CN117554150B - 一种放射虫化石的定向包埋方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种放射虫化石的定向包埋方法及检测方法，属于仪器测试技术领域，用以解决现有技术中无法定向包埋使得待测试的样品表面朝上、无法控制样品上表面胶的厚度以及不能同时满足包埋剂渗入样品内部孔隙、固化后的硬度与样品的硬度接近、固化后的包埋剂的图像灰度明显区别于放射虫化石的图像灰度中至少一个问题。该方法包括将放射虫化石样品的待切割溅射表面朝上；制备包埋剂；吸取包埋剂，滴于放射虫化石样品的表面；将包埋剂渗透至放射虫化石样品内部，充分固化。本发明可用于放射虫化石的包埋和检测。
Description
技术领域
本发明属于仪器测试技术领域，尤其涉及一种放射虫化石的定向包埋方法及检测方法，可广泛应用于硅酸盐类放射虫化石样品测试中。
背景技术
放射虫化石个体的直径大约在数十微米至数百微米，属于肉眼不能识别的微体化石，分类学上为了观察重建其壳内的骨骼结构，通常使用聚焦离子束扫描电子显微镜(镓离子束)对其进行横截面暴露及成像，在暴露和成像之前，需要对样品进行包埋预处理，以保持其内部的孔隙和结构不被损坏。
常规的包埋方式是将化石放入合适的包埋盒中，再倒入包埋剂进行固化。但是，一方面，由于样品小且轻，其会在包埋剂中飘浮旋转，无法定向包埋使得待测试的表面朝上；另一方面，此种方法无法控制样品上表面胶的厚度；再一方面，常规的包埋剂不能同时满足以下三个要求：固化前的包埋剂渗入样品内部孔隙，固化后的包埋剂耐受镓离子束的轰击，其硬度与样品的硬度接近；固化后的包埋剂二次电子或背散射电子图像的灰度明显区别于硅质的放射虫化石二次电子或背散射电子图像。
发明内容
鉴于上述分析，本发明旨在提供一种放射虫化石的定向包埋方法及检测方法，用以解决现有技术中无法定向包埋使得待测试的表面朝上、无法控制样品上表面胶的厚度以及不能同时满足包埋剂渗入样品内部孔隙、固化后的硬度与样品的硬度接近、固化后的包埋剂的图像灰度明显区别于放射虫化石的图像灰度中至少一个问题。
本发明的目的主要是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种放射虫化石的定向包埋方法，包括如下步骤：
步骤1：将放射虫化石样品的待切割溅射表面朝上；
步骤2：制备包埋剂，包埋剂的组成按质量份数计包括双酚F环氧树脂2份和三乙烯四胺固化剂1～1.2份；
步骤3：吸取包埋剂，滴于放射虫化石样品的表面；
步骤4：吸取放射虫化石样品侧面多余的包埋剂，得到包埋的放射虫化石样品；
步骤5：将包埋剂渗透至放射虫化石样品内部，得到渗透的放射虫化石样品；
步骤6：对渗透的放射虫化石样品进行充分固化，得到包埋固化后的放射虫化石样品。
进一步地，步骤4中，包埋剂的高度不低于放射虫化石样品待切割溅射表面的最高处。
进一步地，步骤4中，包埋剂覆盖放射虫化石样品待切割溅射表面的厚度小于50μm。
进一步地，步骤1包括如下步骤：
步骤11：将双面导电碳胶粘在样品台上；
步骤12：将放射虫化石样品的待切割溅射的表面朝上放置；
步骤13：采用红貂毛笔粘取放射虫化石样品放在样品台的双面导电碳胶上。
进一步地，双面导电碳胶为铝基底类型的双面导电碳胶。
进一步地，步骤2包括如下步骤：
步骤21：提供两份双酚F环氧树脂和一份三乙烯四胺固化剂，将第一份双酚F环氧树脂和一份三乙烯四胺固化剂搅拌混合，得到第一混合溶液；
步骤22：将第二份双酚F环氧树脂与第一混合溶液搅拌混合至质地均匀，得到包埋剂。
进一步地，第一份双酚F环氧树脂与三乙烯四胺固化剂的质量比为1：1～1.2。
进一步地，第二份双酚F环氧树脂与三乙烯四胺固化剂的质量比为1：1～1.2。
进一步地，步骤21中，将第一份双酚F环氧树脂倒入容器中，将三乙烯四胺固化剂沿着容器的内壁倒入第一份双酚F环氧树脂；
和/或，步骤22中，将第二份双酚F环氧树脂沿着容器的内壁倒入第一混合溶液中。
本发明还提供了一种放射虫化石的检测方法，包括如下步骤：
提供一包埋固化后的放射虫化石样品，包埋固化后的放射虫化石样品采用上述定向包埋方法制得。
与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果：
本发明提供的放射虫化石的定向包埋方法，一方面，在包埋过程中能够实现放射虫化石的定向，控制放射虫化石样品的包埋深度，包埋剂能够充分填充放射虫化石样品的内部，对放射虫化石样品的内部结构进行有效支撑，且固化后的包埋剂具有与放射虫化石样品接近的溅射速率，从而更加有利于进行下一步镓离子束的精细加工，实现放射虫化石指定位置的截面成像，获得全新的放射虫化石样品内部信息的同时，还能够节约时间、资源。另一方面，采用上述包埋方法包埋的样品所获得的截面二次电子图像中，化石与包埋胶的衬度差异大，分析软件能够成功识别并提取的化石的图像信息，无需人工手画以区分图片中的信息，能够有效节省人工成本投入，减少人为的干扰因素。
本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分的从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图仅用于示出具体发明的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。
图1为本发明提供的放射虫化石的定向包埋方法中放射虫化石样品的位置示意图；
图2为本发明提供的放射虫化石的检测方法中溅射截面的位置示意图；
图3为本发明实施例1获取放射虫化石样品的横截面显微图像；
图4为本发明实施例1基于灰度提取出显微图像中的化石图像；
图5为对比例1获取放射虫化石样品的横截面显微图像；
图6为对比例2获取放射虫化石样品的横截面显微图像。
附图标记：
1-包埋剂；2-放射虫化石样品；3-样品台；4-双面导电碳胶；5-溅射截面。
具体实施方式
下面结合附图来具体描述本发明的优选发明，其中，附图构成本发明的一部分，并与本发明的发明一起用于阐释本发明的原理。
本发明提供了一种放射虫化石的定向包埋方法，包括如下步骤：
步骤1：将放射虫化石样品2置于样品台3上，放射虫化石样品2的待切割溅射表面朝上；
步骤2：制备包埋剂1，包埋剂1的组成按质量份数计包括双酚F环氧树脂2份和三乙烯四胺固化剂1～1.2份；
步骤3：在显微镜下，使用0.1μL的移液器吸取中间位置的包埋剂1，滴于放射虫化石样品2的表面，使得包埋剂1没过放射虫化石样品2的表面；
步骤4：在显微镜下，使用低尘纸(Kimtech)吸取放射虫化石样品2侧面多余的包埋剂1，直至包埋剂1均匀覆盖放射虫化石样品2表面，得到包埋的放射虫化石样品2，这样，尽可能减少覆盖的包埋剂1，以减少放射虫化石样品2表面的包埋剂1厚度，厚度小于50μm，减少测试过程中镓离子源的消耗量和溅射时间；
需要说明的是，包埋剂1的高度不低于放射虫化石样品2待切割溅射表面的最高处；
步骤5：将包埋的放射虫化石样品2放入密闭腔中，打开机械泵，在真空负压作用下，包埋剂1渗透至放射虫化石样品2内部，减少孔隙，得到渗透的放射虫化石样品2；
步骤6：将渗透的放射虫化石样品2放在20～30℃环境下保持12～16h进行充分固化(温升峰值<45℃以避免渗透的放射虫化石样品2变质)，得到包埋固化后的放射虫化石样品2，固化后的包埋剂1的硬度为80～90HD，其被镓离子束溅射的速度与放射虫化石被溅射的速度相近。
与现有技术相比，本发明提供的放射虫化石的定向包埋方法，一方面，在包埋过程中能够实现放射虫化石的定向，控制放射虫化石样品2的包埋深度，包埋剂1能够充分填充放射虫化石样品2的内部，对放射虫化石样品2的内部结构进行有效支撑，且固化后的包埋剂1具有与放射虫化石样品2接近的溅射速率，从而更加有利于进行下一步镓离子束的精细加工，从而实现放射虫化石指定位置的截面成像，获得全新的放射虫化石样品2内部信息的同时，还能够节约时间、资源。另一方面，采用上述包埋方法包埋的样品所获得的截面二次电子图像中，化石与包埋胶的衬度差异大，分析软件能够成功识别并提取的化石的图像信息，无需人工手画以区分图片中的信息，能够有效节省人工成本投入，减少人为的干扰因素。
具体来说，上述步骤1包括如下步骤：
步骤11：将双面导电碳胶4(例如，铝基底类型的双面导电碳胶4)粘在样品台3上；
步骤12：将放射虫化石样品2的待切割溅射的表面朝上放置(即对样品定向放置)；
步骤13：采用红貂毛笔(直径0.08mm)粘取放射虫化石样品2轻轻放在样品台3的双面导电碳胶4上，并微调使其保持原有方向，参见图1。
为了能够获得质地均匀、气泡较少的包埋剂1，上述步骤2包括如下步骤：
步骤21：提供两份双酚F环氧树脂和一份三乙烯四胺固化剂，将第一份双酚F环氧树脂和一份三乙烯四胺固化剂搅拌混合，得到第一混合溶液；其中，第一份双酚F环氧树脂与三乙烯四胺固化剂的质量比为1：1～1.2，搅拌时间为5～10min；
步骤22：将第二份双酚F环氧树脂与第一混合溶液搅拌混合至质地均匀，得到包埋剂1；其中，第二份双酚F环氧树脂与三乙烯四胺固化剂的质量比为1：1～1.2，搅拌时间为8～15min，包埋剂1的粘度为800±50mPa.S，@25℃。
需要说明的是，使用纤细的红貂毛能够更加容易定位到单颗指定化石，翻转化石时便于观察，并且柔软的毛发不伤害易碎的化石样品。
为了能够减少气泡的产生，上述步骤21中，将第一份双酚F环氧树脂倒入容器(例如，玻璃杯)中，将三乙烯四胺固化剂沿着容器的内壁倒入第一份双酚F环氧树脂。
同样地，为了能够减少气泡的产生，上述步骤22中，将第二份双酚F环氧树脂沿着容器的内壁倒入第一混合溶液中。
为了能够进一步减少气泡的产生，上述步骤21和/或步骤22中，均采用玻璃棒或磁力搅拌器进行搅拌混合。
示例性地，上述步骤22之后还包括如下步骤：
对制备的包埋剂1进行消泡处理。
具体来说，消泡处理包括如下步骤：
步骤23：将包埋剂1放入密闭腔中；
步骤24：打开机械泵进行抽真空，在真空负压作用下，气泡将逐渐溢出，关闭机械泵，抽真空时间为10～20min，视气泡溢出情况而定；
步骤25：用塑料吸管和/或移液枪吸取位于表层的含有气泡的包埋剂1；
步骤26：重复步骤24至步骤25，直至包埋剂1的中间区域没有肉眼可见气泡。
本发明还提供了一种放射虫化石的检测方法，包括如下步骤：
步骤A：提供一包埋固化后的放射虫化石样品，该包埋固化后的放射虫化石样品采用上述定向包埋方法制得；
步骤B：对包埋固化后的放射虫化石样品进行镀金膜处理，使用喷金仪(磁控溅射仪)在包埋固化后的放射虫化石样品的表面镀上一层细腻均匀的Au/Pt薄膜；
步骤C：将镀金膜的放射虫化石样品移入聚焦离子束扫描电子显微镜，Ga离子束沿着镀金膜的放射虫化石样品表面垂直的方向轰击镀金膜的放射虫化石样品，对镀金膜的放射虫化石样品待切割区域进行Ga离子束溅射，固化后的包埋剂的硬度为80～90HD，硬度与放射虫化石的硬度基本一致，得到的溅射截面5较为平整，且固化后的包埋剂耐热性能较好，能够在较大离子束流下进行溅射，且基本上没有融化效应；
步骤D：调节亮度和对比度以提高图片质量，减少对后期图像识别分割的干扰，获取放射虫化石样品的横截面显微图像；
步骤E：利用Dragonfly软件对得到的显微图像进行化石识别处理。
与现有技术相比，本发明提供的放射虫化石的检测方法的有益效果与上述提供的放射虫化石的定向包埋方法的有益效果基本相同，在此不一一赘述。
为了能够提高溅射速度和效率，上述步骤C中，采用聚焦离子束扫描电子显微镜的最大电压和最大束流Ga离子束，即Ga离子束的电压为30kV，Ga离子束的束流为100nA或65nA。
示例性地，上述步骤E包括如下步骤：
步骤E1：将显微图像导入到Dragonfly软件中；
步骤E2：基于显微图像的灰度区别，使用分析软件中图像分割功能，识别和分离显微图像中的化石区域与包埋胶区域，提取出显微图像中的化石图像。
实施例1
本实施例以200微米的放射虫化石为例进行包埋处理。
本实施例的放射虫化石的检测方法具体包括如下步骤：
将铝基底类型的双面导电碳胶粘在样品台上；
将一个放射虫化石样品的待切割溅射的表面朝上放置；
采用直径为0.08mm的红貂毛笔粘取放射虫化石样品轻轻放在样品台的双面导电碳胶上，并微调使其保持原有方向；
使用玻璃杯分别称取两份双酚F环氧树脂(每份10g)和一份三乙烯四胺固化剂10g，将10g三乙烯四胺固化剂双沿着双酚F环氧树脂玻璃杯的杯壁倒入，使用玻璃棒低速搅拌5min，得到第一混合溶液；
再将10g双酚F环氧树脂沿着玻璃杯的杯壁倒入第一混合溶液中，低速搅拌8min至质地均匀，得到包埋剂；
将包埋剂放入密闭腔中，打开机械泵进行抽真空10min，在真空负压下，气泡将逐渐溢出，关闭机械泵，用塑料吸管吸取位于表层的含有气泡的包埋剂，重复抽真空和吸取包埋剂的步骤，直至包埋剂的中间区域没有肉眼可见气泡；
在显微镜下，使用0.1μL的移液器吸取包埋剂中间位置的液体，滴于放射虫化石样品的表面，使得包埋剂没过放射虫化石样品的表面；
在显微镜下，使用低尘纸(Kimtech)吸取放射虫化石样品侧面多余的包埋剂，直至包埋剂均匀覆盖放射虫化石样品表面，得到包埋的放射虫化石样品；
将包埋的放射虫化石样品放入密闭腔中，打开机械泵，在真空负压作用下，包埋剂渗透至放射虫化石样品内部，得到渗透的放射虫化石样品；
将渗透的放射虫化石样品放在20℃环境下保持16h进行充分固化，得到包埋固化后的放射虫化石样品。
使用喷金仪(磁控溅射仪)在包埋固化后的放射虫化石样品的表面镀上一层细腻均匀的Au/Pt薄膜；
将镀金膜的放射虫化石样品移入聚焦离子束扫描电子显微镜，Ga离子束沿着镀金膜的放射虫化石样品表面垂直的方向轰击镀金膜的放射虫化石样品，对镀金膜的放射虫化石样品待切割区域进行Ga离子束溅射，Ga离子束的电压为30kV，Ga离子束的束流为65nA；
调节亮度和对比度以提高图片质量，减少对后期图像识别分割的干扰，获取放射虫化石样品的横截面显微图像，参见图3，其中，白色区域为截面中的放射虫化石结构，灰色区域为包埋剂区域；
将显微图像导入到Dragonfly软件中；基于显微图像的灰度区别，使用分析软件中图像分割功能，识别和分离显微图像中的化石区域与包埋胶区域，提取出显微图像中的化石图像，参见图4，图4具有足够的衬度时，能够有效地识别并分割截面图像中的放射虫化石样品与包埋胶区域，其中，黑色区域为截面中的放射虫化石结构，黑色为包埋剂区域，从图4可以看出，本实施例的识别精度高，提取还原的化石区域更加真实和完整。
实施例2
本实施例以200微米的放射虫化石为例进行包埋处理。
本实施例的放射虫化石的检测方法具体包括如下步骤：
将铝基底类型的双面导电碳胶粘在样品台上；
将一个放射虫化石样品的待切割溅射的表面朝上放置；
采用直径为0.08mm的红貂毛笔粘取放射虫化石样品轻轻放在样品台的双面导电碳胶上，并微调使其保持原有方向；
使用玻璃杯分别称取两份双酚F环氧树脂(每份10g)和一份三乙烯四胺固化剂12g，将12g三乙烯四胺固化剂双沿着双酚F环氧树脂玻璃杯的杯壁倒入，使用磁力搅拌器低速搅拌8min，得到第一混合溶液；
再将10g双酚F环氧树脂沿着玻璃杯的杯壁倒入第一混合溶液中，低速搅拌12min至质地均匀，得到包埋剂；
将包埋剂放入密闭腔中，打开机械泵进行抽真空18min，在真空负压下，气泡将逐渐溢出，关闭机械泵，用塑料吸管吸取位于表层的含有气泡的包埋剂，重复抽真空和吸取包埋剂的步骤，直至包埋剂的中间区域没有肉眼可见气泡；
在显微镜下，使用0.1μL的移液器吸取包埋剂中间位置的液体，滴于放射虫化石样品的表面，使得包埋剂没过放射虫化石样品的表面；
在显微镜下，使用低尘纸(Kimtech)吸取放射虫化石样品侧面多余的包埋剂，直至包埋剂均匀覆盖放射虫化石样品表面，得到包埋的放射虫化石样品；
将包埋的放射虫化石样品放入密闭腔中，打开机械泵，在真空负压作用下，包埋剂渗透至放射虫化石样品内部，得到渗透的放射虫化石样品；
将渗透的放射虫化石样品放在28℃环境下保持12h进行充分固化，得到包埋固化后的放射虫化石样品。
使用喷金仪(磁控溅射仪)在包埋固化后的放射虫化石样品的表面镀上一层细腻均匀的Au/Pt薄膜；
将镀金膜的放射虫化石样品移入聚焦离子束扫描电子显微镜，Ga离子束沿着镀金膜的放射虫化石样品表面垂直的方向轰击镀金膜的放射虫化石样品，对镀金膜的放射虫化石样品待切割区域进行Ga离子束溅射，Ga离子束的电压为30kV，Ga离子束的束流为100nA；
调节亮度和对比度以提高图片质量，获取放射虫化石样品的横截面显微图像；
将显微图像导入到Dragonfly软件中；基于显微图像的灰度区别，使用分析软件中图像分割功能，识别和分离显微图像中的化石区域与包埋胶区域，提取出显微图像中的化石图像。
对比例1
对比例1使用的包埋剂为Technovit 7200VLC单组分树脂。其包埋过程和图像、结构获取方法与实施例1相同，固化方法为常温下采用黄光照射2～4小时，再使用紫光照射4～6小时。得到的显微图像参见图5，从图5可以看到放射虫样品的头部和中间部分的两个截面都没有充分填充上包埋剂作为样品结构支撑，因此在离子束溅射时，样品内部的结构通常会被破坏，无法观测到实际的结构信息。
对比例2
对比例2使用的包埋剂为Spurr环氧树脂。其包埋剂质量配比为ERL：DER：NSA：DMAE＝10：7：26：0.4。首先需要将ERL树脂与NSA固化剂按照重量比分别称取，依次倒入玻璃容器，低速搅拌3～5min至质地均匀。再加入按照配比称量的DER增塑剂并搅拌均匀，最后加入按照配比称量的DMAE催化剂，充分搅拌至琥珀色。其包埋过程和图像、结构获取方法与实施例1相同。固化方法为：将包埋好的样品放入变温聚合仪，聚合温度为：25℃下8h，紧接着36℃下8h，最后70℃下12h。得到的显微图像参见图6，从图6可以看到放射虫样品已充分填充上包埋剂，并且拍摄的二次电子扫描图像有足够的衬度。但是，在使用30kV，100nA或30kV，65nA的离子束溅射时，作为样品结构支撑的包埋剂不耐受离子束轰击，有融化现象，截面存在大量浅灰色的瀑布状区域。因此，使用该种包埋方法，可能导致截面不平整，另一方面，将导致包埋剂的灰度值改变，影响图片识别分割。若继续降低切割Ga离子束流，则会降低效率。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种放射虫化石的定向包埋方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将放射虫化石样品的待切割溅射表面朝上；
步骤2：制备包埋剂，所述包埋剂的组成按质量份数计包括双酚F环氧树脂2份和三乙烯四胺固化剂1～1.2份；
步骤3：吸取包埋剂，滴于放射虫化石样品的表面；
步骤4：吸取放射虫化石样品侧面多余的包埋剂，得到包埋的放射虫化石样品；
步骤5：将包埋剂渗透至放射虫化石样品内部，得到渗透的放射虫化石样品；
步骤6：对渗透的放射虫化石样品进行充分固化，得到包埋固化后的放射虫化石样品；
所述步骤2包括如下步骤：
步骤21：提供两份双酚F环氧树脂和一份三乙烯四胺固化剂，将第一份双酚F环氧树脂和一份三乙烯四胺固化剂搅拌混合，得到第一混合溶液；
步骤22：将第二份双酚F环氧树脂与第一混合溶液搅拌混合至质地均匀，得到包埋剂；
步骤23：将包埋剂放入密闭腔中；
步骤24：打开机械泵进行抽真空，在真空负压作用下，气泡溢出，关闭机械泵；
步骤25：吸取位于表层的含有气泡的包埋剂；
步骤26：重复步骤24至步骤25，直至包埋剂的中间区域没有肉眼可见气泡。
2.根据权利要求1所述的放射虫化石的定向包埋方法，其特征在于，所述步骤4中，所述包埋剂的高度不低于放射虫化石样品待切割溅射表面的最高处。
3.根据权利要求1所述的放射虫化石的定向包埋方法，其特征在于，所述步骤4中，所述包埋剂覆盖放射虫化石样品待切割溅射表面的厚度小于50μm。
4.根据权利要求1所述的放射虫化石的定向包埋方法，其特征在于，所述步骤1包括如下步骤：
步骤11：将双面导电碳胶粘在样品台上；
步骤12：将放射虫化石样品的待切割溅射的表面朝上放置；
步骤13：采用红貂毛笔粘取放射虫化石样品放在样品台的双面导电碳胶上。
5.根据权利要求4所述的放射虫化石的定向包埋方法，其特征在于，所述双面导电碳胶为铝基底类型的双面导电碳胶。
6.根据权利要求1所述的放射虫化石的定向包埋方法，其特征在于，所述第一份双酚F环氧树脂与三乙烯四胺固化剂的质量比为1：1～1.2。
7.根据权利要求1所述的放射虫化石的定向包埋方法，其特征在于，所述第二份双酚F环氧树脂与三乙烯四胺固化剂的质量比为1：1～1.2。
8.根据权利要求1所述的放射虫化石的定向包埋方法，其特征在于，所述步骤21中，将第一份双酚F环氧树脂倒入容器中，将三乙烯四胺固化剂沿着容器的内壁倒入第一份双酚F环氧树脂；
和/或，所述步骤22中，将第二份双酚F环氧树脂沿着容器的内壁倒入第一混合溶液中。
9.一种放射虫化石的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供一包埋固化后的放射虫化石样品，所述包埋固化后的放射虫化石样品采用如权利要求1至8任一项所述的定向包埋方法制得。
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