JP2012163468A - 迅速測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】測定対象物質を含有する試料と、水不溶の粒子または水不溶の粒子に固定化された結合物質、さらには酵素標識結合物質を混合し、複合体を形成させた後、水不溶の粒子が保持される孔径のメンブレンフィルターに置き、メンブレンフィルター上で直ちに遊離の標識結合物質を検出することにより試料中の測定対象物質を測定する。
【選択図】なし
Description
(1) 測定用具の作製
セルロースアセテート製メンブレンフィルター 孔径:0.20μm、0.45μm、0.80μm、3.00μm (アドバンテック社製)
親水性PVDF製メンブレンフィルター 孔径:0.22μm (日本ミリポア社製)
セルロース混合エステル製メンブレンフィルター 孔径:0.45μm (日本ミリポア社製)
抗ヘモグロビンA1c抗体(フィッツジェラルド社製)をAlkaline Phosphatase Labeling Kit − SH(同仁化学社製)にてアルカリフォスファターゼ標識し、Monolith Ab Spin Kit(京都モノテック社製)にて精製し、透析により、5 mM トリス緩衝液,pH 9.5 にBuffer置換することでアルカリフォスファターゼ標識抗ヘモグロビンA1c抗体を作製した。
粒径0.5μmのラテックス粒子(Polybead Microspheres ポリサイエンス社製)を5.2%(w/v)のラテックス粒子水溶液に調製した。
粒径0.5μmのラテックス粒子(Polybead Microspheres ポリサイエンス社製)を1.3%(w/v)、2.6%(w/v)、5.2%(w/v)、7.8%(w/v)、10.4%(w/v)のラテックス粒子水溶液に調製した。
(2)で作製したアルカリフォスファターゼ標識抗ヘモグロビンA1c抗体を、(3)と同様に希釈して抗体濃度1.2μg/mlの抗体液2と抗体濃度120μg/mlの抗体液3を調製した。
各粒径のラテックス粒子を、粒径が完全に均一かつ完全な球であった場合に粒径0.5μmの5.2%(w/v)ラテックス粒子水溶液と単位体積辺りの表面積がほぼ等しくなる濃度に調製し、各粒径のラテックス粒子水溶液とした。使用したラテックス粒子は以下の通りである。
粒径0.121μm〔ポリスチレン系 JSR社製〕
粒径0.220μm〔ポリスチレン系 JSR社製〕
粒径1.0μm〔Polybead Microspheres ポリサイエンス社製〕
粒径2.0μm〔Polybead Microspheres ポリサイエンス社製〕
粒径3.0μm〔Polybead Microspheres ポリサイエンス社製〕
いずれの粒径のラテックス粒子でも測定が可能であった。
粒径0.5μmの5.2%(w/v)ラテックス粒子水溶液及び1−(6)で調製した粒径0.121μmのラテックス粒子水溶液について、孔径0.20μm、0.45μm、0.80μm、3.00μmのセルロースアセテート製のメンブレンフィルターにて作製した測定用具Aを使い、HbA1c測定用常用参照標準物質を測定した。測定は、ラテックス粒子と測定用具Aが異なる以外1−(2)と同様にして行った。
粒径0.5μmの5.2%(w/v)ラテックス粒子水溶液について、親水性PVDFまたはセルロース混合エステル製のメンブレンフィルターにて作製した測定用具Aを使い、HbA1c測定用常用参照標準物質を測定した。測定は、測定用具Aが異なる以外(4)と同様にして行った。ただし、セルロース混合エステル製メンブレンフィルターにて作製した測定用具Aでは、科学発光撮影装置での露光時間を300秒として測定を行った。孔径0.20μmのセルロースアセテート製メンブレンフィルターにて作製した測定用具Aと粒径0.5μmのラテックス粒子5.2%(w/v)水溶液を用いて測定した(4)における結果と本測定結果を比較した。
HbA1c測定用常用参照標準物質各濃度段階の測定を、粒径0.5μmの7.8%(w/v)ラテックス粒子水溶液を用いて以下のように行った。HbA1c測定用常用参照標準物質各濃度段階を50mM トリス緩衝液(pH 7.4)で25倍に希釈した。希釈直後、この希釈液それぞれを10μlとり、30μlのラテックス粒子水溶液にそれぞれ混合し、30秒間室温に置いた。この混合液から30μlを取り、抗体液1を10μlに加えて測定液とし、1分間室温に置いた。測定液をそれぞれ12μlとり、0.20μmの孔径のセルロースアセテート製メンブレンフィルターにて作製した測定用具Aの測定液添加面(図1−I)中央にそれぞれ加え、直後に検出面からの発光を測定した。発光検出は(4)と同様に行い、露光時間は10秒とした。発光検出終了までの測定に要する時間は2分以内であった。
(1) 測定用具の作製
定性ろ紙〔No.2、アドバンテック社製〕を5mm角の小片に裁断し、各小片に4μlずつ塗布液を添加し、乾熱器にて37℃で乾燥させ、これを吸収材1とした。
測定用具B及びCを用いて、HbA1c測定用常用参照標準物質の測定を行った。測定用具が異なる以外、1−(4)と同様にHbA1c測定用常用参照標準物質の測定を行った。いずれにおいても測定液は測定液添加面(図11−I、図12−I)にある直径3mmの孔より添加した。ラテックス粒子水溶液には粒径0.5μm、5.2%(w/v)を用いた。孔径0.20μmのセルロースアセテート製メンブレンフィルターにて作製した測定用具Aと粒径0.5μmのラテックス粒子5.2%(w/v)水溶液を用いて測定した(4)における結果と本測定結果を比較した。
(1) 測定用具の作製
異なる塗布液を用いる以外実施例1の(1)と同様に測定用具を作製した。メンブレンフィルターには孔径0.20μmセルロースアセテート製メンブレンフィルターを用いた。発色基質溶液〔BCIP/NBT溶液、ナカライテスク社製〕を緩衝液〔10×Assay Buffer、アプライドバイオシステムズ社製〕で25倍希釈して塗布液2を調製した。塗布液2を、ブチルテープに穿った孔からメンブレンフィルターに対して6μl塗布した。これを乾熱器にて37℃で乾燥させ、測定用具Dとした。
実施例1の(2)で作製したアルカリフォスファターゼ標識抗ヘモグロビンA1c抗体を、実施例1の(3)と同様に希釈して抗体濃度20μg/mlの抗体液4を調製した。
(1) アルカリフォスファターゼ標識抗G−CSF抗体の作製
抗G−CSF抗体〔ヤギポリクローナル抗体、アールアンドディー社製〕をアルカリフォスファターゼ標識キット〔Alkaline Phosphatase Labeling Kit − SH、同仁化学社製〕にてアルカリフォスファターゼ標識し、Monolith Ab Spin Kit〔プロテインG、京都モノテック社製〕にて精製し、透析により、5 mM トリス緩衝液(pH 9.5)にBuffer置換することでアルカリフォスファターゼ標識抗G−CSF抗体を作製した。
粒径0.5μmのラテックス粒子(Polybead Microspheres ポリサイエンス社製)1.25%および抗G−CSF抗体〔マウスモノクローナル抗体、アールアンドディー社製〕400μgを、1mlの0.1Mホウ酸バッファー,pH8.5中で室温一晩反応させた。15,000×g,5分間の遠心上清のタンパク量を測定したところ350μgであったので、抗G−CSF抗体は1.25%ラテックス粒子1mlに50μg物理吸着した。これを1%BSAを含む0.1Mホウ酸バッファー,pH8.5で3回洗浄し、1%BSA,5%グリセロールを含むPBS(−)1mlに懸濁し、抗G−CSF抗体固相化ラテックス粒子液とした。
G−CSF(片倉工業製)を1%BSA,0.05%Tween20を含むPBS(−)に0,400,600,800,1000pg/mlとなるよう希釈した。これら各濃度のG−CSF溶液20μlに対し、アルカリフォスファターゼ標識抗G−CSF抗体1ng/mlを含む抗ヘモグロビンA1c抗体固相化ラテックス粒子液をそれぞれ40μl混合し、37℃で1時間静置した後、ピペッティングにより再懸濁して、測定液をそれぞれ12μlとり、0.20μmの孔径のセルロースアセテート製メンブレンフィルターにて作製した測定用具Aの測定液添加面(図1)中央にそれぞれ加え、直後に検出面からの発光を測定した。発光の検出には化学発光撮影装置(アトー社製)を用い、露光時間は1分とした。得られた画像を画像解析ソフトウェア〔CS Analyzer、アトー社製〕で解析し、発光強度を求めた。
II 検出面
1 片面ブチルテープ
2 メンブレンフィルター
3 孔
4 吸収材
5 マグネットシート
6 親水性多孔質粘着材
Claims (10)
- 測定対象物質を含む試料を、水不溶の粒子および標識物質で標識された結合物質と接触させる工程と、得られた試料をメンブレンフィルター上に置く工程、メンブレンフィルターに浸透した上記結合物質を検出する工程を含む、測定方法。
- 水不溶の粒子が、測定対象物質に結合する物質を保持する、請求項1に記載の測定方法。
- 標識物質が、酵素であり、メンブレンフィルターが、酵素の基質を含む、請求項1又は2に記載の測定方法。
- メンブレンフィルターが、吸収材と接触しているかまたは液体を通過させる粘着剤により貼り合わされており、メンブレンフィルターおよび/または吸収材が、酵素の基質を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の測定方法。
- 測定対象物質が、生体分子であり、上記標識物質が、測定対象物質に対する抗体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の測定方法。
- 水不溶の粒子が、ラテックス粒子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の測定方法。
- メンブレンフィルターの材質が、セルロースアセテートであり、かつ、孔径が0.8μm以下であり、ラテックス粒子の粒子径が、0.2μm以上である、請求項6に記載の測定方法。
- メンブレンフィルターの材質が、セルロースアセテートであり、かつ孔径が0.45μm以下であり、ラテックス粒子の粒子径が、0.1μm以上である、請求項6に記載の測定方法。
- 酵素の基質が、発光物質または発色物質である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の測定方法。
- 測定対象物質が、ヘモグロビンA1cである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の測定方法。
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CN114904397A (zh) * | 2021-02-09 | 2022-08-16 | 上海工程技术大学 | 一种测定滤膜孔径及孔径分布的方法 |
Citations (2)
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JPH04113270A (ja) * | 1990-09-04 | 1992-04-14 | Konica Corp | 免疫測定方法 |
JP2006226983A (ja) * | 2005-02-20 | 2006-08-31 | Shino Test Corp | 多孔性膜上に現れる輪を測定する試料中の測定対象物質の測定方法及び測定キット |
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2011
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CN114904397B (zh) * | 2021-02-09 | 2023-09-19 | 上海工程技术大学 | 一种测定滤膜孔径及孔径分布的方法 |
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