JP2006512330A - 竹からの抽出のトリテルペノイドサポゲニン化合物の製法と用途 - Google Patents
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Abstract
Description
Bamboo grass、つまりSasa albomarginta Makino & Shibataなどの品種]における系統的な研究開発が行われ、更に一連の国内特許を出願した。1990年代以降も剛竹属の品種に関わる若干の研究があった。例えばSakai、Wataru が1980年に出願した特許 [Healthful feed containing bamboo extract, JP Patent57074049]は溶剤の利用により剛竹属竹の柔らかい茎から抽出を行い、また抽出物を家禽、家畜、魚貝類、ペット(pet)及び実験動物などの飼料中に添加するというものであり、同年に出願した別の特許 [Healthful food containing bamboo extract, JP Patent 57039753] は以下のようなものである。剛竹属竹の柔らかい茎を粉砕した後に、メタノール、エタノール、クロロフォルム、ベンゼン或はお湯で室温の下で約2週間抽出を行い、又は容器中に入れて水蒸気により180℃まで加熱、蒸留した後の冷却により精油と水の混合物を取得し、減圧濃縮後の産物を多種類の食品に添加することができる。これ以外に、痔疾に対し治療作用のある竹抽出物の特許出願もある。これは主に乾留や水蒸気蒸留により抽出物を取得した後、シリカゲルカラム利用により分離した痔疾治療、降血圧及びリラックス作用のある不同活性部位(Different active sites)を取得し、そのうち、痔疾治療部位は経口投与または外部適用の別なくすべて独特な効果[Production of bamboo extract having effect for hemorrhoids、 JP Patent 57038721]を有する。Kuboyama, N.らは(1981)竹葉の抽出物およびそのリグニンの抗腫瘍活性を報告している[Anti tumor activity of bamboo leaf extracts, JPN J PHARMACOL, 1979, 29(SUPPL.):170; Anti tumor activities of bamboo leaf extracts and its lignin, FOLIA PHARMACOL JPN, 1981, 77(6):579-596]。Sato, Tらは(1986)一種の竹葉抽出物の溶液が歯肉の治療に用いうることを報告している[The use in periodontal therapy
of a bamboo leaf extract solution, Nippon Shishubyo Gakkai Kaishi,1986, 28(2):752-757]。Kenji, Matsui.らが1990年に出願した特許では、一種或は多種の有機溶剤を使って、斑竹(ハンチク)、モウソウチク、金毛竹など剛竹属の竹から抽出した有効成分が多種類の頭垢(ふけ)菌類の抑制、皮膚老化の予防・治療及び脂質の過酸化を抑制できる安定的な製品であるとしている[Skin, scalp and hair agent containing component of suppressing growth of dandruff fungus extracted from bamboo, JP Patent 3251518]。Nishina, A.らは1991に、モウソウチクの茎の皮から抗菌活性成分である2,6-ジメトキシ-p-ベンゾキノン(2,6-Dimethoxy-p-benzoquinone)を検出した[ J of Agric & Food Chem,1991,
39(2):266-269]。Kiyooka, Takatoshi.が1995年に出願した発明特許は「有機溶剤抽出方法による竹の皮からの脱臭剤製造」[JP Patent 9094290]である。Yamanaka, Satoshiらは1998年に、竹の乾留液の抗菌活性及びその応用を報告した[Anti-microbial activity of bamboo dry distillate and its application, Gekkan Fudo Kemikaru, 1998, 14(9): 57-60]。Makino, Akimitsu は1998年に日本発明特許「竹の抽出物の肉類添加剤としての応用」[JP Patent 11346719]を出願した。Mie UniversityのSakai Kojiらは1999年に、タケノコの殻から初めて2種の抗酸化成分ウマゴヤシ素(Tricin)とタクシフォリン(Taxifolin)
を分離し、またPOV方法によりその抗酸化活性はそれぞれα-トコフェロール(α-tocopherol)の10%及び1%となることを測定した[Isolation of antioxidative compounds from bamboo shoots sheath, Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi, 1999, 46(7): 491-493]。
and Prooxidant Activities of Bamboo Phyllostachys nigra Var. Henonis Leaf Extract in vitro, J. Agric Food Chem., 2000, 48,3170-3176.]。Ebl971は豊かな原料ソース
、明確な機能因子、良好な食用安全性(実際無毒)、高効率で安定的な調合剤品質(耐水、耐熱、耐酸分解)及びそのさっぱりとして甘い香りの竹風味により、ここ数年来、天然機能性食品添加剤領域及び医薬健康食品の領域で頭角を現してきている。2000年及び2001年に、国家特許管理局は申請者の1998年に出願した2つの発明特許権をそれぞれ授与した[張英、「フラボノイド類化合物のエキス及び粉剤の生産方法」、中国特許 ZL 98 1 04564.2。張英、「竹葉のフラボン抽出物を添加した保健ビール」、中国特許ZL 98 1 04563.4]。中国でのほぼすべて研究は皆剛竹属の竹種、特に金毛竹、モウソウチクと桂竹(ケイチク)をめぐって展開されてきた。
V.L.P.らは1992年に、異なる加工方法で竜竹笋中の発ガン物質を除去することを報告した[Elimination of cyanogenic compounds of bamboo shoots Dendrocalamus-Giganteus Munro by different processes, REV ESP CIENC TECNOL ALIMENTOS, 1992, 32(2):175-184]。
J,1992, 6(5): A1653]。Rutgers大学のHe YiHuiは博士論文でタケノコの体内外でコレステロールのレベルを下げる作用における系統的な研究を行った後で、主に植物性ステロイド(phytosterols)が作用していると認識した[The hypocholestolemic effect of bamboo shoot in vivo and in vitro (Phyllostachys edulis, Phytosterols) 1998]。
篌竹(ホウチク)( P. nidularia Munro)― 別名花竹(貴州)、槍刀竹(チャトチク)(浙江)、筆笋竹(広東)、剛竹(P. viridis (Young) McClure)、青稈竹(Bambusa tuldoides Munro)、チンコ竹(B. pervariabilis McClure)、粉単竹(B. chungii McClure) [Lingnania
chungii (McClure) McClure]、大頭典竹Dendroclamopsis beecheyana (Munro) Keng f. Var. Pubescens (P. F. Li) 、別名大頭甜竹(《中国竹類植物志略》)、 竹Dendrocalamus affinis Rendle (Sinicalamus affinis (Rendle) McClure)である。採用する竹種類の分布情況によって推定すると、長江流域では散生竹中の淡竹を主とし、次いで人面竹、桂竹、篌竹、粉緑竹、剛竹などがあり、華南と南西地域では密生竹種類中の青稈竹が主であり、次いで大頭典竹、粉単竹、チンコ竹、慈竹(ジチク)などがある。
疱瘡、歯肉が腫れて痛みがある症候に適用される。記載によると、淡竹葉の茎と葉には主にArundoin、Cylindrin、Taraxerol、Friedelinおよびb-sitosterol、stigmasterol、campesterol、taraxasterolなどのトリテルペノイド(triterpenoids)とステロイド類の物質が含まれ、その地上部分にはフェノール(phenol)類物質、アミノ酸、有機酸および糖類物質を含有している。最近、瀋陽薬科大学の陳泉ら研究者は淡竹葉の成分に対し比較的に系統的な研究[陳泉ら、「漢方薬淡竹葉の化学成分研究」、瀋陽薬科大学学報、2002,19(1):23-24と2002, 19(4):257-258] を行い、前後して、4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde、trans-p-hydroxy cinnamic acid、 tricin、tricin-7-O-b-D-glucosyl、vitexin、vanillic aldehyde、thymineおよびadenineなど8つの化合物を分離・鑑定したが、トリテルペノイド(triterpenoid)に対しては言及しなかった。
1123474045510_0.htm
などに含有されているサポニンにおける系統的な研究が進められると同時に、その生物活性と薬用価値も次第に認識され、かつ日増しに重視されてきている。これらの物質は多種類の生物活性を有している。いわば、抗菌、抗ウィルス、抗ガン、抗生育、抗炎、降脂血、降血圧、降血糖、免疫調節など、心血管システム、神経システム、副腎皮質システムと酵素活性などの方面において生理活性を持ち、すでに天然薬物研究中の重要領域となっている [姚新生責任編集、「天然薬物化学」(第3版)、人民衛生出版社 2001,257-294。 呉寿金ら、「ここ数年来サポニンの薬理活性研究概況」、国外医薬・植物薬分冊、1994,9(6): 246-252]。
法によりアセチル化させてアセチル誘導体を取得した後、更なる分離を行う。(4)多くのトリテルペノイド(triterpenoid)は植物体の中ではサポニンの形式で存在し、トリテルペノイドサポニンの加水分解の後で取得することができる。即ち、トリテルペノイドサポニンの加水分解を行った後、その加水分解の産物をクロロフォルムなどの溶剤を使って抽出し、その後分離を行うものである。化学溶剤による抽出方法は、技術処理過程が長く、溶剤消耗量が多く、操作環境が劣るのみでなく、より重要なのは、抽出物の品質が不安定で、重金属と残留農薬の含有量が正常レベルを超えやすく、それに抽出産出率も低い。
triterpenoid sapogenins)は、friedelinとlupenone及びその同族体を主とするpentacylic triterpenoidsの混合物であり、外観は黄色又は黄緑色の粉末、融点74〜79°C、臭化カリウム分析による赤外線スペクトルの測定で、この混合物は2917、2849、1716、1463、1382及び720cm-1の所で特徴的な吸収ピークを示すもので、トリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)を純粋なスペクトルを持つ二塩化メチル(CH2Cl2)に溶解させた後、300〜700nmの波長範囲内でスキャンを行うと、412nmの所に強吸収、665nmの所に次強吸収を示し、また505、535及び605nmの付近ではそれぞれ弱吸収を示した。
sapogenins)及びその代表的化合物(friedelin)の降血圧作用、抗腫瘍活性及びその皮膚生理効果における系統的な研究を行うにより、これらの物質が医薬、健康食品および日用化粧品などの応用領域において広い将来性を持っていることを掲示した。
淡竹抽出物の製造ステップは、(1)20メッシュの粒度の剛竹属の淡竹(Phyllostachys
nigra var. henonis、 別名:毛金竹、金毛竹)の竹茹粉末を抽出釜内に入れ、温度を55°Cまで引上げた後、CO2ポンプを始動して圧力を30MPaまで引上げ、また予熱器を経過して抽出釜内に入れる。(2)エントレイナー(entrainer)のポンプを起動して、10%体積比のアセトンが予熱器を経過して抽出釜内に入るようにする。55°Cの下でダイナミック抽出を3時間行う。その間、分離釜1の設定分離圧力を8 MPa、温度45°Cにし、分離釜2の設定分離圧力を5〜6 MPa、温度27〜30°Cにする。分離釜1から目的産物を取得した後、低温の下で乾燥、粉砕によりEZR2002を121g取得し、その産出率はおよそ2.2%。(3)分離釜2からエントレイナー(entrainer)を回収する。
剛竹属のモウソウチク(Phyllostachys pubescens、楠竹(ナンチク)とも称する)のタケノコを原料に、それを乾燥、粉砕した後、超臨界の状態で抽出を行う。その間、抽出温度を60°C、圧力25 MPa、抽出時間は5hにし、エントレイナー(entrainer)は10%体積比のエタノールに変える以外、その他の条件は実施例1Aと同じく、EZR2002の産出率はおよそ0.98%。
バンブサ(Bambusa)属の青皮竹[Bambusa textiles MuClure、別名:籤竹(ヒゴチク)、山青竹]の全般を原料に、それを乾燥、粉砕した後、超臨界で抽出する。その間、抽出温度を50°C、圧力30 MPa、抽出時間は4hにし、エントレイナー(entrainer)は不使用、分離釜の分離設定圧力を6 MPa、温度40°Cにして目的産物を取得し、また低温の下で乾燥、粉砕によりEZR2002を取得し、その産出率はおよそ1.1%。
実施例1A〜1Cで超臨界CO2抽出方法により取得した竹抽出物(EZR2002と総称する)製品の特徴を論述した。(実施例1A〜1Cでの抽出物の特徴は同じ。)
EZR2002はfriedelin、lupenoneおよびその同族体を主とするペンテシリクトリテルペノイド(pentacylic triterpenoids )類化合物の混合物であり、外観は黄色或は黄録色の粉末であり、融点は74〜79°C。臭化カリウムによる赤外線スペクトルで、混合物は2917、2849、1716、1463、1382及び720cm-1の所で特徴的な吸収ピークを示す(別図1参照)。EZR2002を純粋なスペクトルを持つ二塩化メチル(CH2Cl2)に溶解させた後、300〜700nmの波長範囲内でスキャンを行うと、412nmの所に強吸収、665nmの所に次強吸収を示し、また505、535及び605nmそれぞれの付近に弱吸収を示す(別図2参照)。
検測器: FID, 280°C
パイプ: HP5毛細管
導入気体: N2
H2の流速:30ml/min
空気流速:200ml/min
末端気流注入速度:50ml/min
プログラム化の温度上昇:100°Cの下で2min維持した後に、20°C/min の速率で270°Cまで上昇させて50min維持する。
パイプ:HP5-MS毛細管
導入気体:ヘリウム気体
パイプ内の流速:1ml/min
プログラム化の温度上昇:100°Cの下で3min維持した後に、20°C/min の速率で270°Cまで上昇させて50min維持する。
Vc-Cu++-H2O2-酵母多糖の水酸基フリーラジカル産出システムを採用して、化学発光法による測定[張英ら、「竹の葉の有効成分と抗活性酸素フリーラジカル効能研究」、竹研究誌, 1996, 15(3):17-24]で、EZR2002の水酸基フリーラジカルに対するIC50は39.6±10.5mg/mlであり、比色法による測定でEZR2002のDPPHフリーラジカルに対するEC50は300.4±50.6mg/mlから、より強い活性酸素フリーラジカルの除去能力を示しているため、バイオ抗酸剤として応用の潜在力を有しているものである。
4.1 実験用の原材料
実験に際して、EZR2002をツイーン 80 (Tween-80)の助溶剤添加及び蒸留水を加えることにより、20と60mg/mlの溶液を調製する。対照組に20%のTween-80を100g体重当たり0.5mlの用量で投与する。
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動合証字152号。
意識あるマウスの血圧測定はSHRマウス用電子血圧メーター(北京・中日友好病院製造)を採用して尾動脈の間接的血圧測定法によりマウスを38°Cの温度コントロール可能の箱内に入れて15〜20分間加熱すると同時に、収縮血圧と心拍を測定する。
一日当たり100mg/kg 投与量のEZR2002投与組は、実験開始の当日に測定した投与前のマウス収縮血圧195±8mmHgが、投与後の2時間目(2h)には179±14mmHgに下がり、投与後の4hと6h目の収縮血圧はそれぞれ169±18と165±19mmHgになったことから、投与前に比べてそれぞれ明らかな血圧低下(p<0.05とp<0.01)の効果が見られた。一日当たり300mg/kg投与量のEZR2002投与組は、実験開始の当日に測定した投与前のマウス収縮血圧199±7mmHgが、投与後の2時間目(2h)には179±14mmHgに下がり、投与後の4hと6h目の収縮血圧はそれぞれ181±14と179±6mmHgになったことから、投与前に比べてそれぞれ明らかな血圧低下(p<0.05とp<0.01)の効果が見られた。表1を参照。
竹茹からの抽出物(EZR2002)は、自発性高血圧症マウスに対し明らかな降血圧作用を有する。
5.1 EZR2002の抗腫瘍活性物質の生体外選別
5.1.1選別方法 sulforhodamine B, SRB蛋白染色法
microculture tetrozolium, MTT還元法
5.1.2 細胞株 P388小マウスの白血病細胞とA549ヒトの肺腺癌細胞
5.1.3 作用時間 48時間と72時間
5.1.4 活性評価指標
無効: 10-5mol/L< 85%
弱い効果: 10-5mol/L 3 85% 或10-6mol/L >50%
強い効果: 10-6mol/L 3 85% 或10-7mol/L >50%
EZR2002はP388小マウス白血病及びA549ヒト肺腺癌細胞株に対し抑制作用があり、抗ガン活性を有する。
EZR2002の抗腫瘍能力をいま一歩評価するため、申請者はさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Silica Gel Column chromatography )と向流クロマトグラフィー(Countercurrent Chromatography)の製造技術を採用してEZR2002からFriedelin成分を分離取得し、GC-MS分析により分離成分の純度測定値は90.5%であることを確認した。瀋陽薬科大学の国家沈陽新薬安全評価研究重点実験室に委託してMTT方法採用により、Friedelin単量体サンプルにおける生体外抗ガン活性の評価を行った。
この度の実験は、A375(ヒトの黒色素瘤(human melanoma))、L929(小マウスの肺上皮癌)、Hela(ヒトの子宮頸癌)及びTHP-1(ヒトの大食細胞瘤(macrophage tumor))の4種の細胞株を活性選別として用いた。そのうち、前の3種はアドヘレント細胞(Adherent Cell)で、第4種は浮遊細胞である。
全ての細胞は皆RPMI-1640の培養液により培養し、この培養液は10%の牛胎子血清、100U/mLのペニシリン、100mg/mLのストレプトマイシン、0.2%のNaHCO3を含有する。各成分はすべてイオン除去かつ3度蒸留の水で調製し、溶解した後に0.22μmの濾過膜により濾過除菌し、また牛胎子血清は使用に際し56°Cの温度で30分間加熱により不活発化される。細胞は上述の培養液により、温度37°CかつCO2濃度5%の培養箱に入れて培養する。
対数増殖期のA375、L929、Hela細胞は5×104/mLの密度に、THP-1はより小さいためその密度を1×105/mLに調整して、96ウェルプレート(100μL/well)内に接種する。浮遊細胞は4時間培養後、アドヘレント細胞(Adherent Cell)は12時間培養後サンプルを加える。Friedelinのサンプルは予め超音波の助溶作用によりDMSOに溶解させた後、DMSO濃度<0.1 % (v/v)の 培養液に溶解させる。 その後、サンプルを7.5、15、30、60、120、240、480及び960μmol/L の8つの濃度に分け、またそれぞれの濃度を4つの平行ウェルを設けると同時に陰性対照組も設ける。細胞にサンプルを加えて引き続き24時間と48時間培養後に、細胞液に5mg/mL濃度のMTT溶液をウェルごとに15μl(15μl/well)注入する。
当実験はde-methyl-cantharidinを陽性対照物として用い、8表は120mmol/L濃度のde-methyl-cantharidin物質の24時間目と48時間目にA375細胞、L929細胞及びHela細胞における抑制率、及び相応のFriedelinデータを列記したものである。
EZR2002から分離取得したFriedelin単量体成分のA375(ヒトの黒色素瘤(human melanoma))、L929(小マウスの肺上皮癌)、Hela(ヒトの子宮頸癌)及びTHP-1(ヒトの大食細胞瘤(macrophage tumor))の4種の癌細胞の増殖に対しそれぞれ程度の異なる抑制作用を持ち、またその抑制率は時間・投与量と関係を持っている。
EZR2002の日用化粧品領域における応用の将来性を評価するため、申請者は復旦大学公衆衛生学院の皮膚生理毒理研究室に委託し、EZR2002の皮膚生理効果におけるテストを行った。
6.1.1サンプルの取扱い
EZR2002をDMSOに十分溶解させた後、孔径0.22μmの濾過膜より濾過・除菌を行ってから、無血清のDMEMを加えて希釈することにより濃度が0.5%、0.05%、0.005%及び0.0005%のサンプルに調製し、又これらのサンプルは-4°Cの温度条件で保存し、無血清のDMEMを対照物とした。
K-SFM培地(Gibcol会社、USA)、DMEM培地、インシュリン、小牛血清(NBS)、ヒドロコルチゾン(hydrocortison)、ペニシリン、ストレプトマイシン、トリプシン(trypsinase)、フィコール(Ficoll)、96 ウェルプレートと24 ウェルプレート、及び直径35mmの培養皿と25cm2培養瓶(Corning会社、USA)。
enzyme-labeledメーター(BIO-TEK会社)、pHメーター、超クリーンベンチ(super-clean bench)、培養箱、722分光光度計(spectrophotometer)。
出生3日目のSDマウスの背中皮膚を剥ぎ取り、0.25%濃度のトリプシン(trypsinase)冷消化法(cold digestion method)により表皮角化細胞(epidermal keratinocytes)を準備し、K-SFM培地により細胞密度を1×106/mlに調整してから、96ウェルプレートと24ウェルプレートにそれぞれ接種する。接種後24時間目に1回目となる培地交換を行い、その後は2〜3日ごとに一回ずつ培地を交換する。上述の培養細胞が成長により80%融合された時点で、サンプルを添加する。
MDAの測定はTBA比色法により行い、SODの測定は亜硝酸塩還元法(nitrite reduction method)により行い、試薬の箱は南京建成生物公司の提供による。
1999年国家衛生部公布の「化粧品衛生規範」中の評価プログラムと方法に基づいて行うこととし、テスト用サンプルの濃度は10%に設定する。(1)皮膚刺激試験: 0.2mlのサンプルを毎日一回ずつ、毎次1時間、連続14日間皮膚に塗る。(2)眼刺激試験:0.1mlのサンプルを試験動物の結膜嚢中に滴下し、毒に感染後の1、24、48、72時間目、及び4、7日目において動物眼に対し検査を行う。
6.2.1皮膚に対する抗老化作用
EZR2002は0.0005%〜0.005%の投与量の範囲(即ち、体重1kg当たり5〜50mgの投与量)内で皮膚細胞のMDAレベルは対照組に比べて著しく低く、またSOD活性は対照組に比べて著しく高かった。表9参照。
皮膚刺激試験及び眼刺激試験による結果はすべて陰性であることから、皮膚および眼に対し無刺激性であることが確認された。
EZR2002は体重1kg当たり5〜50mgの投与量の範囲内でかなり強い抗酸化損傷作用を有すると同時に、皮膚のSOD活性を強め、酸化産物のMDA形成を減少させるため、スキンケアやヘアケアなど日用化粧品における応用に関し良好な生理学的効果を有する。
Claims (10)
- friedelinを標準品とするバニリンルアルデヒド(vanillic aldehyde)〜過塩素酸比色法により測定したトリテルペノイドサポゲニンの含有量が10〜90%、GC-MS技術により測定したfriedelinとlupenoneの含有量がそれぞれ5〜35%及び1%〜10%となることを特徴とする竹から抽出したトリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)の組成物。
- トリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)の含有量が40〜80%、friedelin及びlupenoneの含有量はそれぞれ15〜25%及び3〜6%となる、請求項1に記載の組成物。
- トリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)が、friedelinとlupenone及びその同族体を主とするpentacylic triterpenoidsの混合物であり、外観は黄色又は黄緑色の粉末、融点74〜79°C、臭化カリウム分析による赤外線スペクトルの測定で、この混合物は2917、2849、1716、1463、1382及び720cm-1の所で特徴的な吸収ピークを示すもので、トリテルペノイドサポゲニンを純粋なスペクトルを持つ二塩化メチル(CH2Cl2)に溶解させた後、300〜700nmの波長の範囲内でスキャンを行うと、412nmの所に強吸収、665nmの所に次強吸収を示し、また505、535及び605nmのそれぞれの付近に弱吸収を示す、請求項1に記載の組成物。
- 以下のステップを含む、竹からトリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)物質を抽出する方法。
(a)イネ科に所属する竹の茎、竹の葉、タケノコ、タケノコの殻、竹根、或はその混合物を超臨界の二酸化炭素流体と混合により抽出を行い、竹の中の遊離状態のトリテルペノイドなどの低極性物質を二酸化炭素に溶解させるステップであって、抽出温度は50〜65°C、抽出圧力は25〜35Mpaとするステップ、
(b)上述の遊離状態のトリテルペノイドが溶解されている二酸化炭素流体の圧力を変えることにより二酸化炭素を気化分離させると同時に、これに伴って析出されるトリテルペノイドサポゲニンを取得するステップであって、分離温度は35〜45°C、分離圧力は5〜10Mpaとするステップ。 - 原料が10〜20メッシュの粒度の竹粉末であり、またステップ(a)ではエントレイナー(entrainer)を使用し、そのエントレイナーの体積使用量はCO2量の5〜15%を占め、かつ、二酸化炭素気体は循環利用され、循環ダイナミック抽出を行う時間は2〜5時間である、請求項4に記載の方法。
- エントレイナー(entrainer)が、メタノール、エタノール、アセトン、又はその混合物から選定される、請求項4に記載の方法。
- 竹が、剛竹属(Phyllostachys)、バンブサ(Bambusa)属及びデンドロカラムス(Dendrocalamus)属から選定したものである、請求項4に記載の方法。
- 降血圧、抗心不全、抗心筋虚血、抗脳虚血、抗老人性痴呆及び抗腫瘍の新薬製造、漢方・西洋薬の複合調合薬剤、および心・脳血管疾患の予防・治療と抗腫瘍の健康食品と複合調合薬剤の製造に用いられるものである、請求項1で述べたトリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)組成物の使用。
- スキンケア及びヘアケアの有効因子として日用化粧品の製造に用いられる、請求項1で述べられたトリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)組成物の使用。
- トリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)中のpentacylic triterpenoidsが、心・脳血管疾病の予防・治療と抗腫瘍薬物、健康食品、および日用化粧品の製造に用いられる、竹から抽出したトリテルペノイドサポゲニン(total triterpenoid sapogenins)の使用。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006515007A (ja) * | 2003-03-27 | 2006-05-18 | ユニジェン インク. | 炎症性及び血液循環疾患の治療及び予防活性を示す、竹抽出物並びにそれから分離された化合物を含有する組成物 |
JP2013043856A (ja) * | 2011-08-24 | 2013-03-04 | Life Design Kk | 筍の皮抽出物、並びにこれを有効成分とするメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、及び抗菌剤 |
JP2013180999A (ja) * | 2012-03-02 | 2013-09-12 | Kyoei Kagaku Kogyo Kk | 毛髪化粧料 |
JP2014172896A (ja) * | 2013-03-12 | 2014-09-22 | Kyoei Kagaku Kogyo Kk | 毛髪用組成物 |
KR20150125439A (ko) * | 2014-04-30 | 2015-11-09 | 재단법인 전남생물산업진흥원 | 초임계 유체 추출법을 이용하여 추출한 솜대, 맹종죽 및 신이대 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 |
CN106525840A (zh) * | 2016-12-18 | 2017-03-22 | 福建神采新材料科技有限公司 | 一种圆环式竹锟叶绿素铜钠检测对比色板色卡图 |
KR20200064464A (ko) * | 2018-11-29 | 2020-06-08 | 담양죽순 영농조합법인 | 죽순 껍질 추출물을 포함하는 손상 모발 개선용 조성물 |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7409555B2 (en) * | 2003-02-10 | 2008-08-05 | Red Hat, Inc. | Electronic document active content assurance |
JP5097983B2 (ja) * | 2005-02-22 | 2012-12-12 | 学校法人東京農業大学 | 抗酸化活性を有する組成物の製造方法 |
WO2007137449A1 (fr) * | 2006-05-29 | 2007-12-06 | Fenchem Enterprises Ltd. | Compositions de traitement et de prévention de l'hyperlipidémie |
EP2070906A1 (en) | 2007-12-06 | 2009-06-17 | Amorim Revestimentos, S.A. | Extraction and purification of friedelin |
EP2288362A4 (en) * | 2008-04-19 | 2012-05-02 | Nisarga Biotech Pvt Ltd | PLANT-BASED COMPOSITION FOR DECREASING ADD / L ADHD, AND METHOD THEREOF |
KR101597853B1 (ko) * | 2008-09-09 | 2016-02-25 | 라이온 가부시키가이샤 | 사포게닌 고함유 조성물의 제조 방법 |
CN102532240A (zh) * | 2010-12-24 | 2012-07-04 | 苏州宝泽堂医药科技有限公司 | 一种木栓酮的提纯方法 |
WO2012177825A1 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Bvw Holding Ag | Medical device comprising boswellic acid |
CN102429087B (zh) * | 2011-10-25 | 2013-07-17 | 广州蓝韵医药研究有限公司 | 一种竹笋蛋白水解方法 |
CN102911246A (zh) * | 2012-09-06 | 2013-02-06 | 青岛农业大学 | 石楠中木栓酮的提取方法及其新用途 |
CN103070289B (zh) * | 2013-01-14 | 2014-08-13 | 浙江大学 | 来源于竹子的天然物饲料添加剂 |
US20150126463A1 (en) * | 2013-11-04 | 2015-05-07 | Hong Kong Baptist University | Use of herbal saponins to regulate gut microflora |
US10456436B2 (en) * | 2013-11-04 | 2019-10-29 | Wen Luan Wendy Hsiao | Use of herbal saponins to regulate gut microflora |
CN104706550A (zh) * | 2013-12-11 | 2015-06-17 | 江南大学 | 一种竹叶宠物护毛素 |
US9186386B2 (en) | 2014-04-17 | 2015-11-17 | Gary J. Speier | Pharmaceutical composition and method of manufacturing |
US9044390B1 (en) | 2014-04-17 | 2015-06-02 | Gary J. Speier | Pharmaceutical composition and method of manufacturing |
CN104164248A (zh) * | 2014-08-28 | 2014-11-26 | 桂林市艾康科技有限公司 | 一种精制竹醋液的制备方法 |
CN105796571B (zh) * | 2016-04-15 | 2019-11-19 | 江苏康缘药业股份有限公司 | 羽扇烯酮在制备预防和/或治疗老年痴呆药物中的应用与一种制剂 |
CN105998767A (zh) * | 2016-05-20 | 2016-10-12 | 叶茂光 | 一种用竹子制备竹茹提取物和竹浆的方法 |
CN106262639A (zh) * | 2016-08-09 | 2017-01-04 | 蚌埠大成食品有限公司 | 用于烤鸡翅的提鲜调料 |
CN106262589A (zh) * | 2016-08-09 | 2017-01-04 | 蚌埠大成食品有限公司 | 用于油炸鸡柳的提鲜调料的制备方法 |
CN106245424B (zh) * | 2016-08-29 | 2018-01-09 | 赵哲 | 一种抗菌纸的制备方法 |
CN108061774B (zh) * | 2016-11-05 | 2022-03-25 | 天士力医药集团股份有限公司 | 一种同时测定三七中19种有机氯类农药残留量的方法 |
CA3042123A1 (en) | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Reata Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating alport syndrome using bardoxolone methyl or analogs thereof |
CN111655266B (zh) * | 2018-02-14 | 2024-04-12 | 雀巢产品有限公司 | 调节血管性血友病因子水平的化合物及其在治疗血液疾病中的用途 |
CN108835385B (zh) * | 2018-08-01 | 2023-12-19 | 中国海洋大学 | 一种对虾复方中草药解毒保肝饲料添加剂 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08208424A (ja) * | 1994-12-20 | 1996-08-13 | Unilever Nv | ベツリン酸を含む化粧品組成物 |
JPH09151198A (ja) * | 1995-11-30 | 1997-06-10 | Nippon Mektron Ltd | 鎮痛抗炎症剤 |
EP1122259A2 (en) * | 2000-02-03 | 2001-08-08 | Labor Qualitas | Extraction of ceroid fraction of cork smoker wash solids with a supercritical fluid |
JP2002068972A (ja) * | 2000-08-24 | 2002-03-08 | Kaminomoto Co Ltd | 血管新生剤 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5739753A (en) * | 1980-08-22 | 1982-03-05 | Wataru Sakai | Healthful food containing bamboo extract |
JPH03251518A (ja) * | 1990-02-26 | 1991-11-11 | Ichimaru Pharcos Co Ltd | 竹から抽出されたフケ菌発育阻害成分を含有する皮膚・頭皮・頭髪剤 |
US6387417B1 (en) * | 1999-08-23 | 2002-05-14 | Kazuo Iwai | Bactericide against vancomycin resistant enterococcus |
-
2002
- 2002-12-10 CN CNB021544018A patent/CN1271083C/zh not_active Expired - Fee Related
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2003
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08208424A (ja) * | 1994-12-20 | 1996-08-13 | Unilever Nv | ベツリン酸を含む化粧品組成物 |
JPH09151198A (ja) * | 1995-11-30 | 1997-06-10 | Nippon Mektron Ltd | 鎮痛抗炎症剤 |
EP1122259A2 (en) * | 2000-02-03 | 2001-08-08 | Labor Qualitas | Extraction of ceroid fraction of cork smoker wash solids with a supercritical fluid |
JP2002068972A (ja) * | 2000-08-24 | 2002-03-08 | Kaminomoto Co Ltd | 血管新生剤 |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006515007A (ja) * | 2003-03-27 | 2006-05-18 | ユニジェン インク. | 炎症性及び血液循環疾患の治療及び予防活性を示す、竹抽出物並びにそれから分離された化合物を含有する組成物 |
JP4684893B2 (ja) * | 2003-03-27 | 2011-05-18 | ユニジェン インク. | 炎症性及び血液循環疾患の治療及び予防活性を示す、竹抽出物並びにそれから分離された化合物を含有する組成物 |
JP2013043856A (ja) * | 2011-08-24 | 2013-03-04 | Life Design Kk | 筍の皮抽出物、並びにこれを有効成分とするメラニン合成阻害剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤、及び抗菌剤 |
JP2013180999A (ja) * | 2012-03-02 | 2013-09-12 | Kyoei Kagaku Kogyo Kk | 毛髪化粧料 |
JP2014172896A (ja) * | 2013-03-12 | 2014-09-22 | Kyoei Kagaku Kogyo Kk | 毛髪用組成物 |
KR20150125439A (ko) * | 2014-04-30 | 2015-11-09 | 재단법인 전남생물산업진흥원 | 초임계 유체 추출법을 이용하여 추출한 솜대, 맹종죽 및 신이대 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 |
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CN106525840A (zh) * | 2016-12-18 | 2017-03-22 | 福建神采新材料科技有限公司 | 一种圆环式竹锟叶绿素铜钠检测对比色板色卡图 |
KR20200064464A (ko) * | 2018-11-29 | 2020-06-08 | 담양죽순 영농조합법인 | 죽순 껍질 추출물을 포함하는 손상 모발 개선용 조성물 |
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