WO2013035681A1 - 電子顕微鏡用包埋樹脂組成物及び当該組成物を用いた電子顕微鏡による試料の観察方法 - Google Patents

電子顕微鏡用包埋樹脂組成物及び当該組成物を用いた電子顕微鏡による試料の観察方法 Download PDF

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WO2013035681A1
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embedding
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啓介 太田
俊幸 桐生
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学校法人久留米大学
日本カーリット株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
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    • G01N23/225—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by measuring secondary emission from the material using electron or ion

Definitions

  • the present invention relates to an embedding resin composition for an electron microscope and a method for observing a sample with an electron microscope using the composition.
  • Patent Document 1 describes a method in which an observation sample is embedded with an embedding agent and sliced and prepared with a microtome or the like.
  • an embedding agent an epoxy resin, an unsaturated polyester resin, an acrylic resin, or the like is used, and all of them are insulators.
  • Patent Document 2 describes an epoxy resin composition having antistatic ability by adding an alkali metal salt and a polyether polymer to an epoxy resin. However, since the composition does not have sufficient mechanical strength, it does not satisfy the performance as an embedding agent such as embedding performance and sliceability.
  • the present invention has been made in view of such problems of the prior art, and its purpose is to have sufficient performance as an embedding agent such as embedding performance and slicing properties, and excellent charging.
  • An object of the present invention is to provide an embedding resin composition for an electron microscope that exhibits a preventive ability and a method for observing a sample with an electron microscope using the composition.
  • the present invention includes the following inventions.
  • an ionic liquid Including an embedding agent made of epoxy resin, methacrylic acid resin or unsaturated polyester resin, An embedding resin composition for an electron microscope having antistatic ability.
  • the ionic liquid is represented by the formula (I)
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom, alkyl group, alkynyl group, alkenyl group, alkadiene group, alkatriene group, cycloalkyl group or aliphatic complex. A cyclic group, and any hydrogen atom in these groups may be substituted with a substituent, At least one of R 1 , R 2 , R 3 and R 4 is a group containing an alkenyl group, an alkadiene group, an alkatriene group or an epoxy group; R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be bonded to each other to form a ring.
  • composition according to [1] comprising an anion selected from the group consisting of: [3] The composition according to [2], wherein R 1 is an epoxy group, a glycidyl group or an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms. [4] The composition according to [2] or [3], wherein R 2 , R 3 and R 4 are each independently an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the anion is (CF 3 SO 2 ) 2 N — .
  • the non-biological sample is a resin, rubber, synthetic resin, pigment, paint, cosmetic, pharmaceutical, ceramic, magnetic material, magnetic material, semiconductor, metal, metal oxide, mineral, organic salt, or inorganic salt
  • Observation method described in 1. The observation method according to any one of [8] to [14], wherein the sample is powder.
  • the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention has sufficient performance as an embedding agent such as embedding performance and sliceability, and exhibits excellent antistatic ability.
  • the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention includes an ionic liquid and an embedding agent composed of an epoxy resin, a methacrylic acid resin or an unsaturated polyester resin, and has an antistatic ability.
  • the ionic liquid used in the present invention refers to a salt that shows a liquid state at room temperature.
  • the cation in the ionic liquid used in the present invention is not particularly limited as long as it constitutes the ionic liquid.
  • imidazolium, pyridium, pyrrolidinium, quaternary phosphonium, quaternary ammonium compounds and the like can be used. These cations may be used alone or in combination of two or more.
  • imidazolium examples include 1,3-dimethylimidazolium, 1-ethyl-3-methylimidazolium, 1-ethyl-3-methylimidazolium, 1-methyl-3-propylimidazolium, 1-butyl-3- Examples thereof include methyl imidazolium, 1-hexyl-3-methyl imidazolium, 1-butyl-2,3-dimethyl imidazolium and the like.
  • pyridinium include 1-ethylpyridinium, 1-butylpyridinium, 1-butyl-4-methylpyridinium, 1-ethyl-3-methylpyridinium, 1-ethyl-3- (hydroxymethyl) pyridinium, and the like.
  • Examples of pyrrolidinium include N-methyl-N-propylpyrrolidinium and N-methyl-N-butylpyrrolidinium.
  • Examples of the quaternary phosphonium include tributyl lauryl phosphonium, tributyl myristyl phosphonium, tributyl cetyl phosphonium, tributyl stearyl phosphonium, triphenyl lauryl phosphonium, triphenyl myristyl phosphonium, triphenyl cetyl phosphonium, triphenyl stearyl phosphonium, benzyldimethyl lauryl phosphonium, benzyl Examples thereof include dimethyl myristyl phosphonium, benzyl dimethyl cetyl phosphonium, and benzyl dimethyl stearyl phosphonium.
  • Examples of the quaternary ammonium compound include tetraalkylammonium such as tetramethylammonium, tetraethylammonium, and triethylmethylammonium; triazolium, pyridazinium, thiazolium, oxazolium, pyrimidinium, pyrazinium, and the like.
  • a quaternary ammonium compound is preferable, among which the formula (I)
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom, alkyl group, alkynyl group, alkenyl group, alkadiene group, alkatriene group, cycloalkyl group or aliphatic complex. A cyclic group, and any hydrogen atom in these groups may be substituted with a substituent, At least one of R 1 , R 2 , R 3 and R 4 is a group containing an alkenyl group, an alkadiene group, an alkatriene group or an epoxy group; R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be bonded to each other to form a ring. ) It is more preferable that it is a quaternary ammonium compound represented by.
  • alkyl group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be linear or branched, for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, For example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, tert-pentyl group, isopentyl group, 2-methylbutyl group, 1-ethylpropyl group, hexyl group, isohexyl group, 4-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2-methylpentyl group, 1-methylpentyl group, 3,3-dimethylbutyl group, 2 , 2-dimethylbutyl group, 1,1-dimethylbutyl group, 1,2-dimethylbutyl group
  • the alkyl group preferably has 1 to 12 carbon atoms, and more preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkynyl group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be linear or branched. For example, it has 2 to 15 carbon atoms, preferably 2 to 10 carbon atoms, more preferably 2 carbon atoms.
  • -6 alkynyl groups such as ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 3-butynyl group, pentynyl group, hexynyl group and the like.
  • the alkenyl group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be linear or branched.
  • -6 alkenyl groups such as vinyl group, 1-propenyl group, allyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, pentenyl group, hexenyl group, isopropenyl group, 2 -Methyl-2-propenyl group, 1-methyl-2-propenyl group, 2-methyl-1-propenyl group and the like.
  • Examples of the alkadiene group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be linear or branched, for example, an alkadiene group having 3 to 15 carbon atoms, preferably 4 to 10 carbon atoms, Specific examples include butadiene, pentadiene, hexadiene and the like.
  • Examples of the alkatriene group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be linear or branched, for example, an alkatriene group having 4 to 15 carbon atoms, preferably 6 to 12 carbon atoms. Specific examples include hexatriene, heptatriene, octatriene and the like.
  • Examples of the cycloalkyl group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 include cycloalkyl groups having 3 to 14 carbon atoms, preferably 5 to 12 carbon atoms, and more preferably 6 to 12 carbon atoms. Specifically, cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, methylcyclopentyl group, cyclohexyl group, cycloheptyl group, cyclooctyl group, 1,2-dimethylcyclopentyl group, 1,3-dimethylcyclopentyl group, 1-ethyl Examples include a -2-methylcyclopentyl group.
  • Examples of the aliphatic heterocyclic group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 include, for example, 2 to 14 carbon atoms and at least one hetero atom, preferably 1 to 3 atoms such as a nitrogen atom, oxygen Examples thereof include a 5- to 8-membered, preferably 5- or 6-membered monocyclic aliphatic heterocyclic group, polycyclic or condensed aliphatic heterocyclic group containing hetero atoms such as atoms and sulfur atoms.
  • Examples of the aliphatic heterocyclic group include pyrrolidyl-2-one group, piperidino group, piperazinyl group, morpholino group, tetrahydrofuryl group, tetrahydropyranyl group, tetrahydrothienyl group and the like.
  • Any hydrogen atom of the alkyl group, alkynyl group, alkenyl group, alkadiene group, alkatriene group, cycloalkyl group or aliphatic heterocyclic group represented by R 1 , R 2 , R 3 and R 4 is substituted with a substituent. May be.
  • the substituent is not particularly limited.
  • the number of the substituents is preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • the alkyl group as a substituent may be linear or branched, for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms. Specifically, it is the same as the alkyl group as R 1 , R 2 , R 3 and R 4 described above.
  • the alkynyl group as a substituent may be linear or branched, and examples thereof include alkynyl groups having 2 to 15 carbon atoms, preferably 2 to 10 carbon atoms, and more preferably 2 to 6 carbon atoms. Specifically, it is the same as the alkynyl group as the above R 1 , R 2 , R 3 and R 4 .
  • the alkenyl group as a substituent may be linear or branched, and examples thereof include alkenyl groups having 2 to 15 carbon atoms, preferably 2 to 10 carbon atoms, more preferably 2 to 6 carbon atoms. Is the same as the alkenyl group as R 1 , R 2 , R 3 and R 4 described above.
  • the alkadiene group as a substituent may be linear or branched, and examples thereof include an alkadiene group having 3 to 15 carbon atoms, preferably 4 to 10 carbon atoms. Specifically, the above R 1 , R 2 , The same as the alkadiene group as R 3 and R 4 .
  • the alkatriene group as a substituent may be linear or branched, and examples thereof include an alkatriene group having 4 to 15 carbon atoms, preferably 6 to 12 carbon atoms. Specifically, the above R 1 , R 2 , the same as the alkatriene group as R 3 and R 4 .
  • Examples of the cycloalkyl group as a substituent include a cycloalkyl group having 3 to 14 carbon atoms, preferably 5 to 12 carbon atoms, and more preferably 6 to 12 carbon atoms.
  • R 1 This is the same as the aliphatic heterocyclic group as R 2 , R 3 and R 4 .
  • Examples of the aliphatic heterocyclic group as a substituent include 2 to 14 carbon atoms and at least one hetero atom, preferably 1 to 3 hetero atoms such as a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom.
  • a 5- to 8-membered, preferably 5- or 6-membered monocyclic aliphatic heterocyclic group, and a polycyclic or condensed aliphatic heterocyclic group is the same as the aliphatic heterocyclic group as R 1 , R 2 , R 3 and R 4 described above.
  • Examples of the aryl group as a substituent include an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and specifically include a phenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, anthryl group, phenanthryl group, 2-biphenyl group, Examples include 3-biphenyl group, 4-biphenyl group, terphenyl group and the like.
  • Examples of the aryloxy group as a substituent include an aryloxy group having 6 to 14 carbon atoms, and specific examples include a phenoxy group, a tolyloxy group, a xylyloxy group, a naphthoxy group, and an anthryloxy group.
  • Examples of the aralkyl group as a substituent include a group in which at least one hydrogen atom of the alkyl group is substituted with the aryl group, specifically, an aralkyl group having 7 to 18 carbon atoms.
  • Examples include 4-phenylbutyl group and 5-phenylpentyl group.
  • the aromatic heterocyclic group as a substituent has, for example, 2 to 15 carbon atoms and contains at least one, preferably 1 to 3 hetero atoms such as nitrogen, oxygen and sulfur atoms as hetero atoms.
  • hetero atoms such as nitrogen, oxygen and sulfur atoms as hetero atoms.
  • examples thereof include a 5- to 8-membered, preferably 5- or 6-membered monocyclic heteroaryl group, and a polycyclic or fused-ring heteroaryl group.
  • Examples of the 5- or 6-membered monocyclic heteroaryl group, polycyclic or condensed ring heteroaryl group include a furyl group, a thienyl group, a pyrrolyl group, a pyridyl group, a pyrimidyl group, a pyrazyl group, a pyridazyl group, and a pyrazolyl group.
  • Imidazolyl group Imidazolyl group, oxazolyl group, thiazolyl group, benzofuryl group, benzothienyl group, quinolyl group, isoquinolyl group, quinoxalyl group, phthalazyl group, quinazolyl group, naphthyridyl group, cinnolyl group, benzoimidazolyl group, benzoxazolyl group, benzothiazolyl group, etc. Is mentioned.
  • the alkoxy group as a substituent may be linear, branched or cyclic, and examples thereof include an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and specifically include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an iso group.
  • alkylenedioxy group as a substituent examples include an alkylenedioxy group having 1 to 3 carbon atoms, and specifically include a methylenedioxy group, an ethylenedioxy group, a trimethylenedioxy group, and a propylenedioxy group. And isopropylidenedioxy group.
  • the alkylthio group as a substituent may be linear, branched or cyclic, and examples thereof include an alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include a methylthio group, an ethylthio group, an n-propylthio group, and an isopropyl group. Examples thereof include a thio group, an n-butylthio group, a 2-butylthio group, an isobutylthio group, a tert-butylthio group, a pentylthio group, a hexylthio group, and a cyclohexylthio group.
  • Examples of the aralkyloxy group as a substituent include an aralkyloxy group having 7 to 12 carbon atoms, and specifically include a benzyloxy group, a 1-phenylethoxy group, a 2-phenylethoxy group, and a 1-phenylpropoxy group.
  • Examples of the arylthio group as a substituent include an arylthio group having 6 to 14 carbon atoms, and specific examples include a phenylthio group, a tolylthio group, a xylylthio group, and a naphthylthio group.
  • the heteroaryloxy group as a substituent includes, for example, at least one hetero atom, preferably 1 to 3 hetero atoms such as nitrogen atom, oxygen atom, sulfur atom and the like, having 2 to 14 carbon atoms. Examples include heteroaryloxy groups, and specific examples include 2-pyridyloxy group, 2-pyrazyloxy group, 2-pyrimidyloxy group, 2-quinolyloxy group and the like.
  • Examples of the aralkylthio group as a substituent include an aralkylthio group having 7 to 12 carbon atoms, and specific examples include a benzylthio group and a 2-phenethylthio group.
  • the heteroarylthio group for example, a heteroarylthio group having 2 to 14 carbon atoms containing at least one, preferably 1 to 3 heteroatoms such as nitrogen, oxygen and sulfur atoms as heteroatoms.
  • Specific examples include 2-pyridylthio group, 4-pyridylthio group, 2-benzimidazolylthio group, 2-benzoxazolylthio group, 2-benzthiazolylthio group, and the like.
  • Examples of the substituted amino group include an amino group in which one or two hydrogen atoms of the amino group are substituted with a substituent such as an alkyl group, an aryl group, or an aralkyl group.
  • Examples of the amino group substituted with an alkyl group that is, an alkyl group-substituted amino group include an N-methylamino group, an N, N-dimethylamino group, an N, N-diethylamino group, an N, N-diisopropylamino group, an N- Examples thereof include mono- or dialkylamino groups such as a cyclohexylamino group.
  • Examples of the amino group substituted with an aryl group that is, the aryl group-substituted amino group include N-phenylamino group, N, N-diphenylamino group, N, N-ditolylamino group, N-naphthylamino group, N-naphthyl- Examples thereof include mono- or diarylamino groups such as N-phenylamino group.
  • Examples of the amino group substituted with an aralkyl group, that is, an aralkyl group-substituted amino group include mono- or diaralkylamino groups such as N-benzylamino group and N, N-dibenzylamino group.
  • one or two or more hydrogen atoms may be substituted with a halogen atom.
  • the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 is a group containing an alkenyl group, alkadiene group, alkatriene group or epoxy group.
  • the group containing an epoxy group include an epoxy group and a glycidyl group.
  • a glycidyl group is preferable from the viewpoint of reactivity.
  • the alkenyl group, alkadiene group, and alkatriene group include the same alkenyl groups as R 1 , R 2 , R 3, and R 4 described above.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 may be bonded to each other to form a ring.
  • the ring include a 3- to 10-membered ring, more preferably a 5-membered or 6-membered monocyclic or polycyclic ring, which may contain a hetero atom such as a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom.
  • any two groups may be bonded to form a ring, or three or more groups may be bonded to form a ring.
  • the ring include a methylcyclopentyl group, a cyclohexyl group, a furyl group, a thienyl group, a pyrrolyl group, and a pyridyl group.
  • R 1 is preferably an epoxy group, a glycidyl group or an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms. This is because it is a highly reactive group such as an epoxy group, a glycidyl group or an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, and exhibits excellent antistatic ability when mixed with an embedding agent.
  • Examples of the alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms represented by R 1 include a vinyl group, 1-propenyl group, allyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, pentenyl group, hexenyl group, Examples thereof include a propenyl group, a 2-methyl-2-propenyl group, a 1-methyl-2-propenyl group, and a 2-methyl-1-propenyl group.
  • R 1 is particularly preferably a glycidyl group or an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms from the viewpoint of reactivity.
  • R 2 , R 3 and R 4 are each independently preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and a methyl group or an ethyl group. It is particularly preferred. When R 2 , R 3 and R 4 are the above groups, the steric hindrance of R 1 can be prevented and sufficient reactivity can be ensured.
  • the quaternary ammonium compound is preferably a monomer or oligomer or a mixture thereof.
  • examples of the case where the quaternary ammonium compound is an oligomer include a case where the quaternary ammonium compound is a dimer, trimer or an oligomer having a molecular weight of about 1000 or less.
  • the quaternary ammonium compound is an oligomer or a mixture of a monomer and an oligomer, for example, an alkenyl group, alkadiene group, alkatriene group or epoxy group in the quaternary ammonium compound is bonded to each other between molecules to form an oligomer. And the like.
  • the quaternary ammonium compound represented by the formula (I) is preferably glycidyltrimethylammonium, ethylglycidyldimethylammonium, diethylglycidylmethylammonium or triethylglycidylammonium, particularly preferably glycidyltrimethylammonium.
  • the anion in the ionic liquid used in the present invention is not particularly limited as long as it is a conjugate base of Lewis acid constituting the ionic liquid, but BF 4 ⁇ , PF 6 ⁇ , (CF 3 SO 2 ) 2 N ⁇ , halide ion, A conjugate base of carboxylic acid, a conjugate base of sulfonic acid or a conjugate base of inorganic acid is preferred. Among them, BF 4 ⁇ , PF 6 — or (CF 3 SO 2 ) 2 N — is more preferable, and (CF 3 SO 2 ) 2 N ⁇ is particularly preferable from the viewpoint of a low melting point and high heat resistance.
  • These anions may be commercially available, or may be produced by a known method or a method analogous thereto.
  • the ionic liquid used for this invention will not be specifically limited if it is a mixture of the said cation and an anion.
  • ionic liquids include glycidyltrimethylammonium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide, ethyl glycidyldimethylammonium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide, diethyl glycidylmethylammonium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide, triethylglycidylammonium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide are preferred, and glycidyltrimethylammonium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide is particularly preferred.
  • An ionic liquid is manufactured by a well-known method, for example, can be manufactured by methods, such as mixing a cation and an anion.
  • the addition amount of the ionic liquid may be 1 to 50% by volume relative to the whole composition, preferably 5 to 35% by volume, more preferably 7.5 to 25% by volume, and 10 to 10%. Particularly preferred is 20% by volume.
  • the embedding agent used in the present invention comprises an epoxy resin, a methacrylic acid resin, or an unsaturated polyester resin.
  • the embedding agent used in the present invention may use an epoxy resin, a methacrylic acid resin or an unsaturated polyester resin subjected to a polymerization reaction, or an epoxy resin, a methacrylic acid resin or an unsaturated polyester before the polymerization reaction.
  • a resin may be used.
  • the embedding agent used in the present invention preferably contains an epoxy resin from the viewpoints of strength, embedding performance, and slicing properties.
  • the addition amount of the epoxy resin, methacrylic acid resin or unsaturated polyester resin may be 50 to 99% by volume, preferably 65 to 95% by volume, and 75 to 92.5% by volume with respect to the entire composition. % Is more preferable, and 80 to 90% by volume is particularly preferable.
  • the epoxy resin can be prepared, for example, by mixing a monomer, a polymerization initiator, a curing agent, and the like.
  • the monomer used for the epoxy resin is not particularly limited, and any of an aliphatic epoxy monomer and an aromatic epoxy monomer may be used. Moreover, each monomer may be used individually by 1 type, and 2 or more types may be mixed and used for it.
  • Examples of the aliphatic epoxy monomer include 3,4-epoxycyclohexyl methyl carboxylate, 3,4-epoxy-6-methylcyclohexyl methyl carboxylate, dimer acid glycidyl ester, hexahydrophthalic acid glycidyl ester, diglycidyl ether, butane Diol diglycidyl ether, hexahydrobisphenol A diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, trimethylolpropane triglycidyl ether, glycerin triglycidyl ether, pentaerythritol triglycidyl ether, Triglycidyl isocyanurate, tetraglycidyl-1,3-bisaminome Wunschkisan, dipentaerythrito
  • aromatic monomer examples include bisphenol A type, bisphenol F type, bisphenol AD type, bisphenol S type, novolac type, biphenyl type, glycidyl ether type, and glycidyl amine type epoxy monomers.
  • a commercially available product may be used as the monomer used for the epoxy resin, or it may be produced by a known method.
  • commercially available monomers used for epoxy resins include Araldite CY-212, Epon812, Epok812 (manufactured by ABBA).
  • the methacrylic acid resin can be prepared, for example, by mixing a monomer, a polymerization initiator, a curing agent, and the like. Although it does not specifically limit as a monomer used for a methacrylic acid resin, It is preferable to mix and use methacrylic acid ester and styrene monomers, such as methyl methacrylate and butyl methacrylate.
  • the polyester resin can be prepared, for example, by mixing a monomer, a polymerization initiator, a curing agent, and the like. Although it does not specifically limit as a monomer used for unsaturated polyester resin, It is preferable to mix and use Rigolac (brand name) and a styrene monomer.
  • the embedding agent which consists of an epoxy resin used for this invention contains a hardening
  • the curing agent is not particularly limited, and examples thereof include carboxylic acid anhydrides, amines, sulfur-containing compounds, dicyandiamide, and organic hydrazides.
  • One type of curing agent may be used alone, or two or more types may be mixed and used.
  • the carboxylic acid anhydride may be any carboxylic acid anhydride containing two or more carboxyl groups, but is preferably a carboxylic acid anhydride containing two carboxyl groups.
  • the carboxylic acid anhydride may be any of an aliphatic carboxylic acid anhydride, a cyclic aliphatic carboxylic acid anhydride, and an aromatic carboxylic acid anhydride.
  • Examples of the aliphatic carboxylic acid anhydride include acetic anhydride, maleic anhydride, propionic anhydride, succinic anhydride, acetyl succinic anhydride, 3-dodecenyl succinic anhydride (DDSA), adipic anhydride, azelaic anhydride Citrate malic anhydride, malonic anhydride, glutaric anhydride, citric anhydride, tartaric anhydride, oxoglutaric anhydride, pimelic anhydride, sebacic anhydride, itaconic anhydride, suberic anhydride And diglycolic anhydride.
  • DDSA 3-dodecenyl succinic anhydride
  • cycloaliphatic carboxylic acid anhydrides include hexahydrophthalic acid anhydride, cyclobutane dicarboxylic acid anhydride, cyclopentane dicarboxylic acid anhydride, norbornane dicarboxylic acid anhydride, hexahydrotrimellitic acid anhydride, and tetrahydrophthalic acid anhydride.
  • aromatic carboxylic acid anhydride examples include phthalic anhydride, trimellitic anhydride, pyromellitic anhydride, merophanic anhydride, naphthalic anhydride, and the like.
  • carboxylic acid anhydride any hydrogen atom or hydrocarbon group may be substituted with a substituent.
  • Examples of amines include diethylenetriamine, triethylenetetramine, diethylaminopropylamine, N-aminoethylpiperazine, bis (4-amino-3-methylcyclohexyl) methane, metaxylylenediamine, menthanediamine, 3,9-bis (3- Aminopropyl) -2,4,8,10-tetraoxaspiro [5.5] undecane and the like.
  • Examples of the sulfur-containing compound include polysulfide and polymercaptan.
  • Examples of dicyandiamide include DICY-7 manufactured by Yuka Shell Epoxy.
  • organic hydrazides examples include adipic acid hydrazide, phthalic acid hydrazide 7,11-octadecadien-1,18-carbohydrazide, bisphenol A ether dicarboxylic acid hydrazide, and the like.
  • the addition amount of the curing agent is preferably 5 to 80 phr (parts per hundred of parts per hundred of resin) with respect to the embedding agent made of epoxy resin.
  • a reaction accelerator In the embedding agent used in the present invention, a reaction accelerator, a polymerization initiator, a color pigment, a filler, a fiber, various additives, a solvent, a reactive diluent, and the like can be added as long as the effects of the invention are not hindered. .
  • Examples of the embedding agent comprising the epoxy resin used in the present invention include triethylenediamine, benzyldimethylamine (BDMA), 2- (dimethylaminomethyl) phenol (DMP-10), 2,4,6-tris (dimethyl). It preferably contains a tertiary amine such as (aminomethylphenol) (DMP-30) and a reaction accelerator such as triphenylphosphine.
  • BDMA benzyldimethylamine
  • DMP-10 2- (dimethylaminomethyl) phenol
  • 2,4,6-tris dimethyl
  • It preferably contains a tertiary amine such as (aminomethylphenol) (DMP-30) and a reaction accelerator such as triphenylphosphine.
  • the embedding agent which consists of a methacrylic acid resin or unsaturated polyester resin used for this invention contains a polymerization initiator.
  • the polymerization initiator is not particularly limited, and a thermal polymerization initiator or a photopolymerization initiator may be used.
  • the photopolymerization initiator include radical reaction initiators such as alkylphenone series, acylphosphine oxide series, and titanocene series.
  • the thermal polymerization initiator include radical reaction initiators such as benzoyl peroxide (BPO) and azobisisobutyronitrile (AIBN).
  • the embedding agent made of an epoxy resin used in the present invention preferably contains a polymerization initiator. It does not specifically limit as a polymerization initiator, You may use a photoinitiator.
  • the photopolymerization initiator include cationic polymerization initiators. For example, cations such as diazonium, sulfonium salt, iodonium, oxonium and the like and PF 6 ⁇ , SbF 6 ⁇ , (C 6 F 5 ) 4 B ⁇ , and BF 4 ⁇ are used. And salts composed of anions such as
  • the addition amount of the polymerization initiator is preferably 0.1 to 10 phr (parts per hundred, parts of resin) with respect to the embedding agent made of epoxy resin, methacrylic acid resin or unsaturated polyester resin.
  • the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention is obtained by mixing an ionic liquid and an embedding agent composed of an epoxy resin, a methacrylic acid resin or an unsaturated polyester resin.
  • the “embedded resin composition for an electron microscope” refers to a liquid, paste or slurry composition to be embedded.
  • the embedding resin composition for an electron microscope is preferably the one before curing.
  • the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention comprises mixing an ionic liquid and an embedding agent composed of an epoxy resin, a methacrylic acid resin or an unsaturated polyester resin, embedding a sample, and then performing polymerization and curing. Is preferred.
  • the polymerization of the composition can be performed by, for example, irradiation with light or heating at 40 to 80 ° C. for 24 to 96 hours.
  • the composition can be cured, for example, by heating at room temperature to 100 ° C. for 24 to 96 hours.
  • the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention has antistatic ability. Since the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention has an antistatic ability, the surface of the sample can be prevented from being charged and the sample can be observed in detail, so that sufficient resolution can be exhibited.
  • the antistatic ability of the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention may be 1.0 ⁇ 10 15 ⁇ / ⁇ or less, and 1.0 ⁇ 10 14 ⁇ / ⁇ or less in the surface resistance value of the composition. It is preferable that it is 7.5 ⁇ 10 13 ⁇ / ⁇ or less. When the surface resistance value is in the above range, charging of the sample surface can be efficiently prevented, and various non-conductive samples can be observed in detail. Moreover, sufficient resolution can be exhibited.
  • the antistatic ability it is preferable that the sample is photographed with a scanning electron microscope, the image is not charged, and no image defect or distortion is observed.
  • the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention satisfies general performances required as an embedding resin composition such as sliceability and embedding performance.
  • embedding performance means that a sufficient image is obtained when a sample is photographed with an electron microscope.
  • the slicing property means that when a sample is embedded, it can be sliced to a sufficient thickness.
  • the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention can be used for embedding treatment during sample observation with an electron microscope.
  • the sample to be embedded is not particularly limited as long as it can be used in an embedding process described later, and may be either a biological sample or a non-biological sample.
  • the biological sample is preferably an animal or plant cell or tissue.
  • plants include prokaryotes, protists, fungi, algae, land plants, and the like.
  • prokaryotes include bacteria such as Escherichia coli, lactic acid bacteria, pneumococcus, nitrite bacteria, nitrate bacteria, and sulfur bacteria; green algae such as green sulfur bacteria, red sulfur bacteria, uremo, and renjumo;
  • Examples of protozoa include protozoa and unicellular algae. Examples of protozoa include rhizopods such as amoeba; ciliates such as Paramecium; flagellates such as trypanosomes; spores such as malaria pathogens and the like.
  • Examples of the unicellular algae include Euglena, such as Euglena, Tokurigemushi; dinoflagellates, such as Tsunomo and Jakouchu;
  • Examples of fungi include slime molds and fungi.
  • Examples of slime molds include deformed fungi such as purple mold and mold fungi; and cellular slime molds such as Tama dust mold and acridosis.
  • fungi examples include oomycetes such as sphagnum mold, cotton mold, and fungi; zygomycetes such as spider mold, moldy mold, and agaric mold; aspergillus fungi such as koji mold, green mold, red bread mold, chawantake, and yeast; matsutake, shiitake, jellyfish, enoki mushroom Basidiomycetes such as; and the like.
  • algae examples include red algae such as Asakusa Nori, Proboscis, Funori, Tosaka Nori, Kawazu, etc .; Brown algae such as Kombu, Wakame, Hijiki, Mozuku, Hyundai Walla, Umichiwa; Shajikumo such as flask model;
  • terrestrial plants include moss plants such as mushrooms, mushrooms, cedar moss, sphagnum moss; fern plants such as pine balun, lizard pods, horsetail, toxa, bracken, and spring; nude plants such as cycad, ginkgo, red pine, cedar and cypress; rice, Angiosperms such as palm and orchid; and the like.
  • Examples of the animal include sponge animals, coelenterates, protozoa, pouch animals, annelids, mollusks, arthropods, fur animals, crustaceans, vertebrates and the like.
  • Examples of the sponge animals include black sponge, purple silk, and silkworm.
  • Examples of principal animals include sea anemones, corals, and hydras.
  • Examples of deformed animals include planarians, tapeworms, and mussel.
  • pouch-shaped animals include linear animals such as nematodes, nematodes, gypsophila, and spiny beetles; ring-shaped animals such as hornworms, rat worms, and stag beetles; Examples of the ring-shaped animals include earthworms, idworms, sandworms, zelkova, leeches and the like. Examples of the mollusks include clams and clams such as clams and swordfish; gastropods such as Sazae and Maimai; cephalopods such as octopus and squid; and the like.
  • arthropods include crustaceans such as daphnids, shrimps and crabs; centipedes such as catfish and geji; spiders such as spiders and mites; insects such as grasshoppers and beetles;
  • hairy animals include worms.
  • persimmon animals include sea lily, sea urchin, sea cucumber, sea urchin, starfish and the like.
  • Vertebrates include, for example, protozoa such as sea squirts, sea urchins, slugs, arachnids such as lampreys; cartilage such as sharks and rays; teleosts such as carp and saury; amphibians such as frogs and newts; And reptiles such as snakes; birds such as pigeons, swallows, pheasants, sparrows and chickens; mammals such as humans, monkeys, lions, whales, rats, cows, horses and sheep;
  • Examples of the biological sample include animal or plant cells or tissues.
  • animal cells or tissues include epidermal tissues such as the epidermis of the skin, hair, claws, inner walls of the digestive tract, capillaries, and salivary glands; connective tissues such as the dermis of skin, tendons, blood, cartilage, bone, and fat; Examples thereof include muscle tissues such as striated muscle, smooth muscle, and cardiac muscle; neural tissues such as neurons; and the like or cells thereof.
  • animal cells or tissues include digestive system organs such as oral cavity, salivary gland, esophagus, stomach, pancreas, gallbladder, liver, duodenum, small intestine, large intestine, appendix, rectum; heart, aorta, inferior vena cava, Circulatory organs such as brachial artery, brachial vein, carotid artery, jugular vein, subclavian artery, subclavian vein; respiratory organs such as trachea, bronchus, lung; draining organs such as kidney, ureter, bladder, brain, spinal cord , Nervous system organs such as peripheral nerves; skeletal system organs such as skull, spine, pelvis, femur, shoulder ribs; muscular organs such as great pectoral muscle, biceps brachii muscle, frontal muscle; gonad, oviduct, vas deferens, uterus, Reproductive organs such as placenta; endocrine
  • plant cells or tissues include skin tissue, mechanical tissue, absorptive tissue, anabolic tissue, passage tissue, storage tissue, aeration tissue, secretory tissue, and the like, or cells thereof.
  • plant cells or tissues include cells or tissues of organs such as roots, stems, leaves, seeds, and flowers.
  • the non-biological sample may be an organic material or an inorganic material.
  • the non-biological sample may exist in nature or may be artificially synthesized.
  • Examples of non-biological samples include resins, rubbers, synthetic resins, pigments, paints, cosmetics, pharmaceuticals, ceramics, magnetic materials, magnetic materials, semiconductors, metals, metal oxides, minerals, organic salts, and inorganic salts.
  • the sample to be embedded may be used as it is, or may be used after dehydration.
  • the sample to be embedded may be a water-containing sample.
  • the size of the sample is not particularly limited, and may be a powder.
  • powders include foods such as flour, coffee, salt, sugar, starch, spices and seasonings; pharmaceuticals such as granules, cosmetics and powders; metal oxides such as alumina, iron oxide and tin oxide; metals, feeds, Examples include detergents, cosmetics, pigments, powder paints, carbon toners, magnetic materials, magnetic materials, cement, glass, abrasives, sand, semiconductors, ceramics, minerals, sintered bodies, explosives, and the like.
  • the method for observing a sample with an electron microscope of the present invention includes an embedding step of embedding the sample using the above-described embedding resin composition for an electron microscope.
  • the embedding step can be carried out by a known method or a method analogous thereto, except that the above composition is used.
  • Examples of the embedding step include embedding an observation sample in the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention.
  • a non-conductive sample such as a biological sample, a non-biological sample, or a powder sample can be used as the observation sample.
  • a water-containing sample it can be embedded after dehydration using, for example, an alcohol or acetone rising series.
  • a sample not containing water such as a non-biological sample or a powder sample
  • it can be embedded as it is or mixed with the resin.
  • a biological sample what cut out the observation part after fixing a sample with glutaraldehyde etc. previously can be used.
  • the method for observing a sample with an electron microscope according to the present invention is such that the surface structure of the sample can be sufficiently observed because the embedding resin composition for an electron microscope has an antistatic ability, and the embedding for the electron microscope is performed. Since the resin composition has sufficient performance as an embedding resin composition, it can be used for embedding various samples.
  • the sample observation method using the electron microscope of the present invention can be observed using an unstained sample. By not dyeing the sample, a contrast reflecting the elemental composition of the sample itself can be obtained.
  • the method for observing a sample with the electron microscope of the present invention can include a staining step for staining the sample.
  • a staining step for staining the sample.
  • the staining step can be performed on both biological samples and non-biological samples.
  • Staining can be performed by a known method, for example, 1) en bloc staining method: osmic acid alone or tannic acid-osmic acid staining (TaO method), ferrocyanide potassium-osmium acid-thiocarbohydrazide-osmic acid Double staining (OTO method) followed by additional staining such as uranyl acetate staining, lead staining (Walton method), phosphotungstic acid staining, potassium permanganate staining, or 2) Acetic acid from the sample surface after the observation surface was created
  • a method such as direct dyeing with a uranyl solution can be used.
  • the said dyeing process may be performed before an embedding process and may be performed after an embedding process, it is preferable to perform an embedding process after a dyeing process. This is because by staining the sample in advance, sufficient staining can be performed regardless of the resin used.
  • the method for observing a sample with the electron microscope of the present invention preferably further includes a technique of slicing the sample or exposing the surface.
  • the slicing process can be performed using a known apparatus such as an ultramicrotome or a polishing apparatus.
  • the sample is preferably sliced to 50 nm to 100 nm.
  • Surface exposure is performed using an ultramicrotome using a diamond knife, or by a focused ion beam device (FIB), an ion polishing device, or a precision mechanical polishing device, and the obtained surface can be observed with a scanning electron microscope.
  • FIB focused ion beam device
  • the electron microscope used in the observation method of the present invention is not particularly limited, and may be any of a transmission electron microscope (TEM), a scanning electron microscope (SEM), and a scanning transmission electron microscope (STEM). SEM and SEM with a built-in FIB device are preferred.
  • TEM transmission electron microscope
  • SEM scanning electron microscope
  • STEM scanning transmission electron microscope
  • a scanning electron microscope (“S-800” manufactured by Hitachi, Ltd.) was used for observing the surface of the embedded sample. Further, in the observation of the non-biological sample, an SEM (“Quanta FEG (FEI)” manufactured by FEI Japan) with a built-in FIB apparatus was used for the observation of the embedded sample surface. A microtome (“UltracutE” manufactured by Reichert (currently Leica)) was used for slicing. The reagents used were commercially available products except those specifically mentioned.
  • Example 1 (Preparation of epoxy resin) Epoxy resins were prepared according to the Lucas formulation (6: 4). An EPON812 resin kit manufactured by TABB was used. As an epoxy monomer, 4.7 ml of EPON812 manufactured by Shell Chemical Co., 2.8 ml of methyl nadic acid anhydride (MNA) and 2.5 ml of dodecenyl succinic anhydride (DDSA) were mixed as a curing agent. To this was added 0.15 ml of 2,4,6-tris (dimethylaminomethyl) phenol (DMP-30) as a polymerization accelerator to obtain a pasty epoxy resin.
  • MNA methyl nadic acid anhydride
  • DDSA dodecenyl succinic anhydride
  • DMP-30 2,4,6-tris (dimethylaminomethyl) phenol
  • Rat liver tissue was used as an observation sample. After fixation with 2% glutaraldehyde + 2.5% formaldehyde solution, the liver tissue sample that had been excised was post-fixed with 2% osmic acid, 1% ferrocyanic potassium solution, and then with 1% uranyl acetate aqueous solution. Bloc staining was performed. Thereafter, the observation sample and the embedding resin composition were mixed and poured into a mold. This was heated and heated at 63 to 65 ° C. for 48 hours to polymerize and cure the embedded resin composition.
  • the cured embedding resin fat composition was sliced and cut with a diamond knife and an ultramicrotome to prepare an embedding resin composition for SEM observation in which a smooth surface was formed.
  • the composition was fixed on a SEM sample stage with silver paste, and the surface of the composition was not subjected to treatment such as conductive coating, and the smooth surface of the composition was observed with SEM.
  • Example 2 The experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the addition amount of the epoxy resin was 4.50 ml and the addition amount of GTA-TFSI was 0.50 ml.
  • Example 3 The experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the addition amount of the epoxy resin was 4.75 ml and the addition amount of GTA-TFSI was 0.25 ml.
  • Example 1 The experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the addition amount of the epoxy resin was 5.00 ml and the addition amount of GTA-TFSI was 0 ml. The results of Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 are shown in Table 1.
  • Example 1 The secondary electron image at the time of SEM observation of Example 1 is shown in FIG. From FIG. 1, it was found that charging was not observed on the sample surface, and the shape of the sample surface could be observed sufficiently. Moreover, the secondary electron image at the time of SEM observation of the comparative example 1 is shown in FIG. From FIG. 2, it was found that the sample surface was charged and the surface state could not be observed sufficiently.
  • Example 4 Preparation of embedded resin composition for electron microscope
  • 3.75 ml of the epoxy resin prepared in Example 1 and 1.25 ml of GTA-TFSI as an ionic liquid were mixed to obtain a paste-like embedding resin composition for an electron microscope.
  • Waste toner from a color copier was used as an observation sample. 5 parts by weight of the observation sample and 95 parts by weight of the embedded resin composition were mixed and poured into a mold. This was heated and heated at 63 to 65 ° C. for 48 hours to polymerize and cure the embedded resin composition.
  • the cured embedding resin fat composition was sliced and cut with a diamond knife and an ultramicrotome to prepare an embedding resin composition for SEM observation in which a smooth surface was formed.
  • the composition was fixed to the SEM sample stage with silver paste, and the surface of the composition was not subjected to treatment such as conductive coating, and the smooth surface of the composition was observed with SEM.
  • the obtained secondary electron image is shown in FIG. 3, and the reflected electron image is shown in FIG.
  • Example 2 An experiment was conducted in the same manner as in Example 4 except that a resin composition containing only 5.00 ml of epoxy resin and containing no ionic liquid was used. The obtained secondary electron image is shown in FIG. 5, and the reflected electron image is shown in FIG.
  • Example 5 A plastic sticky note (with glue) was used as an observation sample.
  • the paste-like embedding resin composition prepared in Example 1 was poured into a mold, and an observation sample was embedded.
  • the embedded resin composition was polymerized and cured by heating at 63 to 65 ° C. for 48 hours.
  • the surface of the cured resin fat composition was cut and cut with a microtome to prepare an embedding resin composition for SEM observation in which a smooth surface was formed.
  • the composition was fixed to the SEM sample stage with silver paste, and the surface of the composition was not subjected to treatment such as conductive coating, and the smooth surface of the composition was observed with SEM.
  • the obtained secondary electron image is shown in FIG. 7, and the reflected electron image is shown in FIG. Also, FIG. 9 shows a reflected electron image of the glue part of the plastic sticky note paper.
  • Example 3 An experiment was performed in the same manner as in Example 5 except that a resin composition containing only 5.00 ml of an epoxy resin and containing no ionic liquid was used. The obtained secondary electron image is shown in FIG. 10, and the reflected electron image is shown in FIG. The results of Examples 4 and 5 and Comparative Examples 2 and 3 are shown in Table 2.
  • Example 4 From the secondary electron image of Example 4 (see FIG. 3), when a mixture of epoxy resin and ionic liquid was used as the embedding resin composition, no charge was observed on the sample surface, and the shape of the waste toner was sufficiently observed. I understood that I could do it.
  • Comparative Example 2 when used as an embedding resin composition using a composition containing only an epoxy resin and not containing an ionic liquid, due to image defects or distortion, It was found that the shape of the waste toner cannot be sufficiently observed. In the reflected electron image of Example 4 (see FIG. 4), the toner composition contrast could be clearly observed. On the other hand, in the reflected electron image of Comparative Example 2 (see FIG. 6), a meaningful image could not be obtained due to the strong charging, and the composition contrast of the sample could not be observed.
  • Example 5 From the secondary electron image of Example 5 (see FIG. 7), when a mixture of epoxy resin and ionic liquid was used as the embedding resin composition, no charge was seen on the sample surface, and the shape of the plastic sticky note paper It was found that it can be observed sufficiently.
  • Comparative Example 3 when used as an embedding resin composition composed of an epoxy resin alone and containing no ionic liquid, due to image defects or distortion, It was found that the shape of plastic sticky notes cannot be observed sufficiently.
  • the backscattered electron image of Example 5 see FIG. 8
  • when a mixture of epoxy resin and ionic liquid was used as the embedded resin composition no large charge was observed on the sample surface, and the composition contrast of the sample could be observed.
  • Example 6 The waste toner embedded sample of the color copier of Example 4 was used as an observation sample.
  • the sample surface was continuously cut by FIB by 100 nm.
  • a fresh smooth surface obtained by cutting was observed by SEM in the same manner as in Example 4.
  • This cutting / observation cycle was repeated 377 times to obtain a continuous cutting image of the embedded sample.
  • the obtained image was processed with Avizo 6.3 software (VSG Inc., Bordeaux, France) and reconstructed three-dimensionally to obtain a three-dimensional image of waste toner particles.
  • the obtained image is shown in FIG.
  • the embedding resin composition for an electron microscope of the present invention includes an ionic liquid and an embedding agent composed of an epoxy resin, a methacrylic acid resin, or an unsaturated polyester resin, and has an antistatic ability, and thus is industrially useful.

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Abstract

　包埋性能、薄切性等の包埋剤としての十分な性能を有し、優れた帯電防止能を発揮する電子顕微鏡用包埋樹脂組成物及び当該組成物を用いた電子顕微鏡による試料の観察方法を提供する。　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、イオン液体と、エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤を含み、帯電防止能を有する。イオン液体が式（Ｉ）で表される第４級アンモニウム化合物及びＢＦ４ －、ＰＦ６ －、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ－、ハロゲン化物イオン、カルボン酸の共役塩基、スルホン酸の共役塩基及び無機酸の共役塩基からなる群より選択されるアニオンからなることが好ましい。

Description

電子顕微鏡用包埋樹脂組成物及び当該組成物を用いた電子顕微鏡による試料の観察方法
　本発明は、電子顕微鏡用包埋樹脂組成物及び当該組成物を用いた電子顕微鏡による試料の観察方法に関する。
　細胞、組織等の生体試料、高分子樹脂試料、無機物等の結晶性試料の極微細観察として、電子顕微鏡が一般的に用いられている。電子顕微鏡としては、走査型電子顕微鏡（以下、SEMともいう。）及び透過型電子顕微鏡（以下、TEMともいう。）が知られている。
　特許文献１には、観察用試料を包埋剤にて包埋し、ミクロトーム等により薄切し調製する方法が記載されている。包埋剤としてはエポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アクリル樹脂等が用いられているが、いずれも絶縁物である。そのため、電子顕微鏡での観察時に帯電し対象物の観察が困難となったり、電子顕微鏡内での放電現象により検出器を傷めるといった問題がある。この問題は特にＳＥＭにて絶縁物を観察する時に問題となる。
　ＳＥＭでの観察時の帯電に対し、観察方法を工夫する方法が従来用いられてきた。例えば入射電子と放出電子のバランスがある特定角度条件のもとでの観察や、低真空条件での観察や、あるいは低電流条件での観察等が従来行われてきたが、観察可能な範囲が狭く、十分なコントラストや分解能が得られず、元素分析が行えないといった問題がある。
　また、特許文献２には、エポキシ樹脂に、アルカリ金属塩とポリエーテル系高分子を添加することで、帯電防止能を有するエポキシ樹脂組成物が記載されている。しかし当該組成物は機械的強度が十分ではないため、包埋性能、薄切性等の包埋剤としての性能を満足しない。
特開平５－２６７９４号公報 特開平３－１２２１６５号公報
　本発明は、このような従来技術の有する問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は包埋性能、薄切性等の包埋剤としての十分な性能を有し、優れた帯電防止能を発揮する電子顕微鏡用包埋樹脂組成物及び当該組成物を用いた電子顕微鏡による試料の観察方法を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］イオン液体と、
　エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤を含み、
　帯電防止能を有する電子顕微鏡用包埋樹脂組成物。
［２］イオン液体が式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基、シクロアルキル基又は脂肪族複素環基であり、これらの基における任意の水素原子は置換基で置換されていてもよく、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも一つが、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基又はエポキシ基を含む基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が互いに結合し環を形成してもよい。）
で表される第４級アンモニウム化合物及び
ＢＦ４ －、ＰＦ６ －、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ－、ハロゲン化物イオン、カルボン酸の共役塩基、スルホン酸の共役塩基及び無機酸の共役塩基からなる群より選択されるアニオンからなる［１］に記載の組成物。
［３］Ｒ１が、エポキシ基、グリシジル基又は炭素数２～１０のアルケニル基である［２］に記載の組成物。
［４］Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基である［２］又は［３］に記載の組成物。
［５］第４級アンモニウム化合物がモノマー若しくはオリゴマー又はこれらの混合物である［２］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］アニオンが（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ－である［２］～［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］イオン液体の添加量が、組成物全体に対し５～３５体積％である［１］～［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の組成物を用いて試料を包埋する包埋工程を有する電子顕微鏡による試料の観察方法。
［９］試料を染色する染色工程を有し、
　染色工程の後に包埋工程を行う［８］に記載の観察方法。
［１０］電子顕微鏡が走査型電子顕微鏡である［８］又は［９］に記載の観察方法。
［１１］試料が生体試料である［８］～［１０］のいずれかに記載の観察方法。
［１２］生体試料が植物又は動物の細胞又は組織である［１１］に記載の観察方法。
［１３］試料が非生体試料である［８］～［１０］のいずれかに記載の観察方法。
［１４］非生体試料が樹脂、ゴム、合成樹脂、顔料、塗料、化粧品、医薬品、セラミック、磁性体、磁気材料、半導体、金属、金属酸化物、鉱物、有機塩又は無機塩である［１３］に記載の観察方法。
［１５］試料が粉体である［８］～［１４］のいずれかに記載の観察方法。
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、包埋性能、薄切性等の包埋剤としての十分な性能を有し、優れた帯電防止能を発揮する。
実施例１の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いて肝細胞を包埋した場合の、電子顕微鏡による観察結果を示す写真である（倍率２０００倍）。 比較例１の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いて肝細胞を包埋した場合の、電子顕微鏡による観察結果を示す写真である（倍率２０２４倍）。 実施例４の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いて廃トナーを包埋した場合の、電子顕微鏡による二次電子像の観察結果を示す写真である（倍率２００倍）。 実施例４の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いて廃トナーを包埋した場合の、電子顕微鏡による反射電子像の観察結果を示す写真である（倍率２０００倍）。 比較例２の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いて廃トナーを包埋した場合の、電子顕微鏡による二次電子像の観察結果を示す写真である（倍率２００倍）。 比較例２の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いて廃トナーを包埋した場合の、電子顕微鏡による反射電子像の観察結果を示す写真である（倍率２０００倍）。 実施例５の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いてプラスチック系付箋紙を包埋した場合の、電子顕微鏡による二次電子像の観察結果を示す写真である（倍率２００倍）。 実施例５の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いてプラスチック系付箋紙を包埋した場合の、電子顕微鏡による反射電子像の観察結果を示す写真である（倍率１２００倍）。 実施例５の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いてプラスチック系付箋紙を包埋した場合の、プラスチック系付箋紙ののり部分の反射電子像の観察結果を示す写真である（倍率５０００倍）。 比較例３の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いてプラスチック系付箋紙を包埋した場合の、電子顕微鏡による二次電子像の観察結果を示す写真である（倍率２００倍）。 比較例３の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いてプラスチック系付箋紙を包埋した場合の、電子顕微鏡による反射電子像の観察結果を示す写真である（倍率１２００倍）。 実施例６における廃トナーの三次元再構築画像を示す写真である。
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、イオン液体と、エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤を含み、帯電防止能を有する。
イオン液体
　本発明に用いるイオン液体とは、常温下で液体状態を示す塩をいう。
（カチオン）
　本発明に用いるイオン液体におけるカチオンは、イオン液体を構成するものであれば特に限定されず、例えばイミダゾリウム、ピリジウム、ピロリジニウム、第４級ホスホニウム、第４級アンモニウム化合物等を用いることができる。これらのカチオンは１種を単独又は２種以上を混合して用いてもよい。
　イミダゾリウムとしては、例えば１，３－ジメチルイミダゾリウム、１－エチル－３－メチルイミダゾリウム、１－エチル－３－メチルイミダゾリウム、１－メチル－３－プロピルイミダゾリウム、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウム、１－ヘキシル－３－メチルイミダゾリウム、１－ブチル－２，３－ジメチルイミダゾリウム等が挙げられる。
　ピリジニウムとしては、例えば１－エチルピリジニウム、１－ブチルピリジニウム、１－ブチル－４－メチルピリジニウム、１－エチル－３－メチルピリジニウム、１－エチル－３－（ヒドロキシメチル）ピリジニウム等が挙げられる。
　ピロリジニウムとしては、例えばＮ－メチル－Ｎ－プロピルピロリジニウム、Ｎ－メチル－Ｎ－ブチルピロリジニウム等が挙げられる。
　第４級ホスホニウムとしては、例えばトリブチルラウリルホスホニウム、トリブチルミリスチルホスホニウム、トリブチルセチルホスホニウム、トリブチルステアリルホスホニウム、トリフェニルラウリルホスホニウム、トリフェニルミリスチルホスホニウム、トリフェニルセチルホスホニウム、トリフェニルステアリルホスホニウム、ベンジルジメチルラウリルホスホニウム、ベンジルジメチルミリスチルホスホニウム、ベンジルジメチルセチルホスホニウム、ベンジルジメチルステアリルホスホニウム等が挙げられる。
　第４級アンモニウム化合物としては、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、トリエチルメチルアンモニウム等のテトラアルキルアンモニウム；トリアゾリウム、ピリダジニウム、チアゾリウム、オキサゾリウム、ピリミジニウム、ピラジニウム等が挙げられる。
　本発明に用いるイオン液体に用いるカチオンとしては、第４級アンモニウム化合物が好ましく、中でも式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基、シクロアルキル基又は脂肪族複素環基であり、これらの基における任意の水素原子は置換基で置換されていてもよく、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも一つが、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基又はエポキシ基を含む基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が互いに結合し環を形成してもよい。）
で表される第４級アンモニウム化合物であることがより好ましい。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表されるアルキル基としては、直鎖状でも、分岐状でもよい、例えば炭素数１～２０の直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、イソペンチル基、２－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、４－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１－メチルペンチル基、３，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、１－エチルブチル基、２－エチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、セチル基、ステアリル基などの直鎖状又は分岐状のアルキル基などが挙げられる。上記アルキル基の炭素数は１～１２であることが好ましく、１～６であることがより好ましい。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表されるアルキニル基としては、直鎖状でも分岐状でもよい、例えば炭素数２～１５、好ましくは炭素数２～１０、より好ましくは炭素数２～６のアルキニル基が挙げられ、具体的にはエチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－ブチニル基、３－ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等が挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表されるアルケニル基としては、直鎖状でも分岐状でもよい、例えば炭素数２～１５、好ましくは炭素数２～１０、より好ましくは炭素数２～６のアルケニル基が挙げられ、具体的にはビニル基、１－プロペニル基、アリル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、イソプロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基等が挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表されるアルカジエン基としては、直鎖状でも分岐状でもよい、例えば炭素数３～１５、好ましくは炭素数４～１０のアルカジエン基が挙げられ、具体的にはブタジエン、ペンタジエン、ヘキサジエン等が挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表されるアルカトリエン基としては、直鎖状でも分岐状でもよい、例えば炭素数４～１５、好ましくは炭素数６～１２のアルカトリエン基が挙げられ、具体的にはヘキサトリエン、ヘプタトリエン、オクタトリエン等が挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表されるシクロアルキル基としては、例えば炭素数３～１４、好ましくは炭素数５～１２、より好ましくは炭素数６～１２のシクロアルキル基が挙げられ、具体的にはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、１，２－ジメチルシクロペンチル基、１，３－ジメチルシクロペンチル基、１－エチル－２－メチルシクロペンチル基等が挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表される脂肪族複素環基としては、例えば炭素数２～１４で、異種原子として少なくとも１個、好ましくは１～３個の例えば窒素原子、酸素原子、硫黄原子等の異種原子を含んでいる、５～８員、好ましくは５又は６員の単環の脂肪族複素環基、多環又は縮合環の脂肪族複素環基が挙げられる。脂肪族複素環基としては、例えばピロリジル－２－オン基、ピペリジノ基、ピペラジニル基、モルホリノ基、テトラヒドロフリル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチエニル基等が挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で表されるアルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基、シクロアルキル基又は脂肪族複素環基の任意の水素原子は置換基で置換されていてもよい。上記置換基としては特に限定されないが、例えばアルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基、アリール基、アルコキシ基、アルキレンジオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、ヘテロアリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、脂肪族複素環基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、ヘテロアリールチオ基、アミノ基、置換アミノ基、シアノ基、ヒドロキシル基、オキソ基、エポキシ基、グリシジル基、ニトロ基、メルカプト基又はハロゲン原子等が挙げられる。上記置換基の数は１～３個が好ましく、１又は２個がより好ましい。
　置換基としてのアルキル基としては、直鎖状でも、分岐状でもよい、例えば炭素数１～２０の直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられる。具体的には、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としてのアルキル基と同じである。
　置換基としてのアルキニル基としては、直鎖状でも分岐状でもよい、例えば炭素数２～１５、好ましくは炭素数２～１０、より好ましくは炭素数２～６のアルキニル基が挙げられる。具体的には、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としてのアルキニル基と同じである。
　置換基としてのアルケニル基としては、直鎖状でも分岐状でもよい、例えば炭素数２～１５、好ましくは炭素数２～１０、より好ましくは炭素数２～６のアルケニル基が挙げられ、具体的には、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としてのアルケニル基と同じである。
　置換基としてのアルカジエン基としては、直鎖状でも分岐状でもよい、例えば炭素数３～１５、好ましくは炭素数４～１０のアルカジエン基が挙げられ、具体的には上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としてのアルカジエン基と同じである。
　置換基としてのアルカトリエン基としては、直鎖状でも分岐状でもよい、例えば炭素数４～１５、好ましくは炭素数６～１２のアルカトリエン基が挙げられ、具体的には上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としてのアルカトリエン基と同じである。
　置換基としてのシクロアルキル基としては、例えば炭素数３～１４、好ましくは炭素数５～１２、より好ましくは炭素数６～１２のシクロアルキル基が挙げられ、具体的には、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としての脂肪族複素環基と同じである。
　置換基としての脂肪族複素環基としては、例えば炭素数２～１４で、異種原子として少なくとも１個、好ましくは１～３個の例えば窒素原子、酸素原子、硫黄原子等のヘテロ原子を含んでいる、５～８員、好ましくは５又は６員の単環の脂肪族複素環基、多環又は縮合環の脂肪族複素環基が挙げられる。具体的には、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としての脂肪族複素環基と同じである。
　置換基としてのアリール基としては、例えば炭素数６～２０のアリール基が挙げられ、具体的にはフェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、アントリル基、フェナンスリル基、２－ビフェニル基、３－ビフェニル基、４－ビフェニル基、ターフェニル基等が挙げられる。
　置換基としてのアリールオキシ基としては、例えば炭素数６～１４のアリールオキシ基が挙げられ、具体的にはフェノキシ基、トリルオキシ基、キシリルオキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基等が挙げられる。
　置換基としてのアラルキル基としては、上記アルキル基の少なくとも１個の水素原子が上記アリール基で置換された基が挙げられ、具体的には炭素数７～１８のアラルキル基が挙げられ、具体的にはベンジル基、フェネチル基、１－フェニルプロピル基、３－ナフチルプロピル基、ジフェニルメチル基、１－ナフチルメチル基、２－ナフチルメチル基、２，２－ジフェニルエチル基、３－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、５－フェニルペンチル基等が挙げられる。
　置換基としての芳香族複素環基としては、例えば炭素数２～１５で、異種原子として少なくとも１個、好ましくは１～３個の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等の異種原子を含んでいる、５～８員、好ましくは５又は６員の単環式ヘテロアリール基、多環式又は縮合環式のヘテロアリール基が挙げられる。５又は６員の単環式ヘテロアリール基、多環式又は縮合環式のヘテロアリール基としては、例えばフリル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジル基、ピリダジル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基、フタラジル基、キナゾリル基、ナフチリジル基、シンノリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基等が挙げられる。
　置換基としてのアルコキシ基としては、直鎖状でも分岐状でも或いは環状でもよい、例えば炭素数１～６のアルコキシ基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、２－メチルブトキシ基、３－メチルブトキシ基、２，２－ジメチルプロピルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、２－メチルペンチルオキシ基、３－メチルペンチルオキシ基、４－メチルペンチルオキシ基、５－メチルペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、メトキシメトキシ基、２－エトキシエトキシ基等が挙げられる。
　置換基としてのアルキレンジオキシ基としては、例えば炭素数１～３のアルキレンジオキシ基が挙げられ、具体的にはメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、トリメチレンジオキシ基、プロピレンジオキシ基、イソプロピリデンジオキシ基等が挙げられる。
　置換基としてのアルキルチオ基としては、直鎖状でも分岐状でも或いは環状でもよい、例えば炭素数１～６のアルキルチオ基が挙げられ、具体的にはメチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ－ブチルチオ基、２－ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｔｅｒｔ－ブチルチオ基、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基、シクロヘキシルチオ基等が挙げられる。
　置換基としてのアラルキルオキシ基としては、例えば炭素数７～１２のアラルキルオキシ基が挙げられ、具体的には、ベンジルオキシ基、１－フェニルエトキシ基、２－フェニルエトキシ基、１－フェニルプロポキシ基、２－フェニルプロポキシ基、３－フェニルプロポキシ基、１－フェニルブトキシ基、３－フェニルブトキシ基、４－フェニルブトキシ基、１－フェニルペンチルオキシ基、２－フェニルペンチルオキシ基、３－フェニルペンチルオキシ基、４－フェニルペンチルオキシ基、５－フェニルペンチルオキシ基、１－フェニルヘキシルオキシ基、２－フェニルヘキシルオキシ基、３－フェニルヘキシルオキシ基、４－フェニルヘキシルオキシ基、５－フェニルヘキシルオキシ基、６－フェニルヘキシルオキシ基等が挙げられる。
　置換基としてのアリールチオ基としては、例えば炭素数６～１４のアリールチオ基が挙げられ、具体的にはフェニルチオ基、トリルチオ基、キシリルチオ基、ナフチルチオ基等が挙げられる。
　置換基としてのヘテロアリールオキシ基としては、例えば、異種原子として少なくとも１個、好ましくは１～３個の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等の異種原子を含んでいる、炭素数２～１４のヘテロアリールオキシ基が挙げられ、具体的には、２－ピリジルオキシ基、２－ピラジルオキシ基、２－ピリミジルオキシ基、２－キノリルオキシ基等が挙げられる。
　置換基としてのアラルキルチオ基としては、例えば炭素数７～１２のアラルキルチオ基が挙げられ、具体的にはベンジルチオ基、２－フェネチルチオ基等が挙げられる。
　ヘテロアリールチオ基としては、例えば異種原子として少なくとも１個、好ましくは１～３個の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等の異種原子を含んでいる、炭素数２～１４のヘテロアリールチオ基が挙げられ、具体的には、例えば２－ピリジルチオ基、４－ピリジルチオ基、２－ベンズイミダゾリルチオ基、２－ベンズオキサゾリルチオ基、２－ベンズチアゾリルチオ基等が挙げられる。
　置換アミノ基としては、例えばアミノ基の１個又は２個の水素原子がアルキル基、アリール基またはアラルキル基等の置換基で置換されたアミノ基が挙げられる。
　アルキル基で置換されたアミノ基、即ちアルキル基置換アミノ基としては、例えばＮ－メチルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ基、Ｎ－シクロヘキシルアミノ基等のモノ又はジアルキルアミノ基が挙げられる。
　アリール基で置換されたアミノ基、即ちアリール基置換アミノ基としては、例えばＮ－フェニルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジフェニルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジトリルアミノ基、Ｎ－ナフチルアミノ基、Ｎ－ナフチル－Ｎ－フェニルアミノ基等のモノ又はジアリールアミノ基が挙げられる。
　アラルキル基で置換されたアミノ基、即ちアラルキル基置換アミノ基としては、例えばＮ－ベンジルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジベンジルアミノ基等のモノ又はジアラルキルアミノ基が挙げられる。
　上記置換基は一又は二以上の水素原子がハロゲン原子で置換されていてもよい。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも一つが、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基又はエポキシ基を含む基である。
　エポキシ基を含む基としては、例えばエポキシ基、グリシジル基等が挙げられるが、反応性の観点よりグリシジル基が好ましい。
　アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基としては、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としてのアルケニル基と同じものが挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が互いに結合し環を形成してもよい。上記環としては３～１０員環、より好ましくは５員又は６員の単環又は多環が挙げられ、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等の異種原子を含んでいてもよい。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、いずれか２つの基が結合し環を形成してもよいし、３つ以上が結合し環を形成してもよい。上記環としては、例えばメチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基等が挙げられる。
　Ｒ１は、エポキシ基、グリシジル基又は炭素数２～１０のアルケニル基であることが好ましい。エポキシ基、グリシジル基又は炭素数２～１０のアルケニル基等の反応性の高い基であることで、包埋剤と混合した際に優れた帯電防止能を発揮するからである。
　Ｒ１で表される炭素数２～１０のアルケニル基としては、ビニル基、１－プロペニル基、アリル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、イソプロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基等が挙げられる。
　Ｒ１は、反応性の観点よりグリシジル基又は炭素数１～６のアルケニル基であることが特に好ましい。
　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基であることが好ましく、炭素数１～４のアルキル基であることがより好ましく、メチル基又はエチル基であることが特に好ましい。Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が上記基であることにより、Ｒ１の立体障害を防止し、十分な反応性を確保することができる。
　第４級アンモニウム化合物は、モノマー若しくはオリゴマー又はこれらの混合物であることが好ましい。第４級アンモニウム化合物がオリゴマーである場合としては、例えば第４級アンモニウム化合物が二量体、三量体又は分子量１０００程度以下のオリゴマー等である場合等が挙げられる。第４級アンモニウム化合物がオリゴマー又はモノマーとオリゴマーの混合物である場合として、例えば、第４級アンモニウム化合物中のアルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基又はエポキシ基が分子間で互いに結合し、オリゴマーを形成する場合等が挙げられる。
　式（Ｉ）で表される第４級アンモニウム化合物としては、グリシジルトリメチルアンモニウム、エチルグリシジルジメチルアンモニウム、ジエチルグリシジルメチルアンモニウム、トリエチルグリシジルアンモニウムであることが好ましく、グリシジルトリメチルアンモニウムであることが特に好ましい。
（アニオン）
　本発明に用いるイオン液体におけるアニオンは、イオン液体を構成するルイス酸の共役塩基であれば特に限定されないが、ＢＦ４ －、ＰＦ６ －、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ－、ハロゲン化物イオン、カルボン酸の共役塩基、スルホン酸の共役塩基又は無機酸の共役塩基が好ましい。中でも、融点が低い点及び耐熱性が高い点より、ＢＦ４ －、ＰＦ６ －又は（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ－がより好ましく、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ－が特に好ましい。
　これらのアニオンは、市販品を用いてもよいし、公知方法又はそれに準じる方法により製造してもよい。
（イオン液体）
　本発明に用いるイオン液体は、上記カチオン及びアニオンの混合物であれば特に限定されない。イオン液体としては、グリシジルトリメチルアンモニウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド、エチルグリシジルジメチルアンモニウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド、ジエチルグリシジルメチルアンモニウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド、トリエチルグリシジルアンモニウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミドが好ましく、グリシジルトリメチルアンモニウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミドが特に好ましい。
　イオン液体は公知の方法により製造され、例えばカチオンとアニオンを混合する等の方法により製造することができる。
　イオン液体の添加量としては、組成物全体に対し１～５０体積％であればよく、５～３５体積％であることが好ましく、７．５～２５体積％であることがより好ましく、１０～２０体積％であることが特に好ましい。
包埋剤
　本発明に用いる包埋剤は、エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる。本発明に用いる包埋剤は、重合反応を行ったエポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂を用いてもよいし、重合反応を行う前のエポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂を用いてもよい。
　本発明に用いる包埋剤は、強度、包埋性能、薄切性の観点より、エポキシ系樹脂を含むことが好ましい。
　エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂の添加量は、組成物全体に対して５０～９９体積％であればよく、６５～９５体積％であることが好ましく、７５～９２．５体積％であることがより好ましく、８０～９０体積％であることが特に好ましい。
（エポキシ系樹脂）
　エポキシ系樹脂は、例えばモノマー、重合開始剤、硬化剤等を混合することで調製できる。
　エポキシ系樹脂に用いるモノマーとしては特に限定されず、脂肪族エポキシモノマー、芳香族エポキシモノマーのいずれを用いてもよい。また、各モノマーは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
　脂肪族系エポキシモノマーとしては、例えば３，４－エポキシシクロヘキシルメチルカルボキシレート、３，４－エポキシ－６－メチルシクロヘキシルメチルカルボキシレート、ダイマー酸グリシジルエステル、ヘキサヒドロフタル酸グリシジルエステル、ジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサヒドロビスフェノールＡジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパントリグリシジルエーテル、グリセリントリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールトリグリシジルエーテル、トリグリジシルイソシアヌレート、テトラグリシジル－１，３－ビスアミノメチルヘキサン、ジペンタエリスリトールヘキサグリシジルエーテル等が挙げられる。
　芳香族モノマーとしては、例えばビスフェノールＡ型、ビスフェノールＦ型、ビスフェノールＡＤ型、ビスフェノールＳ型、ノボラック型、ビフェニル型、グリシジルエーテル型、グリシジルアミン型のエポキシモノマー等が挙げられる。
　エポキシ系樹脂に用いるモノマーは市販品を用いてもよいし、公知の方法により製造してもよい。エポキシ系樹脂に用いるモノマーの市販品としては、例えばアラルダイトＣＹ－２１２、Ｅｐｏｎ８１２、Ｅｐｏｋ８１２（以上ＡＢＢＡ社製）等が挙げられる。
（メタクリル酸樹脂）
　メタクリル酸樹脂は、例えばモノマー、重合開始剤、硬化剤等を混合することで調製できる。
　メタクリル酸樹脂に用いるモノマーとしては特に限定されないが、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ブチル等のメタクリル酸エステル及びスチレンモノマーを混合して用いることが好ましい。
（不飽和ポリエステル樹脂）
　ポリエステル樹脂は、例えばモノマー、重合開始剤、硬化剤等を混合することで調製できる。
　不飽和ポリエステル樹脂に用いるモノマーとしては特に限定されないが、リゴラック（商品名）及びスチレンモノマーを混合して用いることが好ましい。
（硬化剤）
　本発明に用いるエポキシ樹脂からなる包埋剤は、硬化剤を含むことが好ましい。硬化剤としては特に限定されず、カルボン酸無水物、アミン類、硫黄含有化合物、ジシアンジアミド、有機ヒドラジッド類等が挙げられる。硬化剤は１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を混合して使用しても良い。
　カルボン酸無水物としては、カルボキシル基を２以上含むカルボン酸の無水物であればよいが、カルボキシル基を２つ含むカルボン酸の無水物が好ましい。カルボン酸無水物は、脂肪族カルボン酸無水物、環状脂肪族カルボン酸無水物、芳香族カルボン酸無水物のいずれでもよい。
　脂肪族カルボン酸無水物としては、無水酢酸、無水マレイン酸、プロピオン酸無水物、コハク酸無水物、アセチルコハク酸無水物、３－ドデセニル無水コハク酸（ＤＤＳＡ）、アジピン酸無水物、アゼライン酸無水物、シトラリンゴ酸無水物、マロン酸無水物、グルタル酸無水物、クエン酸無水物、酒石酸無水物、オキソグルタル酸無水物、ピメリン酸無水物、セバシン酸無水物、イタコン酸無水物、スベリン酸無水物、ジグリコール酸無水物等が挙げられる。
　環状脂肪族カルボン酸無水物としては、例えばヘキサヒドロフタル酸無水物、シクロブタンジカルボン酸無水物、シクロペンタンジカルボン酸無水物、ノルボルナンジカルボン酸無水物、ヘキサヒドロトリメリット酸無水物、テトラヒドロフタル酸無水物、メチルテトラヒドロフタル酸無水物、テトラヒドロフタル酸無水物、メチルエンドメチレンテトラヒドロフタル酸無水物、クロレンド酸無水物、メチルヘキサヒドロナジック酸無水物等が挙げられる。
　芳香族カルボン酸無水物としては、無水フタル酸、トリメリット酸無水物、ピロメリット酸無水物、メロファン酸無水物、ナフタル酸無水物等が挙げられる。
　上記カルボン酸無水物は、いずれの水素原子又は炭化水素基が置換基で置換されていてもよい。
　アミン類としては、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、ジエチルアミノプロピルアミン、Ｎ－アミノエチルピペラジン、ビス（４－アミノ－３－メチルシクロヘキシル）メタン、メタキシリレンジアミン、メンタンジアミン、３，９－ビス（３－アミノプロピル）－２，４，８，１０－テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン等が挙げられる。
　硫黄含有化合物としては、ポリスルフィド、ポリメルカプタン等が挙げられる。
　ジシアンジアミドとしては、例えば油化シェルエポキシ社製のＤＩＣＹ－７等が挙げられる。
　有機ヒドラジッド類としては、例えばアジピン酸ヒドラジッド、フタル酸ヒドラジッド７，１１－オクタデカジエン－１，１８－カルボヒドラジッド、ビスフェノールＡエーテルジカルボン酸ヒドラジッド等が挙げられる。
　硬化剤の添加量は、エポキシ系樹脂からなる包埋剤に対し５～８０ｐｈｒ（parts per hundred parts of resin）であることが好ましい。
（任意成分）
　本発明に用いる包埋剤は、発明の効果を妨げない範囲で、反応促進剤、重合開始剤、着色顔料、フィラー、繊維、各種添加剤、溶剤、反応性希釈剤等を添加することができる。
（反応促進剤）
　本発明に用いるエポキシ樹脂からなる包埋剤包埋剤は、例えばトリエチレンジアミン、ベンジルジメチルアミン（ＢＤＭＡ）、２－（ジメチルアミノメチル）フェノール（ＤＭＰ－１０）、２，４，６－トリス（ジメチルアミノメチルフェノール）（ＤＭＰ－３０）等の３級アミン類、トリフェニルフォスフィン等の反応促進剤を含むことが好ましい。
（重合開始剤）
　本発明に用いるメタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤は、重合開始剤を含むことが好ましい。重合開始剤としては特に限定されず、熱重合開始剤を用いても光重合開始剤を用いてもよい。
　光重合開始剤としては、例えばアルキルフェノン系、アシルフォスフィンオキサイド系、チタノセン系等のラジカル反応開始剤が挙げられる。
　熱重合開始剤としては、例えば過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）等のラジカル反応開始剤が挙げられる。
　本発明に用いるエポキシ樹脂からなる包埋剤は、重合開始剤を含むことが好ましい。重合開始剤としては特に限定されず、光重合開始剤を用いてもよい。
　光重合開始剤としては、カチオン型重合開始剤が挙げられ、例えばジアゾニウム、スルホニウム塩、ヨードニウム、オキソニウム等のカチオンとＰＦ６ －、ＳｂＦ６ －、（Ｃ６Ｆ５）４Ｂ－、ＢＦ４ －等のアニオンからなる塩等が挙げられる。
　重合開始剤の添加量は、エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤に対し０．１～１０ｐｈｒ（parts per hundred parts of resin）であることが好ましい。
組成物の調製
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、イオン液体と、エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤を混合することにより得られる。
　本明細書において、「電子顕微鏡用包埋樹脂組成物」とは包埋に供する液状、ペースト状又はスラリー状の組成物をいう。電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、硬化を行う前のものが好ましい。
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、イオン液体と、エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤を混合し、試料を包埋した後に重合及び硬化を行うことが好ましい。組成物の重合は、例えば光の照射もしくは、４０～８０℃にて２４～９６時間加熱する等により行うことができる。また、組成物の硬化は、例えば常温～１００℃にて２４～９６時間加熱する等により行うことができる。
組成物の性能
（帯電防止能）
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、帯電防止能を有する。本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、帯電防止能を有することにより、試料表面の帯電を防止し、試料を詳細に観察することができるため、十分な分解能を発揮することができる。
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物の帯電防止能は、組成物の表面抵抗値において１．０×１０１５Ω／□以下であればよく、１．０×１０１４Ω／□以下であることが好ましく、７．５×１０１３Ω／□以下であることが特に好ましい。表面抵抗値が上記範囲にあることにより、試料表面の帯電を効率的に防止し、様々な非導電性試料を詳細に観察することができる。また、十分な分解能を発揮することができる。
　帯電防止能は、試料を走査型電子顕微鏡で撮影し、画像に帯電が見られず、画像不良や歪みが見られないことが好ましい。
（包埋樹脂組成物としての性能）
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、薄切性、包埋性能等の包埋樹脂組成物として要求される一般的性能を満たす。
　なお、包埋性能とは、試料を電子顕微鏡にて撮影した際に十分な画像が得られることをいう。また、薄切性とは、試料を包埋した際に、十分な薄さに薄切できることをいう。
（用途）
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、電子顕微鏡による試料観察時の包埋処理に用いることができる。
　包埋する試料は、後述する包埋工程に用いることができれば特に限定されず、生体試料、非生体試料のいずれであってもよい。
（生体試料）
　生体試料は、動物又は植物の細胞又は組織であることが好ましい。
　植物としては、例えば原核生物、原生生物、菌類、藻類、陸上植物等が挙げられる。
　原核生物としては、例えば大腸菌、乳酸菌、肺炎双球菌、亜硝酸菌、硝酸菌、硫黄細菌等の細菌類；緑色硫黄細菌、紅色硫黄細菌、ユレモ、ネンジュモ等のラン藻類；等が挙げられる。
　原生生物としては、例えば原生動物、単細胞藻類等が挙げられる。原生動物としては、例えばアメーバ等の根足虫類；ゾウリムシ等の繊毛虫類；トリパノゾーマ等のべん毛虫類；マラリア病原菌等の胞子虫類等が挙げられる。単細胞藻類としては、例えばミドリムシ、トックリヒゲムシ等のミドリムシ類；ツノモ、ヤコウチュウ等の渦ベン毛藻類；ハネケイソウ、フナガタケイソウ等のケイ藻類；等が挙げられる。
　菌類としては、例えば粘菌類、真菌類等が挙げられる。粘菌類としては、例えばムラサキホコリカビ、ケホコリカビ等の変形菌類；タマホコリカビ、アクラシス等の細胞性粘菌類；等が挙げられる。真菌類としては、例えばミズカビ、ワタカビ、フハイカビ等の卵菌類；クモノスカビ、ケカビ、トリモチカビ等の接合菌類；コウジカビ、アオカビ、アカパンカビ、チャワンタケ、酵母菌等の子のう菌類；マツタケ、シイタケ、キクラゲ、エノキダケ等の担子菌類；等が挙げられる。
　藻類としては、例えばアサクサノリ、テングサ、フノリ、トサカノリ、カワモズク等の紅藻類；コンブ、ワカメ、ヒジキ、モズク、ホンダワラ、ウミウチワ等の褐藻類；ボルボックス、クラミドモナス、クロレラ、アオサ、カサノリ等の緑藻類；シャジクモ、フラスコモ等のシャジクモ類；等が挙げられる。
　陸上植物としては、例えばゼニゴケ、シャゴケ、スギゴケ、ミズゴケ等のコケ植物；マツバラン、ヒカゲノカズラ、スギナ、トクサ、ワラビ、ゼンマイ等のシダ植物；ソテツ、イチョウ、アカマツ、スギ、ヒノキ等の裸子植物；イネ、ヤシ、ラン等の被子植物；等が挙げられる。
　動物としては、例えば海綿動物、腔腸動物、へん形動物、袋形動物、環形動物、軟体動物、節足動物、毛がく動物、きょく皮動物、脊椎動物等が挙げられる。
　海綿動物としては、例えばクロイソカイメン、ムラサキカイメン、カイロウドウケツ等が挙げられる。校長動物としては、例えばイソギンチャク、サンゴ、ヒドラ等が挙げられる。へん形動物としては、例えばプラナリア、サナダムシ、コウガイビル等が挙げられる。袋形動物としては、センチュウ、カイチュウ、ギョウチュウ、ハリガネムシ等の線形動物；ツボワムシ、ネズミワムシ、ヒルガタワムシ等の輪形動物；等が挙げられる。
　環形動物としては、例えばミミズ、イドミミズ、ゴカイ、ケヤリ、ヒル等が挙げられる。軟体動物としては、例えばハマグリ、シジミ等のおの足類；サザエ、マイマイ等の腹足類；タコ、イカ等の頭足類；等が挙げられる。節足動物としては、例えばミジンコ、エビ、カニ等の甲殻類；オオムカゲ、ゲジ等のムカデ類；ジョロウグモ、ダニ等のクモ類；バッタ、カブトムシ等の昆虫類；等が挙げられる。毛がく動物としては、例えばオオヤムシ等が挙げられる。きょく皮動物としては、例えばウミユリ、ウミシダ、ナマコ、ウニ、ヒトデ等が挙げられる。
　脊椎動物としては、例えばホヤ、ウミタル、ナメクジウオ等の原索動物；ヤツメウナギ等の無がく類；サメ、エイ等の軟骨魚類；コイ、サンマ等の硬骨魚類；カエル、イモリ等の両生類；トカゲ、カメ、ヘビ等のは虫類；ハト、ツバメ、キジ、スズメ、ニワトリ等の鳥類；ヒト、サル、ライオン、クジラ、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ等のほ乳類；等が挙げられる。
　生体試料としては、例えば動物又は植物の細胞又は組織が挙げられる。
　動物の細胞又は組織としては、例えば皮膚の表皮、毛、つめ、消化管内壁、毛細血管、だ液腺等の上皮組織；皮膚の真皮、腱、血液、軟骨、骨、脂肪等の結合組織；横紋筋、平滑筋、心筋等の筋組織；ニューロン等の神経組織；等又はその細胞が挙げられる。
　また、動物の細胞又は組織としては、例えば口腔、だ液腺、食道、胃、膵臓、胆嚢、肝臓、十二指腸、小腸、大腸、虫垂、直腸等の消化系器官；心臓、大動脈、下大静脈、上腕動脈、上腕静脈、頸動脈、頸静脈、鎖骨下動脈、鎖骨下静脈等の循環系器官；気管、気管支、肺等の呼吸系器官；腎臓、輸尿管、膀胱等の排出系器官、脳、脊髄、末梢神経等の神経系器官；頭蓋骨、脊柱、骨盤、大腿骨、肩胛骨等の骨格系器官；大胸筋、上腕二頭筋、前頭筋等の筋肉系器官；生殖腺、輸卵管、輸精管、子宮、胎盤等の生殖系器官；脳下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、膵臓、生殖腺等の内分泌系器官；目、耳、鼻、舌、皮膚等の感覚系器官；等の器官の細胞又は組織が挙げられる。
　植物の細胞又は組織としては、例えば皮膚組織、機械組織、吸収組織、同化組織、通道組織、貯蔵組織、通気組織、分泌組織等又はその細胞が挙げられる。
　また、植物の細胞又は組織としては、例えば根、茎、葉、種子、花等の器官の細胞又は組織が挙げられる。
（非生体試料）
　非生体試料は、有機物であってもよいし、無機物であってもよい。非生体試料は、自然界に存在するものであってもよいし、人工的に合成したものであってもよい。非生体試料としては、例えば樹脂、ゴム、合成樹脂、顔料、塗料、化粧品、医薬品、セラミック、磁性体、磁気材料、半導体、金属、金属酸化物、鉱物、有機塩又は無機塩等が挙げられる。
　包埋する試料は、採取したものをそのまま用いてもよいし、脱水処理を行った後に用いてもよい。また、包埋する試料は含水試料であってもよい。
　試料の大きさは特に限定されず、粉体であってもよい。粉体としては、例えば小麦粉、コーヒー、塩、砂糖、デンプン、香辛料、調味料等の食品；顆粒、化粧品、粉薬等の医薬品；アルミナ、酸化鉄、酸化錫等の金属酸化物；金属、飼料、洗剤、化粧品、顔料、粉体塗料、カーボントナー、磁性体、磁気材料、セメント、ガラス、研磨剤、砂、半導体、セラミックス、鉱物、焼結体、火薬等が挙げられる。
電子顕微鏡による試料の観察方法
（包埋工程）
　本発明の電子顕微鏡による試料の観察方法は、上記電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を用いて試料を包埋する包埋工程を有する。
　包埋工程は、上記組成物を用いる以外は公知の方法またはこれに準ずる方法により行うことができる。包埋工程としては、例えば観察試料を本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物に埋め込むこと等が挙げられる。上記工程において、観察試料としては例えば生体試料、非生体試料、粉体試料等の非導電性試料を用いることができる。含水試料の場合は、例えばアルコールもしくはアセトン上昇系列等を用い脱水した後に包埋することができる。例えば非生体試料、粉体試料等の水を含まない試料の場合は、樹脂にそのまま、または混和することで包埋ができる。なお生体試料を用いる場合、予め試料をグルタールアルデヒド等で固定した後に観察部分を切り出したもの等を用いることができる。
　本発明の電子顕微鏡による試料の観察方法は、上記電子顕微鏡用包埋樹脂組成物が帯電防止能を有することにより、試料の表面構造を十分に観察することができる、また上記電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は包埋樹脂組成物として十分な性能を有するため、様々な試料の包埋に用いることができる。
（無染色試料）
　本発明の電子顕微鏡による試料の観察方法は、無染色試料を用いて観察することができる。試料に染色を行わないことで、試料自身の元素組成を反映したコントラストを得ることができる。
（染色工程）
　本発明の電子顕微鏡による試料の観察方法は、試料を染色する染色工程を有することができる。染色工程を有することで、表面構造または内部構造を詳細に観察できる。染色工程は、生体試料、非生体試料のいずれに対しても行うことができる。
　染色は公知の方法により行うことができ、例えば１）en bloc染色法：オスミウム酸単独、もしくはタンニン酸－オスミウム酸染色(TaO法)、フェロシアン化カリ－オスミウム酸－チオカルボハイドラザイド－オスミウム酸重染色(OTO法)の後、酢酸ウラニル染色、鉛染色(Walton法)、リンタングステン酸染色、過マンガン酸カリ染色等の追加染色をおこなう、や２）観察面作成後の試料表面からの酢酸ウラニル溶液にて直接染色する、等の方法を用いることができる。
　上記染色工程は包埋工程の前に行ってもよいし、包埋工程の後に行ってもよいが、染色工程の後に包埋工程を行うことが好ましい。予め試料を染色しておくことにより、使用する樹脂によらず十分な染色が行えるからである。
（観察面作製工程）
　本発明の電子顕微鏡による試料の観察方法は、さらに試料を薄切もしくは表面を露出する手技を有することが好ましい。薄切工程は、ウルトラミクロトームや研磨装置等の公知の装置を用いて行うことができる。薄切工程において、試料は50ｎｍ～100ｎｍに薄切することが好ましい。表面露出はダイヤモンドナイフを用いたウルトラミクロトームを用いるか、収束イオンビーム装置（ＦＩＢ）、イオン研磨装置、精密機械研磨装置によって行い、得られた表面を走査型電子顕微鏡で観察できる。
　本発明の観察方法で用いる電子顕微鏡としては特に限定されず、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）のいずれでもよいが、表面観察という点でＳＥＭ、およびＦＩＢ装置を内蔵したＳＥＭが好ましい。
　以下例を挙げて本願発明を説明するが、本願発明はこれらに限定されるものではない。
　生体試料の観察において、包埋試料表面観察には走査型電子顕微鏡（日立社製の「Ｓ－８００」）を用いた。また、非生体試料の観察において、包埋試料表面観察にはＦＩＢ装置を内蔵したＳＥＭ（日本ＦＥＩ社製「Ｑｕａｎｔａ　ＦＥＧ（ＦＥＩ）」）を用いた。
　薄切にはミクロトーム（ライヘルト社（現ライカ社）製の「UltracutE」）を用いた。
　用いた試薬は、特記あるものを除き市販品を用いた。
（評価方法）
　重合性は、組成物が重合した場合を良好とした。
　薄切性は、組成物を用いて試料を包埋した場合に、試料を５０ｎｍに薄切できた場合を良好とした。
　包埋性能は、試料をＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）で撮影し、イオン液体を含まない組成物を包埋剤として用いた場合と遜色ない画像が得られた場合を良好とした。
　生体試料の観察において、帯電防止能は、表面抵抗が１．０×１０１５以下の場合を良好とした。また、非生体試料の観察において、帯電防止能は、試料を走査型電子顕微鏡で撮影し、画像に帯電が見られず、画像不良や歪みが見られない場合を良好とした。
生体試料の観察（実施例１～３，比較例１）
（実施例１）
（エポキシ系樹脂の調製）
　Ｌｕｆｔの処方（６：４）に従い、エポキシ系樹脂を調製した。ＴＡＢＢ社製のＥＰＯＮ８１２樹脂キットを用いた。エポキシモノマーとしてShell Chemical社製のＥＰＯＮ８１２を４．７ｍｌ、硬化剤として無水メチルナディック酸（ＭＮＡ）を２．８ｍｌ及び無水ドデセニールコハク酸（ＤＤＳＡ）を２．５ｍｌ混合した。これに重合促進剤として2,4,6－トリス（ジメチルアミノメチル）フェノール（ＤＭＰ－３０）を０．１５ｍｌ加え、ペースト状のエポキシ系樹脂を得た。
（電子顕微鏡用包埋樹脂組成物の調製）
　上記エポキシ系樹脂を４．００ｍｌ、イオン液体としてＮ－グリシジルトリメチルアンモニウムビス(トリフルオロメタンスルニル)イミド（日本カーリット社製、以下「ＧＴＡ－ＴＦＳＩ」ともいう。）を１．００ｍｌ混合し、ペースト状の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を得た。
（包埋処理）
　観察試料としてラットの肝組織を用いた。２％グルタールアルデヒド＋２．５％フォルムアルデヒド液にて固定後、切り出しを行った肝臓組織試料を２％オスミウム酸、１％フェロシアンカリウム溶液にて後固定後、１％酢酸ウラニル水溶液にてｅｎ　ｂｌｏｃ染色を行った。
　その後、観察試料と包埋樹脂組成物を混和し、型に流し込んだ。これを加熱し、６３～６５℃にて４８時間加熱し、包埋樹脂組成物の重合及び硬化を行った。硬化した包埋樹脂脂組成物をダイヤモンドナイフ及びウルトラミクロトームにて薄切・切削し、平滑面が形成されたＳＥＭ観察用の包埋樹脂組成物を作成した。その組成物を銀ペーストにてＳＥＭ試料台に固定し、表面に導電コーティング等の処理は行なわず、組成物の平滑面をＳＥＭにて観察した。
（実施例２）
　エポキシ系樹脂の添加量を４．５０ｍｌ、ＧＴＡ－ＴＦＳＩの添加量を０．５０ｍｌとした以外は実施例１と同様に実験を行った。
（実施例３）
　エポキシ系樹脂の添加量を４．７５ｍｌ、ＧＴＡ－ＴＦＳＩの添加量を０．２５ｍｌとした以外は実施例１と同様に実験を行った。
（比較例１）
　エポキシ系樹脂の添加量を５．００ｍｌ、ＧＴＡ－ＴＦＳＩの添加量を０ｍｌとした以外は実施例１と同様に実験を行った。
　実施例１～３及び比較例１の結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（評価）
　実施例１～３の包埋樹脂組成物は、薄切性、包埋性能という包埋樹脂組成物の基本性能を保ちつつ、十分な帯電防止能を有することが分かった。
　実施例１のＳＥＭ観察時の二次電子像を図１に示す。図１より、試料表面に帯電は見られず、試料の表面の形状を十分観察できることが分かった。
　また、比較例１のＳＥＭ観察時の二次電子像を図２に示す。図２より、試料表面が帯電し、表面状態が十分に観察できないことが分かった。
非生体試料の観察（実施例４，５，比較例２，３）
（実施例４）
（電子顕微鏡用包埋樹脂組成物の調製）
　実施例１で調製したエポキシ系樹脂を３．７５ｍｌ、イオン液体としてＧＴＡ－ＴＦＳＩを１．２５ｍｌ混合し、ペースト状の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物を得た。
（包埋処理）
　観察試料としてカラーコピー機の廃トナーを用いた。観察試料を５重量部、包埋樹脂組成物を９５重量部混和し、型に流し込んだ。これを加熱し、６３～６５℃にて４８時間加熱し、包埋樹脂組成物の重合及び硬化を行った。
　硬化した包埋樹脂脂組成物をダイヤモンドナイフ及びウルトラミクロトームにて薄切・切削し、平滑面が形成されたＳＥＭ観察用の包埋樹脂組成物を作成した。その組成物を銀ペーストにてＳＥＭ試料台に固定し、表面に導電コーティング等の処理を行わず、組成物の平滑面をＳＥＭにて観察した。得られた二次電子像を図３に、反射電子像を図４にそれぞれ示す。
（比較例２）
　エポキシ系樹脂５．００ｍｌのみからなり、イオン液体を含まない樹脂組成物を用いた以外は、実施例４と同様に実験を行った。得られた二次電子像を図５に、反射電子像を図６にそれぞれ示す。
（実施例５）
　観察試料としてプラスチック系付箋紙（のり付き）を用いた。実施例１で調製したペースト状の包埋樹脂組成物を型に流し込み、観察試料を埋入した。６３～６５℃にて４８時間加熱し、包埋樹脂組成物を重合及び硬化させた。硬化した樹脂脂組成物の表面をミクロトームにて薄切・切削し、平滑面が形成されたＳＥＭ観察用の包埋樹脂組成物を作成した。その組成物を銀ペーストにてＳＥＭ試料台に固定し、表面に導電コーティング等の処理を行わず、組成物の平滑面をＳＥＭにて観察した。得られた二次電子像を図７に、反射電子像を図８にそれぞれ示す。また、プラスチック系付箋紙ののり部分の反射電子像を図９に示す。
（比較例３）
　エポキシ系樹脂５．００ｍｌのみからなり、イオン液体を含まない樹脂組成物を用いた以外は、実施例５と同様に実験を行った。得られた二次電子像を図１０に、反射電子像を図１１にそれぞれ示す。
　実施例４，５及び比較例２，３の結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（評価）
　表２より、実施例４及び５の包埋樹脂組成物は、薄切性、包埋性能という包埋樹脂組成物の基本性能を保ちつつ、十分な帯電防止能を有することが分かった。
　実施例４の二次電子像（図３参照）より、エポキシ系樹脂とイオン液体の混合物を包埋樹脂組成物として用いた場合、試料表面に帯電は見られず、廃トナーの形状を十分観察できることが分かった。一方、比較例２の二次電子像（図４参照）より、エポキシ系樹脂のみからなり、イオン液体を含まない組成物を用いた包埋樹脂組成物として用いた場合、画像不良や歪みにより、廃トナーの形状を十分に観察することができないことが分かった。
　実施例４の反射電子像（図４参照）において、トナーの組成コントラストを明瞭に観察することができた。一方、比較例２の反射電子像（図６参照）において、強度の帯電により意味のある画像を得ることはできず、試料の組成コントラストの観察は不可能であった。
　実施例５の二次電子像（図７参照）より、エポキシ系樹脂とイオン液体の混合物を包埋樹脂組成物として用いた場合、試料表面に帯電は見られず、プラスチック系付箋紙の形状を十分観察できることが分かった。一方、比較例３の二次電子像（図１０参照）より、エポキシ系樹脂のみからなり、イオン液体を含まない組成物を用いた包埋樹脂組成物として用いた場合、画像不良や歪みにより、プラスチック系付箋紙の形状を十分に観察することができないことが分かった。
　実施例５の反射電子像（図８参照）において、エポキシ系樹脂とイオン液体の混合物を包埋樹脂組成物として用いた場合、試料表面に大きな帯電は見られず、試料の組成コントラストを観察可能であることがわかった。また、試料ののり部分も明瞭に観察することができた（図９参照）。一方、比較例３の反射電子像（図１１参照）において、強度の帯電による強いノイズが見られ、試料を十分に観察することができないことが分かった。
（実施例６）
　観察試料として実施例４のカラーコピー機の廃トナー包埋試料を用いた。試料表面をFIBにて１００ｎｍずつ連続切削した。切削により得られた新鮮な平滑面を、実施例４と同様の方法によりＳＥＭ観察した。この切削・観察のサイクルを３７７回繰り返し包埋試料の連続切削像を取得した。（観察領域：42μm×42μm×38μm, Voxel Size:41.6nｍ×41.6nｍ×100nm）。得られた画像をAvizo 6.3 software(VSG Inc., Bordeaux, France) にて処理し、三次元的再構築をおこない、廃トナー粒子の立体画像を得た。得られた画像を図１２に示す。
（評価）
　実施例６の三次元構築画像（図１２参照）より、エポキシ系樹脂とイオン液体の混合物を包埋樹脂組成物として用いることで、帯電の影響なく廃トナーの三次元構造を詳細に観察できることが分かった。
　本発明の電子顕微鏡用包埋樹脂組成物は、イオン液体と、エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤を含み、帯電防止能を有するため、産業上有用である。

Claims (15)

  1. 　イオン液体と、
    　エポキシ系樹脂、メタクリル酸樹脂又は不飽和ポリエステル樹脂からなる包埋剤を含み、
    　帯電防止能を有する電子顕微鏡用包埋樹脂組成物。
  2. 　イオン液体が式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基、シクロアルキル基
    又は脂肪族複素環基であり、これらの基における任意の水素原子は置換基で置換されていてもよく、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも一つが、アルケニル基、アルカジエン基、アルカトリエン基又はエポキシ基を含む基であり、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が互いに結合し環を形成してもよい。）
    で表される第４級アンモニウム化合物及び
    ＢＦ４ －、ＰＦ６ －、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ－、ハロゲン化物イオン、カルボン酸の共役塩基、スルホン酸の共役塩基及び無機酸の共役塩基からなる群より選択されるアニオンからなる請求項１に記載の組成物。
  3. 　Ｒ１が、エポキシ基、グリシジル基又は炭素数２～１０のアルケニル基である請求項２に記載の組成物。
  4. 　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基である請求項２又は３に記載の組成物。
  5. 　第４級アンモニウム化合物がモノマー若しくはオリゴマー又はこれらの混合物である請求項２～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 　アニオンが（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ－である請求項２～５のいずれかに記載の組成物。
  7. 　イオン液体の添加量が、組成物全体に対し５～３５体積％である請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の組成物を用いて試料を包埋する包埋工程を有する電子顕微鏡による試料の観察方法。
  9. 　試料を染色する染色工程を有し、
    　染色工程の後に包埋工程を行う請求項８に記載の観察方法。
  10. 　電子顕微鏡が走査型電子顕微鏡である請求項８又は９に記載の観察方法。
  11. 　試料が生体試料である請求項８～１０のいずれかに記載の観察方法。
  12. 　生体試料が植物又は動物の細胞又は組織である請求項１１に記載の観察方法。
  13. 　試料が非生体試料である請求項８～１０のいずれかに記載の観察方法。
  14. 　非生体試料が樹脂、ゴム、合成樹脂、顔料、塗料、化粧品、医薬品、セラミック、磁性体、磁気材料、半導体、金属、金属酸化物、鉱物、有機塩又は無機塩である請求項１３に記載の観察方法。
  15. 　試料が粉体である請求項８～１４のいずれかに記載の観察方法。
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