JP2019148529A - 分析ユニット及び分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】検出対象物質を精度よく分析できる分析ユニットを提供する。【解決手段】分析ユニット１はウェル１０を備える。ウェル１０は穴形状を有し、かつ、穴形状における底面に対応する第１の面１１と、内側の側面に対応する第２の面１２とを有する。ウェル１０は第１の面１１と第２の面１２とに異なる生体分子２０と３０とが固定されている。第１の面１１には検出対象物質４０と抗原抗体反応により特異的に結合する第１の生体分子２０が固定されている。第２の面１２には検出対象物質４０と特異的に結合しない第２の生体分子３０が固定されている。【選択図】図４

Description

本発明は、抗原または抗体等の生体物質を分析するための分析ユニット及び分析方法に関する。

血液、血清、または血漿等の生体試料に含まれるタンパク質などの生体物質（例えば生体細胞から分泌されるエクソソームなどの小胞顆粒）を分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。

一般的に、生体試料中には、生体物質である検出対象物質以外に夾雑物が含まれている。夾雑物は、例えば検出対象物質以外の種々のタンパク質、脂質、または糖鎖化合物等である。夾雑物は、１次抗体、２次抗体、または１次抗体をウェル等の支持体に固相化するための固相化層（固相化支持体）等に、抗原抗体反応しない状態で非特異的に吸着する。夾雑物は、蛍光標識体が結合することにより、夾雑物に起因する非特異シグナルが発生し、バックグランドノイズの原因となっている。

特許文献１には、糖鎖を有する測定試薬が用いられる免疫測定法において、非特異反応を低減させる糖鎖化合物を用いることが記載されている。特許文献１に記載されている免疫測定法は、糖鎖を有する測定試薬の反応点を添加した別の糖鎖化合物を用いて非特異的吸着をブロックすることにより、ノイズを低減するものである。

特許文献２には、生体試料として用いる血清が由来する動物とは異なる動物に由来する血清をブロッキング材として用いることが記載されている。ブロッキング材は、非特異的吸着をブロックすることにより、ノイズを低減するものである。

特開２０１０−６０２９３号公報 特開２００９−２２９０７４号公報

しかしながら、検出対象物質が微量である場合、非特異的吸着をブロックするだけでは、検出対象物質を精度よく分析することが困難な場合がある。

本発明は、検出対象物質を精度よく分析できる分析ユニット及び分析方法を提供することを１つの目的とする。

本発明の一側面として、穴形状を有し、かつ、前記穴形状における底面に対応する第１の面と、前記穴形状における内側の側面に対応する第２の面とを有するウェルを備え、前記ウェルは、前記第１の面と前記第２の面とに異なる生体分子が固定されていることを特徴とする分析ユニットを提供する。

また、本発明の一側面として、穴形状を有し、かつ、前記穴形状における底面に対応する第１の面と、前記穴形状における内側の側面に対応する第２の面とを有し、前記第１の面と前記第２の面とに異なる生体分子が固定されているウェルを備えた分析ユニットを用い、
前記ウェルに検出対象物質を含む生体試料液を注入し、前記検出対象物質を前記第１の面に固定されている生体分子と抗原抗体反応により特異的に結合させ、前記第１の面に固定されている生体分子と特異的に結合している検出対象物質を分析することを特徴とする分析方法を提供する。

本発明の分析ユニット及び分析方法によれば、検出対象物質を精度よく分析できる。

一実施形態の分析ユニットを示す平面図である。 図１のＡ−Ａで切断した分析ユニットの断面図である。 カートリッジを試料分析用ディスクより取り外した状態を示す断面図である。 図１のＢ−Ｂで切断したウェルを示す拡大斜視図である。 ウェルの底面に固定されている抗体とウェルの内周面に固定されている抗体との関係を示す図である。 分析ユニットを用いた分析方法の一例を説明するためのフローチャートである。 分析ユニットを用いた分析方法の一例を示す図である。 分析ユニットを用いた分析方法の一例を示す図である。 分析ユニットを用いた分析方法の一例を示す図である。 分析ユニットを用いた分析方法の一例を示す図である。 分析ユニットを用いた分析方法の一例を示す図である。 分析ユニットを用いた分析方法の一例を示す図である。 試料分析用ディスクに形成された反応領域を模式的に示す図である。

図１、図２Ａ、図２Ｂ、図３、及び図４を用いて、一実施形態の分析ユニットを説明する。図１は一実施形態の分析ユニットをカートリッジ側から見た状態を示している。図２Ａは図１のＡ−Ａで切断した分析ユニットの断面を示している。図２Ｂはカートリッジを試料分析用ディスクより取り外した状態を示している。図３は図１のウェルをＢ−Ｂで切断した状態を部分的に拡大して示している。

図１に示すように、分析ユニット１は、試料分析用ディスク１００とカートリッジ２００とを備える。試料分析用ディスク１００は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。

試料分析用ディスク１００は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂またはシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、試料分析用ディスク１００は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態または所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。

図１、図２Ａ、または図２Ｂに示すように、試料分析用ディスク１００は、中心孔１０１と切欠き部１０２とを有する。中心孔１０１は試料分析用ディスク１００の中心部に形成されている。切欠き部１０２は試料分析用ディスク１００の外周部に形成されている。切欠き部１０２は、試料分析用ディスク１００の基準位置を識別するための基準位置識別部である。

図３に示すように、試料分析用ディスク１００の表面には、凹部１０３と凸部１０４とが半径方向に交互に配置されたトラック領域１０５が形成されている。凹部１０３と凸部１０４とは、試料分析用ディスク１００の内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凹部１０３は光ディスクのグルーブに相当する。凸部１０４は光ディスクのランドに相当する。光ディスクのトラックピッチに相当する試料分析用ディスク１００のトラックピッチは例えば３２０ｎｍである。

図１、図２Ａ、または図２Ｂに示すように、カートリッジ２００は、周方向に複数の円筒状の貫通孔２０１が形成されている。複数の貫通孔２０１は、それぞれの中心が同一円周上に位置するように等間隔に形成されている。カートリッジ２００は、中心部に形成された凸部２０２と、外周部に形成された凸部２０３とを有する。

オペレータは、カートリッジ２００を試料分析用ディスク１００に取り付ける場合、凸部２０２を試料分析用ディスク１００の中心孔１０１に挿入し、凸部２０３を切欠き部１０２に挿入する。これにより、カートリッジ２００と試料分析用ディスク１００とを位置決めすることができる。

図２Ａまたは図３に示すように、分析ユニット１は、カートリッジ２００の貫通孔２０１と試料分析用ディスク１００の表面（トラック領域１０５）とによって形成される複数のウェル１０を有する。ウェル１０は穴形状を有する。ウェル１０は、穴形状における底面に対応する第１の面１１と、穴形状における内側の側面に対応する第２の面１２とを有する。以下、説明をわかりやすくするために、ウェル１０において第１の面１１を底面１１、第２の面１２を内周面１２とする。

試料分析用ディスク１００の表面はウェル１０の底面１１を構成している。貫通孔２０１の内側の面である内周面はウェル１０の内周面１２を構成している。ウェル１０は試料液、緩衝液、及び、洗浄液等の溶液を溜めるための容器である。なお、図１では、一例として８つのウェル１０を示しているが、ウェル１０の数はこれに限定されるものではない。

図２Ｂに示すように、カートリッジ２００を試料分析用ディスク１００から分離することができる。検出対象物質を標識する微粒子の検出及び計測は、カートリッジ２００が分離された試料分析用ディスク１００単体で行われる。

図４を用いて、ウェル１０の底面１１に固定されている抗体とウェル１０の内周面１２に固定されている抗体との関係を説明する。なお、図４では、説明をわかりやすくするために、ウェル１０を構成する試料分析用ディスク１００とカートリッジ２００とを簡略化して示している。

図４に示すように、ウェル１０の底面１１には、検出対象物質と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体２０が固定されている。ウェル１０の内周面１２には、抗体２０とは異なり、かつ、検出対象物質と特異的に結合しない抗体３０が固定されている。検出対象物質は、例えば生体細胞から分泌されるエクソソーム等の小胞顆粒である。抗体２０は例えばエクソソームと抗原抗体反応により特異的に結合するanti-Human CD9抗体等の生体分子（第１の生体分子）である。抗体３０は例えばエクソソームと特異的に結合しないIgG1抗体等のネガティブコントロール抗体等の生体分子（第２の生体分子）である。ウェル１０の底面１１及び内周面１２にはブロッキング層１３が形成されている。

図５、図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ、図７Ｂ、図８、図９Ａ、及び、図９Ｂを用いて、分析ユニット１を用いた分析方法の一例を説明する。オペレータは、図５に示すフローチャートのステップＳ１１にて、図６Ａに示すように、試料分析用ディスク１００ａとカートリッジ２００ａとを備える分析ユニット１ａを作製する。試料分析用ディスク１００ａは、図４に示す試料分析用ディスク１００に相当する。図６Ａに示す符号１０ａはウェルを示す。図６Ａに示す符号１１ａ及び１２ａはウェル１０ａの底面及び内周面を示す。底面１１ａは、図４に示す底面１１に相当する。

オペレータは、ステップＳ１２にて、抗体２０を含む緩衝液２１をウェル１０ａに注入する。さらに、オペレータは、分析ユニット１ａを適切な時間だけ適切な温度でインキュベートさせる。これにより、抗体２０は、ウェル１０ａの底面１１ａを構成する試料分析用ディスク１００ａの表面に形成されたトラック領域１０５上に固定される。なお、抗体２０は、ウェル１０ａの内周面１２ａを構成するカートリッジ２００ａの貫通孔２０１の内周面にも固定される。

オペレータは、緩衝液２１をウェル１０ａから排出する。オペレータは、ウェル１０ａを別の緩衝液で洗浄する。ウェル１０ａの底面１１ａ及び内周面１２ａに固定されなかった抗体２０はこの洗浄によって除去される。オペレータは、ステップＳ１３にて、試料分析用ディスク１００ａとカートリッジ２００ａとを分離する。

オペレータは、ステップＳ１１〜Ｓ１３により、図６Ｂに示すように、検出対象物質と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体２０が表面（トラック領域１０５）に固定されている試料分析用ディスク１００ａを作製する。

オペレータは、ステップＳ２１にて、図７Ａに示すように、試料分析用ディスク１００ｂとカートリッジ２００ｂとを備える分析ユニット１ｂを作製する。カートリッジ２００ｂは、図４に示すカートリッジ２００に相当する。図７Ａに示す符号１０ｂはウェルを示す。図７Ａに示す符号１１ｂ及び１２ｂはウェル１０ｂの底面及び内周面を示す。内周面１２ｂは、図４に示す内周面１２に相当する。

オペレータは、ステップＳ２２にて、抗体３０を含む緩衝液３１をウェル１０ｂに注入する。さらに、オペレータは、分析ユニット１ｂを適切な時間だけ適切な温度でインキュベートさせる。これにより、抗体３０は、ウェル１０ｂの内周面１２ｂを構成するカートリッジ２００ｂの貫通孔２０１の内周面に固定される。なお、抗体３０は、ウェル１０ｂの底面１１ｂを構成する試料分析用ディスク１００ｂの表面上にも固定される。

オペレータは、緩衝液３１をウェル１０ｂから排出する。オペレータは、ウェル１０ｂを別の緩衝液で洗浄する。ウェル１０ｂの底面１１ｂ及び内周面１２ｂに固定されなかった抗体３０はこの洗浄によって除去される。オペレータは、ステップＳ２３にて、カートリッジ２００ｂと試料分析用ディスク１００ｂとを分離する。

オペレータは、ステップＳ２１〜Ｓ２３により、図７Ｂに示すように、検出対象物質と特異的に結合しない抗体３０が貫通孔２０１の内周面に固定されているカートリッジ２００ｂを作製する。なお、オペレータは、ステップＳ１１〜Ｓ１３とステップＳ２１〜Ｓ２３とを並行して実行してもよいし、別々の時間に実行してもよい。

オペレータは、ステップＳ３１にて、試料分析用ディスク１００ａにカートリッジ２００ｂを取り付けることにより、図４に示すウェル１０を有する分析ユニット１を作製する。

オペレータは、ステップＳ３２にて、分析ユニット１のウェル１０の底面１１及び内周面１２を、スキムミルクまたはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のブロッキング剤を用いてブロッキング処理する。例えば、オペレータは、リン酸緩衝液等の緩衝液で希釈されたスキムミルクをウェル１０に注入する。さらに、オペレータは分析ユニット１を適切な時間だけ適切な温度で静置または振盪させる。

オペレータは、スキムミルクを含む緩衝液をウェル１０から排出する。オペレータは、ウェル１０を別の緩衝液で洗浄する。洗浄に用いられる緩衝液は、スキムミルクを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。また、洗浄を省略してもよい。これにより、図４に示すように、ウェル１０の底面１１及び内周面１２にブロッキング層１３が形成される。

オペレータは、ステップＳ３３にて、図８に示すように、検出対象物質４０を含む生体試料液４１をウェル１０に注入する。検出対象物質４０は、例えば生体細胞から分泌されるエクソソーム等の小胞顆粒である。なお、生体試料液４１には検出対象物質４０が含まれていない場合もある。説明をわかりやすくするために、生体試料液４１に検出対象物質４０が含まれている場合について説明する。

オペレータは、分析ユニット１を適切な時間だけ適切な温度でインキュベートさせる。これにより、検出対象物質４０は、ウェル１０の底面１１に固定されている抗体２０と抗原抗体反応により特異的に結合する。その結果、検出対象物質４０は、試料分析用ディスク１００の表面に形成されたトラック領域１０５に捕捉される。ブロッキング層１３は、検出対象物質４０がウェル１０の底面１１及び内周面１２に非特異的に吸着することを防止する。

一般的に、生体試料液４１には、検出対象物質４０以外の夾雑物４２が含まれている。夾雑物４２は、例えば検出対象物質４０以外の種々のタンパク質、脂質、または糖鎖化合物等である。夾雑物４２は、ウェル１０の底面１１に固定されている抗体２０、及び、ウェル１０の内周面１２に固定されている抗体３０に、抗原抗体反応しない状態で非特異的に吸着する。ブロッキング層１３は、夾雑物４２がウェル１０の底面１１及び内周面１２に非特異的に吸着することを防止する。従って、ブロッキング層１３は、検出対象物質４０、及び、夾雑物４２がウェル１０の底面１１及び内周面１２に非特異的に吸着することを防止する。

ウェル１０の内周面１２には検出対象物質４０と特異的に結合しない抗体３０が固定されている。ウェル１０の底面１１には検出対象物質４０と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体２０が固定されている。従って、検出対象物質４０が、ウェル１０の底面１１を構成する試料分析用ディスク１００の表面（トラック領域１０５）に捕捉される確率を向上させることができる。

夾雑物４２は、ウェル１０の底面１１及び内周面１２に固定されている抗体２０及び３０に、抗原抗体反応しない状態で非特異的に吸着する。検出対象物質４０はウェル１０の底面１１に固定されている抗体２０と抗原抗体反応により特異的に結合する。これにより、夾雑物４２が、ウェル１０の底面１１を構成する試料分析用ディスク１００の表面に非特異的に吸着する確率を低減させることができる。

オペレータは、ウェル１０から生体試料液４１を排出する。オペレータは、ウェル１０を緩衝液で洗浄する。なお、生体試料液４１中に分散している検出対象物質４０と夾雑物４２とは、この洗浄によって除去される。

オペレータは、ステップＳ３４にて、図９Ａに示すように、標識となる微粒子５０を含む緩衝液５１をウェル１０に注入する。微粒子５０の表面には検出対象物質４０の抗原と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体が形成されている。さらに、オペレータは、分析ユニット１を適切な時間だけ適切な温度でインキュベートさせる。

これにより、微粒子５０は、試料分析用ディスク１００の表面に形成されたトラック領域１０５上に捕捉されている検出対象物質４０と抗原抗体反応により特異的に結合する。その結果、微粒子５０は、試料分析用ディスク１００のトラック領域１０５、具体的にはトラック領域１０５の凹部１０３に、検出対象物質４０と結合した状態で捕捉される。ブロッキング層１３は、微粒子５０がウェル１０の底面１１及び内周面１２に非特異的に吸着することを防止する。

オペレータは、ウェル１０から緩衝液５１を排出する。オペレータは、ウェル１０を別の緩衝液で洗浄し、さらに必要に応じて純水で洗浄した後、乾燥させる。なお、緩衝液５１中に分散している微粒子５０は洗浄により除去される。

オペレータは、ステップＳ３５にて、試料分析用ディスク１００とカートリッジ２００とを分離する。図２Ｂに示すように、試料分析用ディスク１００には、複数のウェル１０に対応して複数の反応領域６０が形成される。

図９Ｂに示すように、反応領域６０には、微粒子５０が検出対象物質４０と結合した状態で、試料分析用ディスク１００の表面に形成されたトラック領域１０５に捕捉されている。即ち、検出対象物質４０は、抗体２０と微粒子５０とによってトラック領域１０５にサンドイッチ捕捉されている。

オペレータは、ステップＳ３６にて、反応領域６０に捕捉されている微粒子５０を検出し、カウントする。これにより、反応領域６０に捕捉されている検出対象物質４０を間接的に検出し、カウントすることができる。

本実施形態の分析ユニット及び分析方法では、検出対象物質４０と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体２０が固定されている試料分析用ディスク１００に、検出対象物質４０と特異的に結合しない抗体３０が固定されているカートリッジ２００を取り付け、分析ユニット１を作製する。

検出対象物質４０はカートリッジ２００に固定されている抗体３０とは特異的に結合しないため、抗体２０が試料分析用ディスク１００、及び、カートリッジ２００に固定されている場合と比較して、検出対象物質４０が試料分析用ディスク１００に捕捉される確率を増加させることができる。

本実施形態の分析ユニット及び分析方法では、検出対象物質４０が試料分析用ディスク１００に固定されている抗体２０と抗原抗体反応により特異的に結合する。それに対して、夾雑物４２は、試料分析用ディスク１００に固定されている抗体２０、及び、カートリッジ２００に固定されている抗体３０に、抗原抗体反応しない状態で非特異的に吸着する。そのため、夾雑物４２が試料分析用ディスク１００に固定されている抗体２０に非特異的に吸着する確率を低減することができる。

本実施形態の分析ユニット及び分析方法では、さらに、分析ユニット１のウェル１０の底面１１、及び、内周面１２にブロッキング層１３が形成される。ブロッキング層１３は、検出対象物質４０、夾雑物４２、及び、微粒子５０がウェル１０の底面１１及び内周面１２に非特異的に吸着することを防止する。ウェル１０の底面１１を構成する試料分析用ディスク１００に非特異的に吸着した夾雑物４２は、試料分析用ディスク１００に捕捉されている微粒子５０（検出対象物質４０）を検出するときのノイズ成分となる。従って、ブロッキング層１３によりノイズ成分を低減することができる。

従って、本実施形態の分析ユニット及び分析方法によれば、検出対象物質４０が試料分析用ディスク１００に捕捉される確率を増加させることにより、検出対象物質４０の検出精度を向上させることができる。

また、本実施形態の分析ユニット及び分析方法によれば、夾雑物４２が試料分析用ディスク１００に固定されている抗体２０に非特異的に吸着する確率を低減させることにより、ノイズ成分を低減することができる。ブロッキング層１３により、ノイズ成分をさらに低減することができる。

よって、本実施形態の分析ユニット及び分析方法によれば、ノイズ成分を低減し、かつ、検出対象物質４０の検出精度を向上させることにより、検出対象物質４０を検出するための検出下限ＬＯＤ（Limit Of Detection）、及び、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。これにより、検出対象物質４０の検出感度を向上させることができるため、生体試料液４１に含まれる検出対象物質４０が微量であっても、検出対象物質４０を精度よく分析することができる。

なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。

１ 分析ユニット
１０ ウェル
１１ 底面（第１の面）
１２ 内周面（第２の面）
２０ 抗体（第１の生体分子）
３０ 抗体（第２の生体分子）
４０ 検出対象物質
５０ 微粒子
１００ 試料分析用ディスク
２００ カートリッジ
２０１ 貫通孔

Claims (4)

1. 穴形状を有し、かつ、前記穴形状における底面に対応する第１の面と、前記穴形状における内側の側面に対応する第２の面とを有するウェルを備え、
   前記ウェルは、前記第１の面と前記第２の面とに異なる生体分子が固定されている
   ことを特徴とする分析ユニット。
2. 前記第１の面には、検出対象物質と抗原抗体反応により特異的に結合する第１の生体分子が固定されており、
   前記第２の面には、前記検出対象物質と特異的に結合しない第２の生体分子が固定されている
   ことを特徴とする請求項１に記載の分析ユニット。
3. 貫通孔を有するカートリッジと、
   試料分析用ディスクと、
   を備え、
   前記ウェルは前記カートリッジの貫通孔と前記試料分析用ディスクの表面とによって形成され、
   前記第１の面は前記試料分析用ディスクの表面に対応し、
   前記第２の面は前記貫通孔の内側の面に対応し、
   前記第１の面に対応する前記試料分析用ディスクの表面には前記第１の生体分子が固定され、
   前記第２の面に対応する前記貫通孔の内側の面には前記第２の生体分子が固定されている
   ことを特徴とする請求項２に記載の分析ユニット。
4. 穴形状を有し、かつ、前記穴形状における底面に対応する第１の面と、前記穴形状における内側の側面に対応する第２の面とを有し、前記第１の面と前記第２の面とに異なる生体分子が固定されているウェルを備えた分析ユニットを用い、
   前記ウェルに検出対象物質を含む生体試料液を注入し、
   前記検出対象物質を前記第１の面に固定されている生体分子と抗原抗体反応により特異的に結合させ、
   前記第１の面に固定されている生体分子と特異的に結合している検出対象物質を分析する
   ことを特徴とする分析方法。

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