WO2015122067A1

WO2015122067A1 - 柑橘類種子抽出物含有組成物、食品、医薬品、および柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法

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Publication number: WO2015122067A1
Application number: PCT/JP2014/080256
Authority: WO
Inventors: 太郎堀場
Original assignee: キッコーマン株式会社
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2015-08-20
Also published as: CN106132425A; JP6541582B2; EP3106171A4; US20200164018A1; CN106132425B; US11253567B2; JPWO2015122067A1; EP3106171B1; US20170165310A1; EP3106171A1

Abstract

　柑橘類（詳細には、柑橘類種子抽出物）の新たな機能を十分に発揮することができる柑橘類種子抽出物含有組成物、食品、医薬品、および柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法を提供する。柑橘類種子抽出物由来のオバクノンとノミリンとを含有し、前記ノミリンの含有量に対する前記オバクノンの含有量（＝前記オバクノンの含有量／前記ノミリンの含有量）が０．０２０以上であることを特徴とする柑橘類種子抽出物含有組成物により上記課題を解決する。

Description

柑橘類種子抽出物含有組成物、食品、医薬品、および柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法

　本発明は、柑橘類種子抽出物含有組成物、食品、医薬品、および柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法に係り、特に、新規な用途を有する柑橘類種子抽出物含有組成物、食品、医薬品、および柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法に関する。

　柑橘類（ムクロジ目ミカン科のミカン属、カラタチ属、キンカン属）の果実は、生食、ジュース、製菓材料、料理の風味付け等として世界各地で広く利用されている。また、柑橘類にはビタミンＣや食物繊維等が豊富に含まれていることから、柑橘類の果実は、健康の増進に寄与する食物であると認識されている。
　この柑橘類の中でも、特に、ユズ（学名：Ｃｉｔｒｕｓ　ｊｕｎｏｓ）については、最近の研究において、様々な優れた機能を有するとの報告がなされている。

　例えば、特許文献１には、ユズ抽出物が、ヒアルロン酸産生能を促進させる機能を有することが開示されている。さらに、特許文献２には、ユズの単細胞化処理物が、角質を剥離させる機能を有することが開示されている。
　つまり、特許文献１および特許文献２には、ユズ抽出物の用途（ヒアルロン酸産生能促進用、角質剥離用）が開示されている。

特開２００１－１５８７２８号公報特開２００４－１０４８０号公報

　しかしながら、ユズ等の柑橘類の抽出物には、特許文献１および特許文献２に開示されているような機能だけではなく、これらの機能の他に、今までに見出されていない新たな機能が存在する可能性がある。

　さらに、柑橘類の新たな機能を見出すだけでなく、新たな機能を強く発揮する有効成分を柑橘類（詳細には、柑橘類種子）内部から特定し、当該有効成分を増加させる方法を見出すことで、新たな機能を十分に発揮できる有用性の高い組成物を提供することが望まれる。

　そこで、本発明は、柑橘類（詳細には、柑橘類種子抽出物）の新たな機能を十分に発揮することができる柑橘類種子抽出物含有組成物、食品、医薬品、および柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法を提供することを課題とする。

　前記課題は、以下の手段により解決することができる。
（１）柑橘類種子抽出物由来のオバクノンとノミリンとを含有し、前記ノミリンの含有量に対する前記オバクノンの含有量（＝前記オバクノンの含有量／前記ノミリンの含有量）が０．０２０以上であることを特徴とする柑橘類種子抽出物含有組成物。
（２）前記ノミリンの含有量に対する前記オバクノンの含有量（＝前記オバクノンの含有量／前記ノミリンの含有量）が０．１００以上であることを特徴とする前記（１）に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
（３）前記ノミリンの含有量に対する前記オバクノンの含有量（＝前記オバクノンの含有量／前記ノミリンの含有量）が０．３００以上であることを特徴とする前記（１）または前記（２）に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
（４）前記柑橘類種子抽出物はユズ種子抽出物であることを特徴とする前記（１）ないし前記（３）のいずれか１つに記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
（５）血糖降下用であることを特徴とする前記（１）ないし前記（４）のいずれか１つに記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
（６）骨格筋増量用であることを特徴とする前記（１）ないし前記（５）のいずれか１つに記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
（７）体脂肪低減用であることを特徴とする前記（１）ないし前記（６）のいずれか１つに記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
（８）前記（１）ないし前記（７）のいずれか１つに記載の柑橘類種子抽出物含有組成物を含有することを特徴とする食品。
（９）前記（１）ないし前記（７）のいずれか１つに記載の柑橘類種子抽出物含有組成物を有効成分として含有することを特徴とする医薬品。
（１０）柑橘類種子を６０℃以上で加熱する加熱工程と、加熱後の前記柑橘類種子から柑橘類種子抽出物を抽出する抽出工程と、を含むことを特徴とする柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法。
（１１）前記加熱工程は、前記柑橘類種子を１００℃以上で加熱する工程であることを特徴とする前記（１０）に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法。
（１２）前記加熱工程は、前記柑橘類種子を５分以上加熱する工程であることを特徴とする前記（１０）または前記（１１）に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法。
（１３）前記柑橘類種子はユズ種子であることを特徴とする前記（１０）ないし前記（１２）のいずれか１つに記載の柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法。

　本発明に係る柑橘類種子抽出物含有組成物は、ノミリンの含有量に対するオバクノンの含有量を所定値以上に特定していることにより、オバクノンを多く含むこととなり、新たな機能（血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減）を十分に発揮することができる。

　本発明に係る食品および医薬品は、オバクノンを多く含んだ柑橘類種子抽出物含有組成物を含有することから、新たな機能（血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減）を十分に発揮することができる。

　本発明に係る柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法は、柑橘類種子を所定温度以上で加熱する加熱工程を含むことから、オバクノンを多く含むことで、新たな機能（血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減）を十分に発揮することができる柑橘類種子抽出物含有組成物を製造することができる。

ＫＫＡｙマウスの血糖値の推移を示す測定データである。ＫＫＡｙマウスのＨｂＡ１ｃの推移を示す測定データである。ＫＫＡｙマウスの血糖値の推移を示す測定データである。ＫＫＡｙマウスのＨｂＡ１ｃの推移を示す測定データである。実験飼育開始後２８日目におけるＫＫＡｙマウスの腓腹筋の重量割合を示す測定データである。実験飼育開始後２８日目におけるＫＫＡｙマウスの各脂肪の重量割合を示す測定データであって、（ａ）は、腎臓周囲脂肪の測定データであり、（ｂ）は、腸間膜脂肪の測定データであり、（ｃ）は、精巣上体周囲脂肪の測定データであり、（ｄ）は、皮下脂肪の測定データである。リモノイドアグリコン（デアセチルノミリン）のＬＣ－ＭＳ解析データである。リモノイドアグリコン（リモニン）のＬＣ－ＭＳ解析データである。リモノイドアグリコン（ノミリン）のＬＣ－ＭＳ解析データである。リモノイドアグリコン（オバクノン）のＬＣ－ＭＳ解析データである。実験飼育開始後２８日目におけるＫＫＡｙマウスの血糖値を示す測定データである。ＫＫＡｙマウスのＨｂＡ１ｃの推移を示す測定データである。加熱の温度がオバクノンの相対量およびオバクノンの含有量／ノミリンの含有量に与える影響を示すデータである。加熱の時間がオバクノンの相対量およびオバクノンの含有量／ノミリンの含有量に与える影響を示すデータである。レモン種子のＨＰＬＣ分析データである。グレープフルーツ種子のＨＰＬＣ分析データである。本実施形態に係る柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法の内容を説明するフローチャートである。

　以下、本発明に係る柑橘類種子抽出物含有組成物、食品、医薬品、および柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法を実施するための形態（実施形態）について説明する。

≪柑橘類種子抽出物含有組成物≫
　本実施形態に係る柑橘類種子抽出物含有組成物（以下、適宜「組成物」という）は、柑橘類種子抽出物由来のオバクノンとノミリンとを含有し、ノミリンの含有量に対するオバクノンの含有量が所定値以上であることを特徴とする。
　以下、本実施形態に係る組成物について、まず、柑橘類種子抽出物および用途について説明し、その後、組成物の構成を説明する。

［柑橘類種子抽出物］
　柑橘類種子とは、ムクロジ目ミカン科のミカン属、カラタチ属、キンカン属に属する植物の種子であり、柑橘類種子抽出物とは、これらの種子から抽出して得られる抽出物である。
　そして、柑橘類には、具体的には、ミカン科ミカン属のユズ（学名：Ｃｉｔｒｕｓ　ｊｕｎｏｓ）、ミカン科ミカン属のレモン（学名：Ｃｉｔｒｕｓ　ｌｉｍｏｎ）、ミカン科ミカン属のグレープフルーツ（学名：Ｃｉｔｒｕｓ　Ｘ　ｐａｒａｄｉｓｉ）等が該当する。
　なお、発明者は、柑橘類に属する複数の果実の様々な部位の組成等を確認したところ、柑橘類の中でも特に種子部分の抽出物に、血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減という機能を向上させるリモノイドアグリコンが多く含まれていることを確認した。
　よって、柑橘類種子抽出物のリモノイドアグリコンを用いることにより、少量の原料（ユズ種子、レモン種子、グレープフルーツ種子等）から多量のリモノイドアグリコンを得ることができるため、原料の使用量や原料コストを抑えることができるとともに、製造工程における抽出作業の負担の軽減や抽出時間の短縮にもつながる。

［用途］
　本実施形態に係る柑橘類種子抽出物含有組成物の新規な用途としては、次に示す用途が存在する。

（血糖降下用）
　血糖降下用とは、血糖値やＨｂＡ１ｃを降下させるという用途であり、詳細な用途としては、例えば、血糖降下剤、血糖降下用食品（健康食品）、血糖降下用医薬品である。
　なお、ＨｂＡ１ｃとは、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端のバリンにグルコースが安定的に結合したものを測定し、全体のヘモグロビン量に占める割合を算出して求められる値である。

（骨格筋増量用）
　骨格筋増量用とは、骨格筋の量を増やすという用途であり、詳細な用途としては、例えば、骨格筋増量剤、骨格筋増量用食品（健康食品）、骨格筋増量用医薬品である。
　ここで、骨格筋とは、筋肉の一分類であり、骨格を動かす筋肉を示す。そして、骨格筋としては、例えば、腓腹筋等がある。

（体脂肪低減用）
　体脂肪低減用とは、体脂肪の量を減らすという用途であり、詳細な用途としては、例えば、体脂肪低減剤、体脂肪低減用食品（健康食品）、体脂肪低減用医薬品である。
　そして、体脂肪（脂肪組織）としては、例えば、腎臓周囲脂肪、腸間膜脂肪、精巣上体周囲脂肪、皮下脂肪等がある。

［組成物の構成］
　本実施形態に係る組成物は、柑橘類種子抽出物由来のリモノイドアグリコン、リモノイドグリコシドを含んで構成される。
［リモノイドアグリコン］
　リモノイドアグリコンは、柑橘類種子抽出物由来のもの（柑橘類種子抽出物に含まれているもの）であり、血糖を低下させたり、骨格筋を増量させたり、体脂肪を低減させたりするという効果を発揮する化合物群である。

　そして、リモノイドアグリコンのリモノイドとは、柑橘類の植物に多く含まれる天然の化学物質（フィトケミカル）のことであり、化学構造的にはフラノラクトン骨格を有する化学物質である。また、リモノイドアグリコンのアグリコンとは、グリコシド（配糖体）から糖部分が外れた非糖状態を示すものである。

　そして、リモノイドアグリコンは、以下に示すリモニン、ノミリン、デアセチルノミリン、およびオバクノンを含んで構成される。

（リモニン）
　リモニン（Ｃ_２６Ｈ_３０Ｏ_８）とは、以下の構造式により表される。

（ノミリン）
　ノミリン（Ｃ_２８Ｈ_３４Ｏ_９）とは、以下の構造式により表される。

（デアセチルノミリン）
　デアセチルノミリン（Ｃ_２６Ｈ_３２Ｏ_８）とは、以下の構造式により表される。

（オバクノン）
　オバクノン（Ｃ_２６Ｈ_３０Ｏ_７）とは、以下の構造式により表される。

［オバクノンの含有割合］
　本実施形態に係る組成物は、ノミリンの含有量に対するオバクノンの含有量（＝オバクノンの含有量／ノミリンの含有量：以下、適宜「オバクノンの含有割合」という）が０．０２０以上である。
　前記したリモノイドアグリコンの中でも、特に、オバクノンは、極少量で血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減の機能を発揮することができる。よって、本実施形態に係る組成物は、オバクノンの含有割合が０．０２０以上であれば、前記した各機能を十分に発揮することができる。そして、前記した各機能をより確実に発揮させるためには、オバクノンの含有割合は０．１００以上であるのが好ましく、０．３００以上であるのが特に好ましい。
　なお、オバクノンの含有割合の上限については、特に限定されないが、後記する本実施形態の組成物の製造方法によると、５.０００以下となる。
　また、柑橘類種子抽出物含有組成物の固形分中にオバクノンが好ましくは０．００１～１０質量％、さらに好ましくは０．００５～５質量％含有することが望ましい。

　そして、本実施形態に係る組成物のオバクノンの含有割合や含有量については、後記する加熱工程の処理により制御することができる。

［リモノイドグリコシド］
　リモノイドグリコシドは、柑橘類種子抽出物由来のもの（柑橘類種子抽出物に含まれているもの）であり、前記したリモノイドアグリコンに糖が結合（グリコシド結合）した化合物群である。

［その他の含有物］
　本実施形態に係る組成物は、前記したリモノイドアグリコンおよびリモノイドグリコシド以外にも、抽出残渣である糖類などを含んでいてもよい。
　また、本実施形態に係る組成物は、食品や医薬品等の素材（材料、剤）として好適に用いる形態とするため、例えば、粉末状、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、カプセル型、または、液体状とすることができる。
　そして、本実施形態に係る組成物は、柑橘類抽出物を含有する組成物であればよいので、当然、柑橘類抽出物のみで構成されていてもよい。

　本実施形態に係る組成物の投与量は、対象の用途、対象者の年齢、体重等に応じて適宜設定することができるが、通常成人一日当たりオバクノンを乾燥物換算で０．１～２，０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２～３００ｍｇ／ｋｇ体重程度投与することができる。なお、投与は単回投与でも数回に分けた投与でもよい。

　次に、前記した本実施形態に係る柑橘類種子抽出物含有組成物を含有する食品について説明する。
≪食品≫
　本実施形態に係る食品とは、前記した組成物を含有する食品であり、血糖降下用、骨格筋増量用、体脂肪低減用の健康食品として利用することができる。
　そして、本実施形態に係る食品とは、例えば、菓子、パン、牛乳、各種飲料、うどん、そば、パスタ、米飯、調味料、香辛料、惣菜、油脂含有食品、酒類、清涼飲料が挙げられる。なお、本実施形態に係る食品は、前記した食品の種類に応じて、当業者に公知の各種成分を配合して構成すればよい。

　次に、前記した本実施形態に係る柑橘類種子抽出物含有組成物を有効成分として含有する医薬品について説明する。
≪医薬品≫
　本実施形態に係る医薬品とは、前記した組成物を有効成分として含有する医薬品であり、血糖降下用、骨格筋増量用、体脂肪低減用の医薬品として利用することができる。
　そして、本実施形態に係る医薬品とは、薬剤としての操作性、あるいは生体に投与された際の吸収性等を向上させるため、前記した組成物を、常法に従い適当な賦形剤等の医薬品用担体と組合せて製剤化することが好ましい。
　また、本実施形態に係る医薬品は、種々の剤型での投与が可能であり、例えば、経口投与剤としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、ドライシロップ剤が挙げられる。また、非経口投与剤としては、軟膏、経皮吸収性テープ等の経皮吸収剤、注射剤、坐薬、膣坐薬、噴霧剤等の経鼻投与剤が挙げられる。

　次に、前記した本実施形態に係る柑橘類種子抽出物含有組成物、食品および医薬品の製造方法について説明する。
≪柑橘類種子抽出物含有組成物等の製造方法≫
　本実施形態に係る組成物の製造方法は、図１７に示すように、加熱工程Ｓ１と、抽出工程Ｓ２と、を含むことを特徴とする。そして、本実施形態に係る組成物の製造方法は、後記する粉砕工程を含んでもよい。

（加熱工程）
　加熱工程Ｓ１とは、柑橘類種子を加熱する工程である。
　そして、加熱工程Ｓ１における加熱の温度は、６０℃以上であり、１００℃以上が好ましい。このように柑橘類種子に対して所定温度以上の加熱を行うことにより、柑橘類種子内にオバクノンを発現させ、オバクノンの含有量を増加させることができる。その結果、この柑橘類種子から抽出した抽出物含有組成物は、血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減の機能を十分に発揮することができる。
　加熱工程Ｓ１における加熱の温度の上限については、特に限定されないが、１５０℃を超えると、オバクノンを含めたリモノイドアグリコンが減少する虞があるという観点から、１５０℃以下が好ましく、１４０℃以下が特に好ましい。

　ここで、加熱工程Ｓ１とは、前記のとおり、柑橘類種子を加熱する工程であれば特に限定されないが、加熱することにより柑橘類種子を乾燥する役割をも果たす工程、つまり、乾燥工程であってもよく、加湿することなく柑橘類種子を乾燥する乾熱乾燥工程であってもよい。
　そして、加熱工程Ｓ１において、前記した所定温度で柑橘類種子を加熱することにより、柑橘類種子が乾燥する場合は、加熱後の柑橘類種子のコンディション（状態）を略一定に保つことができる。その結果、後記の抽出工程Ｓ２における抽出条件の設定が容易となるとともに、最終的に得られる組成物の品質を安定させることができる。

　なお、前記した加熱の温度とは、詳細には、加熱工程Ｓ１における加熱環境内（雰囲気内）を測定した温度である。ただし、加熱工程Ｓ１では、加熱対象である柑橘類種子の温度も、加熱環境の温度と略同じ温度となっている。

　加熱工程Ｓ１における加熱の時間は、５分以上、好ましくは１０分以上、さらに好ましくは３０分以上であれば、柑橘類種子内のオバクノンの含有量の増加という効果を十分に得ることができる。なお、加熱の時間が１４４０分を超えてもオバクノンの含有量はほとんど増加しないとともに、オバクノン以外のリモノイドアグリコンが減少する虞があるという観点から、１４４０分以内が好ましく、７２０分以内がさらに好ましく、３６０分以内が特に好ましい。

　なお、加熱工程Ｓ１における処理の方法は、前記した所定温度以上の温度環境（乾燥炉等）に柑橘類種子を静置するという方法、柑橘類種子に温風を吹き付けるという方法等、公知の方法で行えばよい。

（粉砕工程）
　粉砕工程とは、柑橘類種子を粉砕する工程である。この粉砕工程での粉砕方法は特に限定されず、粉砕処理機等を用いて公知の方法で行えばよい。
　そして、この粉砕工程は、前記した加熱工程Ｓ１の後であって、後記の抽出工程Ｓ２の前に行うが、加熱工程Ｓ１の前に行ってもよい。

（抽出工程）
　抽出工程Ｓ２とは、柑橘類種子より抽出物を抽出する工程である。
　そして、抽出工程Ｓ２での抽出処理は、前記した加熱工程Ｓ１後（または、粉砕工程後）の柑橘類種子を、極性溶媒を用いて抽出する処理である。

　抽出工程Ｓ２での極性溶媒を用いた抽出の温度は、０℃～極性溶媒の沸点程度であり、通常は常温で行う。例えば、極性溶媒としてエタノールを使用する場合、抽出効率の観点から、０℃以上７０℃未満が好ましく、５℃以上６０℃以下がより好ましい。例えば、極性溶媒として水を使用する場合、抽出効率の観点から、０℃以上１００℃以下が好ましく、２５℃以上１００℃以下がより好ましい。

　抽出工程Ｓ２での抽出時間は、１分～２４時間が好ましいが、これより長時間抽出を行ってもよい。そして、抽出は、静置、攪拌のいずれの手法を用いてもよい。
　抽出工程Ｓ２での抽出処理としては、例えば、前記した加熱工程Ｓ１後（または、粉砕工程後）の柑橘類種子に１～５０倍量、好ましくは５～２０倍量程度の極性溶媒を加え抽出することにより柑橘類抽出物を得ることができる。そして、適宜、定法に従い希釈、濃縮、乾燥、精製等を行うことで柑橘類種子抽出物含有組成物を得ることができる。

　抽出工程Ｓ２で用いる極性溶媒としては、食品添加物の抽出溶剤となり得る極性溶媒であれば特に限定されず、例えば、アセトン、エタノール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸エチル、酢酸メチル、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２－テトラフルオロエタン、１，１，２－トリクロロエテン、１－ブタノール、２－ブタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、プロピレングリコール、ヘキサン、水、メタノール等から選択される１または複数の有機溶媒を用いることができる。
　これらのうち好ましくは、エタノール（１０体積％以上１００体積％以下）、メタノール（１０体積％以上９９．５体積％未満）、１－ブタノール（３０体積％以上９９．５体積％未満）、ヘキサン（５体積％７０体積％未満）および水から選択される有機溶媒を用いることができ、より好ましくは、エタノールまたは水を用いることができ、最も好ましくはエタノールを用いることができる。
　例えば、極性溶媒として、１０体積％以上１００体積％以下のエタノール溶媒を用いることができ、好ましくは５０体積％以上１００体積％以下のエタノール溶媒を用いることができ、より好ましくは７０体積％程度のエタノール溶媒用いることができる。なお、７０体積％のエタノール溶媒とは、水とエタノールの体積比３：７の混合物を指す。

　そして、本実施形態に係る柑橘類種子抽出物含有組成物は、前記のとおり、柑橘類種子の有機溶媒抽出物であることが好ましく、柑橘類種子のアルコール抽出物であることがより好ましく、柑橘類種子のエタノール抽出物であることが特に好ましい。

　なお、本実施形態に係る食品および医薬品の製造方法については、前記の方法によって製造した柑橘類種子抽出物含有組成物を、食品や医薬品の材料に混合させ、その後は、当業者に公知の食品や医薬品の製造方法によって製造すればよい。

　次に、本発明の要件を満たす実施例とそうでない比較例とを例示して、本発明に係る柑橘類種子抽出物含有組成物、食品および医薬品について説明する。

　詳細には、まず、実験１～３に基づき、ユズ種子抽出物およびリモノイドアグリコンが、血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減の機能を発揮する点について説明する。
　次に、実験４に基づき、リモノイドアグリコンを構成する化合物を特定する。
　その次に、実験５に基づき、リモノイドアグリコンの中でも特にオバクノンが、血糖降下の機能を十分に発揮する点について説明する。
　さらに、実験６に基づき、ユズ種子に施す乾熱乾燥の温度および時間がオバクノンの相対量および含有割合に与える影響について説明する。
　最後に、実験７に基づき、ユズ種子以外の柑橘類種子を用いた場合において、乾熱乾燥がオバクノンの発現に与える影響について説明する。

［実験１：ＫＫＡｙマウスを用いた動物実験（血糖値およびＨｂＡ１ｃ）］
（実験飼育の条件）
　糖尿病発症モデルマウスとして３週齢のＫＫＡｙマウスを日本クレアより購入し、７日間の予備飼育後に実験飼育を行った。なお、マウスの飼育条件は、温度２３±１℃、湿度５５±１０％、午前７時～午後７時の間点灯（その他は消灯）、水と飼料は自由摂取させた。

（実験飼料の組成）
　実験飼料は、ＡＩＮ－９３Ｇを用い、これにユズ種子抽出物を１質量％または３質量％となるように、あるいはピオグリタゾンを０．０３質量％となるように混餌して投与した。
　なお、実験１において使用したユズ種子抽出物は、ユズ種子を１００℃、７２０ｍｉｎで乾熱乾燥した後、粒径（直径）がほぼ１ｍｍ以下となるように粉砕し、粉砕したユズ種子に対して１０倍量の１００％エタノールを用いて常温で１０分間抽出を行って得たものである。

（実験結果の測定方法）
　コントロール群（何も混餌していないＡＩＮ－９３Ｇを投与した群）、ユズ種子抽出物１質量％添加群、ユズ種子抽出物３質量％添加群、ピオグリタゾン０．０３質量％添加群は、各群１０匹で７日間の予備飼育後、２８日間実験飼料で飼育した。
　実験飼育開始後、所定日数経過した日の午前９～１１時の間に尾静脈より採血し、血糖値検査装置（ＨＯＲＩＢＡ社製、アントセンスIIIおよびバイエル社製、ＤＣＡ２０００）を用いて血糖値およびＨｂＡ１ｃを計測した。そして、計測した血糖値およびＨｂＡ１ｃについて、各群の平均値を算出した。
　なお、実験において計測および算出したＨｂＡ１ｃは、全てＪＤＳ値である。

　図１は、実験飼料を与えたＫＫＡｙマウスの血糖値の推移を示し、図２は、実験飼料を与えたＫＫＡｙマウスのＨｂＡ１ｃの推移を示す。なお、図１の縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）であり、図２の縦軸はＨｂＡ１ｃ（％）であり、横軸はいずれも実験飼育開始後の経過日数（日）である。
　なお、図中の「ｐ＜数値ｖｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ値が表記した数値より小さいという意味である。

（実験結果の検討）
　図１の結果が示すように、コントロール群は、日数が経過するにしたがい血糖値が上昇しているのに対し、ユズ種子抽出物添加群は、血糖値の上昇を抑制し、血糖値を低下させていることがわかる。そして、ユズ種子抽出物１質量％添加群の結果から、血糖値低下の効果を十分に確認することができ、特に、ユズ種子抽出物３質量％添加群の結果は、０日目よりも１４、２７日目の血糖値の方が低くなるとともに、ピオグリタゾンを投与した群と比較しても、同等以上の血糖値低下の効果を確認することができた。

　図２の結果が示すように、ユズ種子抽出物添加群は、ＨｂＡ１ｃを低下させていることがわかった。そして、ユズ種子抽出物１および３質量％添加群の結果から、ＨｂＡ１ｃ低下の効果を十分に確認することができた。

　以上より、本発明に係る柑橘類種子（ユズ種子）抽出物含有組成物は、通常時の血糖値を低下させるという効果だけでなく、慢性の高血糖状態における血糖値をも低下させる効果があることを確認できた。

［実験２：ＫＫＡｙマウスを用いた動物実験（血糖値およびＨｂＡ１ｃ）］
　実験飼育の条件、実験結果の測定方法については、前記実験１と同様の条件（ただし各群８匹または９匹）および方法を用いた。

（実験飼料の組成）
　実験飼料についても、前記実験１と基本同様のものを用いているが、実験飼料にユズ種子抽出物（飼料中３質量％）を含有させた飼料以外にも、リモノイドアグリコン、リモノイドグリコシド（ともにユズ種子抽出物群の摂取量と等量になるように調製）を含有させた飼料を使用した。
　なお、リモノイドアグリコンおよびリモノイドグリコシドは、実験１と同様の方法で準備したユズ種子抽出物から分画して得られたものを使用した。

　図３は、実験飼料を与えたＫＫＡｙマウスの血糖値の推移を示し、図４は、実験飼料を与えたＫＫＡｙマウスのＨｂＡ１ｃの推移を示す。なお、図３の縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）であり、図４の縦軸はＨｂＡ１ｃ（％）であり、横軸はいずれも実験飼育開始後の経過日数（日）である。

（実験結果の検討）
　図３の結果が示すように、リモノイドグリコシド添加群は、７日目ではコントロール群と比較し血糖値の上昇をある程度抑制できているが、日数が経過するにしたがいコントロール群が示す血糖値と略同じ値を示す結果となった。
　一方、リモノイドアグリコン添加群は、７日目以降、コントロール群と比較し、大幅に血糖値を低下させるという結果となった。また、リモノイドアグリコン添加群は、ユズ種子抽出物添加群（図３中のｔｏｔａｌ）が示す血糖値と略同じ値を示す結果となった。

　図４の結果が示すように、リモノイドアグリコン添加群は、２８日目において、コントロール群およびリモノイドグリコシド添加群と比較し、大幅にＨｂＡ１ｃの上昇を抑制し、ＨｂＡ１ｃを低下させていることがわかった。また、リモノイドアグリコン添加群は、ユズ種子抽出物添加群（図中のｔｏｔａｌ）が示すＨｂＡ１ｃと略同じ値を示す結果となった。

　以上より、本発明に係る柑橘類種子（ユズ種子）抽出物含有組成物の中でも、主にリモノイドアグリコンが、血中の血糖値を低下させるという効果、および、慢性の高血糖状態における血糖値を低下させる効果を発揮することが確認できた。

［実験３：ＫＫＡｙマウスを用いた動物実験（骨格筋増量および体脂肪低減）］
　実験飼育の条件については、前記実験１と同様の条件（ただし各群８匹または９匹）で行い、実験飼料については、前記実験２と同様の飼料を用いた。

（実験結果の測定方法）
　コントロール群、リモノイドグリコシド添加群、リモノイドアグリコン添加群、ユズ種子抽出物添加群は、各群８匹または９匹で７日間の予備飼育後、２８日間実験飼料で飼育した。

　骨格筋の筋肉量の変動を確認するため、実験飼育開始後２８日目のマウスについて、マウス体重に対する「腓腹筋」の重量割合（＝腓腹筋重量（ｇ）／マウス体重（ｇ））を計測した。
　また、脂肪の量の変動を測定するため、実験飼育開始後２８日目のマウスについて、マウス体重に対する「腎臓周囲脂肪」、「腸間膜脂肪」、「精巣上体周囲脂肪」、「皮下脂肪」の重量割合（＝各脂肪重量（ｇ）／マウス体重（ｇ））を計測した。
　そして、計測した筋肉および脂肪の重量割合について、各群の平均値を算出した。
　なお、前記筋肉および脂肪の重量の測定は、各組織を摘出し、生理食塩水で洗浄後、脱脂綿で水分を除去して行った。

　図５は、実験飼育開始後２８日目のＫＫＡｙマウスの腓腹筋の重量割合を示す。また、図６の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、それぞれ、実験飼育開始後２８日目のＫＫＡｙマウスの腎臓周囲脂肪、腸間膜脂肪、精巣上体周囲脂肪、皮下脂肪の重量割合を示す。

（実験結果の検討）
　図５の結果が示すように、リモノイドアグリコン添加群は腓腹筋の重量割合を上昇させるという結果となった。

　図６の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の結果が示すように、リモノイドアグリコン添加群は、腎臓周囲脂肪、腸間膜脂肪、精巣上体周囲脂肪、皮下脂肪の重量割合のいずれの重量割合も低下するという結果となった。

　以上より、本発明に係る柑橘類種子（ユズ種子）抽出物含有組成物の中でも、主にリモノイドアグリコンが、骨格筋を増量させるという効果、および、体脂肪を低減させるという効果を発揮することが確認できた。

［実験４：柑橘類種子抽出物に含まれるリモノイドアグリコン］
　実験３で得られたリモノイドアグリコンをシリカゲルカラム（ｄａｉｓｏｇｅｌ　１００２Ａ　ＩＲ６０－４０／６３Ａ）を用いて分画し、４種のリモノイドアグリコンを得た。これらのサンプルを定法に基づきＬＣ－ＭＳ解析に供した結果を図７～１０に示す。

（実験結果の検討）
　図７から、このサンプルのｍ／ｚは４７３．２１６２であり、このリモノイドアグリコンがデアセチルノミリン（［Ｍ＋Ｈ］^＋は４７３．２１７５）であることがわかる。また、図８から、このサンプルのｍ／ｚは４７１．２００６であり、このリモノイドアグリコンがリモニン（［Ｍ＋Ｈ］^＋は４７１．２０１９）であることがわかる。また、図９より、このサンプルのｍ／ｚは５１５．２２８３であり、このリモノイドアグリコンがノミリン（［Ｍ＋Ｈ］^＋は５１５．２２８１）であることがわかる。また、図１０より、このサンプルのｍ／ｚは４５５．２０５５であり、このリモノイドアグリコンがオバクノン（［Ｍ＋Ｈ］^＋は４５５．２０７０）であることがわかる。

　以上より、本発明に係る柑橘類種子（ユズ種子）抽出物含有組成物のリモノイドアグリコンには、デアセチルノミリン、リモニン、ノミリン、オバクノンが含まれていることが確認できた。

［実験５：ＫＫＡｙマウスを用いた動物実験（血糖値およびＨｂＡ１ｃ）］
　実験飼育の条件および実験結果の測定方法については、前記実験１と同様の条件（ただし各群８匹とし、水と飼料は自由摂取ではなくペアフィード）および測定方法で行った。

（実験飼料の組成）
　実験飼料は、ＡＩＮ－９３Ｇを用い、これにオバクノンを０．０３５質量％となるように含有させたものを使用した。
　なお、実験５において使用したオバクノンは、ユズ種子を１００℃、７２０ｍｉｎで乾熱乾燥した後、粒径（直径）がほぼ１ｍｍ以下となるように粉砕し、粉砕したユズ種子に対して１０倍量の１００％エタノールを用いて常温で１０分間抽出を行い、得られた抽出物からシリカゲルカラム（ｄａｉｓｏｇｅｌ　１００２Ａ　ＩＲ６０－４０／６３Ａ）を用いて分画したものである。

　図１１は、実験飼料を与えたＫＫＡｙマウスの血糖値（実験開始から２８日目）を示し、図１２は、実験飼料を与えたＫＫＡｙマウスのＨｂＡ１ｃの推移を示す。なお、図１１の縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）であり、図１２の縦軸はＨｂＡ１ｃ（％）であり、図１２の横軸は実験飼育開始後の経過日数（日）である。

（実験結果の検討）
　図１１の結果が示すように、オバクノン添加群は、コントロール群と比較して、血糖値が５０ｍｇ／ｄｌ程度低くなっていることがわかった。また、図１２の結果が示すように、オバクノン添加群は、ＨｂＡ１ｃが低下していることがわかった。
　そして、オバクノン添加群の実験飼料は、オバクノンを０．０３５質量％という極微量しか混餌していないにもかかわらず、図１１、１２に示すような効果を得られたことから、オバクノンは極微量であっても、血糖値およびＨｂＡ１ｃの低下に大きく寄与することが確認できた。

　以上より、本発明に係る柑橘類種子（ユズ種子）抽出物含有組成物は、オバクノンを含有することにより、血糖値およびＨｂＡ１ｃの低下という効果を確実に発揮できるということが確認できた。

［実験６：乾熱乾燥によるオバクノンの発現と、その温度、時間による発現量の変動］
（実験サンプルの調整）
　柑橘類種子として、「ユズ種子」を用意した。そして、ユズ種子に対して、乾熱乾燥を施した。その後、ユズ種子を粒径（直径）がほぼ１ｍｍ以下となるように粉砕し、粉砕したユズ種子に対して１０倍量の１００％エタノールを用いて常温で１０分間抽出を行い、各サンプルを得た。
　なお、実験６での「乾熱乾燥」は、所定温度にした乾燥炉内にユズ種子を所定時間静置するというものであった。

（実験サンプルの測定方法）
　前記した調整方法により得られたサンプル、ノミリン標準品、およびオバクノン標準品（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ社製）を、定法に基づきＨＰＬＣ分析に供し、ノミリン、オバクノン量を定量した。その測定値に基づき「オバクノンの相対量」および「オバクノンの含有量／ノミリンの含有量」を算出した。ＨＰＬＣ分析は、Ｗａｔｅｒｓ社Ｄｅｔｅｃｔｏｒ２９９６－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ６００－ａｕｔｏ　ｓａｍｐｌｅｒ７１７ｐｌｕｓシステムおよび資生堂社カラムＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０（１５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）を用い、水－アセトニトリルのグラジエント（０ｍｉｎ　８５：１５→５ｍｉｎ　７７：２３→２５ｍｉｎ　７４：２６→３０ｍｉｎ　６０：４０→４５ｍｉｎ　５４：４６、以降６５ｍｉｎまで）にて溶出を行った。流速は１ｍｌ／ｍｉｎで、検出波長は２１０ｎｍとした。
　なお、「オバクノンの相対量」とは、図１３および表１に示したサンプル（乾熱乾燥の時間を２４時間に固定）については、乾熱乾燥の温度が１００℃の場合の値を１．００００と規定した場合の相対量であり、図１４および表２に示したサンプル（乾燥時間の温度を１５０℃に固定）については、乾熱乾燥の時間が３０ｍｉｎの場合の値を１．００００と規定した場合の相対量である。
　そして、「オバクノンの含有量／ノミリンの含有量」とは、ノミリン標準品とサンプルが示すノミリンの値を比較して算出したサンプル内の「ノミリンの含有量」と、オバクノン標準品とサンプルが示すオバクノンの値を比較して算出したサンプル内の「オバクノンの含有量」とを用いて求めた値である。

　なお、図１３および表１は、乾熱乾燥の時間を２４時間に固定して、乾熱乾燥の温度を変化させた場合の「オバクノンの相対量」および「オバクノンの含有量／ノミリンの含有量」を示す。また、図１４および表２は、乾熱乾燥の温度を１５０℃に固定して、乾熱乾燥の時間を変化させた場合の「オバクノンの相対量」および「オバクノンの含有量／ノミリンの含有量」を示す。
　なお、図または表中の「オバクノン」は「オバクノンの相対量」を示し、「オバクノン／ノミリン」は「オバクノンの含有量／ノミリンの含有量」を示す。

（実験結果の検討）
　図１３および表１の結果が示すように、乾熱乾燥（加熱）の温度が６０℃以上の場合に、オバクノンが発現することがわかった。また、乾熱乾燥（加熱）の温度が６０℃以上の場合に、「オバクノンの含有量／ノミリンの含有量」の値が０．０２０以上となった。
　図１４および表２の結果が示すように、乾熱乾燥（加熱）の時間が５分以上の場合に、オバクノンが発現することがわかった。また、乾熱乾燥（加熱）の時間が１０分以上の場合に、「オバクノンの含有量／ノミリンの含有量」の値が０．０２０以上となった。なお、乾熱乾燥（加熱）が１４４０分の場合に、抽出サンプル中のノミリン含有量、オバクノン含有量はそれぞれ１３３．７μｇ／ｍｌ、２０７．１μｇ／ｍｌであり、乾熱乾燥（加熱）が４３２０分の場合には、抽出サンプル中のノミリン含有量、オバクノン含有量はそれぞれ６７．５μｇ／ｍｌ、１９４．８μｇ／ｍｌであった。

　以上より、本発明に係る柑橘類種子（ユズ種子）抽出物含有組成物の製造方法は、柑橘類種子を６０℃以上で加熱する加熱工程を含むことにより、「オバクノンの含有量／ノミリンの含有量」の値が０．０２０以上となる組成物、つまり、血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減という効果を確実に発揮できる組成物を製造できるということが確認できた。

［実験７：ユズ種子以外の柑橘種子における乾熱乾燥によるオバクノンの発現］
（実験サンプルの調整）
　柑橘類種子として、「レモン種子」、「グレープフルーツ種子」を用意した。そして、各種子に対して、凍結乾燥または乾熱乾燥（１００℃、２４時間）を施した。その後、各種子を粒径（直径）がほぼ１ｍｍ以下となるように粉砕し、粉砕したユズ種子に対して１０倍量の１００％エタノールを用いて常温で１０分間抽出を行い、各サンプルを得た。
　なお、実験７での「凍結乾燥」の方法は、共和真空技術製の凍結乾燥器ＲＬＥ－１０３を用い、－３０℃で凍結したサンプルを９６時間乾燥させるというものであった。また、実験７での「乾熱乾燥」は、雰囲気温度を１００℃にした乾燥炉内に各種子を２４時間静置するというものであった。

（実験サンプルの測定方法）
　前記した調整方法により得られたサンプルおよびオバクノン標準品（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ社製）を、実験６と同様の条件にてＨＰＬＣ分析に供した結果を図１５、１６に示す。

　なお、図１５の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、凍結乾燥したレモン種子サンプルの測定結果、乾熱乾燥したレモン種子サンプルの測定結果、オバクノン標準品の測定結果を示す。また、図１６の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、凍結乾燥したグレープフルーツ種子サンプルの測定結果、乾熱乾燥したグレープフルーツ種子サンプルの測定結果、オバクノン標準品の測定結果を示す。

（実験結果の検討）
　図１５の（ａ）、図１６の（ａ）のいずれの測定結果にも、オバクノン標準品が示す時間においてピークが確認できなかった、つまり、オバクノンはほとんど含有していないという結果が得られた。一方、図１５の（ｂ）、図１６の（ｂ）のいずれの測定結果にも、オバクノン標準品が示す時間において大きなピークが確認できた、つまり、オバクノンが含まれているという結果が得られた。
　言い換えると、柑橘類種子を凍結乾燥した場合にほとんど含まれていなかったオバクノンが、柑橘類種子を乾熱乾燥（加熱）することによって発現することがわかった。

　以上より、本発明に係る柑橘類種子（レモン種子、グレープフルーツ種子）抽出物含有組成物の製造方法は、柑橘類種子を加熱する加熱工程を含むことにより、オバクノンを含有し、血糖降下、骨格筋増量、体脂肪低減という効果を確実に発揮できる組成物を製造できるということが確認できた。

　本発明に係る柑橘類種子抽出物含有組成物、食品、医薬品、および柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法について、実施の形態および実施例を示して詳細に説明したが、本発明の趣旨は前記した内容に限定されることなく、特許請求の範囲の記載に基づいて改変・変更等することができることはいうまでもない。

　Ｓ１　　加熱工程
　Ｓ２　　抽出工程

Claims

　柑橘類種子抽出物由来のオバクノンとノミリンとを含有し、
　前記ノミリンの含有量に対する前記オバクノンの含有量（＝前記オバクノンの含有量／前記ノミリンの含有量）が０．０２０以上であることを特徴とする柑橘類種子抽出物含有組成物。
　前記ノミリンの含有量に対する前記オバクノンの含有量（＝前記オバクノンの含有量／前記ノミリンの含有量）が０．１００以上であることを特徴とする請求項１に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
　前記ノミリンの含有量に対する前記オバクノンの含有量（＝前記オバクノンの含有量／前記ノミリンの含有量）が０．３００以上であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
　前記柑橘類種子抽出物はユズ種子抽出物であることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
　血糖降下用であることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
　骨格筋増量用であることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
　体脂肪低減用であることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物。
　請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物を含有することを特徴とする食品。
　請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物を有効成分として含有することを特徴とする医薬品。
　柑橘類種子を６０℃以上で加熱する加熱工程と、
　加熱後の前記柑橘類種子から柑橘類種子抽出物を抽出する抽出工程と、
　を含むことを特徴とする柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法。
　前記加熱工程は、前記柑橘類種子を１００℃以上で加熱する工程であることを特徴とする請求項１０に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法。
　前記加熱工程は、前記柑橘類種子を５分以上加熱する工程であることを特徴とする請求項１０または請求項１１に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法。
　前記柑橘類種子はユズ種子であることを特徴とする請求項１０ないし請求項１２のいずれか１項に記載の柑橘類種子抽出物含有組成物の製造方法。