 (m, 4H), 2.83 (d, 2H, J = 14.2 Hz), 2.99 (dd, 2H, J = 4.9, 14.2 Hz), 3.11 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.25-3.36 (m, 4H), 3.36-3.46 (m, 6H), 3.61 (t, 2H, J = 5.3 Hz), 3.69 (s, 4H), 3.71 (s, 6H), 4.41 (dd, 2H, J = 5.2, 9.7 Hz), 4.52 (dd, 2H, J = 4.6, 8.1 Hz), 4.72 (dd, 5H, J = 4.6, 8.1 Hz), 7.81 (s, 1H), 7.96 (d, 2H, J = 1.6 Hz); LRMS (ESI): m/z 546 [M+2H]2+.
2,2',2''-(10-(1-((3,5-ビス(((S)-5-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)カルバモイル)フェニル)アミノ)-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11-ジアザトリデカン-13-イル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリイル)トリ酢酸トリ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (38)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 　ビスイミノビオチン36 (10.0 mg, 7.24 μmol)のN,N-ジメチルホルムアミド (100 μL)、トリエチルアミン (15.1 μL, 10.9 μmol) 混合溶液に、DOTA-NHS-ester (37)(6.1 mg, 7.96 μmol) を加え、室温で20時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相HPLC (0.0-20.0-20.5-60.5-61.0-75.0 min; 5.0-5.0-17.5-57.5-100.0-100.0% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 35.2 min) で精製することで、標題化合物38 (2.0 mg, 収率16%, 黄色高粘性油状) を得た。
LRMS (ESI): m/z 739 [M+2H]2+. 
実施例１Ｃ：色素、キレート基又は薬剤が結合しているビオチン改変体２量体化合物の合成
　核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは、JEOL ECX500 (1H NMR: 500MHz)、またはJEOL ECS400(1H NMR: 400MHz) スペクトロメータを用いて測定した。化学シフトは、内部参照として重溶媒中の残存溶媒ピークに対する値としてppmで記載した（CDCl3:δ= 7.26 ppm,  CD3OD:δ= 3.31 ppm）。低分解能質量スペクトル (ESI) は、Waters ZQ4000スペクトロメータもしくはAgilent Technologies 1290 Infinity LCに接続したAgilent 6120 Quadrupole LC/MS（ESI）を用いて測定した。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル Merk 60 (230-400 mesh ASTM) 、逆相カラムクロマトグラフィーはワコーシルR 40C18 (30～50μm 70% up)、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーはSephadex LH-20  lab Packs担体を用いて行った。を用いて行った。反応は薄層クロマトグラフィー(TLC)、あるいは低分解能質量分析によって追跡した。
　逆相高速液体クロマトグラフフィー (HPLC) は、JASCO-HPLCシステムを用いて行った。210 nm または 254 nmの紫外光を用いて検出し、移動相はグラジエント溶媒系 (アセトニトリル／0.1% トリフルオロ酢酸MQ溶液、または0.1%ギ酸MQ溶液) を用いた。分析については、YMC-Triart-C18 (150×4.6 mL) のカラムを用い、流速 1 mL/minで行った。分取については、YMC-Triart-C18 (250×10 mL) のカラムを用い、流速3.5 mL/minで行った。
　DOTA-NHS-esterはMacrocyclics社から購入した。IRDyeR 800CW NHS EsterはLI-COR社から購入した。その他の試薬は、Aldrich、東京化成工業株式会社(TCI)、関東化学株式会社(Kanto)、和光純薬工業株式会社、渡辺化学工業株式会社から購入した。全ての試薬及び溶媒は、特に明記が無い限り市販品をそのまま使用した。
(3aS,4S,6aR)-4-(5-((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)-5-オキソペンチル)テトラヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-2(3H)-イミニウム2,2,2-トリフルオロアセテート(41)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 　2-イミノビオチン39 (88.0 mg, 0.36 mmol) にトリフルオロ酢酸を加え、撹拌した後に過剰のトリフルオロ酢酸を減圧留去した。得られた白色固体のアセトニトリル (3.4 mL)溶液にピリジン (82.5 μL, 0.72 mmol)、ジスクシンイミド 40(175 mg, 1.08 mmol)を加え、30℃で11時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、標題化合物41を含む粗生成物 (黄色高粘性油状) を得た。得られた粗生成物は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
LRMS (ESI): m/z 341 [M+H]+.
(R,S,S,2S,2'S)-ジメチル 6,6'-((5-(3-(3-オキソ-1-フェニル-2,7,10-トリオキサ-4-アザドデカン-12-イル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザンジイル))ビス(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)ヘキサノエート)ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (35)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 　ジアミン34 (78.5 mg, 81.1μmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (5.0 mL)、トリエチルアミン (339μL, 2.43 mmol) 混合溶液に、2-イミノビオチン39(88.0 mg, 0.36 mmol)より調製したエステル41を加え、室温で21時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー (水／メタノール＝2：1→1:2) で精製することで、標題化合物35(59.3 mg, 収率52%, 黄色高粘性油状)を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.32-1.53 (m, 8H), 1.53-1.69 (m, 10H), 1.69-1.79 (m, 4H), 1.83-1.93 (m, 2H), 2.25 (q, 4H, J = 6.9 Hz), 2.88 (d, 2H, J = 12.6 Hz), 3.01 (dd, 2H, J = 5.2, 12.6 Hz), 3.27-3.33 (m, 4H), 3.34-3.45 (m, 6H), 3.55 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.57 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63 (s, 4H), 3.71 (s, 6H), 4.40 (dd, 2H, J = 4.6, 9.2 Hz), 4.49 (dd, 2H, J = 4.6, 8.6 Hz), 4.75 (dd, 2H, J = 4.6, 8.6 Hz), 5.06 (s, 2H), 7.21-7.38 (m, 5H), 7.81 (brs, 1H), 7.87 (brs, 2H); LRMS (ESI): m/z 613 [M+2H]2+.
(R,S,S,2S,2'S)-ジメチル 6,6'-((5-(3-(2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチル)ウレイド)イソフタロイル)ビス(アザンジイル))ビス(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)ヘキサノエート)トリ(2,2,2-トリフルオロアセテート) (36)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 　ビスイミノビオチン35 (59.3 mg, 41.8μmol) の水 (400μL) 溶液に、トリフルオロ酢酸 (8.0mL) を加え、50℃で4時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー (水／メタノール＝2：1→1:2) で精製することで、標題化合物36 (37.1 mg, 収率64%, 黄色高粘性油状) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.39-1.82 (m, 22H), 1.82-1.94 (m, 2H), 2.20-2.30 (m, 4H), 2.83 (d, 2H, J = 14.2 Hz), 2.99 (dd, 2H, J = 4.9, 14.2 Hz), 3.11 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.25-3.36 (m, 4H), 3.36-3.46 (m, 6H), 3.61 (t, 2H, J = 5.3 Hz), 3.69 (s, 4H), 3.71 (s, 6H), 4.41 (dd, 2H, J = 5.2, 9.7 Hz), 4.52 (dd, 2H, J = 4.6, 8.1 Hz), 4.72 (dd, 5H, J = 4.6, 8.1 Hz), 7.81 (s, 1H), 7.96 (d, 2H, J = 1.6 Hz); LRMS (ESI): m/z 546 [M+2H]2+.
2,2',2''-(10-(1-((3,5-ビス(((S)-5-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)カルバモイル)フェニル)アミノ)-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11-ジアザトリデカン-13-イル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリイル)トリ酢酸トリギ酸 (42)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 　ビスイミノビオチン36(23.4 mg, 16.9μmol)のメタノール (234μL)、トリエチルアミン (35.4μL, 253 μmol) 混合溶液に、DOTA-NHS-ester37(25.8 mg, 24.9μmol) を加え、室温で13時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相HPLC (0.0-20.0-20.5-60.5-61.0-75.0 min; 5.0-5.0-17.5-57.5-100.0-100.0% CH3CN in 0.1% HCOOHMQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 31.5 min) で精製することで、標題化合物42 (3.55 mg, 収率13%, 黄色高粘性油状) を得た。
LRMS (ESI): m/z 739 [M+2H]2+.
1-(1-((3,5-ビス(((S)-5-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)カルバモイル)フェニル)アミノ)-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11-ジアザヘプタデカン-17-イル)-2-((E)-2-((E)-3-(2-((E)-3,3-ジメチル-5-スルホ-1-(4スルホブチル)インドリン-2-イリデン)エチリデン)-2-(4-スルホフェノキシ)シクロヘキ-1-エン-1-イル)ビニル)-3,3-ジメチル-3H-インドール-1-イウム-5-スルホネート(44)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 　ビスイミノビオチン36 (1.13 mg, 0.82μmol)のN,N-ジメチルホルムアミド (200μL)、トリエチルアミン (2.17μL, 15.6μmol) 混合溶液に、IRDyeR 800CW NHS Ester (43, 2.41 mg, 2.06μmol) を加え、室温で17時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相HPLC (0.0-20.0-20.5-60.5-61.0-75.0 min; 5.0-5.0-17.5-57.5-100.0-100.0% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 40.9 min) で精製することで、標題化合物44 (0.65 mg, 収率34%, 緑色高粘性油状) を得た。
LRMS (ESI): m/z 1038 [M+2H]2+.
ベンジル (2-(2-(2-(3-(3,5-ビス((2-(2-((tert-ブトキシカルボニル)アミド)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)ウレイド)エトキシ)エトキシ)エチル)カーバメート（46）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 　ジスクシンイミド体30 (198mg, 0.290 mmol) のN,N-ジメチルホルムアミド (1.9 mL)、溶液に、既知の手法（Aranoら，Bioorg. Med. Chem. (2012) 20, 978）で合成したアミン45 (118 mg, 0.580 mmol, N,N-ジメチルホルムアミド (1 mL)溶液) を加え、室温で6時間30分攪拌した。さらにアミン45 (59 mg, 0.290 mmol, N,N-ジメチルホルムアミド (0.5 mL)溶液) を加え、室温で13時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、酢酸エチルを加え、1 M水酸化ナトリウム水溶液、1 M塩酸、飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン／ヘキサン＝1：30→1:20→1:10→1:5) で精製することで、標題化合物46 (83.7 mg, 収率33%,白色固体) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ:1.39 (s, 18H), 3.23 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 3.29-3.35 (m, 1H), 3.40 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 3.49-3.60 (m, 13H), 3.60-3.65 (m, 8H), 5.06 (s, 2H), 7.25-7.36 (m, 5H), 7.83 (s, 1H), 7.96 (brs, 2H); LRMS (ESI): m/z 884 [M+Na]+.
ベンジル (2-(2-(2-(3-(3,5-ビス((2-(2-アミノエトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)ウレイド)エトキシ)エトキシ)エチル)カーバメート　ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（48）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 　ジカーバメート体47(26.6 mg, 31μmol) の水 (400 μL)溶液にトリフルオロ酢酸 (200 μL) を氷冷下加え、30分撹拌した後、室温に昇温しさらに1.5時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、標題化合物48 を含む粗生成物(34.0 mg, 無色液体) を得た。得られた粗生成物は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 3.14 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 3.29-3.35 (m, 1H), 3.41 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 3.53-3.65 (m, 13H), 3.67-3.73 (m, 8H),5.06 (s, 2H), 7.24-7.37 (m, 5H), 7.85 (t, 1H, J = 1.4 Hz), 7.98 (d, 2H, J = 1.4 Hz); LRMS (ESI): m/z 662 [M+H]+.
ベンジル (2-(2-(2-(3-(3,5-ビス((2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)ウレイド)エトキシ)エトキシ)エチル)カーバメート　ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（49）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 　2-イミノビオチン39(16.6 mg,68 μmol)より調製した41を用意した試験管に、ジアミン48 (25.2 mg) のN,N-ジメチルホルムアミド (420 μL)溶液、ジイソプロピルエチルアミン (40.1μL, 23μmol) を加え、室温で12時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール／水＝２：１, 0.3% TFA) で精製することで、標題化合物49 (28.8 mg, 無色液体)を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.33-1.41 (m, 4H), 1.47-1.62 (m, 6H), 1.64-1.72 (m, 2H), 2.17 (q, 4H, J = 6.4 Hz), 2.80 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.97 (dd, 2H, J = 4.6, 13.2 Hz), 3.20-3.25 (m, 2H), 3.29-3.35 (m, 1H), 3.35-3.42 (m, 6H), 3.53-3.61 (m, 13H), 3.63-3.67 (m, 8H), 4.49 (dd, 2H, J = 4.6, 8.1 Hz), 4.71 (dd, 2H, J = 5.2, 8.1 Hz), 5.07 (s, 2H), 7.24-7.38 (m, 5H), 7.88 (brs, 1H), 7.99 (brs, 2H).
5-(3-(2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エチル)ウレイド)-N1,N3-ビス(2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)エトキシ)エチル)イソフタルアミド　トリ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（50）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 　ビスイミノビオチン49(6.9 mg, 5.3μmol) にトリフルオロ酢酸 (1 mL)、水(50 μL)混合溶液を加え、50℃に昇温して1時間30分撹拌した。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、標題化合物50 を含む粗生成物(5.3 mg, 無色液体) を得た。得られた粗生成物は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 1.32-1.43 (m, 4H), 1.47-1.62 (m, 6H), 1.63-1.74 (m, 2H), 2.13-2.20 (m, 4H), 2.81 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 2.98 (dd, 2H, J = 4.6, 13.2 Hz), 3.08-3.14 (m, 2H), 3.20-3.27 (m, 2H), 3.35-3.45 (m, 6H), 3.52-3.73 (m, 20H), 4.51 (dd, 2H, J = 4.6, 8.1 Hz), 4.72 (dd, 2H, J = 5.2, 8.1 Hz), 7.87 (brs, 1H), 8.00 (brs, 2H).
2,2',2''-(10-(1-((3,5-ビス((2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)アミノ)-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11-ジアザトリデカン-13-イル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリイル)トリ酢酸　トリ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（51）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 　ビスイミノビオチン50 (2.4 mg, 1.9μmol)のメタノール(100μL)、トリエチルアミン(10 μL, 72 μmol) 混合溶液に、DOTA-NHS-ester 37(3.5 mg, 4.6 μmol) を加え、室温で21時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相HPLC(0.0-20.0-20.5-60.5-61.0-75.0 min; 5.0-5.0-17.5-57.5-100.0-100.0% CH3CN in 0.1% TFA MQ, ramp time 40 min (17.5-57.5%), tR = 32.6 min) で精製することで、標題化合物51 (黄色高粘性油状) を得た。
LRMS (ESI): m/z 683 [M+2H]2+.
5-(3-(2-(2-(2-(3',6'-ジヒドロキシ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-5（6）-イルカルボキサミド)エトキシ)エトキシ)エチル)ウレイド)-N1,N3-ビス(2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)エトキシ)エチル)イソフタルアミド（52）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 　ビスイミノビオチン50 (4.3 mg, 3.4μmol)のメタノール(100μL)、トリエチルアミン(9.5 μL, 68 μmol) 混合溶液に、5(6)-カルボキシフルオレセイン N-ヒドロキシスクシミドエステル51(4.8 mg, 10 μmol) を加え、室温で16時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー(メタノール／水＝1：1→2：1, 0.5% TFA) で精製し、さらにSephadex 20LH（メタノール, 1% TFA）で精製することで、標題化合物52(2.2 mg, 収率49%)を得た。
LRMS (ESI): m/z 669 [M+2H]2+.
(S)-(S)-9-((tert-ブトキシカルボニル)オキシ)-4,11-ジエチル-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-4-イル 2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)プロパノエート（55）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 　既知の手法（Bioconjugate Chem. (2008) 19, 849.）で合成したSN38 Boc保護体53 (20.0mg, 41μmol)、Cbz-Ala-OH 54（12.7mg, 57μmol）のジクロロメタン (480μL)溶液に、氷冷下1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC・HCl, 12.7 mg, 66 μmol)、 ジメチルアミノピリジン(1.5 mg, 12μmol) を加え、徐々に室温へ昇温し11時間30分攪拌した。ジクロロメタンを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液、水、0.1 M塩酸、飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン／メタノール＝30：1) で精製することで、標題化合物55 (26.8 mg, 収率95%,淡黄色固体) を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 0.94 (t, 3H, J = 7.5 Hz), 1.38 (t, 3H, J = 7.4 Hz), 1.53 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 1.61 (s, 9H), 2.05-2.32 (m, 2H), 3.07-3.20 (m, 2H), 4.50-4.60 (m, 1H), 5.12-5.30 (m, 5H), 5.39 (d, 1H, J = 17.2 Hz), 5.68 (d, 1H, J = 17.2 Hz), 7.02-7.20 (m, 2H), 7.26-7.38 (m, 3H), 7.38-7.46 (m, 1H), 7.63 (dd, 1H J = 9.2, 2.3 Hz), 7.89 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H, J = 9.2 Hz); LRMS (ESI): m/z 720 [M+Na]+.
(S)-(S)-9-((tert-ブトキシカルボニル)オキシ)-4,11-ジエチル-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-4-イル 2-アミノプロパノエート（56）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 　55（11.3mg, 16μmol）の酢酸エチル（320μL）溶液にPd/C（1.7 mg）を加え、容器内を水素雰囲気に置換後、室温で16時間、40℃で1時間撹拌し、セライト濾過した。溶媒を減圧留去して得られた粗生成物を薄層クロマトグラフィー (ジクロロメタン／メタノール＝30：1) で精製することで、標題化合物56 (2.3 mg, 収率26%) を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 0.99 (t, 3H, J = 7.5 Hz), 1.29 (t, 3H, J = 8.0 Hz), 1.45  (d, 3H, J = 6.9 Hz), 1.61 (s, 9H), 2.14-2.22 (m, 1H), 2.26-2.36 (m, 1H), 3.15 (q, 2H, J = 8.0 Hz), 3.75 (q, 1H, J = 6.9 Hz), 5.25 (d, 2H, J = 3.5 Hz), 5.42 (d, 1H, J = 17.2 Hz), 5.69 (d, 1H, J = 17.2 Hz), 7.67 (dd, 1H J = 9.2, 2.3 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 8.21 (d, 1H, J = 9.2 Hz).
(S)-(S)-9-((tert-ブトキシカルボニル)オキシ)-4,11-ジエチル-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-4-イル 2-イソシアナトプロパノエート（57）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 　56（2.3mg, 4.1μmol）のジクロロメタン（100μL）溶液に、氷冷下トリホスゲン（3.3 mg, 11μmol）、ピリジン（5.0 μL, 62μmol）を加え、室温に昇温して2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、真空下乾燥することで、標題化合物57 を含む粗生成物(褐色液体) を得た。得られた粗生成物は更なる精製操作を行わずに次の反応に用いた。
(S)-(S)-9-((tert-ブトキシカルボニル)オキシ)-4,11-ジエチル-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-4-イル 1-((3,5-ビス((2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)アミノ)-14-メチル-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11,13-トリアザペンタデカン-15-オエート　トリ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（58）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 　ビスイミノビオチン50 (3.4 mg, 2.7μmol)および57を含む粗生成物のメタノール(200μL)溶液に、トリエチルアミン(10 μL, 72 μmol) を加え、室温で15時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相薄層クロマトグラフィー（メタノール／水＝3：1,　１％TFA）で精製することで、標題化合物58 (1.5 mg, 収率30%) を得た。
LRMS (ESI): m/z 785 [M+2H]2+.
(S)-(S)-4,11-ジエチル-9-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-3,4,12,14-テトラヒドロ-1H-ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-4-イル 1-((3,5-ビス((2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタナミド)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)アミノ)-14-メチル-1,12-ジオキソ-5,8-ジオキサ-2,11,13-トリアザペンタデカン-15-オエート　ジ(2,2,2-トリフルオロアセテート)（59）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 　ビスイミノビオチン58 (1.5 mg, 0.8μmol)の水(100μL)溶液に、トリフルオロ酢酸(100 μL) を加え、室温で1時間30分　攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を逆相薄層クロマトグラフィー（メタノール／水＝3：1,　１％TFA）で精製することで、標題化合物59 (0.4 mg, 収率29%) を得た。
LRMS (ESI): m/z 735 [M+2H]2+.
実施例２：LISA314 の変異体V21およびV212 の発現と結晶構造解析
　野生型コアストレプトアビジンをコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。本発明では、低免疫原性（改変体）ストレプトアビジンとして国際公開ＷＯ２０１０／０９４５５に記載されているｍｃＳＡ３１４（本明細書中、ＬＩＳＡ３１４ＷＴ又はＬＩＳＡ３１４とも称する）を使用した。ｍｃＳＡ３１４は、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の変異の全てを有する、ストレプトアビジン変異体である。
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：及び
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
　各変異体作製に用いたオリゴDNAは５’側が１５塩基オーバーラップするように、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）の説明書に従い設計した。下記のプライマーを使用し、 ＬＩＳＡ３１４が挿入されたpＣｏｌｄ TF ベクターを鋳型とし、ＳｉｔｅーＤｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。その後、制限酵素ＤｐｎＩにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。
プライマー：
LISA314 V21 Fw: TGGAGCgatCAGCTGGGCgatACCTTT（配列番号５）
LISA314 V21 Rv: CAGCTGatcGCTCCAGGTGCCGGTAAT（配列番号６）
　LISA314変異体であるLISA314 V21（以下V21とも称する）は、LISA314に対してさらに、N23D、S27Dの変異を有する。N23Dとは、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において１１番目のアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換している変異を意味する。S27Dとは、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において１５番目のアミノ酸残基のセリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換している変異を意味する。
　即ち、V21は、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
（７）１１番目のアミノ酸残基のアスパラギンがアスパラギン酸に置換している変異；
（８）１５番目のアミノ酸残基のセリンがアスパラギン酸に置換している変異：
を有する変異体ストレプトアビジンである。
　V21の更なる変異体の作成に用いたオリゴDNAは５’側が１５塩基オーバーラップするように、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）の説明書に従い設計した。以下のプライマーを使用し、上述のV21が挿入されたベクターを鋳型とし、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。その後、制限酵素ＤｐｎＩにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。
プライマー
S45N Fw: TATGAAAACGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号７）
S45N Rv: CACGGCGTTTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号８）
　S45Nは、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において３３番目のアミノ酸残基のセリンがアスパラギン（Ｎ）に置換していることを示す。即ち、V21に対して更にS45Nのアミノ酸変異が導入された変異体LISA314 V212（以下、V212とも称する）が製造される。この変異体のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。
［２］V212タンパク質の発現・精製
　V212タンパク質は大腸菌（BL21(DE3)株）により発現させインクルージョンボディーとして回収し、希釈法により巻き戻しを行いアフィニティー精製およびゲル濾過精製をすることで4量体形成画分を得た。具体的には、精製したインクルージョンボディーを変性バッファー（6Mグアニジン塩酸、50mM Tris-HCl, 200mM NaCl、1mM EDTA、pH8.0 at 4℃）にてオーバーナイトで溶解した。溶解した液を吸光度 n=280 で測定したところ50mg/mLであったため、100マイクロリットル（５mg相当）の溶解液を50mLのリフォールディングバッファー（50mM Tris-HCl, 300mM NaCl、1mM EDTA、400mM Arginine-HCl、pH8.0 at 4℃）に撹拌しながら滴下し、4℃にて静置し保存した。安定的な巻き戻しを行うために保存時間は2日とした。 2日間の保存の後、Ni-NTAレジン（cOmplete His-Tag Purificaiton Resin; Roche）を使用しアフィニティー精製を行った。その後、ゲル濾過精製（HiLoad 16/60 Superdex 200pg GEヘルスケア社製）により4量体画分を分画した。
［３］V21およびV212の結晶化方法
　タンパク質と化合物との複合体の精製は次のように実施した。希釈法により巻き戻したタンパク質をNi-NTAレジンによるアフィニティー精製で濃縮し、溶媒をPBSに置換後、モル比1:8で化合物Cを添加し1時間インキュベートしたのち、ゲル濾過カラムにて4量体画分を得た。これらの精製物を限外濾過カラム（VIVASPIN20）にて10 mg/mLの濃度まで濃縮を行った。
　結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法により実施した。結晶化温度は20℃にて行った。タンパク質とリザーバ溶液（0.2M Sodium floride, 20% PEG 3350）を0.5 マイクロリットル：0.5 マイクロリットルの比率で混合したドロップを60マイクロリットルのリサーバ溶液に対し平衡化を行った。また、抗凍結剤として6％グリセロール溶液を使用した。
［４］結晶の解析方法
　回収強度データはSpring 8 BL44XU で収集した。収集したデータはPhaser（分子置換プログラム）を用いて、先に構造解析を実施したV21とイミノビオチン longtail との共結晶データ（図１）をモデル分子とした分子置換法により、V212の結晶構造の位相を決定した。精密化はREFMAC5を用いて行った。
［５］結晶構造解析の結果
　V212と化合物Cとの共結晶構造を解析したところ図２のように、ループ構造が開いた状態になっていた。その原因としてN45とN49（配列表３の３３番と３７番）とが形成する水素結合が大きく関与していることが示唆された（図２）。
実施例３：V2122の設計、発現及び精製
　開いた状態のループ構造を閉じた構造にするためには、N45とN49（配列表３の３３番と３７番のアミノ酸）とが形成する水素結合を抑制する必要があると考えられた。そのため、配列番号３に記載のアミノ酸配列の３７番目に相当するアスバラギン（N）をアラニン（A）、グリシン（G）、セリン（S）に改変した。これらの変異をN49A、N49G、N49Sと記す。発現方法は前述と同じ方法で、以下のプライマーセットを用い、site directed mutagenesis法により期釈放により変異体発現ベクターの構築を行った。
プライマーセット：
N49A Fw: GTGGGTgcgGCGGAAAGCCGTTATGTT（配列番号９）
N49A Rv: TTCCGCcgcACCCACGGCattTTCATA（配列番号１０）
N49G Fw: GTGGGTggtGCGGAAAGCCGTTATGTT（配列番号１１）
N49G Rv: TTCCGCaccACCCACGGCattTTCATA（配列番号１２）
N49S Fw: GTGGGTagcGCGGAAAGCCGTTATGTT（配列番号１３）
N49S Rv: TTCCGCgctACCCACGGCattTTCATA（配列番号１４）
　変異体タンパク質の発現と精製は前述と同様にインクルージョンボディーを変性し、希釈法による巻き戻しで行った。巻き戻しを行った精製タンパク質の4量体形成をSDS-PAGEにより分析したところ、図３に示すように、グリシン変異体の4量体形成率が最も高く、その他のアラニン、セリン変異体は4量体形成率が低いことがわかった。このことから、今後はグリシン変異体(N49G)を用いることとし、またこの変異体をLISA314-V2122（以下V2122）とした。V2122のアミノ酸配列を、配列表の配列番号４に記載する。
実施例４：V2122と化合物とのＩＴＣ結合解析
　測定はMicrocal iTC200 (MicroCal, Northampton, MA)を用いて行った。
精製したV2122をPBSにて4 ℃、終夜透析し、透析外液を用いて化合物 C および ビオチン,ストック溶液を調製した。測定の際、ストック溶液は測定するV2122の10倍濃度になるように濃度調整して用いた。 カロリメーターのセル内に25μMのV2122を導入し、撹拌速度1000 rpm、25 ℃ にて各溶液を滴下した。得られたデータはORIGINを用いて解析を行い、滴定曲線はone-site binding isothermにてフィッティングを行った。
　結果を図４に示す。
　ITCの結果より、V2122と化合物Cとの相互作用は発熱反応を示し、両者は強い結合をしていることが確認できた。一方、V2122とビオチンとは発熱反応、吸熱反応共ともに示さないことから、両者は相互作用はしていないことが確認された。
実施例５：免疫原性試験
（１）タンパク質の調製
　免疫原性試験用のタンパク質の発現ベクターは前述の発現ベクターに対し以下のプライマーセットを使用しsite directed mutagenesis法によりN末端に付加されているT7-tagを発現しないように変更を加えたものを用いた。
プライマーセット
T7tagRemove Fw: tacatatgGCCGAAGCAGGTATTACC（配列番号１５）
T7tagRemove Rv: CTTCGGCcatatgtatatctccttc（配列番号１６）
　目的タンパク質は大腸菌（BL21(DE3)株）により発現させインクルージョンボディーとして回収し、希釈法により巻き戻しを行いアフィニティー精製およびゲル濾過精製をすることで4量体形成画分を得た。具体的には、精製したインクルージョンボディーを変性バッファー（6Mグアニジン塩酸、50mM Tris-HCl, 200mM NaCl、1mM EDTA、pH8.0 at 4℃）にてオーバーナイトで溶解した。溶液の吸光度280を測定し、5 mg分の溶解液を50mLのリフォールディングバッファー（50mM Tris-HCl, 300mM NaCl、1mM EDTA、400mM Arginine-HCl、pH8.0 at 4℃）に撹拌しながら滴下し、4℃にて静置し保存した。安定的な巻き戻しを行うために保存時間は2日とした。 2日間の保存の後、Ni-NTAレジン（cOmplete His-Tag Purificaiton Resin; Roche）を使用しアフィニティー精製を行った。その後、バッファーとして生理食塩水を用いてゲル濾過精製（HiLoad 16/60 Superdex 200pg GEヘルスケア社製）により4量体画分を分画した。
（２）免疫原性試験
　免疫原性試験はカニクイサル4匹を用いて行った。1 mgの精製タンパク質を3回投与した。投与前に陰性コントロール血清のための採血実施し、1 mgの精製タンパク質を3回投与した。具体的には、初回投与日を0日目とすると2回目投与日は21日目、3回目投与日は42日目とした。また、V2122については7, 14, 28, 35日目に採血を実施し血清サンプルを調製し、それ以外については7, 14, 28, 35, 49, 56日目に採血を実施し血清サンプルを調製した。
　血清サンプル中のV2122に対する抗体の解析は表面プラズモン共鳴（SPR）により行った。具体的には、測定器はBiacore T200 (GE ヘルスケア)、immunogenicity パッケージを使用するモードで測定を行った。センサーチップはCM5を使用し、V2122タンパク質（10μg/mL）をマニュアルに従いCM5センサーチップ上にアミンカップリングキットを使用して固定化した。血清はランニングバッファー（HBS-EP、GEヘルスケアバイオサイエンス）で10倍希釈し相互作用を解析した。具体的に10倍希釈した血清を10μL/minで5分間、ランニングバッファー中にロードした。得られたセンサーグラムは、解析ソフトウエアBiacore T200 Evaluation Softwareで解析した。
　結果を図５に示す。V2122の免疫原性は、野生型ストレプトアビジン及びLISA314の免疫原性と比較して低いことが示された。
実施例６：V2122と化合物とのアフィニティー解析
　前述の方法で精製したLISA314改変体タンパク質V2122を用いて化合物Cとの相互作用を表面プラズモン共鳴（SPR）により行った。具体的には、Biacore T200 (GE ヘルスケア)を測定器として用い、センサーチップにはセンサーチップNTA（GE ヘルスケア）を使用し核タンパク質に融合しているHis-Tagを利用してセンサーチップ上にタンパク質を固定化した。ランニングバッファーはHBS-P(+)を用いマニュアルに記載されている通りバッファー調製を行った。化合物の希釈系列は1600nMから2倍希釈9系列をランニングバッファーで調整した。アフィニティーの測定はカイネティクスモードでデータを取得した。取得したデータの平行値解析をBiacore T200 Evaluation Softwareで行いアフィニティーを求めた。
　V2122とビオチンとの解離定数（Ｍ）は未検出であり、ビスイミノビオチン（化合物７）との解離定数（Ｍ）は、３．１５×１０-9であった。
実施例７：V2122と化合物との共結晶構造解析
　結晶構造解析では免疫原性試験と同じT7-Tagを除去したタンパク質を用いた。タンパク質の発現は大腸菌BL21-codonplus RIL を使用し、2xYT培地にて培養し、インクルージョンボディーを回収した。回収したインクルージョンボディーは6M GdnHCl, pH1.5で溶解し、リフォールディングバッファー（50mM Tris-HCl, 300mM NaCl、1mM EDTA、400mM Arginine-HCl、pH8.0 at 4℃）を使用し前述の希釈法で巻き戻しを行い4℃にて静置し保存した。安定的な巻き戻しを行うために保存時間は2日とした。 2日間の保存の後、Ni-NTAレジン（cOmplete His-Tag Purificaiton Resin; Roche）を使用しアフィニティー精製を行った。その後、バッファーとしてPBSを用いてゲル濾過精製（HiLoad 16/60 Superdex 200pg GEヘルスケア社製）により4量体画分を分画した。
　精製した4量体画分に対しモル比1:8で化合物Cまたは化合物Dを添加し1時間インキュベートした。その後、限外濾過カラム（VIVASPIN20）にて限外濾過カラム（VIVASPIN20）にて20 mM tris-HCl, pH7.5, 200 mM NaCl にバッファー交換しながら10 mg/mLの濃度まで濃縮を行った。
（１）V2122と化合物Cとの共結晶化
　結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法により実施した。結晶化温度は20℃にて行った。タンパク質とリザーバ溶液（0.2M Sodium citrate tribasic dehydrate, 20%(w/v) PEG 3350）を0.1 マイクロリットル：0.1 マイクロリットルの比率で混合したドロップを60マイクロリットルのリサーバ溶液に対し平衡化を行った。また、抗凍結剤として25％グリセロール溶液を使用した。
（２）V2122と化合物Dとの共結晶化
 結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法により実施した。結晶化温度は20℃にて行った。タンパク質とリザーバ溶液（0.2M Sodium citrate tribasic dehydrate, 20%(w/v) PEG 3350）を0.5 マイクロリットル：0.5 マイクロリットルの比率で混合したドロップを60マイクロリットルのリサーバ溶液に対し平衡化を行った。また、抗凍結剤としてOilを使用した。
（３）結晶の解析方法
　回収強度データはSpring 8 BL44XU で収集した。収集したデータはPhaser（分子置換プログラム）を用いて、先に構造解析を実施したV21とイミノビオチン longtail との共結晶データをモデル分子とした分子置換法により、位相を決定した。精密化はREFMAC5を用いて行った。
　結晶構造解析の結果を図６、７に示す。
　化合物Cが結合したV212の結晶と比較すると、化合物Cを結合させたV2122の結晶構造は、設計通りアミノ酸番号４５番と４９番（配列表４のアミノ酸配列における３３番と３７番）の相互作用がなくなり、ループ構造が大きく構造変化をしV21様に閉じた形になっていることが確認され、変異N49Gの有用性が示された。また、図７に示した化合物Cもしくは化合物Dを結合させたV2122の構造の比較では、前述ループ部分に構造上の違いが確認され化合物CとDの長さに起因する構造変化を確認する結果となった。
実施例８：フローサイトメトリーによるＲＡＭＯＳ細胞上のＣＤ２０の認識解析
　Rituximab-scFv-V2122の遺伝子配列については人工遺伝子合成（ライフテクノロジーズ社）し入手した。具体的にはDrugBankデータベース（www.drugbank.ca）に登録されているリツキシマブのアミノ酸配列から軽鎖（VL）および重鎖（VH）のアミノ酸配列を抜き出し、VLとVHとをリンカー（GGGS x 4）でVL-VHの順でつなぎ合わせた。さらに、LV-LHとV2122とをリンカー（SSGSGSA）で結合したものを大腸菌のコドン配列に最適化し人工合成した。Rituximab-scFv-V2122の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２７及び２８に示す。配列番号２８のアミノ酸配列における各配列の位置を以下に示す。
pelB signal 配列:アミノ酸番号１－２３
VL配列：アミノ酸番号２４－１３０
Linker 配列１: アミノ酸番号１３１－１４８
VH 配列：アミノ酸番号１４９－２６９
Linke 配列２：アミノ酸番号２７０－２７６
V2122配列：アミノ酸番号２７７－４０５
6xHis-Tag配列：アミノ酸番号４０６－４１１
　前述のように人工合成した遺伝子はpET21a(+)に組込み、大腸菌BL21(DE3)を用いて蛋白質発現を行い、インクルージョンボディーでタンパク質を回収した。回収したインクルージョンボディーは、非特許文献（Yumura et al. 2013, Protein Science）に従って巻き戻し精製を実施した。
　巻き戻し精製を行ったRituximab-scFv-V2122についてCD20陽性細胞であるRAMOS(ヒトバーキッドリンパ腫)細胞（JCRB細胞バンク）を用いて結合性の評価を行った。具体的には、PBSにてRituximab-scFv-V2122を希釈し3濃度（0.05, 0.5, 5 μg/mL）を用意した。1x106個の細胞を1.5mL Tube に分取し400 xg、4分間で遠心し上清を廃棄して細胞を回収した。回収した細胞に対し、希釈したRituximab-scFv-V2122を100 μL 添加しよく混和し氷上30分でインキュベーションをおこなった。再び遠心を行い、上清を廃棄し、１mLのPBSを添加し細胞の洗浄をおこない細胞を回収した。次に13nMもしくは1.3nMのFITC-Psycheまたは、0.5μg/mL（3.3nM）のAnti-His-tag mAb-Alexa Flour 488（株式会社 医学生物学研究所）を100μL細胞へ添加し混和後、氷上30分インキュベーションをおこなった。インキュベーション後、再び遠心を行い、上清を廃棄し、１mLのPBSを添加し細胞の洗浄をおこない細胞を回収した。回収した細胞に500μLのPBSで懸濁してフローサイトメーター（guava easyCyte シングル　システム；Merck Millipore）にて測定をおこなった。
　結果を図８に示す。
　まず、Alexa Flour 488標識抗Hisタグ抗体（3.3nM）をもちいたアッセイ結果Aにより、Rituximab-scFv-V2122の濃度依存的に蛍光強度のシフトが観察され、今回作製したRituximab-scFv-V2122は、RAMOS細胞表面上のCD20を認識していることが確認された。次に、FITC標識されたFITC標識化合物Bを使用したアッセイ結果Bにより、標識抗Hisタグ抗体同様に、Rituximab-scFv-V2122濃度依存的な蛍光強度のシフトが確認された。さらに化合物の濃度(3nM, 10nM, 30nM)において濃度依存的な蛍光強度のシフトが確認されたことからFITC標識化合物BがRituximab-scFv-V2122と結合していることが初めて証明された。
比較例１：野生型ストレプトアビジン変異体Y43AおよびS45Aとの性能比較１（ビオチン結合性の比較）
　はじめに、pET21a(+)ベクターにある制限酵素NdeIとXhoIサイトを使用しワイルドタイプ コアストレプトアビジン配列（特許文献１、配列表２のアミノ酸配列）を導入したベクターを作製した。次にその鋳型として、以下のプライマーセットをもちいてsite directed mutagenesis法により、Y43AもしくはS45A（配列表２のアミノ酸配列において３１番および３３番のアミノ酸をそれぞれ置換）の変異体を作製した。目的タンパク質は大腸菌（BL21(DE3)株）により発現させインクルージョンボディーとして回収し、希釈法により巻き戻しを行いアフィニティー精製およびゲル濾過精製をすることで4量体形成画分を得た。具体的には、精製したインクルージョンボディーを変性バッファー（6Mグアニジン塩酸、50mM Tris-HCl, 200mM NaCl、1mM EDTA、pH8.0 at 4℃）にてオーバーナイトで溶解した。溶液の吸光度280を測定し、5 mg分の溶解液を50mLのリフォールディングバッファー（50mM Tris-HCl, 300mM NaCl、1mM EDTA、400mM Arginine-HCl、pH8.0 at 4℃）に撹拌しながら滴下し、4℃にて静置し保存した。安定的な巻き戻しを行うために保存時間は2日とした。 2日間の保存の後、Ni-NTAレジン（cOmplete His-Tag Purificaiton Resin; Roche）を使用しアフィニティー精製を行った。その後、バッファーとしてPBSを用いてゲル濾過精製（HiLoad 16/60 Superdex 200pg GEヘルスケア社製）により4量体画分を分画した。
　精製した2種類のワイルドタイプ コアストレプトアビジン変異体（cSA-Y43A, cSA-S45A）および精製されたLISA314、およびV2122タンパク質を用いてビオチン（シグマアルドリッチ）との相互作用を表面プラズモン共鳴（SPR）により行った。具体的には、Biacore T200 (GE ヘルスケア)を測定器として用い、センサーチップにはセンサーチップNTA（GE ヘルスケア）を使用し核タンパク質に融合しているHis-Tagを利用してセンサーチップ上にタンパク質を固定化した。ランニングバッファーはHBS-P(+)を用いマニュアルに記載されている通りバッファー調製を行った。化合物の希釈系列は1.8nM, 9nM, 18nM, 90nM, 180nM, 900nM, 1800nMの７系列をランニングバッファーで調整しデータの取得をおこなった。
プライマーセット
Y43A Fw: GGCACCGCCGAAAGCGCCGTGGGTAAT（配列番号１７）
Y43A Rv: GCTTTCGGCGGTGCCGGTCAGCGCACC（配列番号１８）
S45A Fw: TATGAAGCCGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号１９）
S45A Rv: CACGGCGGCTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号２０）
　結果を図９に示す。
得られたセンサーグラムから、野生型ストレプトアビジン変異体cSA-Y43A、cSA-S45Aは、ビオチン濃度依存的に相互作用を示し、解離が極端に遅いLISA314と同等なビオチンと強い特異的結合を示すことが確認された。一方、V2122はビオチン濃度依存的な相互作用は見られず、特異的な結合は無い事が確認された。この結果、野生型ストレプトアビジン変異体cSA-Y43A、cSA-S45A、およびLISA314とV2122とは、ビオチンに対して全く異なった性質をもつタンパク質であることが確認された。
比較例２：野生型ストレプトアビジン変異体Y43AおよびS45Aとの性能比較２
（化合物C とV2122との特異的結合性の証明）
　前述した、精製した2種類のワイルドタイプ コアストレプトアビジン変異体（cSA-Y43A, cSA-S45A）および精製されたV2122タンパク質を用いて化合物Cとの相互作用を表面プラズモン共鳴（SPR）により行った。具体的には、Biacore T200 (GE ヘルスケア)を測定器として用い、センサーチップにはセンサーチップNTA（GE ヘルスケア）を使用し核タンパク質に融合しているHis-Tagを利用してセンサーチップ上にタンパク質を固定化した。ランニングバッファーはHBS-P(+)を用いマニュアルに記載されている通りバッファー調製を行った。化合物の希釈系列は1.8nM, 9nM, 18nM, 90nM, 180nM, 900nM, 1800nMの７系列をランニングバッファーで調整しデータの取得をおこなった。
　結果を図１０に示す。
測定の結果、野生型ストレプトアビジン変異体cSA-Y43Aは、化合物Cと濃度依存的な相互作用を示すが、解離が速いことが確認され、また野生型ストレプトアビジン変異体cSA-S45Aは化合物Cと極めて弱い濃度依存的な相互作用を示すに留まった。一方、V2122とBis-iminobiotinとは濃度依存的相互作用であり、極めて解離が遅い特異的な結合を示すことが確認された。この結果、野生型ストレプトアビジン変異体cSA-Y43A、cSA-S45AとV2122とは、化合物Cに対して全く異なった性質を持つタンパク質であることが確認された。また、化合物C とV2122とは極めて特異的に強固な結合を示すことが確認された。
実施例9：エピレギュリン（epiregulin）抗原と抗エピレギュリンscFv抗体との結晶構造解析
（１）抗エピレギュリンscFvの発現培養と精製
　抗エピレギュリンscFvをコードするプラスミドを大腸菌に形質転換した。大腸菌のコロニーをLB液体培地で前培養した後、本培養を2×YT培地で行い、IPTGを添加して抗エピレギュリンscFvの発現を誘導した。回収した菌体をTrisバッファー中で破砕し、遠心処理した上清を回収した。これをNiカラム、陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムで順次精製した。ゲルろ過後のSDS-PAGEの結果を図１１に示す。
　結晶化は20 ℃でシッティングドロップ蒸気拡散法により実施した。精製したタンパク質溶液（15 mg/mL抗エピレギュリンscFv), 20mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl）をリザーバー溶液（2% Tacsimate (pH 7.0), 5% 2-Propanol, 0.1 M Imidazole (pH 7.0), 11% PEG 3350）と混合してドロップを作ることで良質な結晶を得た。
　得られた結晶は、SPring-8 BL44XUビームラインにてX線回折実験を行い、2.4 Å分解能の回折データが得られた。これをプログラムHKL2000で処理し、Phaserにより分子置換法で位相決定し、Refmac5で構造を精密化した。
（２）抗エピレギュリンscFvとエピレギュリンの複合体の調製、結晶化、構造解析
　抗エピレギュリンscFvとエピレギュリン（細胞外ドメイン）を5.0 mgずつ混合し、25 ℃で1 時間インキュベートした。これをゲルろ過カラムで精製し、複合体画分を回収した。
　結晶化は20 ℃でハンギングドロップ蒸気拡散法により実施した。複合体サンプル（15 mg/mL, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl）をリザーバー溶液（0.1 M Magnesium Chloride, 0.1 M Sodium Acetate (pH 5.1), 10% PEG 6,000）と混合してドロップを作ることで良質な結晶を得た。
　得られた結晶について、SPring-8 BL32XUビームラインにてX線回折実験を行い、1.8 Å分解能の回折データを収集した。これをプログラムHKL2000で処理し、Phaserによる分子置換法で位相決定し、Refmac5で構造を精密化した。
（３）抗エピレギュリンscFv抗体によるエピレギュリンの認識機構
　抗エピレギュリンscFv単体とエピレギュリン複合体の結晶構造から次のことが明らかになった。抗エピレギュリンscFvとエピレギュリンの相互作用領域は主に3か所あり、エピレギュリンのN末端領域と抗エピレギュリンscFv軽鎖のCDR1とCDR3との相互作用（Interaction 1）、エピレギュリンのC末端領域と抗エピレギュリンscFv重鎖のCDR2の相互作用（Interaction 2）、エピレギュリンのβ-sheet領域と抗エピレギュリンscFv重鎖のCDR3との相互作用（Interaction 3）に大別された。Interaction 1と2では、エピレギュリンのループ構造が変化し、HM(scFv)のCDRにさほど構造変化は見られなかった。一方、Interaction 3領域では逆にエピレギュリンの構造は変化せず、抗エピレギュリンscFv重鎖のCDR3で、P103残基のシス－トランス異性化を伴う構造変化が見られ、induced fitにより抗原認識がなされていた（図１２）。
実施例１０：
（１）抗エピレギュリンscFv-V2122発現ベクターの作製
　一本鎖可変部抗体とストレプトアビジンとの融合タンパク質（scFv-SA）を大腸菌で発現させると、多くの場合アグリゲーションやインクルージョンボディーを形成するため可溶性の状態での回収は難しいことが一般的に知られている。そのため、scFv-SAタンパク質を得るためにインクルージョンボディーを変性さタンパク質の巻き戻しによる方法が定石とされていた。しかし、巻き戻しによるタンパク質生産は時間と手間がかかる。今回はシャペロン機能を有するタンパク質skpと抗エピレギュリンscFv-V2122と同時に大腸菌で発現させることで可溶性画分にて回収する方法を実施した。
　具体的には、シャペロンskpの遺伝子配列は、タンパク質配列（配列番号２４）を基に大腸菌使用コドンに合わせた配列設計を実施した（配列番号２３）。一方、抗エピレギュリン抗体の一本鎖可変部抗体（抗エピレギュリンscFv）とV2122との融合タンパク質（抗エピレギュリンscFv-V2122）の遺伝子配列は、抗エピレギュリン抗体の可変部をVH、VLの順でリンカー(GGGGS)x4(配列番号３５)で結合し、VLとV2122とはリンカー（GGGGSGGGG）（配列番号３６）で結合させたタンパク質配列を設計これもskpと同様に大腸菌使用コドンに合わせた遺伝子配列を設計した。２つの遺伝子配列は人工遺伝子合成サービス（ライフテクノロジーズ社）にて人工合成し作製した。なお可変部VH、VLは、Lee YH, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2013 Nov29;441(4):1011-7. doi: 10.1016/j.bbrc.2013.11.014. Epub 2013 Nov 12. PubMed PMID:24239549を参照した。
　抗エピレギュリン抗体の一本鎖可変部抗体（抗エピレギュリンscFv）の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２１及び２２に示す。
　配列番号２２のアミノ酸配列における各配列の位置を以下に示す。
pelB signal 配列: アミノ酸番号１－２２
VH配列：アミノ酸番号２３－１４０
Linker 配列１: アミノ酸番号１４１－１６４
VL 配列：アミノ酸番号１６５－２７３
6xHis-Tag配列：アミノ酸番号２７４－２７９
　抗エピレギュリンscFvとV2122との融合タンパク質（抗エピレギュリンscFv-V2122）の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２９及び３０に示す。
　配列番号３０のアミノ酸配列における各配列の位置を以下に示す。
pelB signal 配列:アミノ酸番号１－２２
VH配列：アミノ酸番号２３－１４０
Linker 配列１: アミノ酸番号１４１－１６４
VL配列：アミノ酸番号１６５－２７２
Linke 配列２：アミノ酸番号２７３－２８２
V2122配列：アミノ酸番号２８３－４０９
6xHis-Tag配列：アミノ酸番号４１０－４１５
　次に人工合成した２つの遺伝子をpETDuet-1ベクター（Novagen社）のマルチクローニングサイト1（MSC1）にskp の遺伝子配列を組込み、MCS2に抗エピレギュリンscFv-V2122の遺伝子配列を組み込んだ。具体的には、初めにベクターの直鎖化を制限酵素NcoI で実施し、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社）のマニュアルに従って設計したプライマー（MCS1_skp_Fw: AGGAGATATACCATGATGAAAAAATGGCTGCTGGC(配列番号３７), MCS1_skp_Rv: CGCCGAGCTCGAATTTTATTTCACTTGTTTCAGAACG(配列番号３８)）を使用したPCRでskp遺伝子配列を増幅しゲル切り出し精製の後、In-Fusion HD Cloning Kitで直鎖化ベクターとのライゲーションしクローニング作業を実施し、クローニングしたプラスミドをシーケンス解析し目的のクローンの選択をおこなった。次に、skp遺伝子を挿入したプラスミドベクターの直鎖化を制限酵素NdeI実施し、前述と同様にIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社）のマニュアルに従って設計したプライマー（MCS2_scFvV2122_Fw; AAGGAGATATACATAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAG(配列番号３９), MCS2_ scFvV2122_Rv; TTGAGATCTGCCATATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCTG(配列番号４０)）を使用したPCRで抗エピレギュリンscFv-V2122遺伝子配列を増幅しゲル切り出し精製の後、In-Fusion HD Cloning Kitで直鎖化ベクターとのライゲーションしクローニング作業を実施し、クローニングしたプラスミドをシーケンス解析し目的のクローンの選択をおこなった。これによりskpタンパク質と抗エピレギュリンscFv-V2122タンパク質とを同時に発現できるベクター（pETDuet-epiregulin-scFvV2122_skp）が完成した。
（２）抗エピレギュリンscFv-V2122タンパク質の発現
　pETDuet-epiregulin-scFvV2122_skpをBL21(DE3)（ニッポン・ジーン社）に形質転換し２xYT培地（SIGMA-ADLRICH社）、37℃にて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5～2.0になるまで37℃で培養を行った。次に最終濃度1mM IPTG、1% Triton X-100を添加し16℃で４時間培養し培養上清を回収した後、４℃で保存した。
（３）抗エピレギュリンscFv-V2122タンパク質の精製
　抗エピレギュリンscFv-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用しバッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA（50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 5mM Imidazole, pH8.0）で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を４℃で保存した培養上清へ添加し、２時間から一晩、４℃にて撹拌しレジンへのタンパク質結合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業を行った。その後、バッファーB（50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazole, pH8.0）で溶出し抗エピレギュリンscFv-V2122の粗精製物の回収を行った。
　次に、ハイドロキシアパタイトカラム（Bio-Scale CHT2-I）（Bio-Rad社）による精製を行った。具体的には、抗エピレギュリンscFv-V2122の粗精製物をビバスピンTurbo15（分画分子量：30,000）カラムを用いて濃縮を行った後、PD10カラムを使用し、開始バッファー（5mM Na2PO4、 pH7.0） に粗精製物のバッファーを置換した。ハイドロキシアパタイトカラムを開始バッファーで十分平衡化した後に、バッファー置換した粗精製物をカラムにアプライした。20カラム容量の洗浄の後、溶出バッファー（400mM Na2PO4、 pH7.0）の0%から60%グラジエントを15カラム容量で溶出を行い目的の精製物を調製できた（図１３）。
（４）エピレギュリンIgGの発現と精製
　エピレギュリンIgGはLeeらの非特許文献を参考にして発現精製を行った。具体的には文献に記載されているVLとヒト軽鎖定常領域と、VHはヒト重鎖定常領域と結合させた遺伝子配列を人工合成しそれぞれ、エピレギュリンIgG の軽鎖、重鎖とした。エピレギュリンIgGの重鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号３１及び３２に示し、エピレギュリンIgGの軽鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号３３及び３４に示す。
　次に軽鎖、重鎖をpcDNA3.4 TOPO TA Cloning Kit（ライフテクノロジーズ社）を使用し、pcDNA3.4ベクターに組み発現ベクターの調製を行った。タンパク質の発現は、軽鎖、重鎖のベクターを2:1になるようにExpi293F細胞（ライフテクノロジーズ社）へExpiFectamine 293 Transfection Kit を利用し遺伝子導入を行った。細胞の培養はExpi293 Expression System Kit のマニュアルの用法容量に従い、CO2濃度８％、振とう回転数125rpm、１L三角フラスコ（コーニング社）を使用し、哺乳類細胞用高温振とう培養機CO2-BR-43FL（タイテック社）で行った。５日間の培養後、遠心にて細胞を除去し、上清を回収し４℃で保存した。次に、４℃で保存した培養上清からエピレギュリンIgGの精製はBio-Scale Mini UNOspher SUPrA アフィニティーカートリッジ（Bio-Rad社）を使用し、マニュアルの用法容量に従い実施した。
Pro-EPR-mFcの発現と精製
　エピレギュリンの細胞外ドメインとマウスIgG1抗体重鎖Fc領域とを融合させたタンパク質（Pro-EPR-mFc）の発現と精製を実施した。Pro-EPR-mFcの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２５及び２６に示す。具体的にはエピレギュリンの細胞外ドメインとマウスIgG1抗体重鎖Fc領域とを融合させた遺伝子をpcDNA3.4ベクターに導入し、「エピレギュリンIgGの発現と精製」と同様の方法でタンパク質の発現精製を行った。
（５）精製物のFITC標識および標識体の検定
　精製された抗エピレギュリンscFv-V2122のFITC標識体（抗エピレギュリンscFv -V2122-FITC）の作製はFluorescein Labeling Kit － NH2（同仁化学）を用いキットの用法容量従い行った。また、エピレギュリンIgG、抗エピレギュリンscFvタンパク質の標識も同様の方法で行った。
　次に標識による結合性低下の有無を確認するために、抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCの抗原結合性の確認をSPR（Biacore T200）にて行った。具体的には、リガンドであるエピレギュリン細胞膜外領域をマウスFc領域と融合させたタンパク質（Pro-EPR-mFc）をanti-Mouse IgG抗体を固定化したセンサーチップCM5にキャプチャーさせ、アナライトである抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCの希釈系列20nMから2倍希釈９系列を用いてカイネティクスアッセイを行った（図１４）。その結果、抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCは標識後も抗原に対し結合性をそのアフィニティーは2.3E-10であることが確認された。また、エピレギュリンIgG、抗エピレギュリンscFvタンパク質の結合確認も300nMから２倍希釈９系を用意し列同様の方法で行った（図１４）。Biacore evaluation softwareでデータを解析その結果、エピレギュリンIgG-FITC、抗エピレギュリンscFv-FITCともに標識後も結合性を有していることが確認され、それぞれのアフィニティーは3.4E-08、1.2E-07となり、　抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCはエピレギュリンIgG-FITC、　抗エピレギュリンscFv-FITCの約100倍から1,000倍のアフィニティーを有することが確認された。
（６）抗ピレギュリンscFv-V2122-FITCを用いた細胞染色および内在化の解析
　細胞染色に用いたヒト大腸がん由来DLD1細胞、完全培地RPNI1640 (10% FBS含有)にて培養を行い、アッセイ２日前にuClear 96well plate (グライナー社)に細胞を１x104 cell/wellの細胞密度で播種した。細胞染色は、まず始めに1μMになるようにヘキスト33342を添加した完全培地に培地交換を行い、１５分後に　抗エピレギュリンscFv-V2122-FITC、エピレギュリンIgG-FITC、抗エピレギュリンscFv-FITCを濃度25nM, 50nM, 100nMになるように各ウェルに添加した。
　細胞表面への抗体結合および内在化の解析にはIN Cell Analyzer 6000（GEヘルスケアバイオサイエンス）を使用した。５分間隔でタイムラプスによる画像取得を実施した。
　その結果、抗エピレギュリンscFv-V2122-FITC、エピレギュリンIgG-FITC、　抗エピレギュリンscFv-FITC全てにおいて、細胞膜表面の染色が確認された。また、内在化は特に　抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCにおいて顕著に観察され、抗体添加10分後くらいから内在化が観察されはじめ、65分後には蛍光の大部分が細胞質内に移行していることが確認された（図１５）。
（７）抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCを用いたFACS解析
　標識抗体である抗エピレギュリンscFv-V2122-FITC、エピレギュリンIgG-FITC、　抗エピレギュリンscFv-FITCを用いたFACSによる細胞表面結合性の確認を行った。具体的には0nM、0.5nM, 5nM, 50nMの標識抗体希釈液とエピレギュリンが発現しているDLD1細胞（1x106 cells/mL, 500mL）とを30分間氷上で反応させ、フローサイトメーター　guava easyCyte 5にて測定を行った。測定方法は機械の説明書の用法容量に従った。
　その結果、標識抗体抗エピレギュリンscFv-V2122-FITCとエピレギュリンIgG-FITCとは同等の結合性を示したが、これら２つと比較して抗エピレギュリンscFv-FITCは結合性が弱いことが確認された（図１６）。
実施例１１：Rituximab-scFv-V2122生体イメージング
（１）発現ベクターの構築
　リツキシマブ一本鎖抗体（single chain variable fragment; scFv）は軽鎖可変領域VLと重鎖可変領域VHをVL、VHの順にリンカー（GGGGS）×４で結合する設計を行った。VLには分泌シグナルであるPelB配列を付加し、PelB-VL-(GGGGS)4-VH という配列にした。さらにscFvをリンカー（GGGGSGGGG）でＶ2122と結合させる設計（以下、Rituximab-scFv-V2122）を行った（アミノ酸配列：配列番号４２）。タンパク質発現用の遺伝子配列は人工遺伝子合成サービスを利用し作製した（遺伝子配列：配列番号４１）。発現ベクターは実施例１０の（１）抗エピレギュリンscFv-V2122発現ベクターの作製の場合と同様にpETDuet-1のマルチクローニングサイト２（MCS2）にRituximab-scFv-V2122の組み込みを実施した。
　Rituximab-scFv-V2122のアミノ酸配列及び塩基配列を以下に示す。
Rituximab-scFv-V2122の遺伝子配列（配列番号４１）
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCA
ATGGCACAGATTGTTCTGAGCCAGAGTCCGGCAATTCTGAGCGCATCACCGGGTGAAAAA
GTTACCATGACCTGTCGTGCAAGCAGCAGCGTTAGCTATATTCATTGGTTTCAGCAGAAA
CCGGGTAGCAGCCCGAAACCGTGGATTTATGCAACCAGCAATCTGGCAAGCGGTGTTCCG
GTTCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGCACCAGCTATAGCCTGACCATTAGCCGTGTTGAA
GCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGACCAGTAATCCGCCTACCTTTGGT
GGTGGCACCAAACTGGAAATTAAAGGAGGTGGTGGTTCAGGAGGTGGTGGTAGCGGTGGC
GGTGGTAGCGGAGGTGGTGGTAGCCAGGTTCAGCTGCAGCAGCCTGGTGCAGAACTGGTT
AAACCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCAGCTAC
AATATGCATTGGGTTAAACAGACACCGGGTCGTGGTCTGGAATGGATTGGTGCAATTTAT
CCGGGTAATGGTGATACGAGCTATAACCAGAAATTCAAAGGCAAAGCAACCCTGACCGCA
GATAAAAGCAGCAGTACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGTCTGACCAGCGAAGATAGCGCA
GTTTATTACTGTGCACGTAGCACCTATTACGGTGGTGATTGGTATTTTAACGTTTGGGGT
GCAGGCACCACCGTTACCGTTAGCGCAGGCGGAGGTGGAAGCGGTGGAGGTGGAGCAGAA
GCAGGTATTACCGGCACCTGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGC
GCAGATGGTGCACTGACCGGTACATATGAAAATGCAGTTGGTAATGCAGAAAGCCGTTAT
GTTCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGT
TGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACATGGTCAGGT
CAGTATGTTGGTGGTGCAGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGTGGTACA
ACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGCACCCTGGTTGGTCATGATACATTTACCAAAGTTAAA
CCGAGCGCAGCGAGCGGTGGTCATCATCATCACCATCAT
Rituximab-scFv-V2122のアミノ酸配列（配列番号４２）
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQK
PGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFG
GGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSY
NMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSA
VYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAG
ADGALTGTYENAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSG
QYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGGHHHHHH
（２）タンパク質の発現および粗精製
　Rituximab-scFv-V2122タンパク質の発現は大腸菌により実施した。具体的にはBL21(DE3)（ニッポンジーン社）にプラスミドベクター pETDuet-1(skp)Rituximab-scFv-V2122 を導入し形質転換を行った。形質転換した大腸菌は100 mL の 2xYT 培地で37度にて一晩培養を行った。次に１Lの2xYT培地に対し前培養液 20mL を添加し、37℃で培養を行い、OD600 nm = 2.0 になった時点で終濃度 1 mM IPTGと終濃度１％ Triton X-100 を添加し18時間～24時間、２０℃で培養を実施した。その後、遠心にて培養上清を回収し、4L分の上清をプールした。次に Ni-NTAレジンによる粗精製を実施した。具体的には cOmplete His-Tag Purification Resin (Roche社) 5mL相当を4Lのプールに添加しスターラーで撹拌しながら４℃で一晩、結合処理を実施した。その後、レジンをカラムに回収して、50 mL 洗浄バッファー（50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 5mM Imidazole, pH8.0）にて洗浄を行い、40 mL の溶出バッファー（50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazole, pH8.0）にて溶出を行った。溶出液は VIVASPIN Turbo 15 30,000 MWCO（ザルトリウス社）にて1～３mLになるまで濃縮を行い冷凍（-80℃）にて保存した（図１７）。
（３）Rituximab-scFv-V2122タンパク質の Protein L カラムによる精製
　更なる精製は Protein L 1mL カラム (HiTrap L (GEヘルスケア社))を使用し実施した。具体的には、10 CV のPBSでカラムの平衡化を行い、PBSで2倍希釈したサンプルをアプライした。次に10 CV のPBSで洗浄を行い、10 CV の 10 mM Glycine-HCl pH2.5 バッファーで溶出を行った。溶出液は直ちにPD10を用いてPBSにバッファー置換を行った。その後、VIVASPIN Turbo 15 MWCO100,000（ザルトリウス社）にて0.3 mL ～ 1 mL になるまで濃縮を行い冷蔵にて保存した（図１７）。
（４）蛍光標識
　精製されたRituximab-scFv-V2122は事前に、DMSOに溶解したPsyche F-IRDye 800 (上記実施例の化合物４４)（最終濃度１０倍モル濃度）と混合し氷上で１０分間インキュベートした。その後、Zeba Spin Desalting Column (Thermo SCIENTIFIC)にて日本薬局方生理食塩液（大塚製薬株式会社）にバッファー置換した。
（５）フローサイトメーター
　ヒトCD20抗原を高発現している、Ramos細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来細胞）（JCR細胞バンク）を遠心にて回収した。細胞をPBSに懸濁させ（細胞 1x106個／mL）、試験抗体（0nM, 0.5nM, 5nM, 50nM, 100nM）とともに室温で３０分間インキュベートした。PBSで２回洗浄した後、細胞にanti 6xHis-tag antibody Alexa Flour 488 （500ng/mL）を0.1mL加えて室温で３０分間インキュベートした。PBSで２回洗浄した後、試験抗体の結合様式および特異性をguava easyCyte (Merck Millipore)により製造元の使用説明書に従って評価した（図１８）。
（６）異種移植モデル
　Ramos細胞懸濁液とマトリゲルマトリックス（コーニング）と１：１で混合（細胞5x106個／0.1mL）した液0.1mLを５～6週齢の雌性ヌードマウス（三協ラボサービス）の左脇腹へ皮下接種した。これらのマウスを数週間飼養して腫瘍を発生させた。撮像１週間前に低蛍光飼料（iVid #1、オリエンタル酵母工業株式会社）に切り替え飼養した。蛍光イメージング試験には、平均腫瘍容積が100～600 mm3に達したマウスを用いた。
（７）生体内イメージング
　樹立されたヒトバーキットリンパ腫Ramosを有するヌードマウスに、あらかじめPsyche F-IRDye 800 (上記実施例の化合物４４)と反応させることで蛍光標識されたRituximab-scFv-V2122抗体（25μg, 50μg, 100μg）を静脈内注射した。腫瘍への集積調査では、投与後２、２４、および４８時間後にIRDye800の腫瘍への集積を in vivo 光イメージンング装置 Clairvivo OPT plus（株式会社島津製作所）で評価した（図１９）。
（８）結果
　第一に、図１８により、Rituximab-scFv-V2122抗体はターゲット細胞に濃度依存的に結合していることが示された。第二に、図１９に示されるようにRituximab-scFv-V2122抗体は投与２時間後にモデルマウスの腫瘍集積していることが確認された。まとめると、Rituximab-scFv-V2122抗体とPsyche F-IRDye 800 (上記実施例の化合物４４)は生体内でも結合しており、腫瘍特異的に場所に素早く集積することが可能である。すなわち、Rituximab-scFv-V2122抗体は診断用薬剤や治療用薬剤を素早く腫瘍部位にデリバーでき、有用な診断、治療薬候補である。
実施例１２：抗エピレギュリンscFv-V2122を用いた生体イメージング
（１）タンパク質の発現および粗精製
　実施例１０の（１）に記載した抗エピレギュリンscFv-V2122発現ベクターを用い抗エピレギュリンscFv-V2122タンパク質の発現を実施した。具体的にはBL21(DE3)（ニッポンジーン社）にプラスミドベクター pETDuet-epiregulin-scFvV2122_skpを導入し形質転換を行った。形質転換した大腸菌は100 mL の 2xYT 培地（Difco Laboratories）で37℃にて一晩培養を行った。次に１Lの2xYT培地に対し前培養液 20mL を添加し、37℃で培養を行い、OD600 nm = 2.0 になった時点で終濃度 1 mM IPTGと終濃度１％ Triton X-100 を添加し18時間～24時間、２０℃で培養を実施した。その後、遠心にて培養上清を回収し、4L分の上清をプールした。
　次に Ni-NTAレジンによる粗精製を実施した。具体的には cOmplete His-Tag Purification Resin (Roche社) 5mLを4Lのプールサンプルに添加しスターラーで撹拌しながら４℃で一晩、結合処理を実施した。その後、レジンをカラムに回収して、50 mL 洗浄バッファー（50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 5mM Imidazole, pH8.0）にて洗浄を行い、40 mL の溶出バッファー（50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazole, pH8.0）にて溶出を行った。溶出液は VIVASPIN Turbo 15 30,000 MWCO（ザルトリウス社）にて1～３mLになるまで濃縮を行い冷凍（-80℃）にて保存した。
（２）Protein L カラムによる精製
　更なる精製は Protein L 1mL カラム (HiTrap L (GEヘルスケア社))を使用し実施した。具体的には、10 CV のPBSでカラムの平衡化を行い、PBSで2倍希釈したサンプルをアプライした。次に10 CV のPBSで洗浄を行い、10 CV の 10 mM Glycine-HCl pH2.5 バッファーで溶出を行った。溶出液は直ちにPD-10カラム（GEヘルスケア社）を用いてPBSにバッファー置換を行った。その後、VIVASPIN Turbo 15 MWCO100,000（ザルトリウス社）にて0.3 mL ～ 1 mL になるまで濃縮を行い冷蔵にて保存した（図２０）。
（３）蛍光標識
　精製された抗エピレギュリンscFv-V2122は事前に、DMSOに溶解したPsyche F-IRDye 800 (上記実施例の化合物４４)（最終濃度１０倍モル濃度）と混合し氷上で１０分間インキュベートした。その後、Zeba Spin Desalting Column (Thermo SCIENTIFIC)にて日本薬局方生理食塩液（大塚製薬株式会社）にバッファー置換し冷蔵にて保存した。また、エピレギュリンIgGの標識は、ICG Labeling Kit - NH2（株式会社同仁化学）を用いて実施した。
（４）異種移植モデル
　ヒト大腸がん由来DLD1細胞懸濁液とマトリゲルマトリックス（コーニング社）と１：１で混合（細胞5x106個／0.1mL）した液0.1mLを５～6週齢の雌性ヌードマウス（三協ラボサービス）の左脇腹へ皮下接種した。これらのマウスを数週間飼養して腫瘍を発生させた。撮像１週間前に低蛍光飼料（iVid #1、オリエンタル酵母工業株式会社）に切り替え飼養した。蛍光イメージング試験には、平均腫瘍容積が100～600 mm3に達したマウスを用いた。
（５）生体内イメージング
　樹立されたDLD1腫瘍を有するヌードマウスに、あらかじめPsyche F-IRDye 800 (上記実施例の化合物４４)と反応させることで蛍光標識された抗エピレギュリンscFv-V2122抗体（25μg, 50μg, 100μg）もしくは蛍光標識されたエピレギュリンIgG（50μg）を静脈内注射した。腫瘍への集積調査では、投与後２、２４、および４８時間後にIRDye800の腫瘍への集積を in vivo 光イメージンング装置 Clairvivo OPT plus（株式会社島津製作所）で評価した（図２１）。
（６）結果
　第一に、図２１により、腫瘍部が描出されていることから抗エピレギュリンscFv-V2122抗体とPsyche F-IRDye 800 (上記実施例の化合物４４)は生体内でも結合していることが示された。第二に、図２１に示されるように抗エピレギュリンscFv-V2122抗体標識体はIgG標識体に比して早期（投与２時間後）にモデルマウスの腫瘍集積していることが確認された。まとめると、抗エピレギュリンscFv-V2122抗体とPsyche F-IRDye 800 (上記実施例の化合物４４)は生体内でも結合しており、腫瘍特異的に場所に素早く集積することが可能である。すなわち、抗エピレギュリンscFv-V2122抗体は診断用薬剤や治療用薬剤を素早く腫瘍部位にデリバーでき、有用な診断、治療薬候補である。

Claims (17)

  1. 下記式（１）で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、Ｖ1及びＶ2はそれぞれ独立にＳ又はＳ+－Ｏ-を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、ｍ１及びｍ２はそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、Ｌは連結基を示す。）
  2. ｎ１及びｎ２が０である、下記式（２）で示される、請求項１に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ、Ｘ２ｂ、Ｙ1、Ｙ2、Ｚ1、Ｚ2、Ｖ1、Ｖ2、ｍ１、ｍ２及びＬは、請求項１と同義である）
  3. Ｌが、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－Ｏ－、炭素数１から１０のアルキレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、又はそれらの組み合わせである、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. Ｌが、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）q－Ｏ－（ＣＨ2）r－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）q－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－ＣＯＮＨ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＮＨＣＯ－（ＣＨ2）s－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ3）－（ＣＨ2）p－ＮＨＣＯ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）s－ＣＨ（ＣＯＯＣＨ3）－ＮＨ－ＣＯ－、又は－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）p－Ｏ－（ＣＨ2）t－ＮＨＣＯ－（置換基を有していてもよいフェニレン基）－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）s－Ｏ－（ＣＨ2）u－ＮＨ－ＣＯ－である（式中、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、及びｕはそれぞれ独立に１～１０の整数を示す）、請求項１から３の何れか１項に記載の化合物。
  5. 以下の何れかの化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  6. 請求項１から５の何れか１項に記載の化合物に、放射性同位元素を捕捉するキレート基が結合している化合物。
  7. 請求項１から５の何れか１項に記載の化合物に、蛍光化合物又は薬剤化合物が結合している化合物。
  8. 以下の何れかの化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  9. 配列番号３に記載のアミノ酸配列において３７番目のアミノ酸残基であるAsnが他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる、ストレプトアビジン変異体。
  10. 配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体。
  11. 請求項９又は１０に記載のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡ。
  12. 請求項９又は１０に記載のストレプトアビジン変異体に分子プローブを結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物。
  13. 分子プローブが抗ヒトCD20抗体である、請求項１２に記載のストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物。
  14. 分子プローブが、リツキシマブである、請求項１２に記載のストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物。
  15. 分子プローブが、抗エピレギュリン一本鎖抗体である、請求項１２に記載のストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物。
  16. 請求項１２から１５の何れか１項に記載のストレプトアビジン変異体－分子プローブ結合物を含む、治療剤又は体内あるいは体外診断剤。
  17. （ａ）請求項１２から１５の何れか１項に記載のストレプトアビジン変異体―分子プローブ結合物；及び（ｂ）請求項１から５の何れか１項に記載の化合物で標識した体内あるいは体外診断用又は治療用物質を含む治療又は体内あるいは体外診断キット。
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Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018097239A1 (ja) 2016-11-25 2018-05-31 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 クリアリングエージェント
WO2018151301A1 (ja) 2017-02-17 2018-08-23 三井化学株式会社 抗体医薬の開発に資する創薬標的タンパク質の同定方法及び標的タンパク質に対する抗体の製造方法
WO2019189867A1 (ja) 2018-03-30 2019-10-03 三井化学株式会社 ビスイミノビオチン化合物の薬物送達用の用途
CN110337445A (zh) * 2016-12-23 2019-10-15 印度血清研究所私人有限公司 用于提高哺乳动物细胞培养物中的抗体生产力并最小化下游、配制过程中的聚集的改进的方法，以及由其获得的稳定抗体制剂
WO2019230905A1 (ja) 2018-05-30 2019-12-05 国立大学法人 東京大学 ハロゲン化したビオチン改変二量体およびその利用
WO2020032165A1 (ja) 2018-08-08 2020-02-13 国立大学法人 東京大学 ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート
WO2020138427A1 (ja) 2018-12-28 2020-07-02 国立大学法人 東京大学 がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
JP2021052669A (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 国立大学法人 東京大学 タンパク質認識物質とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
JP2021054739A (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 国立大学法人 東京大学 ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート
WO2021210573A1 (ja) 2020-04-14 2021-10-21 国立大学法人 東京大学 ビオチン改変二量体およびその利用
WO2021215534A1 (ja) 2020-04-24 2021-10-28 国立大学法人 東京大学 デュオカルマイシン誘導体及びその利用
CN114605432A (zh) * 2022-03-22 2022-06-10 湘潭大学 基于花菁染料的靶向性半胱氨酸荧光探针的制备和应用
WO2022203000A1 (ja) 2021-03-25 2022-09-29 国立大学法人 東京大学 抗原結合分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
US20220348681A1 (en) * 2021-04-22 2022-11-03 The University Of Tokyo Fused protein of an antibody which recognizes cancer-cells and a streptavidin mutant
WO2023085418A1 (ja) * 2021-11-15 2023-05-19 国立大学法人 東京大学 ウイルス阻害分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
US12115223B2 (en) 2021-04-22 2024-10-15 The University Of Tokyo Conjugate of biotin-modified dimer and phthalocyanine dye

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3109252B1 (en) 2014-02-18 2020-12-30 Savid Therapeutics Inc. Modified biotin, streptavidin mutant, and usage of them
CN115160338B (zh) * 2022-04-27 2023-05-12 湘潭大学 基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的制备和应用
CN114957415B (zh) * 2022-05-09 2023-11-07 南京巨匠生物科技有限公司 链霉亲和素突变体及其应用和产品、基因、重组质粒和基因工程菌
CN116262760A (zh) * 2023-01-18 2023-06-16 杭州纽龙生物科技有限公司 一种生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020068367A1 (en) * 2000-10-11 2002-06-06 Coffen David L. Linker and method for solid phase combinatorial synthesis
JP2006275865A (ja) * 2005-03-30 2006-10-12 Citizen Watch Co Ltd Ｑｃｍセンサーを用いた定量方法
WO2009089262A1 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Stabilization of solid support assay reagents
WO2010095455A1 (ja) * 2009-02-20 2010-08-26 国立大学法人 東京大学 低免疫原性ストレプトアビジンおよびその利用
WO2012023580A1 (ja) * 2010-08-19 2012-02-23 分子動力学抗体創薬技術研究組合 抗体を結合した低免疫原性ストレプトアビジンの製造方法
WO2012023579A1 (ja) * 2010-08-19 2012-02-23 分子動力学抗体創薬技術研究組合 ストレプトアビジンの製造方法
WO2012058635A1 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Life Technologies Corporation Biotin derivatives
WO2014129446A1 (ja) * 2013-02-20 2014-08-28 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5608060A (en) 1992-06-09 1997-03-04 Neorx Corporation Biotinidase-resistant biotin-DOTA conjugates
JPH0696371A (ja) 1992-09-14 1994-04-08 Matsushita Electric Works Ltd 自火報システム
US6153442A (en) * 1998-05-20 2000-11-28 Dade Behring Inc. Reagents and methods for specific binding assays
US6451810B1 (en) 1999-06-10 2002-09-17 3M Innovative Properties Company Amide substituted imidazoquinolines
HUP0401953A3 (en) 2000-06-16 2005-06-28 Mitra Medical Technology Ab Biotin derivatives
DE10151158B4 (de) * 2001-10-19 2004-07-29 Esplora GmbH c/o TU Darmstadt Institut für Biochemie Verbindungen zur Markierung von Zellmembranproteinen
RU2537245C2 (ru) 2006-10-12 2014-12-27 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Диагностика и лечение злокачественной опухоли с использованием антитела против ereg
CN103184981A (zh) 2008-07-18 2013-07-03 艾伦·琼斯 一种组件区段模块的蜂窝式腔室存储系统
GB0919102D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Streptavidin mutant proteins
EP2335721A1 (en) 2009-12-21 2011-06-22 Institut Pasteur Streptavidin and Biotin-based antigen delivery system
CN103172713B (zh) 2013-03-05 2015-05-27 盘古基因科技（苏州）有限公司 一种链霉亲和素突变体及其制备方法
EP3109252B1 (en) 2014-02-18 2020-12-30 Savid Therapeutics Inc. Modified biotin, streptavidin mutant, and usage of them

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020068367A1 (en) * 2000-10-11 2002-06-06 Coffen David L. Linker and method for solid phase combinatorial synthesis
JP2006275865A (ja) * 2005-03-30 2006-10-12 Citizen Watch Co Ltd Ｑｃｍセンサーを用いた定量方法
WO2009089262A1 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Stabilization of solid support assay reagents
WO2010095455A1 (ja) * 2009-02-20 2010-08-26 国立大学法人 東京大学 低免疫原性ストレプトアビジンおよびその利用
WO2012023580A1 (ja) * 2010-08-19 2012-02-23 分子動力学抗体創薬技術研究組合 抗体を結合した低免疫原性ストレプトアビジンの製造方法
WO2012023579A1 (ja) * 2010-08-19 2012-02-23 分子動力学抗体創薬技術研究組合 ストレプトアビジンの製造方法
WO2012058635A1 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Life Technologies Corporation Biotin derivatives
WO2014129446A1 (ja) * 2013-02-20 2014-08-28 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAIRHEAD, M. ET AL.: "Plug-and-Play Pairing via Defined Divalent Streptavidins", J. MOL. BIOL., vol. 426, no. 1, 2014, pages 199 - 214, XP028806053 *
FAIRHEAD, M. ET AL.: "SpyAvidin Hubs Enable Precise and Ultrastable Orthogonal Nanoassembly", J. AM. CHEM. SOC., vol. 136, no. 35, 2014, pages 12355 - 12363, XP055200529 *
GREEN, N. M. ET AL.: "The Use of Bifunctional Biotinyl Compounds to Determine the Arrangement of Subunits in Avidin", BIOCHEM. J., vol. 125, no. 3, 1971, pages 781 - 791, XP002114517 *
See also references of EP3109252A4 *
WILBUR, D. S. ET AL.: "Design and Synthesis of Bis-Biotin-Containing Reagents for Applications Utilizing Monoclonal Antibody-Based Pretargeting Systems with Streptavidin Mutants", BIOCONJUGATE CHEM., vol. 21, no. 7, 2010, pages 1225 - 1238, XP055221504 *

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7045069B2 (ja) 2016-11-25 2022-03-31 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 クリアリングエージェント
US11866457B2 (en) 2016-11-25 2024-01-09 Savid Therapeutics Inc. Clearing agent
CN109983024A (zh) * 2016-11-25 2019-07-05 赛威德医疗公司 清除剂
JPWO2018097239A1 (ja) * 2016-11-25 2019-10-17 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 クリアリングエージェント
WO2018097239A1 (ja) 2016-11-25 2018-05-31 サヴィッド・セラピューティックス株式会社 クリアリングエージェント
CN110337445B (zh) * 2016-12-23 2023-05-23 印度血清研究所私人有限公司 用于提高哺乳动物细胞培养物中的抗体生产力并最小化下游、配制过程中的聚集的改进的方法，以及由其获得的稳定抗体制剂
CN110337445A (zh) * 2016-12-23 2019-10-15 印度血清研究所私人有限公司 用于提高哺乳动物细胞培养物中的抗体生产力并最小化下游、配制过程中的聚集的改进的方法，以及由其获得的稳定抗体制剂
US11442066B2 (en) 2017-02-17 2022-09-13 Mitsui Chemicals, Inc Method for identifying drug-discovery target protein for development of antibody drug, and method for producing antibody against target protein
WO2018151301A1 (ja) 2017-02-17 2018-08-23 三井化学株式会社 抗体医薬の開発に資する創薬標的タンパク質の同定方法及び標的タンパク質に対する抗体の製造方法
JP7174951B2 (ja) 2017-02-17 2022-11-18 三井化学株式会社 抗体医薬の開発に資する創薬標的タンパク質の同定方法及び標的タンパク質に対する抗体の製造方法
JPWO2018151301A1 (ja) * 2017-02-17 2019-12-12 三井化学株式会社 抗体医薬の開発に資する創薬標的タンパク質の同定方法及び標的タンパク質に対する抗体の製造方法
WO2019189867A1 (ja) 2018-03-30 2019-10-03 三井化学株式会社 ビスイミノビオチン化合物の薬物送達用の用途
JPWO2019189867A1 (ja) * 2018-03-30 2021-04-01 三井化学株式会社 ビスイミノビオチン化合物の薬物送達用の用途
JPWO2019230905A1 (ja) * 2018-05-30 2021-06-24 国立大学法人 東京大学 ハロゲン化したビオチン改変二量体およびその利用
WO2019230905A1 (ja) 2018-05-30 2019-12-05 国立大学法人 東京大学 ハロゲン化したビオチン改変二量体およびその利用
CN112566669B (zh) * 2018-08-08 2024-06-14 国立大学法人东京大学 生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物
WO2020032165A1 (ja) 2018-08-08 2020-02-13 国立大学法人 東京大学 ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート
JPWO2020032165A1 (ja) * 2018-08-08 2021-08-12 国立大学法人 東京大学 ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート
CN112566669A (zh) * 2018-08-08 2021-03-26 国立大学法人东京大学 生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物
JPWO2020138427A1 (ja) * 2018-12-28 2021-11-11 国立大学法人 東京大学 がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
WO2020138427A1 (ja) 2018-12-28 2020-07-02 国立大学法人 東京大学 がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
JP2021054739A (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 国立大学法人 東京大学 ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート
JP2021052669A (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 国立大学法人 東京大学 タンパク質認識物質とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
CN115605487A (zh) * 2020-04-14 2023-01-13 国立大学法人东京大学（Jp） 生物素变体二聚体及其用途
WO2021210573A1 (ja) 2020-04-14 2021-10-21 国立大学法人 東京大学 ビオチン改変二量体およびその利用
WO2021215534A1 (ja) 2020-04-24 2021-10-28 国立大学法人 東京大学 デュオカルマイシン誘導体及びその利用
WO2022203000A1 (ja) 2021-03-25 2022-09-29 国立大学法人 東京大学 抗原結合分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
US20220348681A1 (en) * 2021-04-22 2022-11-03 The University Of Tokyo Fused protein of an antibody which recognizes cancer-cells and a streptavidin mutant
US12115223B2 (en) 2021-04-22 2024-10-15 The University Of Tokyo Conjugate of biotin-modified dimer and phthalocyanine dye
WO2023085418A1 (ja) * 2021-11-15 2023-05-19 国立大学法人 東京大学 ウイルス阻害分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
CN114605432A (zh) * 2022-03-22 2022-06-10 湘潭大学 基于花菁染料的靶向性半胱氨酸荧光探针的制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US11286285B2 (en) 2022-03-29
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US20200017558A1 (en) 2020-01-16
JP6723913B2 (ja) 2020-07-15
EP3109252A1 (en) 2016-12-28
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CN108752439B (zh) 2022-08-02
US11161884B2 (en) 2021-11-02

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