WO2014168020A1 - 試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法 - Google Patents

試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法 Download PDF

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WO2014168020A1
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exosome
sample analysis
analysis device
antibody
beads
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糸長　誠
柳生　慎悟
祐一 長谷川
辻田　公二
雅之 小野
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株式会社Ｊｖｃケンウッド
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    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings

Definitions

  • the present invention relates to a sample analysis device for analyzing exosomes secreted by various cells and a method for capturing exosomes.
  • Quantitative analysis of disease discovery, treatment effects, etc. is widely performed by detecting and analyzing a specific antigen (or antibody) associated with a disease as a biomarker.
  • a specific antigen or antibody
  • minute membrane vesicles called exosomes are expected as new biomarkers.
  • Exosomes are contained in blood, lymph, saliva, urine, breast milk, semen and the like. Exosomes are roughly spherical in liquid and are distributed around a diameter of about 100 nm. Exosomes are covered with a lipid bilayer, and various substances such as membrane proteins are present in the lipid bilayer. Exosomes are sometimes called microvesicles or extracellular vesicles, and there are multiple names.
  • Patent Document 1 describes that exosomes are detected and analyzed using an immunological measurement method (immunoassay method).
  • immunological assay method immunological assay method
  • exosomes can be detected by recognizing an antibody whose antigen is a membrane protein present in the lipid bilayer membrane of exosomes.
  • the number of membrane proteins is not constant among individuals of exosomes, the number of exosomes cannot be detected with high accuracy.
  • exosomes can be detected with high accuracy, exosomes can be quantitatively measured with high accuracy.
  • an object of the present invention is to provide a sample analysis device capable of detecting exosome with high accuracy and a method for capturing exosome.
  • a base part and an antibody that is formed on the base part and binds to an antigen present in the exosome to be detected are immobilized. And a recess for immobilizing the exosome by binding the exosome to the antibody.
  • the exosome is contained in an injection part having a recess in which an antibody that binds to an antigen present in the exosome to be detected is fixed.
  • a method for capturing an exosome comprising a step of injecting a sample solution, binding an antigen present in the exosome to the antibody fixed in the recess, and fixing the exosome in the recess. Is done.
  • exosomes can be detected with high accuracy.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a first embodiment of a sample analysis device.
  • FIG. 2 is a partially enlarged perspective view cut along AA of FIG.
  • FIG. 3 is an enlarged cross-sectional view showing the dimensional shape of the concavo-convex structure in the first to third embodiments of the sample analysis device.
  • FIG. 4 is a perspective view showing a second embodiment of the sample analysis device.
  • FIG. 5 is a partially enlarged perspective view cut along AA of FIG.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view of an exosome.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view showing beads for modifying exosomes.
  • FIG. 8 is a flowchart showing an embodiment of a method for capturing exosomes.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a first embodiment of a sample analysis device.
  • FIG. 2 is a partially enlarged perspective view cut along AA of FIG.
  • FIG. 3 is an enlarged cross-sectional view showing the dimensional shape of
  • FIG. 9 is a partially enlarged cross-sectional view for explaining the steps executed in one embodiment of the exosome capturing method.
  • FIG. 10 is a partially enlarged cross-sectional view schematically showing a state generated on the concavo-convex structure by a process executed in an embodiment of the exosome capturing method.
  • FIG. 11 is a plan view showing a third embodiment of the sample analysis device.
  • FIG. 12 is a partially enlarged cross-sectional view showing the concavo-convex structure in the third embodiment of the sample analysis device.
  • FIG. 13 is a partial cross-sectional view showing a third embodiment of the sample analysis device.
  • the sample analysis device 101 of the first embodiment is formed in a rectangular shape by, for example, a synthetic resin.
  • the external shape of the sample analysis device 101 is not limited to a rectangle and is arbitrary.
  • the sample analysis device 101 may be formed using glass, metal, a semiconductor substrate, or the like.
  • a plurality of wells 10 that are cylindrical recesses are formed. Although eight wells 10 are formed in FIG. 1, more wells 10 may be formed, and the number of wells 10 is arbitrary.
  • the well 10 is an injection part for injecting each liquid described later.
  • the cross-sectional shape when the well 10 is cut in a direction orthogonal to the thickness direction of the sample analysis device 101 is a perfect circle.
  • the cross-sectional shape of the well 10 may be an ellipse or a rectangle. However, the cross-sectional shape of the well 10 is preferably a perfect circle.
  • FIG. 2 shows an AA cross section of FIG. 1 in an enlarged manner.
  • the bottom surface of the well 10 is formed with a concavo-convex structure 20 in which a plurality of concave portions 20a and a plurality of convex portions 20b adjacent to the concave portions 20a are periodically arranged.
  • the sample analysis device 101 itself made of synthetic resin or the like is a base part for forming the concavo-convex structure 20.
  • the concave portion 20a and the convex portion 20b are formed in a substantially linear shape.
  • the side surfaces of the concave portion 20a and the convex portion 20b are inclined.
  • the concavo-convex structure 20 may be formed so that the side surfaces of the concave portion 20 a and the convex portion 20 b are substantially perpendicular to the surface of the sample analysis device 101.
  • the depth of the concave portion 20a (height of the convex portion 20b) is H
  • the width of each of the concave portion 20a and the convex portion 20b is H / 2 from the bottom surface indicated by the alternate long and short dashed line Wa and Wb in FIG.
  • the width Wa of the concave portion 20a and the width Wb of the convex portion 20b preferably satisfy the relationship of Wa> Wb.
  • sample analysis device 101 configured as described above is formed using a synthetic resin, it can be easily manufactured by integral molding.
  • the sample analysis device 102 includes a substrate 112 formed of, for example, a synthetic resin, and a sheet 122 formed of the synthetic resin and stacked on the substrate 112.
  • the sheet is, for example, a silicone polymer sheet.
  • the silicone polymer sheet 122 is referred to.
  • the sample analysis device 102 is also formed in a rectangular shape, but the outer shape is arbitrary.
  • the material of the sheet stacked on the substrate 112 is not limited to silicone polymer.
  • the material of the sheet may be a material cheaper than the silicone polymer, for example, a resin such as polystyrene, ABS, polycarbonate, or the like.
  • the sample analysis device 102 is formed with a plurality of wells 10 that are cylindrical recesses.
  • FIG. 5 shows an AA cross section of FIG. 4 in an enlarged manner.
  • a concavo-convex structure 20 in which a plurality of concave portions 20 a and convex portions 20 b are arranged is formed on the entire surface of the substrate 112.
  • the substrate 112 formed of synthetic resin or the like serves as a base portion for forming the concavo-convex structure 20.
  • the concavo-convex structure 20 is formed only on the bottom surface of the well 10, whereas in the sample analysis device 102 of the second embodiment, the entire surface of the substrate 112 is formed. An uneven structure 20 is formed.
  • the cylindrical through-hole 11 is formed in the silicone polymer sheet 122.
  • the well 10 is formed by superimposing the substrate 112 and the silicone polymer sheet 122 having the through hole 11.
  • the sample analysis device 102 has substantially the same configuration as the sample analysis device 101 in which the concavo-convex structure 20 is formed on the bottom surface of the well 10 in a state where the substrate 112 and the silicone polymer sheet 122 are overlapped.
  • the silicone polymer sheet 122 Since the silicone polymer sheet 122 is in close contact with the substrate 112, it is not necessary to bond the substrate 112 and the silicone polymer sheet 122. If the substrate 112 and the silicone polymer sheet 122 are not adhered, the silicone polymer sheet 122 can be peeled off as necessary in the exosome detection step described later. Of course, the substrate 112 and the silicone polymer sheet 122 may be bonded together.
  • the substrate 112 and the silicone polymer sheet 122 may be adhered to each other through a packing formed of silicone rubber or the like.
  • the packing may be a flat plate made of silicone rubber that is disposed at the same position as the through hole 11 and has a through hole having a diameter substantially equal to that of the through hole 11.
  • the packing may be an annular member provided in each through hole 11 and having a substantially square or substantially circular cross section.
  • the silicone polymer sheet 122 may be provided with an annular groove, the packing may be provided with an annular protrusion, and the protrusion may be fitted into the groove.
  • a plurality of packings may be provided on the joint surface of the silicone polymer sheet 122 with the substrate 112.
  • the diameter of the plurality of packings is substantially equal to the diameter of the through hole 11.
  • the plurality of packings are provided corresponding to each of the through holes 11.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view of an exosome.
  • the exosome shown in FIG. 6 be the exosome 50 to be detected.
  • the exosome 50 is covered with a lipid bilayer membrane 51.
  • a plurality of transmembrane membrane proteins 52 exist in the lipid bilayer membrane 51.
  • the number of membrane proteins 52 and the position in the lipid bilayer membrane 51 vary depending on the type of exosome.
  • Example 1 the average particle diameter E of the exosome 50 is 100 nm.
  • the width Wa of the concave portion 20a in the sample analysis device 101 is 240 nm
  • the width Wb of the convex portion 20b is 80 nm
  • the depth H of the concave portion 20a is 50 nm.
  • Example 2 the average particle diameter E of the exosome 50 is 70 nm.
  • the width Wa of the concave portion 20a is 260 nm
  • the width Wb of the convex portion 20b is 60 nm
  • the depth H of the concave portion 20a is 60 nm.
  • the average particle diameter E of the exosome 50 means an average value of values obtained by measuring the particle diameter of the exosome 50 by an arbitrary measurement method.
  • a measurement method for example, a wet measurement method in which the exosome 50 is observed in a solution state using a nano particle tracking method, or a dry measurement in which the exosome 50 is observed with a transmission electron microscope being maintained. There is a way.
  • the sample containing the exosome 50 is treated according to a technique for observing cells.
  • the sample is fixed on a substrate, and ethanol impregnation is repeated over several steps from low concentration ethanol to 100% purity ethanol with increasing ethanol concentration for each step. Thereby, the water in the sample is replaced with ethanol and dehydrated.
  • the sample is impregnated with a solution containing a synthetic resin soluble in ethanol, thereby replacing the ethanol with the synthetic resin. Then, the sample substituted with the synthetic resin is sliced and observed.
  • beads 70 shown in FIG. 7A are used to detect the exosome 50 as described later.
  • the diameter D of the beads 70 is 200 nm.
  • the beads 70 are formed in a substantially spherical shape with, for example, a synthetic resin.
  • FIG. 8 shows each step of the procedure for capturing the exosome 50 by the sample analysis device 101.
  • the operator who performs the sample analysis dispenses the buffer solution F60 containing an appropriate amount of the antibody 60 into the well 10 in step S1, as shown in FIG. CD63, CD9, and the like, which are transmembrane membrane proteins, are known as antigens for identifying exosomes.
  • an antibody that reacts with the membrane protein 52 as an antigen is used.
  • the antigen is not limited to the membrane protein 52 and may be other substances present on the surface of the lipid bilayer membrane 51.
  • step S1 the operator shakes the sample analysis device 101 in the state shown in FIG. 9A with the shaker for an appropriate time.
  • the antibody 60 is fixed to the surface of the concavo-convex structure 20 by the process of step S1.
  • Step S1 is an antibody fixing step.
  • step S2 the operator discharges the buffer solution F60 containing the antibody and cleans the well 10 with the buffer solution.
  • FIG. 10A schematically shows the state of the surface of the concavo-convex structure 20 after step S2.
  • the antibody 60 is fixed to the surface of the concavo-convex structure 20 by a hydrophobic bond.
  • the method for fixing the antibody 60 to the surface of the concavo-convex structure 20 is not limited to hydrophobic bonding.
  • the surface of the concavo-convex structure 20 may be appropriately chemically modified, and the antibody 60 may be fixed to the surface of the concavo-convex structure 20 using a covalent bond or the like.
  • a method for immobilizing the antibody 60 on the surface of the concavo-convex structure 20 a method generally used in an immunological assay may be used.
  • the operator performs a blocking process on the surface of the concavo-convex structure 20 in step S3. Specifically, the operator dispenses skim milk diluted with a buffer solution into the well 10 and shakes the sample analysis device 101 for a predetermined time as in step S1.
  • Skimmed milk contains a protein that does not adhere to the exosome 50 and is therefore suitable for blocking treatment.
  • the substance used for the blocking treatment is not limited to skim milk as long as the same effect is obtained.
  • step S4 the operator discharges the buffer solution containing skim milk and cleans the well 10 with the buffer solution.
  • the buffer solution used for washing may or may not include skim milk. It is also possible to omit the cleaning.
  • a block layer 65 is formed on the surface of the concavo-convex structure 20 by steps S3 and S4.
  • step S5 the operator dispenses the sample solution F50 containing the exosome 50 to be detected into the well 10 as shown in FIG. 9B, and the sample analysis device as in step S1. 101 is shaken for an appropriate time. In step S5, for example, the sample analysis device 101 is shaken for about 2 hours.
  • step S5 most of the exosome 50 contained in the sample solution F50 is fixed to the recess 20a of the concavo-convex structure 20 by an antigen-antibody reaction between the antibody 60 and the membrane protein 52.
  • Step S5 is an exosome fixing step.
  • step S6 the operator discharges the sample solution F50 and cleans the well 10 with the buffer solution.
  • exosomes 50 attached to the surface of the concavo-convex structure 20 can be eliminated by non-specific adsorption rather than antigen-antibody reaction.
  • FIG. 10 shows a state in which one exosome 50 is fixed in the recess 20a.
  • the exosome 50 shown in (c) of FIG. 10 schematically shows the exosome 50 shown in FIG. 6 in a simplified manner.
  • the exosome 50 has two types of membrane proteins 52 schematically indicated by a white ellipse and a hatched ellipse.
  • the antibody 60 and the membrane protein 52 indicated by hatching ellipses are bound by the antigen-antibody reaction, and the exosome 50 is fixed in the recess 20a.
  • the type of membrane protein 52 is not limited to two. As described above, substances other than membrane proteins may be used as antigens. When the exosome 50 is recognized and captured using two types of monoclonal antibodies, one or two types of membrane proteins 52 may be recognized.
  • the antibody 80 is immobilized on the surface of the bead 70 in advance.
  • the step of fixing the antibody 80 as shown in FIG. 7B to the bead 70 shown in FIG. 7A to which the antibody 80 is not fixed is a step different from the series of steps of FIG. Just do it.
  • step S7 as shown in FIG. 9C, the operator dispenses the buffer solution F70 including the beads 70 with the antibody 80 immobilized on the surface into the well 10, and performs sample analysis in the same manner as in step S1.
  • the device 101 is shaken for an appropriate time.
  • step S7 the exosome 50 is modified with the beads 70 as shown in FIG.
  • the bead 70 can be used as a label for the exosome 50.
  • Step S7 is a modification step of modifying the exosome 50 with the beads 70.
  • step S8 the operator discharges the buffer solution F70 and cleans the well 10 with the buffer solution.
  • the exosome 50 can be captured by the sample analysis device 101 and the exosome 50 can be modified with the beads 70.
  • an antibody 80 different from the antibody 60 fixed to the surface of the concavo-convex structure 20 is fixed to the bead 70.
  • the antibody 80 and the membrane protein 52 indicated by a white ellipse are bound by an antigen-antibody reaction, and the beads 70 are fixed to the exosome 50.
  • the antibody immobilized on the surface of the uneven structure 20 is different from the antibody immobilized on the surface of the bead 70, exosomes having two different antigens can be detected.
  • the same antibody 60 as the antibody 60 fixed to the surface of the uneven structure 20 may be fixed to the bead 70. Whether to use the same antibody or a different antibody may be appropriately selected depending on the convenience of analyzing the sample.
  • the exosome 50 is captured by the concave portion 20a of the concavo-convex structure 20, and then the bead 70 is introduced to fix the bead 70 to the exosome 50.
  • the exosome 50 and the bead 70 are simultaneously contained in the buffer solution. It may be a procedure of making it react with. In this case, the exosome 50 and the beads 70 are immobilized in the liquid, so that the reaction rate is accelerated.
  • a magnetic substance such as ferrite may be included in the bead 70. If the beads 70 include a magnetic substance, the beads 70 can be quickly collected by placing a magnet on the lower surface of the sample analysis device 101 in step S7. Further, the beads 70 can be effectively directed toward the recess 20a by the magnetic force. Therefore, the time required for step S7 can be shortened.
  • the shaking time for fixing the exosome 50 on the concavo-convex structure 20 can be shortened to about several minutes.
  • the magnet disposed on the lower surface of the sample analysis device 101 is an electromagnet, the power is turned off. If the magnet is a permanent magnet, the buffer solution F70 is re-stirred away from the sample analysis device 101. . As a result, it is possible to remove the immobilized beads 70 from the concavo-convex structure 20 regardless of the antigen-antibody reaction, and then pull the beads 70 again by magnetic force to increase the reaction yield.
  • beads 70 containing a magnetic substance it is possible to stir by changing the direction and intensity of magnetic force in addition to stirring by shaking.
  • the sample solution F50 containing the exosome 50 and the buffer solution F70 containing the beads 70 are separately dispensed into the well 10, but the sample containing the exosome 50 and the beads 70 are simultaneously put in the buffer solution and added to the well. 10 and the steps S5 and S7 may be performed simultaneously. Even in this case, beads 70 including a magnetic substance can be used.
  • the average particle diameter E of the exosome 50, the diameter D of the beads 70, the width Wa and the convexity of the recess 20a of the concavo-convex structure 20 are provided.
  • the width Wb of the portion 20b and the depth H of the recess 20a are preferably in the relationship shown below.
  • the width Wa of the recess 20 a is preferably larger than the average particle diameter E of the exosome 50 and smaller than twice the diameter D of the bead 70. That is, it is preferable that the sample analysis devices 101 and 102 have the relationship of the formula (1). E ⁇ Wa ⁇ 2D (1)
  • E ⁇ Wa of Formula (1) If E ⁇ Wa of Formula (1) is satisfied, the exosome 50 can be fixed to the recess 20a. If Wa ⁇ 2D in Expression (1) is satisfied, it becomes difficult for two beads 70 to enter the width direction of the recess 20a at the same time, and the quantity relationship between the exosome 50 and the beads 70 approaches one to one.
  • the exosome 50 trapped in the recess 20a is deformed from a spherical shape in a direction of expanding the contact area, as shown in FIG. 10 (c). As described above, when the beads 70 including the magnetic substance are used, the deformation of the exosome 50 is promoted by the magnetic force.
  • the diameter of the contact portion with the recess 20a which is the long axis of the spheroid, increases by about 40%.
  • the diameter of the contact portion may increase by 50% or more, sometimes 100% or more of the original spherical shape. It can be.
  • the average particle diameter E of the exosome 50 and the diameter D of the beads 70 preferably satisfy the formula (5).
  • the depth H of the recess 20a preferably satisfies the formula (6). (D + E) / 8 ⁇ H (6)
  • the exosome 50 is almost certainly fixed to the recess 20a to prevent non-specific adsorption of the bead 70 to the protrusion 20b, and the bead 70 is almost certainly attached to the exosome 50 present in the recess 20a. Fixed.
  • the depth H of the recess 20a satisfies the formula (7). (D + E) / 6 ⁇ H (7)
  • Example 1 satisfies Expressions (1) to (6)
  • Example 2 satisfies Expressions (1) to (7).
  • the quantity relationship between the exosome 50 and the beads 70 fixed to the recess 20a can be made almost 1: 1. There are a few cases where two or three beads 70 are bound to one exosome 50, but it hardly affects the quantitative detection of the exosome 50.
  • the sample analysis device may have a circular disk shape in addition to the rectangular shape shown in FIGS. 1 and 4 as the sample analysis devices 101 and 102. Even in this case, the reaction using the immunological measurement method described above can be similarly performed.
  • the sample analysis device has a circular disk shape
  • the concave portion 20a and the convex portion 20b of the concavo-convex structure 20 may be spiral or concentric.
  • the disk-like shape can be utilized.
  • a disk-shaped sample analysis device provided with a structure of a liquid feeding path will be described as a sample analysis device of the third embodiment with reference to FIGS.
  • the same reference numerals are given to substantially the same substances and the same parts as those in the first and second embodiments.
  • a sample analysis device 103 according to the third embodiment is formed in a disk shape having the same diameter as an optical disk such as a Blu-ray disc, a DVD, or a compact disc.
  • the sample analysis device 103 is a sample analysis disk.
  • FIG. 11 is a plan view of the sample analysis device 103 as viewed from the transparent protective layer 36 side.
  • the sample analysis device 103 can be formed of a synthetic resin such as polycarbonate, like the optical disk.
  • a circular opening 103 a is formed at the center of the sample analysis device 103.
  • an injection hole 31 for dropping a sample containing the exosome 50 to be detected is formed so as to surround the opening 103a.
  • a flow path 32 for flowing a sample is connected to each injection hole 31.
  • the plurality of flow paths 32 extend radially from the injection hole 31 toward the outer peripheral end of the sample analysis device 103.
  • a bead filling portion 33 for filling the beads 70 is provided at an intermediate portion of the flow path 32.
  • a detection area 34 that extends in a fan shape is provided.
  • the flow path 32 is connected to the detection region 34.
  • a concavo-convex structure 20 including a spiral or concentric concave portion 20a and a convex portion 20b is formed at the outer peripheral end of the sample analysis device 103.
  • the detection region 34 is provided in the concavo-convex structure 20.
  • a pit structure 20P in which a plurality of concave pits 20c are arranged spirally or concentrically as shown in FIG. Since the portion where the pit 20c is not provided is a convex portion with respect to the pit 20c, the pit structure 20P is also an uneven structure.
  • a disk portion formed of a synthetic resin or the like on the side opposite to the transparent protective layer 36 is a base portion for forming the uneven structure 20 (including the pit structure 20P).
  • a portion other than the detection region 34 of the concavo-convex structure 20 is a track region 35.
  • the address information may be provided by pits or embosses, and the address information may be represented by wobbling on the side surface of the concave portion 20a or the convex portion 20b.
  • FIG. 13 is a partial cross-sectional view of the sample analysis device 103.
  • the antibody 80 is fixed to the beads 70 filled in the bead filling portion 33 in advance, as in FIG. 7B.
  • a reflective layer that reflects the laser beam is provided adjacent to the concavo-convex structure 20, but is not shown in FIGS.
  • the buffer solution F60 containing the antibody 60 is injected from the injection hole 31 and the sample analysis device 103 is rotated, the antibody 60 is fixed to the surface of the concavo-convex structure 20 as in FIG. What is necessary is just to perform the blocking process on the surface of the uneven structure 20 as needed.
  • the exosome 50 is modified with the beads 70 when passing through the bead filling portion 33.
  • the exosome 50 modified with the beads 70 is fixed to the recess 20a as in FIG. 10 (d). In FIG. 13, for convenience of illustration, the exosome 50 is not shown and only the beads 70 are shown.
  • the detection region 34 is irradiated with laser light emitted from a laser light source of an optical pickup (not shown) and condensed by the objective lens 40 through the transparent protective layer 36.
  • the beads 70 fixed to the recess 20a can be detected by analyzing the reflected light of the irradiated laser light.
  • the relationship between the dimensional shape of the concavo-convex structure 20 in the sample analysis device 103 of the third embodiment and the size of the exosome 50 to be detected and the bead 70 used as a label is the same as in the first and second embodiments. is there.
  • the first detection method it is possible to detect the beads 70 using an optical microscope and to count the beads 70 by image processing. As a result, the exosome 50 is detected quantitatively.
  • the first detection method is suitable for detecting the exosome 50 captured by the sample analysis devices 101 and 102 of the first and second embodiments.
  • the accuracy of measurement can be increased by moving the stage on which the sample analysis devices 101 and 102 are mounted and counting the beads 70 in a large area. It is also possible to use a laser microscope instead of an optical microscope to increase the detection resolution and improve the S / N.
  • the beads 70 can be counted by detecting the fluorescence by including a fluorescent material that emits fluorescence when the beads 70 are irradiated with light of a specific wavelength.
  • the beads 70 that emit fluorescence may be measured using an optical microscope, or the total amount of fluorescence may be detected by an optical sensor.
  • the second detection method is suitable for detecting the exosome 50 captured by the sample analysis devices 101 and 102 of the first and second embodiments.
  • the detection apparatus and the sample analysis devices 101 and 102 Can prevent mechanical interference. It is also possible to make the shape of the well 10 avoid the interference of the microscope objective lens or the like.
  • the silicone polymer sheet 122 can be peeled off. If the bead 70 is detected only by the substrate 112 by removing the silicone polymer sheet 122, mechanical interference with the detection device can be avoided.
  • the beads 70 can be detected and counted using a secondary antibody labeled with an enzyme that specifically binds to the antibodies 80 fixed to the beads 70.
  • Typical secondary antibodies are horseradish peroxidase (HRP) labeled antibody and alkaline phosphatase (AP) labeled antibody.
  • the beads 70 can be counted by modifying the beads 70 fixed to the exosome 50 with a secondary antibody and detecting the amount of chemiluminescence generated by adding a luminescent substrate.
  • the sample analysis device 103 is scanned with the laser light emitted from the laser light source of the optical pickup, whereby the beads 70 can be counted.
  • the concave portion 20a of the concavo-convex structure 20 as a track and scanning a laser beam spot along the track using a servo mechanism, the beads 70 can be counted at high speed and with high accuracy.
  • the exosome 50 can be quantitatively measured with high accuracy by counting the beads 70 immobilized as a label on the exosome 50, and the sample can be analyzed.
  • the present invention can be used to detect exosomes contained in blood, lymph, saliva, urine, breast milk, semen and the like.

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Abstract

　合成樹脂等よりなるベース部には、凹部（２０ａ）と凸部（２０ｂ）とが周期的に配列された凹凸構造（２０）が形成されている。凹部（２０ａ）は、検出対象のエクソソーム（５０）に存在する抗原（５２）と結合する抗体（６０）を固定させ、抗体（６０）にエクソソーム（５０）を結合させる。これによって、エクソソーム（５０）は、凹部（２０ａ）に固定される。

Description

試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法
　本発明は、各種の細胞が分泌するエクソソームを分析するための試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法に関する。
　疾病と関連付けられている特定の抗原（または抗体）をバイオマーカとして検出して分析することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析することが広く行われている。近年、エクソソーム（exosome）と称されている微小な膜小胞が新たなバイオマーカとして期待されている。
　エクソソームは、血液，リンパ液，唾液，尿，母乳，精液等に含まれている。エクソソームは液体中では概略球形であり、直径１００ｎｍ程度を中心として分布している。エクソソームは、脂質二重膜で覆われており、脂質二重膜には、様々な物質、例えば膜たんぱく質が存在している。なお、エクソソームは、マイクロベシクル、細胞外小胞と称されることもあり、複数の呼称が存在している。
国際公開第２００９／０９２３８６号 国際公開第２００６／０１６６１７号
　特許文献１には、免疫学的測定法（イムノアッセイ法）を用いてエクソソームを検出して分析することが記載されている。特許文献１に記載されている免疫学的測定法を用いると、エクソソームの脂質二重膜に存在する膜たんぱく質を抗原とする抗体を認識することによってエクソソームを検出することができる。しかしながら、膜たんぱく質の数はエクソソームの個体で一定ではないため、エクソソームの数を精度よく検出することができない。
　そこで、エクソソームを高精度に検出することができる試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法が求められている。エクソソームを高精度に検出することができれば、エクソソームを高精度に定量的に測定することが可能となる。
　本発明はこのような要望に対応するため、エクソソームを高精度に検出することができる試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法を提供することを目的とする。
　本発明の第１の態様によれば、上述した従来の技術の課題を解決するため、ベース部と、前記ベース部上に形成され、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体を固定させ、前記抗体に前記エクソソームを結合させることによって前記エクソソームを固定させる凹部とを備えることを特徴とする試料分析用デバイスが提供される。
　本発明の第２の態様によれば、上述した従来の技術の課題を解決するため、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体が固定された凹部を有する注入部内に、前記エクソソームを含む試料液を注入して、前記凹部に固定された抗体に前記エクソソームに存在する抗原を結合させて、前記凹部に前記エクソソームを固定させるエクソソーム固定工程を含むことを特徴とするエクソソームの捕捉方法が提供される。
　本発明の試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法によれば、エクソソームを高精度に検出することが可能となる。
図１は、試料分析用デバイスの第１実施形態を示す斜視図である。 図２は、図１のＡ－Ａで切断した部分拡大斜視図である。 図３は、試料分析用デバイスの第１～第３実施形態における凹凸構造の寸法的形状を示す拡大断面図である。 図４は、試料分析用デバイスの第２実施形態を示す斜視図である。 図５は、図４のＡ－Ａで切断した部分拡大斜視図である。 図６は、エクソソームの模式的な断面図である。 図７は、エクソソームを修飾するためのビーズを示す断面図である。 図８は、エクソソームの捕捉方法の一実施形態を示すフローチャートである。 図９は、エクソソームの捕捉方法の一実施形態で実行される工程を説明するための部分拡大断面図である。 図１０は、エクソソームの捕捉方法の一実施形態で実行される工程によって凹凸構造上に生じている状態を模式的に示す部分拡大断面図である。 図１１は、試料分析用デバイスの第３実施形態を示す平面図である。 図１２は、試料分析用デバイスの第３実施形態における凹凸構造を示す部分拡大断面図である。 図１３は、試料分析用デバイスの第３実施形態を示す部分断面図である。
　以下、各実施形態の試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法について、添付図面を参照して説明する。
＜第１実施形態の試料分析用デバイス＞
　図１～図３を用いて、第１実施形態の試料分析用デバイスの構成について説明する。図１において、第１実施形態の試料分析用デバイス１０１は、例えば合成樹脂によって矩形状に形成されている。試料分析用デバイス１０１の外形形状は矩形に限定されず任意である。
　試料分析用デバイス１０１を、ガラス，金属，半導体基板等を用いて形成してもよい。
　試料分析用デバイス１０１には、円筒状の凹部であるウェル１０が複数個形成されている。図１では、ウェル１０を８個形成しているが、さらに多くのウェル１０を形成してもよく、ウェル１０の個数は任意である。ウェル１０は、後述する各液を注入する注入部である。
　ウェル１０を試料分析用デバイス１０１の厚さ方向に直交する方向に切断したときの断面形状を真円としている。ウェル１０の断面形状を、楕円または矩形としてもよい。但し、ウェル１０の断面形状を真円とすることが好ましい。
　図２は、図１のＡ－Ａ断面を拡大して示している。図２に示すように、ウェル１０の底面には、凹部２０ａと、凹部２０ａに隣接する凸部２０ｂとを周期的に複数配列させた凹凸構造２０が形成されている。試料分析用デバイス１０１では、合成樹脂等で形成される試料分析用デバイス１０１自体が、凹凸構造２０を形成するベース部となっている。
　凹部２０ａ及び凸部２０ｂは、略直線状に形成されている。凹部２０ａ及び凸部２０ｂそれぞれの側面は傾斜している。凹部２０ａ及び凸部２０ｂそれぞれの側面を、試料分析用デバイス１０１の面に対して略垂直となるように凹凸構造２０を形成してもよい。
　図３の拡大断面図に示すように、凹部２０ａの深さ（凸部２０ｂの高さ）をＨとし、凹部２０ａ及び凸部２０ｂそれぞれの幅を一点鎖線にて示す底面からＨ／２の位置でのＷａ，Ｗｂとする。凹部２０ａの幅Ｗａと凸部２０ｂの幅Ｗｂとは、Ｗａ＞Ｗｂの関係を満たすことが好ましい。
　以上のように構成される試料分析用デバイス１０１は、合成樹脂を用いて形成する場合には、一体成形によって容易に作製することができる。
＜第２実施形態の試料分析用デバイス＞
　図４，図５を用いて、第２実施形態の試料分析用デバイスの構成について説明する。図４，図５において、図１～図３と実質的に同一部分には同一符号を付し、その説明を適宜省略する。
　図４において、第２実施形態の試料分析用デバイス１０２は、例えば合成樹脂によって形成された基板１１２と、合成樹脂によって形成され、基板１１２に重ねられたシート１２２とを有する。シートは、例えばシリコーンポリマーシートである。以下、シリコーンポリマーシート１２２と称する。試料分析用デバイス１０２も矩形状に形成されているが、外形形状は任意である。
　基板１１２に重ねるシートの材料はシリコーンポリマーに限定されない。シートの材料は、シリコーンポリマーより安価な材料、例えばポリスチレン、ＡＢＳ、ポリカーボネート等の樹脂であってもよい。
　試料分析用デバイス１０２には、試料分析用デバイス１０１と同様、円筒状の凹部であるウェル１０が複数個形成されている。
　図５は、図４のＡ－Ａ断面を拡大して示している。図５に示すように、基板１１２の表面全体には、凹部２０ａと凸部２０ｂとを複数配列させた凹凸構造２０が形成されている。試料分析用デバイス１０２では、合成樹脂等で形成される基板１１２が、凹凸構造２０を形成するベース部となっている。
　第１実施形態の試料分析用デバイス１０１においては、ウェル１０の底面のみに凹凸構造２０が形成されているのに対し、第２実施形態の試料分析用デバイス１０２においては、基板１１２の表面全体に凹凸構造２０が形成されている。
　試料分析用デバイス１０２においては、シリコーンポリマーシート１２２に円筒状の貫通孔１１が形成されている。基板１１２と貫通孔１１を有するシリコーンポリマーシート１２２とを重ね合わせることによって、ウェル１０が形成されている。試料分析用デバイス１０２は、基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを重ね合わせた状態で、ウェル１０の底面に凹凸構造２０が形成されている試料分析用デバイス１０１と実質的に同一の構成となる。
　シリコーンポリマーシート１２２は基板１１２に対して密着するので、基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを接着する必要はない。基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを接着させなければ、後述するエクソソームの検出工程において、必要に応じてシリコーンポリマーシート１２２を剥がすことができる。勿論、基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを接着させてもよい。
　基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを、シリコーンゴム等で形成されたパッキングを介して密着させてもよい。例えば、パッキングは、貫通孔１１と同じ位置に配置された、貫通孔１１と略等しい直径で貫通孔が形成されたシリコーンゴムよりなる平板でよい。
　パッキングは、貫通孔１１ごとに設けられた、断面が略四角または略円形の環状の部材であってもよい。
　シリコーンポリマーシート１２２に環状の突起を設け、パッキングに環状の溝を設けて、突起を溝に嵌め込んでもよい。シリコーンポリマーシート１２２に環状の溝を設け、パッキングに環状の突起を設けて、突起を溝に嵌め込んでもよい。
　シリコーンポリマーシート１２２における基板１１２との接合面に、複数のパッキングを設けてもよい。複数のパッキングの直径は貫通孔１１の直径と略等しい。複数のパッキングは、貫通孔１１それぞれに対応して設けられる。
＜一実施形態のエクソソームの捕捉方法＞
　第１実施形態の試料分析用デバイス１０１または第２実施形態の試料分析用デバイス１０２を用いた一実施形態のエクソソームの捕捉方法について説明する。ここでは、試料分析用デバイス１０１を用いる場合について説明する。
　図６は、エクソソームの模式的な断面図である。図６に示すエクソソームを検出対象のエクソソーム５０とする。図６に示すように、エクソソーム５０は脂質二重膜５１で覆われている。脂質二重膜５１には、複数の膜貫通型の膜たんぱく質５２が存在している。膜たんぱく質５２の個数や脂質二重膜５１における位置は、エクソソームの種類によって異なる。
　実施例１では、エクソソーム５０の平均粒径Ｅを１００ｎｍとする。実施例１では、試料分析用デバイス１０１における凹部２０ａの幅Ｗａを２４０ｎｍ、凸部２０ｂの幅Ｗｂを８０ｎｍ、凹部２０ａの深さＨを５０ｎｍとする。
　実施例２では、エクソソーム５０の平均粒径Ｅを７０ｎｍとする。実施例２では、凹部２０ａの幅Ｗａを２６０ｎｍ、凸部２０ｂの幅Ｗｂを６０ｎｍ、凹部２０ａの深さＨを６０ｎｍとする。
　ところで、エクソソーム５０の平均粒径Ｅとは、エクソソーム５０の粒径を任意の測定方法で測定した値の平均値を意味する。測定方法としては、例えば、ナノ粒子トラキング法を用いた、エクソソーム５０が溶液中にある状態で観測する湿式の測定方法や、透過型電子顕微鏡でエクソソーム５０の形態を保ったまま観測する乾式の測定方法がある。
　後者の測定方法では、エクソソーム５０の形態を保ったまま乾式で観測可能とするために、エクソソーム５０を含む試料に対して細胞を観測する手法に準じた処理を施す。
　具体的には、試料を基体上に固定し、低濃度のエタノールから純度１００％のエタノールまで、ステップごとにエタノールの濃度を高くして数ステップをかけてエタノールの含浸を繰り返す。これによって、試料中の水分がエタノールへと置換されて脱水される。
　次に、試料を、エタノールに可溶な合成樹脂を含む溶液で含浸することによって、エタノールを合成樹脂に置換する。そして、合成樹脂に置換された試料を薄片化して観測する。
　また、エクソソーム５０を含む試料を急速冷凍することにより、エクソソーム５０の形態を保ったまま脱水して観測可能とすることもできる。
　本実施形態のエクソソームの捕捉方法、及び、捕捉したエクソソーム５０を検出する試料分析方法では、後述するように、エクソソーム５０を検出するために図７の（ａ）に示すビーズ７０を用いる。実施例１及び実施例２では、ビーズ７０の直径Ｄを２００ｎｍとする。ビーズ７０は、例えば合成樹脂によって略球形に形成されている。
　図８は、エクソソーム５０を試料分析用デバイス１０１によって捕捉するための手順の各工程を示している。図８において、試料分析を行うオペレータは、ステップＳ１にて、図９の（ａ）に示すように、抗体６０を適量含む緩衝溶液Ｆ６０をウェル１０に分注する。膜貫通型の膜たんぱく質であるＣＤ６３やＣＤ９等は、エクソソームを識別するための抗原として知られている。
　ステップＳ１にて用いる抗体６０としては、抗原である膜たんぱく質５２と反応する抗体を用いる。なお、抗原は膜タンパク質５２に限定されず、脂質二重膜５１の表面に存在する、その他の物質であってもよい。
　オペレータは、ステップＳ１にて、図９の（ａ）に示す状態の試料分析用デバイス１０１を振盪機によって、適切な時間、振盪させる。ステップＳ１の処理によって、凹凸構造２０の表面に抗体６０が固定される。ステップＳ１は、抗体固定工程である。
　オペレータは、ステップＳ２にて、抗体を含む緩衝溶液Ｆ６０を排出して、ウェル１０を緩衝溶液で洗浄する。
　図１０の（ａ）は、ステップＳ２の後の凹凸構造２０の表面の状態を模式的に示している。抗体６０は、凹凸構造２０の表面に疎水結合によって固着する。抗体６０を凹凸構造２０の表面に固定する方法は、疎水結合に限定されない。凹凸構造２０の表面を適切に化学的に修飾して、共有結合等を用いて抗体６０を凹凸構造２０の表面に固定させてもよい。凹凸構造２０の表面に抗体６０を固定させる方法は、免疫学測定法で一般的に使われている方法を用いればよい。
　抗体６０の抗原認識部以外に抗原が非特異的に吸着することを防ぐため、オペレータは、ステップＳ３にて、凹凸構造２０の表面をブロッキング処理する。具体的には、オペレータは、緩衝溶液で希釈したスキムミルクをウェル１０に分注し、ステップＳ１と同様に、試料分析用デバイス１０１を所定の時間、振盪させる。
　スキムミルクはエクソソーム５０に付着しないたんぱく質を含むので、ブロッキング処理に好適である。同様の効果を奏するものであれば、ブロッキング処理に用いる物質はスキムミルクに限定されない。
　オペレータは、ステップＳ４にて、スキムミルクを含む緩衝溶液を排出し、ウェル１０を緩衝溶液で洗浄する。洗浄に用いる緩衝溶液としては、スキムミルクを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。また、洗浄を省略することも可能である。図１０の（ｂ）に模式的に示すように、凹凸構造２０の表面には、ステップＳ３，Ｓ４によってブロック層６５が形成されている。
　次に、オペレータは、ステップＳ５にて、図９の（ｂ）に示すように、検出対象のエクソソーム５０を含む試料液Ｆ５０をウェル１０に分注し、ステップＳ１と同様に、試料分析用デバイス１０１を、適切な時間、振盪させる。ステップＳ５では、例えば２時間程度、試料分析用デバイス１０１を振盪させる。
　ステップＳ５によって、試料液Ｆ５０に含まれるエクソソーム５０の多くは、抗体６０と膜たんぱく質５２との抗原抗体反応によって、凹凸構造２０の凹部２０ａに固定される。ステップＳ５は、エクソソーム固定工程である。
　ステップＳ５の後、オペレータは、ステップＳ６にて、試料液Ｆ５０を排出し、ウェル１０を緩衝溶液で洗浄する。ウェル１０を緩衝溶液で洗浄することによって、抗原抗体反応ではなく、非特異な吸着によって凹凸構造２０の表面に付着したエクソソーム５０を排除することができる。
　図１０の（ｃ）は、凹部２０ａに１つのエクソソーム５０が固定された状態を示している。図１０の（ｃ）に示すエクソソーム５０は、図６に示すエクソソーム５０を簡略化して模式的に示している。図１０の（ｃ）に示す例では、エクソソーム５０は、白抜きの楕円とハッチングを付した楕円とで模式的に示す２種類の膜たんぱく質５２を有する。
　図１０の（ｃ）に示すように、抗体６０とハッチングを付した楕円で示す膜たんぱく質５２とが抗原抗体反応によって結合し、エクソソーム５０が凹部２０ａに固定されている。なお、膜たんぱく質５２の種類は２種類に限定されない。上記のように、膜タンパク質以外の物質を抗原としてもよい。２種類のモノクローナル抗体を用いてエクソソーム５０を認識し捕捉する場合は、１または２種類の膜たんぱく質５２を認識すればよい。
　図７の（ｂ）に示すように、ビーズ７０には予め表面に抗体８０が固定されている。抗体８０が固定されていない図７の（ａ）に示すビーズ７０に対して、図７の（ｂ）に示すように抗体８０を固定させる工程は、図８の一連の工程とは別工程で行えばよい。
　オペレータは、ステップＳ７にて、図９の（ｃ）に示すように、表面に抗体８０が固定されたビーズ７０を含む緩衝溶液Ｆ７０をウェル１０に分注し、ステップＳ１と同様に、試料分析用デバイス１０１を、適切な時間、振盪させる。
　ステップＳ７によって、図１０の（ｄ）に示すように、エクソソーム５０はビーズ７０で修飾される。エクソソーム５０をビーズ７０で修飾することによって、ビーズ７０をエクソソーム５０の標識とすることができる。ステップＳ７は、エクソソーム５０をビーズ７０で修飾する修飾工程である。
　オペレータは、ステップＳ８にて、緩衝溶液Ｆ７０を排出し、ウェル１０を緩衝溶液で洗浄する。以上によって、試料分析用デバイス１０１によってエクソソーム５０を捕捉し、エクソソーム５０をビーズ７０で修飾することができる。
　本実施形態では、ビーズ７０には、凹凸構造２０の表面に固定した抗体６０とは異なる抗体８０が固定されている。抗体８０と白の楕円で示す膜たんぱく質５２とが抗原抗体反応によって結合し、ビーズ７０がエクソソーム５０に固定されている。
　凹凸構造２０の表面に固定させる抗体とビーズ７０の表面に固定させる抗体とを異ならせると、２種類の異なる抗原を有するエクソソームを検出することができる。勿論、ビーズ７０に、凹凸構造２０の表面に固定した抗体６０と同じ抗体６０を固定させてもよい。同じ抗体を用いるか異なる抗体を用いるかは、試料を分析する都合によって適宜選択すればよい。
　上記の説明では、まずエクソソーム５０を凹凸構造２０の凹部２０ａによって捕捉し、次いで、ビーズ７０を投入して、ビーズ７０をエクソソーム５０に固定させたが、エクソソーム５０とビーズ７０とを同時に緩衝溶液中に投じて反応させる手順であってもよい。この場合、液中でエクソソーム５０とビーズ７０の固定反応が生じるため反応速度が促進されるというメリットが生じる。
　ビーズ７０の内部に、フェライト等の磁性物質を包含させてもよい。磁性物質を包含したビーズ７０とすると、ステップＳ７で、試料分析用デバイス１０１の下面に磁石を配置することによってビーズ７０を迅速に集めることができる。また、磁力によってビーズ７０を効果的に凹部２０ａに向かわせることができる。よって、ステップＳ７に要する時間を短縮することが可能となる。
　さらに、この場合も、前述のようにエクソソーム５０とビーズ７０とを同時に投入することで、さらなる反応の促進を図ることが可能となる。この場合、エクソソーム５０を凹凸構造２０上に固定するための振盪時間を、数分程度に短縮することも可能である。
　磁力によってビーズ７０を引き寄せた後、試料分析用デバイス１０１の下面に配置する磁石が電磁石であれば電源を切断し、永久磁石であれば試料分析用デバイス１０１から遠ざけて緩衝溶液Ｆ７０を再攪拌する。これによって、抗原抗体反応によらず固定されているビーズ７０を凹凸構造２０から一旦剥がし、その後再び磁力によってビーズ７０を引き寄せて、反応の収率を高めることも可能である。
　磁性物質を包含したビーズ７０を用いる場合、振盪による攪拌の他に、磁力が作用する方向と強さを変化させて攪拌させることも可能である。
　なお、磁力によってビーズ７０が発生する力によりエクソソーム５０が扁平に変更する可能性があるが、一旦、エクソソーム５０が凹部２０ａに捕捉されていれば、凸部２０ｂへと移動することはなく、エクソソーム５０の検出に影響を与えない。
　図８では、エクソソーム５０を含む試料液Ｆ５０とビーズ７０を含む緩衝溶液Ｆ７０とを別々にウェル１０に分注しているが、エクソソーム５０を含む試料とビーズ７０とを同時に緩衝溶液に入れてウェル１０に分注し、ステップＳ５，Ｓ７を同時に行うようにしてもよい。この場合でも、磁性物質を包含したビーズ７０を用いることができる。
　ところで、第１実施形態の試料分析用デバイス１０１及び第２実施形態の試料分析用デバイス１０２では、エクソソーム５０の平均粒径Ｅ、ビーズ７０の直径Ｄ、凹凸構造２０の凹部２０ａの幅Ｗａ及び凸部２０ｂの幅Ｗｂ、凹部２０ａの深さＨを、以下に示す関係とすることが好ましい。
　試料分析用デバイス１０１，１０２の寸法的な形状と、検出対象のエクソソーム５０や標識として用いるビーズ７０とを以下に示す関係とすることによって、図１０の（ｄ）に示すように、１つのエクソソーム５０に１つのビーズ７０を結合させて、エクソソーム５０とビーズ７０との数量関係を極力１対１に近付けることができる。
　凹部２０ａの幅Ｗａは、エクソソーム５０の平均粒径Ｅよりも大きく、ビーズ７０の直径Ｄの２倍よりも小さいことが好ましい。即ち、試料分析用デバイス１０１，１０２は、式（１）の関係を有することが好ましい。
　Ｅ＜Ｗａ＜２Ｄ　　…（１）
　式（１）のＥ＜Ｗａを満たせば、エクソソーム５０を凹部２０ａに固定させることができる。式（１）のＷａ＜２Ｄを満たせば、ビーズ７０が凹部２０ａの幅方向に同時に２つ入りにくくなり、エクソソーム５０とビーズ７０との数量関係が１対１に近付くこととなる。
　式（２）を満たすことが好ましい。
　Ｗｂ＜Ｄ＜Ｗａ＜２Ｄ　　…（２）
　式（２）のＷｂ＜Ｄを満たせば、ビーズ７０は凸部２０ｂ上に位置しにくくなる。式（２）のＤ＜Ｗａを満たせば、ビーズ７０は凹部２０ａに入ることができる。
　式（３）を満たすことが好ましい。
　Ｗｂ＜Ｅ　　…（３）
　式（３）を満たせば、エクソソーム５０は凸部２０ｂ上に位置しにくくなる。
　式（４）を満たすことが好ましい。
　Ｅ＜Ｗａ＜４Ｅ　　…（４）
　凹部２０ａに捕捉されたエクソソーム５０は、多くの場合、図１０の（ｃ）に示すように、球形から、接触面積を拡げる方向に変形する。上記のように、磁性物質を包含したビーズ７０を用いると、磁力によってエクソソーム５０の変形が促進される。
　球形のエクソソーム５０が体積を保って楕円体に変形したと仮定すると、球の直径が５０％変化する場合、回転楕円体の長軸である凹部２０ａとの接触部位の直径は約４０％大きくなる。さらに実際には、回転楕円体形状よりも接触部位の面積が大きくなる方向に変形するので、接触部位の直径は、元の球形のときの直径の５０％以上、ときには１００％以上増大することもありえる。
　以上のことから、式（４）のＷａ＜４Ｅを満たすことが好ましい。
　エクソソーム５０の平均粒径Ｅとビーズ７０の直径Ｄとは、式（５）を満たすことが好ましい。
　Ｅ＜Ｄ　　…（５）
　式（５）を満たせば、凹部２０ａに固定されたエクソソーム５０を複数のビーズ７０で修飾しにくくなり、エクソソーム５０とビーズ７０との数量関係を１対１に近付けることができる。式（５）を満たせば、エクソソーム５０とビーズ７０とが反応的に出会う確率が上がり、結果として反応の収率を上げることができる。
　凹部２０ａの深さＨは、式（６）を満たすことが好ましい。
　（Ｄ＋Ｅ）／８＜Ｈ　　…（６）
　式（６）を満たせば、エクソソーム５０は凹部２０ａにほぼ確実に固定され、ビーズ７０の凸部２０ｂへの非特異的な吸着を防ぎ、ビーズ７０はほぼ確実に凹部２０ａに存在するエクソソーム５０に固定される。
　凹部２０ａの深さＨが式（７）を満たすことはさらに好ましい。
　（Ｄ＋Ｅ）／６＜Ｈ　　…（７）
　実施例１は、式（１）～式（６）を満たし、実施例２は、式（１）～式（７）を満たす。実施例１，２によれば、凹部２０ａに固定されたエクソソーム５０とビーズ７０との数量関係をほぼ１対１とすることができる。１つのエクソソーム５０に２つまたは３つのビーズ７０が結合する場合が僅かにあるが、エクソソーム５０を定量的に検出することにほとんど影響を与えない。
　式（１）～式（７）の全てを満たすことが最も好ましいが、式（１）～式（７）を部分的に満たすだけでもよい。式（１）を満たすだけでも効果的である。式（１）に加えて式（４）を満たすことが好ましい。式（１）に加えて式（３）を満たすことも好ましい。式（１）に加えて式（３）及び式（４）を満たすことはより好ましい。
　式（１）に加えて、式（２）におけるＷｂ＜Ｄを満たすことが好ましい。式（１）に加えて、式（４）及び式（２）におけるＷｂ＜Ｄを満たすことはより好ましい。式（１）に加えて、式（３）及び式（２）におけるＷｂ＜Ｄを満たすこともより好ましい。式（１）と、式（２）におけるＷｂ＜Ｄと、式（３）と、式（４）との全てを満たすことはさらに好ましい。
　ところで、試料分析用デバイスは、試料分析用デバイス１０１，１０２として図１、図４に示した矩形状の他、円形のディスク状であってもよい。この場合であっても、以上説明した免疫学的測定法を用いた反応を同様に行うことができる。試料分析用デバイスを円形のディスク状とした場合には、凹凸構造２０の凹部２０ａ及び凸部２０ｂをスパイラル状または同心円状としてもよい。後述するエクソソーム５０の検出に際して、ディスク状の形状を活かすことができる。
　さらに、ディスク状の場合は、ディスク状の形状に対応させた送液路の構造を設けることも可能である。図１１～図１３を用いて、送液路の構造を設けたディスク状の試料分析用デバイスを第３実施形態の試料分析用デバイスとして説明する。第３実施形態において、第１，第２実施形態と実質的に同一の物質や同一の部分には同一の符号を付して説明することとする。
＜第３実施形態の試料分析用デバイス＞
　図１１において、第３実施形態の試料分析用デバイス１０３は、ブルーレイディスク，ＤＶＤ，コンパクトディスク等の光ディスクと同じ直径の円盤状に形成されている。試料分析用デバイス１０３は、試料分析用ディスクである。図１１は、試料分析用デバイス１０３を透明保護層３６側から見た平面図である。
　試料分析用デバイス１０３は、光ディスクと同様、ポリカーボネート等の合成樹脂によって形成することができる。
　試料分析用デバイス１０３の中心部には、円形の開口１０３ａが形成されている。開口１０３ａの周囲には、開口１０３ａを取り囲むように、検出対象のエクソソーム５０を含む試料を滴下させるための注入孔３１が形成されている。
　それぞれの注入孔３１には、試料を流すための流路３２が連結されている。複数の流路３２は、注入孔３１から試料分析用デバイス１０３の外周端部方向へと放射状に伸びている。流路３２の中間部には、ビーズ７０を充填するためのビーズ充填部３３が設けられている。
　試料分析用デバイス１０３の外周端部には、扇状に広がった検出領域３４が設けられている。流路３２は検出領域３４と連結されている。注入孔３１から試料を注入して、試料分析用デバイス１０３を回転させると、試料は流路３２を伝わって検出領域３４に到達する。従って、検出領域３４は、各液が注入孔３１及び流路３２を経て注入される注入部である。
　試料分析用デバイス１０３の外周端部には、図１２の（ａ）に示すように、スパイラル状または同心円状の凹部２０ａと凸部２０ｂとを含む凹凸構造２０が形成されている。検出領域３４は、凹凸構造２０内に設けられている。
　図１２の（ａ）に示す凹凸構造２０の代わりに、図１２の（ｂ）に示すように、複数の凹状のピット２０ｃがスパイラル状または同心円状に配列されたピット構造２０Ｐとしてもよい。ピット２０ｃを設けていない部分は、ピット２０ｃに対して凸部であるから、ピット構造２０Ｐも凹凸構造である。
　試料分析用デバイス１０３では、透明保護層３６とは反対側の合成樹脂等で形成される円盤部分が、凹凸構造２０（ピット構造２０Ｐを含む）を形成するベース部となっている。
　図１１に示すように、凹凸構造２０の検出領域３４以外の部分はトラック領域３５となっている。トラック領域３５にアドレス情報を設けることによって、試料分析用デバイス１０３の半径方向及び周方向の位置を特定することができる。アドレス情報をピットやエンボスで設けてもよく、凹部２０ａまたは凸部２０ｂの側面のウォブリングによってアドレス情報を表すようにしてもよい。
　図１３は、試料分析用デバイス１０３の部分断面図である。ビーズ充填部３３に充填されているビーズ７０には、図７の（ｂ）と同様に、予め抗体８０が固定されている。実際には、凹凸構造２０に隣接してレーザ光を反射する反射層が設けられているが、図１２及び図１３では図示を省略している。
　まず、注入孔３１から抗体６０を含む緩衝溶液Ｆ６０を注入して試料分析用デバイス１０３を回転させると、図１０の（ａ）と同様に、凹凸構造２０の表面に抗体６０が固定される。必要に応じて、凹凸構造２０の表面をブロッキング処理すればよい。
　注入孔３１から検出対象のエクソソーム５０を含む試料液Ｆ５０を注入して試料分析用デバイス１０３を回転させると、エクソソーム５０がビーズ充填部３３を通過する際にビーズ７０で修飾される。ビーズ７０で修飾されたエクソソーム５０は、図１０の（ｄ）と同様に、凹部２０ａに固定される。図１３では、図示の都合上、エクソソーム５０の図示を省略し、ビーズ７０のみを図示している。
　検出領域３４には、図示していない光ピックアップのレーザ光源から発せられ、対物レンズ４０によって集光されたレーザ光が透明保護層３６を介して照射される。凹部２０ａに固定されたビーズ７０は、照射されたレーザ光の反射光を解析することによって検出できる。
　第３実施形態の試料分析用デバイス１０３における凹凸構造２０の寸法的な形状と、検出対象のエクソソーム５０や標識として用いるビーズ７０との大きさの関係は、第１，第２実施形態と同じである。
＜エクソソームの検出及び試料分析方法＞
　次に、第１～第３実施形態の試料分析用デバイス１０１～１０３によって、図１０の（ｄ）に示すように捕捉したエクソソーム５０を検出する検出方法について説明する。
　第１の検出方法として、光学顕微鏡を用いてビーズ７０を検出して、画像処理によってビーズ７０を計数することができる。その結果、エクソソーム５０が定量的に検出される。第１の検出方法は、第１，第２実施形態の試料分析用デバイス１０１，１０２によって捕捉したエクソソーム５０を検出するのに好適である。
　試料分析用デバイス１０１，１０２を搭載するステージを移動させて大面積でビーズ７０を計数することにより、計測の精度を上げることができる。光学顕微鏡の代わりにレーザ顕微鏡を用いて、検出する解像度を高くし、Ｓ／Ｎを向上させることも可能である。
　第２の検出方法として、ビーズ７０内に特定の波長の光を照射すると蛍光を発する蛍光物質を包含させて、蛍光を検出することによってビーズ７０を計数することができる。光学顕微鏡を用いて蛍光を発するビーズ７０を計測してもよいし、蛍光の総量を光センサで検出してもよい。第２の検出方法は、第１，第２実施形態の試料分析用デバイス１０１，１０２によって捕捉したエクソソーム５０を検出するのに好適である。
　第１及び第２の検出方法を用いる場合、ウェル１０を設けていない試料分析用デバイス１０１，１０２の裏面側からビーズ７０を検出するようにすれば、検出装置と試料分析用デバイス１０１，１０２との機械的な干渉を防ぐことができる。また、ウェル１０の形状を顕微鏡対物レンズ等の干渉を避ける形状とすることも可能である。
　第２実施形態の試料分析用デバイス１０２の場合には、シリコーンポリマーシート１２２を剥がすことができる。シリコーンポリマーシート１２２を剥がして基板１１２のみでビーズ７０を検出すれば、検出装置との機械的な干渉を回避することができる。
　第３の方法として、ビーズ７０に固定されている抗体８０に特異的に結合する酵素を標識とする２次抗体を用いてビーズ７０を検出し、計数することができる。代表的な２次抗体は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）標識抗体やアルカリ・フォスファターゼ（AP）標識抗体である。
　これらの２次抗体は、酵素に応じた発光基質を加えることによって化学発光を生じる。従って、エクソソーム５０に固定されたビーズ７０を２次抗体で修飾して、発光基質を加えて生じた化学発光の光量を検出することによってビーズ７０を計数することができる。
　第４の方法として、第３実施形態の試料分析用デバイス１０３の場合には、上記のように、光ピックアップのレーザ光源から発せられたレーザ光で試料分析用デバイス１０３を走査することによって、ビーズ７０を計数することができる。凹凸構造２０の凹部２０ａをトラックとして、サーボ機構を用いてレーザ光のスポットをトラックに沿って走査させることにより、高速かつ高精度にビーズ７０を計数することが可能である。
　以上のようにして、エクソソーム５０に標識として固定されたビーズ７０を計数することによってエクソソーム５０を高精度に定量的に測定して、試料を分析することができる。
　本発明は、以上説明した各実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。
　本発明は、血液，リンパ液，唾液，尿，母乳，精液等に含まれているエクソソームの検出に利用できる。

Claims (8)

  1. 　ベース部と、
    　前記ベース部上に形成され、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体を固定させ、前記抗体に前記エクソソームを結合させることによって前記エクソソームを固定させる凹部と、
    　を備えることを特徴とする試料分析用デバイス。
  2. 　前記凹部に隣接する凸部をさらに備え、
    　前記凹部と前記凸部とは前記ベース部上に周期的に配列されている
    　ことを特徴とする請求項1記載の試料分析用デバイス。
  3. 　前記凹部の幅は、前記エクソソームの平均粒径よりも大きく、前記エクソソームを修飾するビーズの直径の２倍よりも小さいことを特徴とする請求項１または２に記載の試料分析用デバイス。
  4. 　前記凹部の幅は、前記エクソソームの平均粒径の４倍よりも小さいことを特徴とする請求項３記載の試料分析用デバイス。
  5. 　前記凸部の幅は、前記エクソソームの平均粒径よりも小さいことを特徴とする請求項２記載の試料分析用デバイス。
  6. 　前記凸部の幅は、前記エクソソームを修飾するビーズの直径よりも小さいことを特徴とする請求項２または５に記載の試料分析用デバイス。
  7. 　検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体が固定された凹部を有する注入部内に、前記エクソソームを含む試料液を注入して、前記凹部に固定された抗体に前記エクソソームに存在する抗原を結合させて、前記凹部に前記エクソソームを固定させるエクソソーム固定工程を含むことを特徴とするエクソソームの捕捉方法。
  8. 　前記注入部内に、前記エクソソームが有する抗原と結合する抗体が表面に固定されたビーズを含む緩衝溶液を注入して、前記エクソソームが有する抗原に、前記ビーズに固定された抗体を結合させることにより、前記エクソソームを前記ビーズで修飾する修飾工程をさらに含むことを特徴とする請求項７記載のエクソソームの捕捉方法。
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