WO2012157721A1 - ピロロキノリンキノンと糖を含むリポソーム - Google Patents

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Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
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Definitions

  • the present invention relates to a liposome technology containing pyrroloquinoline quinone. Specifically, the present invention relates to a liposome composition capable of expanding the concentration range in which the function of pyrroloquinoline quinone is exhibited and a method for producing the same.
  • PQQ Pyrroloquinoline quinone
  • This PQQ can be obtained by subjecting PQQ obtained by an organic chemical synthesis method or fermentation method to chromatography, concentrating the PQQ section in the effluent, crystallization by crystallization, and drying.
  • Liposomes usually refer to capsule structures made of lipid membranes composed of phospholipids, in which the aqueous phase is confined.
  • the phospholipid molecule is shaped like a pine needle, and the head part is hydrophilic, and the part that looks like a leaf is hydrophobic, so it is hydrophilic when released into water. The part attracts water and forms liposomes.
  • Liposomes can contain water-soluble components in their hydrophilic portions and oil-soluble components in their hydrophobic portions. Liposomes are mainly attracting attention in the medical field as a method of administering drugs, and are generally known for their advantages such as improved absorbability, improved dispersibility, and improved stability. Widely used in.
  • Non-patent Documents 1 and 2 This proliferative action is cell activation, and is an area expected to be applied in cosmetics and foods. Although this action acts in a certain concentration range, reduction of the concentration and use in a wide range are required. If it can be used in a wide range, it becomes easy to manage, and the design of the composition of cosmetics, foods, culture media and the like can be facilitated. For example, when the type of cell changes, the concentration that exhibits its usefulness changes, and the concentration must be changed according to use, but such work is labor intensive, and it is difficult to properly use it in cosmetics etc. is there. In addition, when used at a high concentration, the risk of growth inhibition increases, and there is a need for a technique that lowers the risk of liposomes that have increased absorption.
  • Liposomeization is generally used to increase the absorption rate of commonly used drugs.
  • the expansion of the concentration range is not known, and in particular, the effect on the enhancement of cell proliferation characteristic of PQQ is not known.
  • Patent Document 1 fuel cells have been developed that use PQQ as an electron mediator and immobilize enzymes as liposomes.
  • PQQ an electron mediator and immobilize enzymes as liposomes
  • Patent Document 2 a composition for administering an S-nitrosyl compound to a mammal
  • Patent Document 3 a literature describing that PQQ can be administered as liposomes or added as liposomes
  • Patent Documents 3, 4, and 5 there are no specific examples, and these documents cannot solve the problems required in the present invention.
  • Phospholipids have a high viscosity as they are, and in order to make liposomes, it is common to dissolve in a solvent such as chloroform, form a liquid film inside the flask, and disperse with ultrasonic waves. Low and there is a risk of residual solvent.
  • a liposome containing PQQ a composition with improved functionality, and a method for producing the composition.
  • PQQ absorption capacity and functionality There is also a need for further improvements in PQQ absorption capacity and functionality.
  • JP 2006-508519 A JP-T-2001-518096 JP 2009-221206 A JP 2006-335651 A Special Table 2005-530786
  • the present inventors include a pyrroloquinoline quinone and a saccharide contained in a liposome obtained by preparing a solution of pyrroloquinoline quinone, a saccharide, and a lipid component at 40 ° C. or higher, and 1 to It has been found that a liposome composition having 45% or more of liposomes having a particle diameter of 10 ⁇ m exhibits a cell growth promoting function in a wide concentration range. The present invention is based on this finding.
  • An object of the present invention is to provide a liposome composition capable of expanding the concentration range in which pyrroloquinoline quinone exhibits its function and an efficient production method thereof.
  • a liposome composition wherein the liposome in the liposome composition is represented by the following formula (1):
  • a liposome composition comprising a pyrroloquinoline quinone or a salt thereof represented by the formula (I) and a sugar, and having a particle size of 1 to 10 ⁇ m of 45% or more.
  • the sugar is selected from the group consisting of monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, and sugar alcohols.
  • a liposome composition containing PQQ having a wide concentration range exhibiting a cell growth promoting function and high stability and an efficient production method thereof can be provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the particle size distribution of 2% sorbitol liposomes of Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the particle size distribution of 10% sorbitol liposomes of Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the particle size distribution of 20% sorbitol liposomes of Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the particle size distribution of 40% sorbitol liposomes of Example 4.
  • 4 is a graph showing the particle size distribution of 0% sorbitol liposomes of Comparative Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the particle size distribution of 10% sorbitol liposomes of Comparative Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the particle size distribution of a sorbitol liposome having a small particle size of 10% in Comparative Example 3.
  • FIG. It is the figure which showed the proliferation test using a cultured cell.
  • 6 is a graph showing the particle size distribution of 10% sorbitol liposomes of Example 5.
  • liposome means a closed vesicle composed of a lipid bilayer and having an aqueous phase inside.
  • the “liposome composition” means a composition composed of a plurality of liposomes.
  • the liposome composition is preferably a liposome dispersion.
  • the liposome contains a free form of PQQ having the structure of the following formula (1) or a salt thereof and a sugar inside the liposome membrane.
  • the pyrroloquinoline quinone used in the present invention can be used as a pyrroloquinoline quinone (free form) or a salt of pyrroloquinoline quinone.
  • Examples of the “pyrroloquinoline quinone salt” used in the present invention include alkali metal salts, alkaline earth metal salts, and ammonium salts of pyrroloquinoline quinone, with alkali metal salts being preferred.
  • alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone used in the present invention examples include salts of sodium, potassium, lithium, cesium, rubidium and the like. Preferably, a sodium salt and a potassium salt are more preferable in terms of easy availability.
  • the pyrroloquinoline quinone may be an alkali metal salt of pyrroloquinoline quinone substituted with 1 to 3 alkali metals, and may be any of a monoalkali metal salt, a dialkali metal salt, and a trialkali metal salt. Dialkali metal salt.
  • disodium salt and dipotassium salt are particularly preferable.
  • the pyrroloquinoline quinone or a salt thereof used in the present invention is particularly easily available in free form, dinatrim form, and dipotassium form.
  • pyrroloquinoline quinone or a salt thereof used in the present invention a commercially available one can be obtained, and it can be produced by a known method.
  • Sugar is preferably water-soluble, and monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, and sugar alcohols can be used.
  • monosaccharides include glyceraldehyde, threose, arabinose, xylose, ribose, ribulose, xylulose, glucose, mannose, galactose, tagatose, allose, altose, gulose, idose, talose, sorbose, psicose, fructose, etc. It is done.
  • disaccharide include trehalose, sucrose, and lactose.
  • oligosaccharides include maltotriose, raffinose, and cyclodextrin.
  • examples of the polysaccharide include water candy and hydrogenated water candy.
  • examples of the sugar alcohol include threitol, erythritol, adonitol, arabitol, xylitol, taritol, sorbitol, mannitol, iditol, dulcitol, inositol, and the like.
  • Monosaccharides, disaccharides and sugar alcohols are preferable, and sugar alcohols are more preferable.
  • the monosaccharide is preferably glucose.
  • the disaccharide is preferably sucrose.
  • the sugar alcohol is preferably sorbitol or xylitol.
  • Sugar alcohols are made by hydrogenating common sugars and syrups and do not have an active carbonyl group. Therefore, it is stable to acid and heat and low in calories. By adding sugar, the concentration range in which the functionality of PQQ is exhibited can be expanded.
  • the sugar used in the present invention can be obtained commercially, or can be produced by a known method.
  • Liposomes are composed of lipid components, and are composed of, for example, phospholipids or glycolipids alone or in combination.
  • phosphatidylcholine is the main component of phospholipids contained in living organisms, and is also called lecithin.
  • Phospholipids include egg yolk lecithin, soybean lecithin, purified soybean lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, sphingomyelin, dicetyl phosphate, stearylamine, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, phosphatidylinositolamine, cardiolipin, ceramide phosphorylethanolamine, Ceramide phosphorylglycerol, a mixture thereof, and the like can be used. It is preferable to use a purified phospholipid.
  • phosphatidylcholine can be used as the phospholipid.
  • NOF COATSOME NC-21 hydrogenated soybean phospholipid, PC content of 90% or more
  • Nikko Chemicals NIKKOL Resinol S-10EX hydrogenated soybean phospholipid, PC content of 95% or more
  • Egg yolk lecithin, soybean lecithin, purified soybean lecithin, and hydrogenated soybean phospholipid are preferred because they are readily available.
  • glycolipid digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride sulfate, galactosylceramide, galactosylceramide sulfate, lactosylceramide, ganglioside G7, ganglioside G6, ganglioside G4, digalactosylceramide, and mixtures thereof can be used.
  • Sterol may be added together with phospholipid or glycolipid lipid as a membrane constituent of liposome.
  • the addition amount is an upper limit of 1/5 weight with respect to the phospholipid or glycolipid, more preferably 1/10 weight.
  • As the sterol cholesterol is most preferable, but other sterols may be used.
  • Liposomes can be produced by a general method. For example, lecithin can be dissolved in an organic solvent such as chloroform, the solvent is distilled off with a rotary evaporator, and the PQQ solution can be added to a lipid film attached to the wall of the flask.
  • an organic solvent such as chloroform
  • the solvent is distilled off with a rotary evaporator
  • the PQQ solution can be added to a lipid film attached to the wall of the flask.
  • this method is not optimal because it is complicated to operate, has the risk of leaving toxic organic solvents, and is expensive because it requires analysis.
  • the liposome composition according to the present invention can be produced by preparing a solution at 40 to 190 ° C. comprising pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, a sugar and a lipid component.
  • the solution can be obtained by mixing pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, sugar, a lipid component, and a solvent. Typically, it can be carried out by adding pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, a sugar, and a lipid component to a solvent.
  • the order of addition is not particularly limited.
  • the solvent used is not particularly limited as long as the reaction proceeds, and water, ethanol or the like can be used, but water (aqueous solution) is preferable because it does not cause a big problem even if it remains in the product.
  • the concentration of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof in the solution can be, for example, 0.0001 to 2% by weight, preferably 0.01 to 1.5% by weight, more preferably 0.1 to 1%. % By weight.
  • the concentration of sugar in the solution can be, for example, 0.5 to 50% by weight, preferably 2 to 50% by weight, more preferably 5 to 30% by weight, and still more preferably 10 to 20% by weight. %.
  • the weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof to sugar is 1: 0.1 to 200, preferably 1: 1 to 200, more preferably 1: 1 to 100, and further preferably 1 : 10 to 100, particularly preferably 1:30 to 70.
  • the concentration of the lipid component in the solution can be 0.001 to 10% by weight.
  • concentration of the lipid component in the solution can be 0.001 to 10% by weight.
  • phospholipid when used as the lipid component, it can be 0.001 to 10% by weight, preferably 0.01 to 8% by weight, more preferably 0.1 to 5% by weight. is there.
  • the weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof to the lipid component can be 1: 0.1 to 30, preferably 1: 1 to 20.
  • the weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, sugar, and lipid component is 1: 0.1 to 200: 0.1 to 30, preferably 1: 1 to 200: 0.1 to 30. More preferably, it can be 1: 1 to 100: 1 to 20, more preferably 1:10 to 100: 1 to 20, and particularly preferably 1:30 to 70: 1 to 20.
  • the weight ratio of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, sugar, and phospholipid is 1: 0.1 to 200: 0.1 to 30, preferably 1: 1 to 200: 0. 1 to 30, more preferably 1: 1 to 100: 1 to 20, more preferably 1:10 to 100: 1 to 20, and particularly preferably 1:30 to 70: 1 to 20. .
  • the pH of the obtained solution can be adjusted to pH 8 or less, preferably pH 1 to 6, more preferably pH 2 to 5, and still more preferably pH 3 to 4.
  • an acidic substance eg, hydrochloric acid, acetic acid, etc.
  • an alkaline substance eg, sodium hydroxide, sodium bicarbonate, etc.
  • the temperature of the obtained solution is from room temperature to 190 ° C., preferably 40 to 190 ° C., more preferably 60 to 190 ° C., further preferably 60 to 150 ° C., and still more preferably 60 to 120 ° C., particularly Preferably, it can be 60 to 100 ° C., and more preferably 60 to 80 ° C. This temperature can be adjusted by adjusting the temperature of the solvent.
  • the obtained solution can be subjected to a temperature adjustment step.
  • the “adjustment” of the temperature can be performed by heating (including maintaining the temperature), allowing to stand, or cooling in consideration of the temperature of the obtained solution.
  • the obtained solution is 40 to 190 ° C, preferably 60 to 190 ° C, more preferably 60 to 150 ° C, still more preferably 60 to 120 ° C, and still more preferably 60 to 100 ° C. It can be adjusted to ° C., particularly preferably 60 to 80 ° C.
  • the temperature of the solution is 60 to 190 ° C. (more preferably 60 to 150 ° C., more preferably 60 to 120 ° C., still more preferably 60 to 100 ° C., particularly preferably 60 to 80 ° C.) And the temperature is 60 ° C. or higher (60 to 190 ° C., preferably 60 to 150 ° C., more preferably 60 to 120 ° C., even more preferably 60 to 100 ° C., particularly preferably 60 to 80 ° C.). C.) is preferably maintained.
  • a homogenization process means the process of highly dispersing the component in the obtained solution.
  • the solution is adjusted to a controlled temperature, ie 40 to 190 ° C., preferably 60 to 190 ° C., more preferably 60 to 150 ° C., more preferably 60 to 120 ° C., and still more preferably It can be maintained at 60 to 100 ° C., particularly preferably at 60 to 80 ° C.
  • a controlled temperature ie 40 to 190 ° C., preferably 60 to 190 ° C., more preferably 60 to 150 ° C., more preferably 60 to 120 ° C., and still more preferably It can be maintained at 60 to 100 ° C., particularly preferably at 60 to 80 ° C.
  • a homogenizer emulsifier
  • emulsifiers as the stirring emulsifier, NISSEI AM-3 homogenizer manufactured by Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd., Ultratax T25 manufactured by IKA, and the like can be used.
  • High-pressure emulsifiers include Primix's thin film swirl type high-speed homomixer (TK Filmix), Microfluidics' ultra-high pressure homogenizer (Microfluidizer), M Technique's internal shear force type mixer (Claremix), Yoshida Machine Kogyo Seiki wet medialess atomizer (nanomizer) and the like can be used.
  • TK Filmix Primix's thin film swirl type high-speed homomixer
  • Microfluidics' ultra-high pressure homogenizer Microfluidizer
  • M Technique's internal shear force type mixer Claremix
  • Yoshida Machine Kogyo Seiki wet medialess atomizer nanomizer
  • the conditions for homogenization can be appropriately determined based on the apparatus to be used. For example, in the case of using NISSEI AM-3 homogenizer manufactured by Nippon Seiki Seisakusyo Co., Ltd., 0.5 to 180 minutes (preferably, 1 to 60 minutes) and 1000 to 10,000 rotations.
  • the homogenization step can be further performed at room temperature.
  • the method and conditions for homogenization are as described above, but the time for the homogenization step is preferably 10 minutes or less.
  • sterols, polyhydric alcohols and pH adjusters are added to an aqueous solution in which 0.001 to 2% by weight of PQQ and 2 to 50% by weight of sugar are dissolved, and heated to 60 to 190 ° C. if necessary. And can be produced by dispersing with a homogenizer. It can be made with high productivity by using a homogenizer.
  • the upper limit concentration of PQQ is the limit of solubility, and if it is higher than this, it tends to precipitate, and if it is lower than the lower limit concentration, the function of PQQ cannot be expected.
  • the pH is preferably 8 or less, more preferably 1 to 6.
  • PQQ decomposes. There is no problem in terms of stability for acidification, but it becomes difficult to increase the content because solubility decreases.
  • the liposome composition of the present invention can be obtained.
  • the particle diameter of the liposome can be 0.5 to 100 ⁇ m, which is the particle diameter of a general liposome. More preferably, the particle diameter of the liposome is 1 to 10 ⁇ m.
  • the liposome preferably has a particle diameter of 1 to 10 ⁇ m of 45% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 80 to 100%, particularly preferably 90 to 100% of the total liposome. 100%.
  • “%” means “volume%”.
  • Small liposomes (for example, liposomes having a particle size of 0.1 to 0.9 ⁇ m) have a high effect of increasing absorbability, but have a low effect of expanding the concentration range in which pyrroloquinoline quinone exerts its function.
  • Large liposomes (for example, liposomes having a particle size of 20 to 200 ⁇ m) are not preferred because they have a low ability to improve absorbability and are difficult to produce.
  • the volume average particle diameter of the liposome can be 0.5 to 20 ⁇ m, preferably 1 to 10 ⁇ m.
  • the particle diameter can be measured using a known device.
  • it can be measured using a particle size distribution measuring instrument (for example, SEISHIN LMS-350 manufactured by Seishin Enterprise Co., Ltd.).
  • the particle diameter in the present invention is measured in a state where liposomes are dispersed in water as described in Examples.
  • the particle diameter of the liposome can be controlled by selection of raw materials, production conditions, and the like. Alternatively, it is easy to control the liposomes once produced by filtering them with a filter or the like. In addition, the liposome can be purified and the size can be controlled by performing treatments such as dialysis, freeze-thawing, freeze-drying, and centrifugation.
  • the present invention has a large size and excellent absorbability. Furthermore, it is possible to widen an optimum concentration range in which a function peculiar to PQQ is exhibited.
  • the “function” of pyrroloquinoline quinone means a cell growth promoting function and an antioxidant property, and particularly a cell growth promoting function.
  • the liposome of the present invention may be in the form of a liposome composition in which a free form of PQQ or a salt thereof and a sugar are present together with the liposome.
  • a liposome composition in which a free form of PQQ or a salt thereof and a sugar are present together with the liposome.
  • Cationic surfactants, amphoteric surfactants, oil agents, moisturizers, water-soluble polymers, antioxidants, UV absorbers, chelating agents, preservatives, antibacterial agents, coloring agents, fragrances, etc. can be blended. .
  • vitamins such as coenzyme Q10, ascorbic acid derivatives, tocopherols, arachidonic acid, DHA, and retinol derivatives, plant extracts such as ginkgo biloba extract and kanka extract may be blended.
  • the liposome composition of the present invention may be any of an aqueous solution, an oil-in-water emulsion composition, a water-in-oil emulsion composition, a multiple emulsion composition, and a multilayer agent.
  • the aqueous solution means an aqueous solution in which liposomes are dispersed.
  • compositions may be appropriately added and mixed by a conventional method.
  • the preparation material that can be added is not particularly limited, and examples thereof include emulsifiers, tensioning agents, buffering agents, solubilizing agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, and antioxidants.
  • the method for storing the liposome composition of the present invention is not particularly limited, and for example, low-temperature storage, anaerobic storage using a sealed container, light-shielding storage, and the like can be used.
  • the composition of the present invention thus prepared can be stably stored without precipitation when stored at refrigeration or at room temperature.
  • the liposome of the present invention can be used in a wide range such as medical use, cosmetic use, food use, horticulture use, and dairy use. Specific forms include injections, infusions, liquids, eye drops, liquids for internal use, lotions, hair tonics, cosmetic emulsions, sprays, aerosols, drinks, liquid fertilizers, preservatives and the like.
  • Animal cell culture is used for research and pharmaceutical production, but when added to the medium, antibody drug production and experiments can be performed efficiently.
  • a liposome composition wherein the liposome in the liposome composition is selected from the group consisting of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, and a monosaccharide, a disaccharide, and a sugar alcohol. And a liposome composition containing 50% or more of liposomes having a particle size of 1 to 10 ⁇ m.
  • a liposome composition wherein the liposome in the liposome composition is selected from the group consisting of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, and a monosaccharide, disaccharide, and sugar alcohol.
  • a liposome composition containing 90% or more of a liposome containing a sugar and having a particle size of 1 to 10 ⁇ m.
  • pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, a sugar selected from the group consisting of a monosaccharide, a disaccharide, and a sugar alcohol, and a pH of 8 or less comprising a phospholipid and A method for producing a liposome composition comprising the steps of preparing a solution at 60 to 120 ° C. (preferably 60 to 80 ° C.) and homogenizing the solution is provided.
  • pyrroloquinoline quinone or a salt thereof, a saccharide selected from the group consisting of a monosaccharide, a disaccharide, and a sugar alcohol, and a phospholipid are in a weight ratio of 1: 1 to 200: 0.
  • Production of a liposome composition comprising a step of preparing a solution having a pH of 8 or less and comprising 60 to 120 ° C. (preferably 60 to 80 ° C.) comprising 1 to 30 and homogenizing the solution A method is provided.
  • the following formula (1) A liposome containing a pyrroloquinoline quinone or a salt thereof and a saccharide represented by the formula: wherein the particle diameter of 1 to 10 ⁇ m is 50% or more.
  • the liposome according to [1] wherein the sugar is sorbitol or xylitol.
  • a pharmaceutical comprising the liposome according to [2].
  • a method for producing liposomes comprising a step of heating an aqueous solution in which pyrroloquinoline quinone and sugar are dissolved to a pH of 8 or less and then heating from 60 ° C to 190 ° C.
  • the method for producing a liposome according to [6] wherein the concentration of pyrroloquinoline quinone or a salt thereof in the aqueous solution is 0.0001 to 2% by weight and sugar is 2 to 50% by weight.
  • the production method according to [7] including a step of using a homogenizer.
  • Liposome particle size measurement SEISHIN LMS-350 (manufactured by Seishin Enterprise Co., Ltd.) was used to determine the particle size distribution by dispersing in water. In this apparatus, 0.1 ⁇ m is the lower limit of detection.
  • Comparative Example 1 Preparation of Liposome Composition Using 0.3 g of PQQ disodium and 3.0 g of COATSOME NC-21 (hydrogenated soybean phospholipid), water was mixed so that the whole became 100 g. The pH at this time was 3.5. While heating the obtained solution to 60 ° C. or higher, it was treated with NISSEI AM-3 homogenizer (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.) for 30 minutes and 7000 rpm, then lowered to room temperature and treated for 10 minutes and 7000 rpm. After the treatment, water with reduced evaporation was added. This was used as the liposome composition of Comparative Example 1.
  • NISSEI AM-3 homogenizer manufactured by Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.
  • Example 1-4 Using 0.3 g of PQQ disodium and 3.0 g of COATSOME NC-21 (hydrogenated soybean phospholipid), sorbitol was added at 2, 10, 20, and 40 g, and water was mixed so that the whole became 100 g. The pH at this time was 3.5. The temperature was 60 ° C. The obtained solution was treated in the same manner as in Comparative Example 1 to prepare the liposome composition of Example 1-4.
  • Comparative Example 2 Preparation of Liposome Composition Containing Sugar Without PQQ Using COATSOME NC-21 (hydrogenated soybean phospholipid) 3.0 g and sorbitol 10 g, water was mixed so that the whole would be 100 g. A liposome composition was prepared by treating in the same manner as in Comparative Example 1.
  • Comparative Example 3 Production of Liposome Composition Containing Small Size Soy lecithin 0.3 g, PQQ disodium 0.3 g, and sorbitol 10 g were mixed with water so that the whole would be 100 g. The same operation as in Comparative Example 1 was performed to prepare a liposome composition.
  • the liposome compositions prepared in Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 3 and PQQ disodium were used, and these samples were diluted with a medium and tested. Test concentrations were 500, 250, 125, 62, 31, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0 ⁇ M. In Comparative Example 2, the concentration of the liposome composition was used. Each test was run twice and averaged. The results are shown in FIG. The vertical axis is a value where the cell concentration without addition was taken as 100.
  • the added amount at which the total number of cells is reduced by about 10% compared with no addition is defined as the growth arresting concentration (absorption is improved when this concentration is lowered), and the cell concentration is about 5% compared with no addition.
  • the higher concentration was defined as the growth promoting concentration, and the test results of each sample are shown in Table 2.
  • the addition amount at which the total cell number was reduced by 10% compared with the medium alone was 500 ⁇ M PQQ disodium in Comparative Example 4 and 62 ⁇ M in the liposome composition without Comparative Example 1 with sorbitol added. On the other hand, it was 31 micromol in the comparative example 3 containing a small liposome composition. The growth-stopping concentration became more absorbable due to liposome formation, and the effect appeared at a low concentration. As for the growth promoting concentration, Example 1-4 was more effective than Comparative Example 1 over a wide concentration range. When PQQ and sugar were added to the liposome, the growth arresting concentration was increased, and the growth inhibitory effect was reduced by the addition of sugar.
  • the sugar-added liposome composition of Comparative Example 2 to which PQQ was not added had an effect on cell growth at an equivalent of 500 ⁇ M, but no other effects. Further, in the small liposome composition of Comparative Example 3, growth inhibition appears at a low concentration, and no growth promoting effect is observed (it is expected that the concentration is lower than the test range).
  • the concentration at which about 5% growth promotion by PQQ was unexpectedly observed was in a wide concentration range as the addition of sugar increased. It was effective from a low concentration to a high range. It is thought that the composition selection at the time of adding to a culture medium becomes easy because the density
  • Example 5 PQQ disodium 0.3 g, sorbitol 10 g, and COATSOME NC-21 (hydrogenated soybean phospholipid) 3.0 g were mixed with water so that the total amount was 100 g.
  • the pH at this time was 3.5.
  • the temperature was 40 ° C. While increasing the temperature of the obtained solution and finally heating to 60 ° C. or higher, treatment with NISSEI AM-3 homogenizer for 30 minutes and 7000 rpm, then lowering to room temperature and treating for 30 minutes and 7000 rpm did. After the treatment, water whose evaporation decreased to a total weight of 100 g was added.
  • the particle size measurement result of the liposome produced in Example 5 is shown in Table 3 below, and the particle size distribution result is shown in FIG.
  • Examples 6 and 7 PQQ disodium 0.3 g, sorbitol 50 or 0.5 g, and COATSOME NC-21 (hydrogenated soybean phospholipid) 3.0 g were mixed with water to a total of 100 g. The pH at this time was 3.5. The temperature was 60 ° C. Liposome compositions were prepared in the same manner as in Examples 1 to 4.
  • Examples 8-12 PQQ disodium 0.3 g, COATSOME NC-21 (hydrogenated soybean phospholipid) 3.0 g, and the weight of sugar shown in Table 6 were used, and water was mixed so that the whole would be 100 g. The pH at this time was 3.5. The temperature was 60 ° C. The obtained solution was treated with NISSEI AM-3 homogenizer as follows to prepare the liposome composition of Examples 8-12.
  • Example 8 1 hour, 7000 rotations while heating above 80 ° C.
  • Example 9 30 minutes, 7000 rotations while heating above 40 ° C.
  • Example 10 30 minutes, 7000 rotations while heating above 60 ° C. Then, the temperature was lowered to room temperature, 1 hour, 7000 rpm
  • Example 11 and 12 30 minutes, 7000 rpm while heating at 60 ° C. or higher
  • the present invention can be effectively used in the fields of cosmetics, foods, medicines and agricultural chemicals.

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Abstract

　本発明は、ピロロキノリンキノンが細胞増殖促進機能を発揮する濃度範囲の拡大を可能とする組成物及びその効率的な製造方法の提供を目的とする。本発明によれば、ピロロキノリンキノン若しくはその塩及び糖を含み、１から１０μｍの粒子径のリポソームが５０％以上含まれるリポソーム組成物およびその製造方法が提供される。

Description

ピロロキノリンキノンと糖を含むリポソーム 関連出願の参照
　本特許出願は、２０１１年５月１７日に提出された日本出願である特願２０１１－１１０６３９の利益を享受する。これらの先の出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明はピロロキノリンキノンを含むリポソーム技術に関する。具体的には、ピロロキノリンキノンの機能が発揮される濃度範囲の拡大を可能とするリポソーム組成物およびその製造方法に関する。
　ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと記すことがある）は新しいビタミンの可能性があることが提案され、栄養機能を強化した食品、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。さらには、ＰＱＱは細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについては、近年までに、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ－作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラ－ゼＩ阻害作用－制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。
　このＰＱＱは、有機化学的合成法または発酵法などの方法により得たＰＱＱをクロマトグラフィーに供し、流出液中のＰＱＱ区分を濃縮して、晶析により結晶化し、乾燥して得ることができる。
　リポソームとは通常はリン脂質からなる脂質の膜でできたカプセル構造のことをいい、中に水相が閉じこめられている。リン脂質の分子は松葉のような形をしていて、頭の部分が親水性、葉のように見える部分が疎水性という２つの性質を併せ持っているので、水に放たれると親水性の部分が水と引きつけあい、リポソームを形成する。リポソームは、水溶性の成分をその親水性の部分に、油溶性の成分をその疎水性の部分に閉じこめることができる。リポソームは薬剤を投与する方法として主に医学の分野で注目されており、吸収性の向上や分散性の向上、安定性の向上等の利点が一般的に知られ、経口、皮膚に塗布する用途で広く使用されている。
　これまでにＰＱＱを繊維芽細胞の培養液に添加することでＤＮＡの合成、増殖に効果があることが知られている（非特許文献１，２）。この増殖作用は細胞の活性化であり、化粧品、食品での応用が期待される分野である。この作用は一定の濃度範囲で作用するが、その濃度の低減化と広い範囲での使用が求められている。広い範囲での使用することができると、管理が容易となり、化粧品、食品、培地等の組成の設計を容易にすることができる。例えば、細胞の種類が変わるとその有用性を発揮する濃度が変わり、使用に合わせて濃度を変えなければならないが、そのような作業は労力を有し、また、化粧品などではその使い分けは困難である。また、高濃度で使用すると増殖阻害の危険性が高くなり、特に吸収を上げたリポソームではその危険性を下げる技術が求められている。
　リポソーム化は一般に使用する薬剤の吸収率を高めるために使用される。しかし、その濃度範囲の拡大については知られておらず、特にＰＱＱ特有の細胞増殖性の増強に対する効果は知られていない。
　これまで、ＰＱＱを電子メディエーターとして使用し、酵素をリポソームとして固定する燃料電池は開発されている（特許文献１）。また、Ｓ-ニトロシル化合物を哺乳類に投与するための組成物として提案されているが、具体的な例はなく、製造方法についても記載がない（特許文献２）。同様にＰＱＱをリポソームにして投与できる、または、リポソームにして加えることができると記載された文献がある（特許文献３，４，５）。しかし、具体的な例はなく、これらの文献では本発明で求められている問題の解決を行うことはできない。リン脂質はそのままでは粘度が高く、リポソームにするにはクロロホルムのような溶剤に溶かし、フラスコ内部に液膜を形成して超音波で分散する方法が一般的であるが、この方法は生産性が低く、また、溶剤が残留する危険性がある。このように、ＰＱＱを含有するリポソームの提供とそれにより機能性が向上した組成物、その製造方法が求められている。また、ＰＱＱのさらなる吸収能力の向上や機能性の向上が求められている。
特表２００６－５０８５１９号公報 特表２００１－５１８０９６号公報 特開２００９―２２１２０６号公報 特開２００６―３３５６５１号公報 特表２００５―５３０７８６号公報
Life Science, Vol 52, p1902-1915 (1993) Int. J. Molecular Med., vol 19, 765-770 (2007)
　本発明者らは、ピロロキノリンキノンと、糖と、脂質成分とを含んでなる４０℃以上の溶液を調製することにより得られた、リポソームにピロロキノリンキノンと糖を含有し、かつ、１～１０μｍの粒子径のリポソームが４５％以上であるリポソーム組成物が、広い濃度範囲で細胞増殖促進機能を発揮することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
　ピロロキノリンキノンが機能を発揮する濃度範囲の拡大を可能とするリポソーム組成物およびその効率的な製造方法の提供を目的とする。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）リポソーム組成物であって、該リポソーム組成物におけるリポソームが、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で表されるピロロキノリンキノンまたはその塩、および糖を含有し、かつ、１～１０μｍの粒子径のリポソームが４５％以上である、リポソーム組成物。
（２）リポソームの体積平均粒子経が、０．５～２０μｍである、（１）に記載のリポソーム組成物。
（３）糖が、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、および糖アルコールからなる群から選択される、（１）に記載のリポソーム組成物。
（４）糖が、ソルビトールまたはキシリトールである、（１）に記載のリポソーム組成物。
（５）（１）～（４）のいずれかに記載のリポソーム組成物を含んでなる、食品。
（６）（１）～（４）のいずれかに記載のリポソーム組成物を含んでなる、医薬品。
（７）（１）～（４）のいずれかに記載のリポソーム組成物を含んでなる、培地。
（８）下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表されるピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分とを含んでなる４０～１９０℃の溶液を調製することを含んでなる、リポソーム組成物の製造方法。
（９）溶液のｐＨが、８以下である、（８）に記載の製造方法。
（１０）溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩の濃度が、０．０００１～２重量％であり、糖が０．５～５０重量％である、（８）に記載の製造方法。
（１１）溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分との重量比が、１：１～２００：０．１～３０である、（８）に記載の製造方法。
（１２）溶液をホモジナイズする工程をさらに含んでなる、（８）に記載の製造方法。
（１３）（８）に記載の製造方法により製造される、リポソーム組成物。
　本発明によれば、細胞増殖促進機能を発揮する濃度範囲が広く、安定性の高いＰＱＱを含むリポソーム組成物及びその効率的な製造方法を提供できる点で有利である。
実施例１の２％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。 実施例２の１０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。 実施例３の２０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。 実施例４の４０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。 比較例１の０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。 比較例２の１０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。 比較例３の小粒子径１０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。 培養細胞を使用した増殖性試験を示した図である。 実施例５の１０％ソルビトールリポソームの粒度分布を示した図である。
　本願明細書において、「リポソーム」とは、脂質二重層からなり内部に水相をもつ閉鎖小胞を意味する。
　本願明細書において、「リポソーム組成物」とは、複数のリポソームから構成されるものを意味する。リポソーム組成物は、好ましくは、リポソーム分散液である。
　本発明において、リポソームは、リポソーム膜の内部に下記式（１）の構造のＰＱＱのフリー体若しくはその塩及び糖を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンは、ピロロキノリンキノン（フリー体）として使用することもできるし、ピロロキノリンキノンの塩として使用することもできる。
　本発明において用いられる「ピロロキノリンキノンの塩」としてはピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩が挙げられるが、好ましくは、アルカリ金属塩である。
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム、ルビジュウムなどの塩が挙げられる。好ましくは、入手しやすい点で、ナトリウム塩およびカリウム塩がより好ましい。ピロロキノリンキノンは、１～３個のアルカリ金属で置換されるピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩であってよく、モノアルカリ金属塩、ジアルカリ金属塩、トリアルカリ金属塩のどれでも良いが、好ましくは、ジアルカリ金属塩である。ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩として、特に好ましくは、ジナトリウム塩およびジカリウム塩である。
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩は、特に入手しやすい、フリー体、ジナトリム体、ジカリウム体が使用しやすい。
　本発明において用いられるピロロキノリンキノンまたはその塩は、市販されているものを入手することができるし、公知の方法により製造することができる。
　糖は水溶性であることが好ましく、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖類、糖アルコールが使用できる。具体的には、単糖として、グリセリンアルデヒド、トレオース、アラビノース、キシロース、リボース、リブロース、キシルロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、タガトース、アロース、アルトース、グロース、イドース、タロース、ソルボース、プシコース、果糖等が挙げられる。二糖としては、トレハロース、ショ糖、乳糖等が挙げられる。オリゴ糖としては、マルトトリオース、ラフィノース、シクロデキストリンが挙げられる。多糖類としては、水あめ、水素化水あめ等が挙げられる。糖アルコールとしては、トレイトール、エリトリトール、アドニトール、アラビトール、キシリトール、タリトール、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ズルシトール、イノシトール等が挙げられる。好ましくは、単糖、二糖および糖アルコールであり、より好ましくは糖アルコールである。単糖は、好ましくは、グルコースである。二糖は、好ましくは、ショ糖である。糖アルコールは、好ましくは、ソルビトール、キシリトールである。糖アルコールは一般的な糖類や水あめに水素添加して作られ、活性なカルボニル基を有していない。そのため、酸や熱に安定でカロリーが低い。糖を添加することでＰＱＱの機能性を発揮する濃度範囲を拡大することができる。
　本発明において用いられる糖は、市販されているものを入手することができるし、公知の方法により製造することができる。
　リポソーム（リポソーム膜）は、脂質成分から構成され、例えば、リン脂質又は糖脂質が単独又は混合されて構成される。
　リン脂質としては、生体に含まれるリン脂質の主成分にホスファチジルコリンがあり、レシチンとも呼ばれる。リン脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、精製大豆レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールアミン、カルジオリピン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、およびこれらの混合物等が使用できる。リン脂質は、精製されたものを用いることが好ましい。
　本発明において、リン脂質としては市販のホスファチジルコリンを用いることができる。例えば、日油製ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＮＣ－２１（水素添加大豆リン脂質、ＰＣ含量９０％以上）、日光ケミカルズ製ＮＩＫＫＯＬ　レシノール　Ｓ－１０ＥＸ（水素添加大豆リン脂質、ＰＣ含量９５％以上）を用いることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチン、精製大豆レシチン、水素添加大豆リン脂質が入手しやすく好ましい。
　糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドＧ７、ガングリオシドＧ６、ガングリオシドＧ４、ジガラクトシルセラミド、およびこれらの混合物等を用いることができる。
　リポソームの膜構成成分としてリン脂質や糖脂質の脂質と共にステロールを添加してもよい。添加量は、リン脂質或いは糖脂質に対して１／５重量が好ましい量の上限であり、１／１０重量が更に好ましい。ステロールとしては、コレステロールが最も好ましいが、その他のステロールを使用してもよい。
　リポソームは、一般的な定法により製造することが可能である。例えば、レシチンを有機溶剤、例えば、クロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去し、フラスコの壁面に付着した脂質のフィルムにＰＱＱ溶液を加えて製造することができる。しかし、この方法は操作が複雑で、毒性のある有機溶媒が残留する危険性があるうえに、そのための分析も必要になるために費用がかかるため、最適とは言えない。
　本発明によるリポソーム組成物は、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分とを含んでなる４０～１９０℃の溶液を調製することにより製造することができる。
　溶液は、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分、溶媒とを混合することにより得ることができる。典型的には、溶媒に、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分とを添加することにより実施することができる。添加の順序は特に限定されない。
　用いられる溶媒は、反応が進行すれば特に限定されず、水、エタノール等を使用することができるが、製品に残留しても大きな問題とならないという点から、水（水溶液）が好ましい。
　溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩の濃度は、例えば、０．０００１～２重量％とすることができるが、好ましくは、０．０１～１．５重量％、より好ましくは、０．１～１重量％である。
　溶液における糖の濃度は、例えば、０．５～５０重量％とすることができるが、好ましくは、２～５０重量％、より好ましくは、５～３０重量％、さらに好ましくは、１０～２０重量％である。
　溶液において、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖との重量比は、１：０．１～２００、好ましくは、１：１～２００、より好ましくは、１：１～１００、さらに好ましくは、１：１０～１００、特に好ましくは、１：３０～７０とすることができる。
　溶液における脂質成分の濃度は、０．００１～１０重量％とすることができる。例えば、脂質成分としてリン脂質を使用する場合は、０．００１～１０重量％とすることができるが、好ましくは、０．０１～８重量％、より好ましくは、０．１～５重量％である。
　溶液において、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、脂質成分との重量比は、１：０．１～３０、好ましくは、１：１～２０とすることができる。
　溶液において、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分との重量比は、１：０．１～２００：０．１～３０、好ましくは、１：１～２００：０．１～３０、より好ましくは、１：１～１００：１～２０、さらに好ましくは、１：１０～１００：１～２０、特に好ましくは、１：３０～７０：１～２０とすることができる。特には、溶液において、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、リン脂質との重量比は、１：０．１～２００：０．１～３０、好ましくは、１：１～２００：０．１～３０、より好ましくは、１：１～１００：１～２０、さらに好ましくは、１：１０～１００：１～２０、特に好ましくは、１：３０～７０：１～２０とすることができる。
　得られた溶液のｐＨは、ｐＨ８以下とすることができるが、好ましくは、ｐＨ１～６、より好ましくは、ｐＨ２～５、さらに好ましくは、ｐＨ３～４とすることができる。ｐＨを調整するために、酸性物質（例えば、塩酸、酢酸等）やアルカリ性物質（例えば、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム等）を使用することができる。
　得られた溶液の温度は、室温から１９０℃、好ましくは、４０～１９０℃、より好ましくは、６０～１９０℃、さらに好ましくは、６０～１５０℃、さらにより好ましくは、６０～１２０℃、特に好ましくは、６０～１００℃、特により好ましくは、６０～８０℃とすることができる。この温度は、溶媒の温度を調整することにより調整することができる。
　得られた溶液は、温度調整工程に供することができる。温度の「調整」は、得られた溶液の温度を考慮して、加温（温度の維持も含む）、放置、または冷却して行うことができる。具体的には、得られた溶液を、４０～１９０℃、好ましくは、６０～１９０℃、より好ましくは、６０～１５０℃、さらに好ましくは、６０～１２０℃、さらにより好ましくは、６０～１００℃、特に好ましくは、６０～８０℃に調整することができる。
　溶液の温度は、予め６０～１９０℃（より好ましくは、６０～１５０℃、さらに好ましくは、６０～１２０℃、さらにより好ましくは、６０～１００℃、特に好ましくは、６０～８０℃）の溶液を得て、その温度を６０℃以上（６０～１９０℃、好ましくは、６０～１５０℃、より好ましくは、６０～１２０℃、さらにより好ましくは、６０～１００℃、特に好ましくは、６０～８０℃）で維持することが好ましい。
　温度調整された溶液は、さらにホモジナイズ工程に供することができる。ホモジナイズ工程とは、得られた溶液中の成分を高分散化する工程を意味する。
　ホモジナイズ工程において、溶液は、調整された温度、すなわち、４０～１９０℃、好ましくは、６０～１９０℃、より好ましくは、６０～１５０℃、さらに好ましくは、６０～１２０℃、さらにより好ましくは、６０～１００℃、特に好ましくは、６０～８０℃で維持することができる。
　ホモジナイズ工程においては、ホモジナイザー（乳化機）を使用することができる。乳化機のうち、攪拌乳化機としては、株式会社日本精機製作所社製　ＮＩＳＳＥＩ ＡＭー３ホモジナイザー、ＩＫＡ製　ウルトラタックスＴ２５等を用いることができる。
　ホモジナイズ工程においては、高圧乳化機も使用することができる。高圧乳化機としてはプライミクス製 薄膜旋回型高速ホモミキサー（Ｔ．Ｋフィルミックス）、マイクロフルイディックス製 超高圧ホモジナイザー（マイクロフルイダイザー）、エム・テクニック製 内部せん断力型ミキサー（クレアミックス）、吉田機械興業製 湿式メディアレス微粒化装置（ナノマイザー）等を用いることができる。
　ホモジナイズの条件は、使用する装置に基づいて、適宜決定することができるが、例えば、株式会社日本精機製作所社製　ＮＩＳＳＥＩ ＡＭー３ホモジナイザーを使用する場合は、０．５～１８０分（好ましくは、１～６０分）で、１０００～１００００回転で行うことができる。
　ホモジナイズ工程は、さらに室温で行うことができる。ホモジナイズの方法や条件は、上記の通りであるが、ホモジナイズ工程の時間は、好ましくは１０分以下である。
　好ましくはＰＱＱを０．０００１～２重量％と糖を２から５０重量％になるように溶解した水溶液に、必要に応じステロール、多価アルコール、ｐＨ調整剤を加え、６０～１９０℃に加温し、ホモジナイザーにより分散することにより製造できる。ホモジナイザーを使用することで高い生産性で作ることが可能である。ここでＰＱＱの上限濃度は溶解度の限度であり、これより高いと析出しやすく、下限濃度より低いとＰＱＱの機能が期待できない。
　ＰＱＱはアルカリ性では安定性が低いため、ｐＨは８以下が好ましく、より好ましくは１から６である。８よりｐＨが高い場合はＰＱＱが分解する。酸性にするのは安定性の面では問題がないが溶解性が下がるために高含有にするのが困難になる。
　上記工程を経て、本発明のリポソーム組成物を得ることができる。
　本発明において、リポソームの粒子径は、一般的なリポソームの粒子径の０．５から１００μｍを使用することができる。より好ましくはリポソームの粒子径が１から１０μｍである。
　本発明において、リポソームは、全リポソームに対し、１～１０μｍの粒子径が４５％以上含まれることが好ましく、より好ましくは、５０％以上、さらに好ましくは８０ー１００％、特に好ましくは、９０～１００％である。ここで、「％」は、「体積％」を意味する。小さなリポソーム（例えば、０．１～０．９μｍの粒子径のリポソーム）は吸収性を上げる効果は高いが、ピロロキノリンキノンがその機能を発揮する濃度範囲を広げる効果は低い。大きなリポソーム（例えば、２０～２００μｍの粒子径のリポソーム）は吸収性向上の機能が低く、製造も難しく好ましくない。
　本発明において、リポソームの体積平均粒子径は、０．５～２０μｍとすることができ、好ましくは、１～１０μｍである。
　本発明において、粒子径は、公知の機器を用いて測定することができる。例えば、粒度分布測定器（例えば、セイシン企業社製ＳＥＩＳＨＩＮ　ＬＭＳ－３５０）を用いて測定することができる。
　尚、本発明における粒子径は、実施例に記載している様に、リポソームを水に分散させた状態で測定したものである。
　リポソームの粒子径は、上述のように、原料の選択、製造条件等で制御することができる。あるいは、いったん製造したリポソームをフィルター等でろ過することで制御することは容易である。また、透析、凍結融解、凍結乾燥、遠心分離等の処理を施すことでリポソームの精製やサイズのコントロールを行うことができる。
　リポソームは小さなものが吸収性に優れることが広く知られているが、本発明は大きなサイズで吸収性が優れる。更に、ＰＱＱ特有の機能が発揮される最適な濃度範囲を広げることが可能となる。
　本願発明において、ピロロキノリンキノンの「機能」とは、細胞増殖促進機能、抗酸化性を意味するが、特には、細胞増殖促進機能である。
　本発明のリポソームは、リポソームと共にＰＱＱのフリー体若しくはその塩及び糖が外在したリポソーム組成物の形態でも良い。リポソーム組成物を調製する際に、本発明の効果を損なわない範囲で他のステロール、ポリオキシエチレンステロールエーテル、多価アルコール、ｐＨ調整剤、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、油剤、保湿剤、水溶性高分子、抗酸化剤、紫外線吸収剤、キレート剤、防腐剤、抗菌剤、着色剤、香料等を配合することができる。また、コエンザイムＱ１０、アスコルビン酸誘導体、トコフェロール、アラキドン酸、ＤＨＡ、レチノール誘導体等のビタミン類やイチョウエキス、カンカエキス等の植物抽出液等を配合しても良い。
　本発明のリポソーム組成物は、水溶液、水中油型乳化組成物、油中水型乳化組成物、多重乳化組成物、多層状剤のいずれでもよい。ここで、水溶液とは、リポソームが分散した水溶液を意味する。
　リポソーム組成物には、更に、薬剤学的に許容されている他の製剤素材を常法により適宜添加混合してもよい。添加しうる製剤素材としては特に限定されず、例えば、乳化剤、緊張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、矯臭剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤などが挙げられる。
　本発明のリポソーム組成物の保存方法としては、特に限定されず、例えば、低温保存、密閉容器による嫌気的保存、遮光保存などを用いることができる。こうして調製される本発明の組成物は、冷蔵あるいは室温で保存した際に、析出物なく安定に保存できる。
　本発明のリポソームは、医療用、化粧用、食品用、園芸用、酪農用など広い範囲で使用できる。具体的な形態としては注射剤、輸液、液剤、点眼剤、内服用液剤、ローション剤、ヘヤートニック、化粧用乳液、スプレー液、エアロゾル、ドリンク液、液体肥料、保存用溶液などが挙げられる。
　動物細胞の培養は研究や医薬品製造に使用されるが、その培地に添加することで抗体医薬の生産や実験を効率的に行うことが可能になる。
　本発明の好ましい態様によれば、リポソーム組成物であって、該リポソーム組成物におけるリポソームが、ピロロキノリンキノンまたはその塩、並びに、単糖、二糖、および糖アルコールからなる群から選択される糖を含有し、かつ、１～１０μｍの粒子径のリポソームが５０％以上である、リポソーム組成物が提供される。
　本発明のより好ましい態様によれば、リポソーム組成物であって、該リポソーム組成物におけるリポソームが、ピロロキノリンキノンまたはその塩、並びに、単糖、二糖、および糖アルコールからなる群から選択される糖を含有し、かつ、１～１０μｍの粒子径のリポソームが９０％以上である、リポソーム組成物が提供される。
　本発明の好ましい態様によれば、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、単糖、二糖、および糖アルコールからなる群から選択される糖と、リン脂質とを含んでなるｐＨ８以下であり、かつ、６０～１２０℃（好ましくは、６０～８０℃）の溶液を調製し、当該溶液をホモジナイズする工程を含んでなるリポソーム組成物の製造方法が提供される。
　本発明のより好ましい態様によれば、ピロロキノリンキノンまたはその塩と、単糖、二糖、および糖アルコールからなる群から選択される糖と、リン脂質とを重量比１：１～２００：０．１～３０で含んでなる、ｐＨ８以下であり、かつ、６０～１２０℃（好ましくは、６０～８０℃）の溶液を調製し、当該溶液をホモジナイズする工程を含んでなるリポソーム組成物の製造方法が提供される。
　本発明によれば、以下の発明も提供される。
〔１〕下記式（１）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 で表されるピロロキノリンキノン若しくはその塩及び糖を含み、１から１０μｍの粒子径が５０％以上含まれるリポソーム。
〔２〕糖がソルビトール又はキシリトールである〔１〕記載のリポソーム。
〔３〕〔２〕記載のリポソームを含む食品。
〔４〕〔２〕記載のリポソームを含む医薬品。
〔５〕〔２〕記載のリポソームを含む培地。
〔６〕ピロロキノリンキノンと糖を溶解させた水溶液を、ｐＨを８以下に調製した後、６０℃から１９０℃に加温する工程を含む、リポソームの製造方法。
〔７〕前記水溶液におけるピロロキノリンキノン若しくはその塩の濃度が０．０００１～２重量％であり、糖が２から５０重量％である〔６〕記載のリポソームの製造方法。
〔８〕ホモジナイザーを使用する工程を含む、〔７〕記載の製造方法。
　以下に実施例及び調製例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例および調製例のみに限定されるものではない。
試薬
　ピロロキノリンキノンジナトリウムは三菱ガス化学、COATSOME NC-２１（水素添加大豆リン脂質）は日本油脂、その他はＷＡＫＯの試薬を使用した。
リポソーム粒子径測定
　ＳＥＩＳＨＩＮ　ＬＭＳ－３５０（セイシン企業社製）を使用して、水に分散して粒度分布を求めた。この装置では０．１μｍが検出下限である。
比較例１：リポソーム組成物の作製
　ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０ｇを用い、水を全体が１００ｇになるように混合した。この時のｐＨは３．５であった。得られた溶液を６０℃以上に加温しながら、ＮＩＳＳＥＩ ＡＭー３ホモジナイザー（株式会社日本精機製作所社製）で３０分、７０００回転、その後、室温に下げ、１０分、７０００回転で処理した。処理後、蒸発減少した水分を追加した。これを比較例１のリポソーム組成物とした。
実施例１－４
　ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０gを用い、ソルビトールの添加を２，１０，２０，４０ｇで行い、水は全体が１００ｇになるように混合した。この時のｐＨは３．５であった。また、温度は６０℃であった。得られた溶液を比較例１と同様に処理して、実施例１－４のリポソーム組成物を作製した。
比較例２：ＰＱＱを含まない糖を含むリポソーム組成物の作製
　ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０g、ソルビトール１０ｇを用い、全体が１００ｇとなる様に水を混合した。比較例１と同様に処理してリポソーム組成物を作製した。
比較例３：小さなサイズを含むリポソーム組成物の作製
　大豆レシチン０．３ｇ、ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ソルビトール１０ｇを用い、全体が１００ｇとなる様に水を混合した。比較例１と同様の操作を行いリポソーム組成物を作製した。
　実施例１～４、比較例１～３で作製したリポソームの粒子径測定結果を以下の表１に、各粒度分布結果を図１から７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　実施例１～４、比較例１～２について、図１－６より１－１０μｍの粒子径に殆どのリポソームが入っていることが分かった。
　ソルビトールの添加による粒子径の変化は小さく、糖添加によるリポソームの粒子径への影響はないことが分かった。ＰＱＱ添加の有無も粒子径への影響はないことが分かった。
　比較例３は一般的な大豆レシチンにすることで小さな粒子を含むリポソームを作ることができ、小さな粒子の影響を見ることができる。
増殖性試験
　チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－ＤＨＦＲ；大日本住友製薬より入手）をα－ＭＥＭ＋１０％牛胎児血清の培地で５％ＣＯ２, ３７℃で培養した。イワキ製９６穴プレートを使用し、１個の穴に５０００個の細胞になるように１００μlの培地とともに加え、一晩培養した。培養液を抜き、所定の試験濃度の実施例１ー４、比較例１ー３で調製したリポソーム組成物を含む培地を加えた。1日培養後、培地を入れ替え同仁化学　ＷＳＴアッセイキットを使用して１時間反応させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。この時の吸光度は細胞数に比例する。
　サンプルとして、実施例１～４、比較例１～３で調製したリポソーム組成物及びＰＱＱジナトリウム（比較例４）を用い、これらのサンプルを培地で希釈して試験した。試験濃度は５００、２５０、１２５、６２、３１、１６、８、４、２、１、０．５、０μＭで行った。比較例２はリポソーム組成物の濃度とした。各サンプルについて試験を２回行い平均化した。結果を図８に示す。縦軸は無添加の細胞濃度を１００とした値である。
　全細胞数が無添加と比較して１０％程度少なくなる添加量を増殖停止濃度とし（この濃度が下がると吸収性が向上している）、また細胞濃度が無添加と比較して５％程度高くなる濃度を増殖促進濃度とし、各サンプルの試験結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　全細胞数が培地のみと比較して１０％少なくなる添加量は比較例４のＰＱＱジナトリウム５００μＭ、比較例１のソルビトール無添加のリポソーム組成物で６２μＭであった。これに対し、小さなリポソーム組成物を含む比較例３では３１μＭとなっていた。増殖停止濃度はリポソーム化により吸収性が上がり、低い濃度で効果が表れた。
　増殖促進濃度は、比較例１より実施例１－４の方が広い濃度範囲で有効であった。
　リポソームにＰＱＱと糖を添加すると増殖停止濃度は上がり、増殖抑制効果は糖の添加により、小さくなった。
　比較例２のＰＱＱを添加しない糖添加のリポソーム組成物では５００μＭ相当では細胞増殖に影響がみられたが、その他では影響がない。また、比較例３の小さなリポソーム組成物では低い濃度で増殖阻害が現れ、増殖促進効果は見られない（試験範囲よりも低い濃度になっていると予想される）。
　さらに、予想外にもＰＱＱによる５％程度の増殖促進が見られる濃度は糖の添加が増えることで広い濃度範囲になった。低濃度から高い範囲で有効であった。
　細胞の増殖を促進する濃度が広くなることで培地に添加する際の組成選択が容易になると考えられる。
実施例５
　ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ソルビトール１０ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０ｇに、水を全体が１００ｇになるように混合した。この時のｐＨは３．５であった。また、温度は４０℃であった。得られた溶液の温度を上げながら、最終的に６０℃以上になるように加温しながら、ＮＩＳＳＥＩ ＡＭ－３ホモジナイザーで３０分、７０００回転、その後、室温に下げ、３０分、７０００回転で処理した。処理後、合計重量１００ｇになるように蒸発減少した水分を追加した。
　実施例５で作製したリポソームの粒子径測定結果を以下の表３に、粒度分布結果を図９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例６および７
　ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ソルビトール５０または０．５ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０gに、水を全体が１００ｇになるように混合した。この時のｐＨは３．５であった。また、温度は６０℃であった。実施例１～４と同様に処理してリポソーム組成物を作製した。
　実施例６および７で作製したリポソームの粒子径測定結果を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　実施例５～７についての増殖性試験の結果を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　１－１０μｍの存在量が５３％で、広い濃度範囲で増殖促進できることが確認された（実施例５）。
　また、糖の濃度が０．５重量％、５０重量％でも広い濃度範囲で増殖促進できることが確認された（実施例６および７）。
実施例８～１２
　ＰＱＱジナトリウム０．３ｇ、ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣー２１（水素添加大豆リン脂質）３．０ｇ、糖を表６に示す重量を用い、全体が１００ｇとなるように水を混合した。この時のｐＨは３．５であった。また、温度は６０℃であった。得られた溶液のＮＩＳＳＥＩ ＡＭー３ホモジナイザーによる処理は以下のように行い、実施例８－１２のリポソーム組成物を作製した。
実施例８：８０℃以上に加温しながら１時間、７０００回転
実施例９：４０℃以上に加温しながら３０分、７０００回転
実施例１０：６０℃以上加温しながら３０分、７０００回転、その後、室温に下げ、１時間、７０００回転
実施例１１および１２：６０℃以上加温しながら３０分、７０００回転
　実施例８～１２で作製したリポソームの粒子径測定結果を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　実施例８～１２についての増殖性試験の結果を以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　１－１０μｍの存在量が４９．５５％で、広い濃度範囲で増殖促進できることが確認された（実施例９）。
　また、糖については、糖アルコールのみならず単糖、二糖でも広い濃度範囲で増殖促進できることが確認された（実施例１１および１２）。
　本発明は、化粧品、食品、医薬・農薬等の分野で有効利用することができる。

Claims (13)

  1. 　リポソーム組成物であって、該リポソーム組成物におけるリポソームが、下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表されるピロロキノリンキノンまたはその塩、および糖を含有し、かつ、１～１０μｍの粒子径のリポソームが４５％以上である、リポソーム組成物。
  2. 　リポソームの体積平均粒子経が、０．５～２０μｍである、請求項１に記載のリポソーム組成物。
  3. 　糖が、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、および糖アルコールからなる群から選択される、請求項１に記載のリポソーム組成物。
  4. 　糖が、ソルビトールまたはキシリトールである、請求項１に記載のリポソーム組成物。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を含んでなる、食品。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を含んでなる、医薬品。
  7. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を含んでなる、培地。
  8. 　下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表されるピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分とを含んでなる４０～１９０℃の溶液を調製することを含んでなる、リポソーム組成物の製造方法。
  9. 　溶液のｐＨが、８以下である、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩の濃度が、０．０００１～２重量％であり、糖が０．５～５０重量％である、請求項８に記載の製造方法。
  11. 　溶液におけるピロロキノリンキノンまたはその塩と、糖と、脂質成分との重量比が、１：１～２００：０．１～３０である、請求項８に記載の製造方法。
  12. 　溶液をホモジナイズする工程をさらに含んでなる、請求項８に記載の製造方法。
  13. 　請求項８に記載の製造方法により製造される、リポソーム組成物。
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