CN105796571B - 羽扇烯酮在制备预防和/或治疗老年痴呆药物中的应用与一种制剂 - Google Patents
羽扇烯酮在制备预防和/或治疗老年痴呆药物中的应用与一种制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了羽扇烯酮在制备预防和/或治疗老年痴呆的药物中的应用。动物实验表明,羽扇烯酮对Aβ25‑35所致老年痴呆小鼠以及D‑半乳糖和AlCl3所致老年痴呆大鼠有较强的保护作用,能够显著改善学习记忆功能,能明显降低脑组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)活性及血液中丙二醛(MDA)含量,明显提高脑组织中胆碱乙酰转移酶(ChAT)、血液中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的含量,并减少Tau蛋白的异常磷酸化水平,因而羽扇烯酮可用于制备防治老年痴呆的药物。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域,尤其涉及羽扇烯酮在制备预防和/或治疗老年痴呆药物中的应用与一种制剂。
背景技术
老年痴呆症(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主要临床表现的中枢神经系统的退行性疾病。目前研究认为,痴呆与大脑皮质和皮质下神经细胞的退化有关,准确的病因学尚无结论。病理生理学研究发现,老年痴呆症患者大脑的新皮质、海马区、基底核和蓝斑核等部位的神经元大量丢失,同时伴有5-羟色胺、去甲肾上腺素以及生长抑素释放因子等多种神经递质在脑内浓度减小,特别是乙酰胆碱的减少,从而导致一系列认知和记忆等功能障碍。AD的主要病理学变化为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑(Senile Plaque,SP)、tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结(Neurofibrillary Tangles,NFT)以及选择性神经元及突触丢失并伴有胶质细胞增生等。据估计,我国已有6-7百万AD患者,且在65岁及以上老龄人口中每年以5-7%的速度在增长。AD是继肿瘤、心脏病、脑血管病之后引起老年人死亡的第四大病因。因此,寻找治疗老年痴呆症的有效药物,已成为医药领域的研究热点之一。由于AD的病因不明,目前的治疗尚无能有效逆转疾病进展的药物,主要是以改善患者的呆症状和提高日常生活能力为主,且副作用较多。
羽扇烯酮是一种羽扇豆烷型的五环三萜类化合物,分子式为C30H48O,分子量为424.72,CAS登录号为:1617-70-5,其结构如下所示:
羽扇烯酮在许多药用植物中存在,如狗肝菜(Dicliptera chinensis(L.)Juss.)、阔叶山麦冬(Liriope platyphylla Wang et Tang)、绿玉树(Euphorbia tirucalli L.)、千里光(Senecio scandens Buch.-Ham)、细叶沙参(Adenophora paniculata Nannf.)、长毛灰叶(Tephrosia villosa(L.)Pers.)和三花假卫矛(Microtropis triflora Merr.etFreem)均可分离得到该化合物。对于羽扇烯酮的生理活性,学者对其研究主要在于对糖尿病和肥胖的治疗上,也有抗病毒、抗菌和抗寄生虫等作用。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种羽扇烯酮在制备预防和/或治疗老年痴呆药物中的应用。
有鉴于此,本申请提供了羽扇烯酮在制备预防和/或治疗老年痴呆药物上的应用。
优选的,羽扇烯酮的纯度为90%以上。
优选的,所述羽扇烯酮的剂量为15mg/kg~60mg/kg。
本申请还提供了一种制剂,包括:羽扇烯酮与药学上可接受的辅料。
优选的,所述制剂的剂型为口服制剂、注射剂、栓剂或吸入剂。
优选的,所述制剂的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
优选的,所述羽扇烯酮的剂量为15mg/kg~60mg/kg。
本申请提供了羽扇烯酮作为制备预防和/或治疗老年痴呆药物中的应用。实验结果表明,羽扇烯酮对Aβ25-35所致老年痴呆小鼠以及D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆大鼠具有较强的保护作用,能够显著改善学习记忆功能,能明显降低脑组织中AchE活性及血液中MDA含量,明显提高脑组织中ChAT、血液中SOD和CAT的含量,并减少Tau蛋白的异常磷酸化水平,因此,羽扇烯酮可用于制备防治老年痴呆的药物。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了羽扇烯酮在制备预防和/或老年痴呆药物中的应用。
本申请所述羽扇烯酮优选从含有该成分的植物及中药材,如狗肝菜、阔叶山麦冬、绿玉树、千里光、细叶沙参、长毛灰叶、三花假卫矛等,或饮片中获得,亦可按照现有方法合成、半合成或由市售获得。
本申请所述羽扇烯酮的化学式如下所示,其为化合物单体,纯度优选为90%以上,更优选为91%~99%,
按照本发明,所述羽扇烯酮的剂量没有特别的限制,其含量越多对老年痴呆的治疗效果越好。作为优选方案,所述羽扇烯酮的剂量优选为10mg/kg~80mg/kg,在实施例中,所述羽扇烯酮的剂量更优选为15mg/kg~60mg/kg。
本申请还提供了一种制剂,其包括羽扇烯酮与药学上可接受的辅料。所述制剂中羽扇烯酮作为活性成分,其剂型优选为口服制剂、注射剂、栓剂或吸入剂,具体的,其剂型包括但不限于片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
按照本发明,在所述制剂中,所述羽扇烯酮的剂量优选为10mg/kg~80mg/kg,在实施例中,所述羽扇烯酮的剂量优选为15mg/kg~60mg/kg。
本申请提供的羽扇烯酮作为制备预防和/或治疗老年痴呆药物中的应用。实验结果表明,本发明所述羽扇烯酮可对Aβ25-35所致老年痴呆小鼠以及D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆大鼠有较强的保护作用,能够显著改善学习记忆功能,明显降低脑组织中AchE活性及血液中MDA含量,明显提高脑组织中ChAT、血液中SOD和CAT的含量,并减少Tau蛋白的异常磷酸化水平,可用于制备防治老年痴呆的药物。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明提供的羽扇烯酮的用途进行详细说明,本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
1、羽扇烯酮对Aβ25-35蛋白引起的老年痴呆小鼠症状的改善作用
1.1实验动物及试药
实验动物:清洁级健康雄性昆明种小鼠50只,体重26-30g,购于扬州大学比较医学中心。试药:羽扇烯酮(纯度为91%),由江苏康缘药业股份有限公司提供;Aβ25-35购于sigma公司;ChAT和AchE检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所;脑复康购于湖北华中药业有限公司。
1.2凝聚态Aβ25-35的制备
将1mg Aβ25-35溶于943μl灭菌生理盐水中,浓度为1mmol/L,密封后置于37℃细胞培养箱中孵育5-7d,使其变为凝聚态的Aβ25-35,放于-20℃冰箱中备用。
1.3小鼠AD模型的制备及给药
小鼠用乙醚麻醉后,将小鼠固定于脑立体定位仪上,定位参照George Paxinos所著的第5版大鼠脑立体定位图谱。每只大鼠用微量进样器注射1mmol/L的Aβ25-35试剂l5μl,缓慢注射,注完留针以保证其充分弥散,随后缝合消毒。
手术10d后,动物随机分为对照组、模型组、阳性药(脑复康)组,羽扇烯酮I组,羽扇烯酮II组,每组10只。对照组于侧脑室注射生理盐水5μl,其它组分别于侧脑室注射1mmol/LAβ25-35蛋白5μl制备AD小鼠模型。脑复康组、羽扇烯酮各剂量组均用生理盐水溶解,模型制备7d后,脑复康组、羽扇烯酮I组、羽扇烯酮II组分别按照400mg/kg、20mg/kg、60mg/kg,灌胃给药,对照组和模型组小鼠灌服等体积的生理盐水,连续用药14d。
1.4Morris水迷宫训练及测试
自给药第8天开始进行水迷宫训练,共7d。将特制水迷宫平台放于第4象限,每只小鼠每天检测2次,排除平台所在象限,在其他3个象限的中间贴壁放入小鼠。以小鼠上台10s不再下水认为一次测试完成;不能上台的小鼠记录满90s,并引导小鼠到平台,使其在平台上持续30s,以强化记忆。拍摄下小鼠的游泳过程,共记录1周,此为小鼠的学习过程。学习过程结束1周,撤去平台,测试小鼠的空间探索能力。
1.5脑组织ChAT和AchE活性的测定
每组取8只小鼠将其断头、取出大脑;迅速分离海马,在冰浴上剥离出皮层和海马组织。按所取组织的重量,加入预冷的磷酸钾缓冲液50mmol/L,冰浴制成组织匀浆,3500r/min离心10min;取上清液置于-20℃冰箱保存。按ChAT和AchE检测试剂盒的说明书测定小鼠脑组织中ChAT和AchE活性。
1.6统计学分析
所有数据用均数±标准差表示,采用SPSS 16.0软件进行分析,用t检验进行各组间的比较。
1.7结果与结论
以脑复康作为阳性对照,测定羽扇烯酮对实验小鼠空间探索能力的影响,其结果如表1所示。
表1 羽扇烯酮对实验小鼠空间探索能力的影响数据表(n=10)
*P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;△P<0.05,△△P<0.01,与对照组比较。
根据表1可知,与模型组相比,脑复康组、羽扇烯酮I组和羽扇烯酮II组均能缩短Aβ25-35所致老年痴呆模型小鼠的潜伏期、增加过台次数,且在第1象限逗留时间延长,显示羽扇烯酮对Aβ25-35所致老年痴呆模型小鼠的记忆及行为具有明显的改善效果。
测定上述实验小鼠脑组织中ChAT和AchE活性,结果如表2所示;
表2羽扇烯酮对痴呆小鼠脑组织中ChAT和AchE活性的影响数据表(n=8)
*P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;△△P<0.01,与对照组比较。
与模型组比较,脑复康组、羽扇烯酮I组和羽扇烯酮II组ChAT活性明显升高,AchE活性明显降低,显示羽扇烯酮可显著改善Aβ25-35所致老年痴呆模型小鼠胆碱能系统,从而改善老年痴呆的学习记忆功能。
实施例2
2、羽扇烯酮对D-半乳糖和AlCl3所致复合型老年痴呆大鼠的保护作用
2.1实验动物及试药
实验动物:老龄健康雄性Wistar大鼠,体重350-390g,共75只,购于扬州大学比较医学中心。试药:羽扇烯酮(纯度为91%),由江苏康缘药业股份有限公司提供;D-半乳糖、AlCl3购于国药集团化学试剂有限公司;SOD、MDA、CAT活性检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所;脑复康购于湖北华中药业有限公司。
2.2复合型老年痴呆动物模型的制备及给药
将实验Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、脑复康组、羽扇烯酮I组,羽扇烯酮II组,每组15只。模型组和给药组腹腔注射给予D-半乳糖60mg/kg(生理盐水配制)和灌胃给予AlCl3 5mg/kg(双蒸水配制);同时脑复康组、羽扇烯酮I组和羽扇烯酮II组分别灌胃给予脑复康250mg/kg、羽扇烯酮15mg/kg、45mg/kg(生理盐水配制);对照组给予同体积的生理盐水和双蒸水,均配成5ml/只/天,连续给药90d。
2.3Morris水迷宫训练及测试
自给药第83d开始按照实例1方法,进行实验大鼠的水迷宫训练,共7d。学习过程结束后1周,撤去平台,测试大鼠的空间探索能力。
2.4血清中SOD、MDA、CAT活性的测定
在完成水迷宫测试后,每组取10只大鼠,用水合氯醛麻醉后,快速开胸,于心脏采血,3500r/min离心10min后取血清,置-70℃低温保藏。按试剂盒说明书,采用紫外分光光度法测定各组实验大鼠血清中SOD、MDA、CAT的活性。
2.5脑组织Tau蛋白磷酸化水平检测
大鼠断头处死,取脑海马组织100mg,加入RIPA(每克组织约3ml)以及PMSF缓冲液(每克组织30μl),冰浴超声处理;4℃,12000rpm离心15min,上清液保存于-20℃备用。各组分别取20μL蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),待目的蛋白接近分离胶底部时停止电泳;取下凝胶,电泳胶置转移缓冲液中平衡20min。裁两张与胶同样大小的滤纸,置转移缓冲液中平衡,硝酸纤维素膜(NC膜)于缓冲液(PBS)中平衡20min。按滤纸(负极)-凝胶-NC膜-滤纸(正极)顺序放置于电泳仪中,5mA/cm2转膜50min,TBS洗膜5min,封闭液室温封闭3h,按各蛋白的分子量裁膜,分别加入封闭液稀释的抗体(actin1:1000,p-Tau(Thr231)1:500,p-Tau(Ser396)1:500,Tau-51:500),4℃孵育过夜;TBST洗膜5min×4次,分别加入二抗室温避光孵育40min,TBST洗膜5min×4次;用TBS洗去膜上残留的Tween-20,用Odyssey扫膜仪进行扫描分析。蛋白表达量以目的蛋白与内参β-actin的比值表示。
2.6统计学分析
所有数据用均数±标准差表示,其中Tau蛋白磷酸化水平以相对于空白对照组的倍数表示。采用SPSS 16.0软件进行分析,用t检验进行各组间的比较。
2.7结果与结论
以脑复康作为阳性对照,测定羽扇烯酮对实验大鼠空间探索能力的影响,其结果如表3所示,
表3 羽扇烯酮对实验大鼠空间探索能力的影响数据表(n=15)
*P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;△P<0.05,△△P<0.01,与对照组比较。
根据表3可知,与模型组相比,脑复康组、羽扇烯酮I组和羽扇烯酮II组均能缩短D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆模型大鼠的潜伏期、增加过台次数,且在第1象限逗留时间延长,显示羽扇烯酮对D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆模型大鼠的记忆及行为具有明显的改善效果。
测定上述实验大鼠血清中SOD、MDA、CAT活性,结果如表4所示,
表4 羽扇烯酮对实验大鼠血清中SOD、MDA、CAT活性的影响数据表(n=10)
*P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;△△P<0.01,与对照组比较。
根据表4可知,与模型组比较,脑复康组、羽扇烯酮I组和羽扇烯酮II组SOD活性、CAT含量均明显增高,MDA含量降低,显示羽扇烯酮可显著增强D-半乳糖和AlCl3所致老年痴呆模型大鼠的抗氧化能力,减轻对脑组织的损伤,保护脑细胞和组织。
检测实验大鼠脑组织中Tau蛋白磷酸化水平,结果如表5所示,
表5 羽扇烯酮对实验大鼠Tau蛋白磷酸化水平的影响数据表(n=10)
*P<0.05,**P<0.01,与模型组比较;△P<0.05,△△P<0.01,与对照组比较。
根据表5可知,对照组与模型组比较,p-Tau(Thr231)、p-Tau(Ser396)水平显著升高,均具有显著的统计学差异;与模型组比较,脑复康组、羽扇烯酮I组和羽扇烯酮II组的p-Tau(Thr231)、p-Tau(Ser396)表达水平均有下降,具有显著的统计学差异,说明羽扇烯酮改善了Tau蛋白的高度磷酸化水平。
综上所述,羽扇烯酮对老年痴呆症动物有明显的改善作用,可能是通过改善胆碱能系统,抗氧化以及减少Tau蛋白的异常磷酸化水平来发挥作用。由以上实验结果可以得出,羽扇烯酮具有治疗老年痴呆的作用。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.羽扇烯酮作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗老年痴呆药物上的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,羽扇烯酮的纯度为90%以上。
3.根据权利要求1所述的应用,所述羽扇烯酮的剂量为15mg/kg~60mg/kg。
4.根据权利要求1所述的应用,所述药物包括:羽扇烯酮与药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型为口服制剂、注射剂、栓剂或吸入剂。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
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