WO2012144528A1 - 標的粒子の定量方法、光分析装置及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

標的粒子の定量方法、光分析装置及び光分析用コンピュータプログラム Download PDF

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秀孝 中田
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Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, to determine the concentration of particles dispersed and moving in a sample solution.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution
  • a confocal microscope or a multiphoton microscope to determine the concentration of particles dispersed and moving in a sample solution.
  • Fluorescence-Intensity Distribution Analysis (FIDA, for example, Patent Document 3) and Photon Counting Histogram (PCH, for example, Patent Document 4) are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of fluorescence intensities of fluorescent molecules entering and leaving the volume is generated.
  • the average value of the intrinsic brightness of fluorescent molecules and the average number of molecules staying in the confocal volume are calculated. Based on the above information, changes in the structure or size of molecules, binding / dissociation states, dispersion / aggregation states, and the like are estimated.
  • Patent Documents 5 and 6 propose a method of detecting a fluorescent substance based on the time lapse of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 7 weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate is measured using a photon counting technique.
  • a signal calculation processing technique for detecting the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by weak light has been proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method.
  • the measurement time is also greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc.
  • the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the magnitude of the temporal fluctuation of the measured fluorescence intensity is calculated by statistical processing, and the sample solution is based on the magnitude of the fluctuation.
  • Various characteristics such as fluorescent molecules entering and exiting the minute region are determined. Therefore, in order to obtain a significant result in the above optical analysis technique, the concentration or number density of the fluorescent molecules to be observed in the sample solution must be as long as one second in the equilibrium state. In order for the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time to enter and exit the micro area, it is preferable that there is always approximately one fluorescent molecule in the micro area.
  • the volume of the confocal volume is typically about 1 fL, so that the concentration of the fluorescent molecule or the like is preferably about 1 nM or more.
  • the concentration or number density of the particles to be observed in the sample solution is significantly lower than the level capable of statistical processing (for example, significantly lower than 1 nM)
  • the observation target is measured in a minute region. A situation occurs that only rarely enters in time. For this reason, in the measurement result of the fluorescence intensity, a state in which the observation object is not present at all in the minute region is included for a long period of time, and the observation amount of the significant fluorescence intensity is reduced.
  • the optical analysis technique based on the statistical fluctuation of the fluorescence intensity as described above cannot obtain a significant or accurate analysis result.
  • Patent Documents 5 and 6 the statistical processing relating to the fluctuation of the fluorescence intensity as described above is not performed, and the measurement time over several seconds is used.
  • the presence or absence of a fluorescent molecule or the like to be observed in the sample can be specified by the presence or absence of the generation of a significant intensity fluorescent signal.
  • Patent Document 6 suggests that detection sensitivity is improved by generating a random flow that stirs the sample solution.
  • the technique of patent document 7 includes processes, such as measurement in a flow cytometer, or the fixation process of the fluorescent particle on a board
  • the amount of sample required for inspection is significantly larger than that of optical analysis technologies such as FCS, FIDA, PCH, etc., and it is considered that complicated and advanced operation techniques are required by practitioners. It is done.
  • the present invention has been devised in view of the above-mentioned problems, does not include statistical processing performed by optical analysis techniques such as FCS, FIDA, and PCH, and the concentration or number density of particles to be observed is Target particles that are dispersed in the sample solution and move randomly by a novel photoanalysis technology that can detect the state or characteristics of particles to be observed in the sample solution that are lower than the level handled by those photoanalysis technologies It aims at providing the method of quantifying.
  • the present inventors have quantified target particles that are dispersed and moving randomly in a sample solution, and are objects to be observed that are dispersed and randomly moved in a sample solution.
  • a particle specifically, a luminescent probe bound to a target particle or a luminescent probe; the same shall apply hereinafter
  • the following two points were found to complete the present invention. It was. That is, (1) the target particle can be detected with high sensitivity even when the concentration of the target particle in the sample solution is very low by detecting the observation target particle using the scanning molecule counting method.
  • the scanning molecule counting method is a novel optical analysis technique proposed by the present applicant in Japanese Patent Application No. 2010-044714.
  • a method for quantifying target particles dispersed and randomly moving in a sample solution comprising: (a) the target particles; Preparing a sample solution containing a luminescent probe that binds to a target particle, and binding the target particle and the luminescent probe in the sample solution; (b) an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope; Using the moving step of moving the position of the light detection region of the optical system in the sample solution, and moving the position of the light detection region of the optical system in the sample solution while moving the position of the light detection region of the optical system.
  • the target particles detected in the detection step are Detecting a light signal emitted from the luminescent probe to directly or indirectly detect the target particles individually; and (c) the target particles detected in the detection step.
  • number Based on a counting step for counting and a calibration curve approximating the correlation between the concentration or the amount of the target particles in the sample solution and the number of the target particles, the target particles counted in the step (b) A calculation step of calculating the concentration of the target particles in the sample solution from the number.
  • the position of the light detection region is moved at a predetermined speed in the moving step.
  • the position of the light detection region is combined with the light emitting probe or the light emitting probe. It is preferable that the target particles move at a speed faster than the faster diffusion movement speed.
  • the position of the light detection region is combined with the light emitting probe or the light emitting probe. It is preferable that the target particles move at a speed faster than the faster diffusion movement speed.
  • the target particles move at a speed faster than the faster diffusion movement speed.
  • the luminescent probe or the target particle bound to the luminescent probe has entered the light detection region.
  • the energy that generates a fluorescence energy transfer phenomenon when the light emitting probes are close to each other.
  • the target particle is a nucleic acid; and the luminescent probe specifically hybridizes with the target particle. It is preferably a single-stranded nucleic acid to which at least one of a fluorescent substance serving as an energy donor and a substance serving as an energy acceptor binds in a soybean and a fluorescence energy transfer phenomenon.
  • a seventh aspect of the present invention in any one of the first aspect to the sixth aspect, (d) after the step (a), binds to the target particle from the sample solution. It is preferable to have a step of recovering a complex containing the target particle and the luminescent probe separately from the luminescent probe that has not been used.
  • a step of recovering a complex containing the target particle and the luminescent probe separately from the luminescent probe that has not been used in the aspect of the seventh aspect, after (e) dissociating the luminescent probe from the complex recovered in the step (d), It is preferable to have a step of collecting the target particles separately from each other.
  • light from a plurality of luminescent particles dispersed and moving randomly in a sample solution is detected using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a light detection device that moves the position of the light detection region of the optical system in the sample solution by changing a light path of the optical system; and the light emission in the light detection region.
  • a light detection unit for detecting light of particles, and an optical signal of the light from each of the light emitting particles detected by the light detection unit while moving the position of the light detection region in the sample solution
  • Signal processing for individually detecting the number of the luminescent particles detected during movement of the position of the light detection region by counting the number of the light signals from the individually detected luminescent particles And the emission in the sample solution
  • a storage unit that stores a calibration curve that approximates a correlation between the concentration or amount of particles and the number of the luminescent particles counted from the sample solution; and is counted by the signal processing unit based on the calibration curve
  • a concentration calculation unit for calculating the concentration of the luminescent particles in the sample solution from the number of the luminescent particles; and a display unit for displaying the concentration of the luminescent particles in the sample solution calculated by the concentration calculation unit; ;including.
  • the light detection area moving unit moves the position of the light detection area at a predetermined speed.
  • the light detection region moving unit is configured to move the light detection region in the light detection region at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. It is preferable to move the position.
  • the signal processing unit detects that one of the luminescent particles has entered the light detection region.
  • the signal processing unit when the optical signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, the signal processing unit is configured such that one of the luminescent particles is It is preferable to detect that the light detection area has been entered.
  • the signal processing unit in any one of the ninth to thirteenth aspects, is configured to perform the sample solution based on the number of the detected luminescent particles. It is preferable to determine the number density or concentration of the luminescent particles therein.
  • the luminescent particle is a target particle bound to a luminescent probe;
  • the emitted light is light emitted from the luminescent probe in a state of being bound to the target particle.
  • the light detected by the light detection unit includes the target particle and the luminescent probe. Light emitted from the luminescent probe released from the complex is preferable.
  • light from a plurality of luminescent particles that are dispersed in a sample solution and move randomly using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope is used.
  • a computer program for optical analysis for detection; a change procedure for changing an optical path of the optical system in order to move a position of a light detection region of the optical system in the sample solution; and the sample solution A light detection procedure for detecting the light of the light emitting particles in the light detection region during movement of the position of the light detection region in the light detection, and a light signal of the light from each of the detected light emission particles
  • Optical signal detection procedure for individually detecting the light emission detected during movement of the position of the light detection region by counting the number of the optical signals of the light from the individually detected light emitting particles grain
  • a calibration curve that approximates the correlation between the concentration or amount of the luminescent particles in the sample solution and the number of the luminescent particles counted from the sample solution.
  • a concentration calculation procedure for calculating the concentration of the target particles in the sample solution from the counted number of the plurality of luminescent particles.
  • the position of the light detection region is moved at a predetermined speed in the changing procedure.
  • the position of the light detection region is faster than a diffusion movement speed of the luminescent particles. It is preferable to move by.
  • the shape of the optical signal detected in time series in the optical signal detection procedure is changed. Preferably, it is detected that one of the luminescent particles has entered the light detection region.
  • the optical signal detection procedure in any one of the seventeenth aspect to the twentieth aspect, the optical signal having an intensity greater than a predetermined threshold is used. When detected, it is preferable to detect that one of the luminescent particles has entered the light detection region.
  • the sample solution in any one of the seventeenth aspect to the twenty-first aspect, further, in the sample solution, based on the number of the detected luminescent particles. It is preferable to include a procedure for determining the number density or concentration of the luminescent particles.
  • light detected from the light detection region in the light detection procedure may be the target.
  • the light is preferably emitted from the luminescent probe in a state of being bound to particles.
  • light detected from the light detection region in the light detection procedure may be the target.
  • the light is preferably emitted from the luminescent probe released from a complex containing particles and the luminescent probe.
  • the target particle concentration in the sample can be determined by the above target particle quantification method even when the target particle to be analyzed is present in a very small amount in the sample. Further, in the target particle quantification method described above, by using a calibration curve prepared from a standard sample with a known target particle concentration, the concentration of the target particle in the sample solution can be more easily determined from the number of target particles counted. Can be requested.
  • FIG. 6 is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle. It is a figure which shows the example of the time change of the photon count (light intensity) in FIG. 4A. It is a figure showing the processing procedure for counting particles from the time change of photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method in the form of a flowchart. It is a figure which shows typically the change of the light intensity corresponding to observation object particle
  • the horizontal axis is the concentration of the fluorescent substance ATTO633 in the sample solution, the vertical axis is the number of peaks, the count value of each sample solution is plotted, and the created calibration curve is shown (normal scale display) ).
  • the horizontal axis is the concentration of the target nucleic acid in the standard sample solution
  • the vertical axis is the number of peaks
  • the count value of each standard sample solution is plotted
  • the prepared calibration curve is shown.
  • the horizontal axis is the concentration of the target nucleic acid in the standard sample solution
  • the vertical axis is the number of peaks, the count value of each standard sample solution is plotted, and the prepared calibration curve is shown.
  • a scanning molecule counting method In the scanning molecule counting method, particles that emit light that moves in a sample solution and moves randomly while traversing the sample solution by the minute region (hereinafter referred to as “luminescent particles”) cross the minute region. In addition, the light emitted from the light emitting particles in the minute region is detected. As a result, the scanning molecule counting method individually detects each of a plurality of luminescent particles in a sample solution, and acquires information on the counting of the luminescent particles and the concentration or number density of the luminescent particles in the sample solution. enable.
  • the sample necessary for measurement may be a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L).
  • the measurement time is short, and it is possible to quantitatively detect the characteristics such as concentration or number density of luminescent particles having a lower concentration or number density than in the case of optical analysis techniques such as FIDA. It becomes.
  • Luminescent particles mean particles that emit light by fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, and the like.
  • the target particle and the luminescent probe are combined to form a luminescent particle.
  • the “light detection region” of the optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope is a minute region in which light is detected in those microscopes, and illumination light is given from an objective lens. Corresponds to a region where the illumination light is condensed. In the confocal microscope, this light detection region is determined by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the light is sequentially detected while moving the position of the light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution with the light detection region.
  • light from the luminescent probe is detected when the moving light detection region includes a luminescent probe that is bound or associated with a randomly moving particle. Thereby, the presence of one particle is detected.
  • the presence of particles to be detected may be detected directly or indirectly.
  • the case where it is directly detected is performed by detecting a luminescent probe bound to a target particle.
  • Indirect detection is performed by detecting the light of the luminescent probe dissociated from the particle after the luminescent probe once binds to the target particle.
  • the presence of the particles is individually detected one by one, and various states relating to the state of the particles in the solution are detected.
  • Information is acquired.
  • the number of particles detected individually may be counted to count the number of particles detected during movement of the position of the light detection region (particle counting). ).
  • particle counting information on the number density or concentration of particles in the sample solution can be obtained by combining the number of particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration of the particles is concrete. Can be calculated automatically.
  • the absolute number density value or concentration value is not directly determined, but the relative number density or concentration ratio with respect to a plurality of sample solutions or a standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated. It may be like this.
  • the optical detection path is moved by changing the optical path of the optical system, so that the movement of the light detection area is quick and the mechanical movement of the sample solution is performed. Vibration and hydrodynamic action are not substantially generated.
  • the light can be measured in a stable state without the influence of the mechanical action on the particles to be detected.
  • vibration or flow acts on the sample solution, the physical properties of the particles may change.
  • measurement and analysis can be performed with a small amount (about 1 to several tens of ⁇ L) of the sample solution as in the case of FCS, FIDA, and the like.
  • the luminescent probe includes a case where one luminescent probe is bonded to one particle, a case where a plurality of luminescent probes are bonded to one particle, and a particle after being bonded to one particle according to an embodiment. Includes luminescent probe when dissociated. The same applies hereinafter.
  • the predetermined threshold is a light intensity value set in advance, and is a value set experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is appropriately changed based on the characteristics of the luminescent probe or the number density or concentration in the sample solution. Good.
  • the manner of light detected from the luminescent probe can vary depending on its properties or number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from the light emitting probe decreases, so that the light speed from the light emitting probe can be measured accurately or with high sensitivity, It is preferable to change appropriately.
  • the movement speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably the diffusion movement speed of the luminescent probe bound to the target particle to be detected ( It is set higher than the average moving speed of particles by Brownian motion).
  • the photodetection region passes through the position of the luminescent probe bonded to one particle, the light emitted from the luminescent probe is detected, and the luminescent probe is individually detected. To detect. However, if the luminescent probe bound to the particles moves randomly by Brownian motion in the solution and enters and exits the photodetection region multiple times, the presence of the particle to be detected multiple times from one luminescent probe.
  • the moving speed of the light detection region is set higher than the diffusion moving speed of the luminescent probe coupled to the particles. Specifically, it is set to move at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent probe in a state of being bound to the target particle.
  • the target particle is detected indirectly by detecting the optical signal emitted from the luminescent probe (that is, when the observation target particle is a luminescent probe)
  • the speed is higher than the diffusion movement speed of the luminescent probe. To be moved.
  • the position of the light detection region is set so as to be moved at a higher speed than the faster one of the diffusion movement speed of the luminescent probe or the target particle combined with the luminescent probe.
  • the optical path of the optical system for moving the position of the light detection region may be changed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the scanning molecule counting method is configured to detect light from the light detection region of the confocal microscope or the multiphoton microscope, as in the case of the optical analysis technology such as FIDA, the light detection mechanism itself, The amount of sample solution may be trace as well.
  • the scanning molecule counting method statistical processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity is not performed, so the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is necessary for the optical analysis technique in which the particle number density or concentration is FIDA or the like. Applicable to sample solutions that are significantly lower than
  • each particle dispersed or dissolved in the solution is individually detected. Therefore, the information is used to quantitatively count the particle concentration or the concentration or number density of the particles in the sample solution. It is possible to obtain information on calculation or concentration or number density.
  • the particles passing through the light detection region and the detected optical signal are made to correspond one-to-one to detect the particles one by one. This makes it possible to count particles that are dispersed in the solution and move randomly, and to determine the concentration or number density of particles in the sample solution with higher accuracy than before.
  • the target particle quantification method described above in which the concentration of the luminescent probe in the sample solution is measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader. Even if the concentration is lower than the concentration that can be determined based on the fluorescence intensity, the target particles can be measured quantitatively.
  • the sample solution is not affected by mechanical vibration or hydrodynamic action. Or the sample solution is observed in a mechanically stable state.
  • the amount of sample required increases significantly, and particles, luminescent probes or conjugates or other substances in the solution may be altered or denatured by hydrodynamic action due to flow.
  • the quantitative detection result Reliability is improved.
  • measurement can be performed in a state where there is no influence or artifact due to mechanical action on particles to be detected in the sample solution.
  • the scanning molecule counting method is a combination of an optical system of a confocal microscope capable of executing FCS, FIDA, and the like and a photodetector as schematically illustrated in FIG. 1A. It can be realized by an optical analyzer. As shown in FIG. 1A, the optical analyzer 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data. The optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope.
  • Laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagating through the single mode fiber 3 is emitted as light that diverges at an angle determined by a specific NA at the output end of the fiber.
  • the emitted light becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5 and the reflection mirrors 6 and 7, and enters the objective lens 8.
  • the laser light emitted from the objective lens 8 is focused in the sample solution in the sample container or well 10, and a region (excitation region) having a high light intensity is formed.
  • particles to be observed and luminescent probes that bind to the particles are dispersed or dissolved.
  • a luminescent label such as a fluorescent dye is added
  • the luminescent probe When particles bound or associated with the luminescent probe (in some embodiments, the luminescent probe once bound to the particle and then dissociated from the particle) enter the excitation region, the luminescent probe is excited and light is emitted during that time.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, and is collected by the condenser lens 12.
  • the collected light passes through the pinhole 13, passes through the barrier filter 14 (here, only the light component in a specific wavelength band is selected), and is introduced into the multimode fiber 15 for light detection.
  • the device (light detection unit) 16 is reached. Then, after being converted into a time-series electrical signal in the photodetector 16, it is input to the computer 18 and processing for optical analysis described later is performed.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8.
  • 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is at the top of the region center).
  • the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere bounded by the plane where the light intensity is 1 / e 2), and is called confocal volume.
  • the photodetector 16 an ultrasensitive photodetector that can be used for photon counting is preferably used.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • the optical path of the optical system is changed to scan the sample solution with the light detection region, that is, the position of the focal region (ie, the light detection region) in the sample solution.
  • a mechanism for moving is provided.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, as schematically illustrated in FIG. 1C, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed.
  • the mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope. Further, the mirror deflector 17 for achieving a desired movement pattern of the position of the light detection region is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof. In other words, various movement patterns may be selected in the program in the computer 18.
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down.
  • mechanical vibrations and hydrodynamic actions are substantially caused in the sample solution. Will not occur. As a result, it becomes possible to eliminate the influence of the dynamic action on the observation object, and stable measurement is achieved.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed.
  • the optical systems 2 to 5 for generating the excitation light may be omitted.
  • the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light is appropriately determined according to the wavelength of the light that excites the conjugate of the particle and the luminescent probe or the luminescent probe. You may be able to choose.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a sample includes a combination of a plurality of types of particles having different wavelengths and a combination of luminescent probes or a luminescent probe, the light from them is changed depending on the wavelength. It may be configured to detect separately.
  • a spectroscopic analysis technique such as FIDA is superior to a conventional biochemical analysis technique in that it requires an extremely small amount of sample and can perform inspection quickly.
  • the concentration and characteristics of the observation target particles are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity. Therefore, in order to obtain an accurate measurement result, the concentration or number density of the observation target particles in the sample solution is a level at which about one observation target particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. It is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that, for example, if the observation target particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV, a significant light intensity (photon count) is measured. It appears only in a part of the time, and it is difficult to calculate the fluctuation of the light intensity with high accuracy. Also, if the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which one observation target particle is always present in the light detection region during measurement, the light intensity fluctuation calculation is affected by the background. Cheap. Furthermore, the measurement time becomes long in order to obtain significant light intensity data sufficient for calculation. In contrast, the scanning molecule counting method can detect characteristics such as the number density or concentration of particles to be observed even when the concentration of particles to be observed is lower than the level required by spectroscopic techniques such as FIDA. It is.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region (light detection region moving unit: mirror deflector 17) is driven to describe the optical path.
  • light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV. Is executed.
  • FIG. 2A shows that during the movement of the light detection region CV (time t0 to t2 in the figure), there is one particle (in the figure, the fluorescent dye F as a luminescent probe is combined with the target particle T).
  • significant light intensity (Em) is detected as depicted in FIG. 2B.
  • the light emitting probe or the coupling of the light emitting probe is detected.
  • Target particles are detected individually.
  • a case where it is directly detected that is, a case where a luminescent probe bound to a target particle is detected will be described, but if it is detected indirectly, that is, a luminescent probe once bound to a target particle. Later, the light of the luminescent probe dissociated from the particles can also be detected.
  • the number of detected particles By counting the number of detected particles, the number of particles existing in the measured region, or information on the concentration or number density can be acquired.
  • the concentration of the fluorescently labeled particles is measured from the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader. It is possible to measure to a lower concentration than when doing so.
  • the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the concentration of the fluorescently labeled particles is sufficiently low, the amount of noise signal with respect to the amount of signal due to light emitted from the fluorescently labeled particles increases (deterioration of the S / N ratio).
  • the proportional relationship between the concentration of the fluorescently labeled particles and the amount of optical signal is lost, and the accuracy of the determined concentration value deteriorates.
  • the noise signal is excluded from the detection result, and only the signal corresponding to each particle is counted to obtain the concentration. Calculated. Thereby, it is possible to detect even a lower concentration than when the concentration is detected on the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the measurement of the light intensity in the optical analysis of the scanning molecule counting method is that the mirror deflector 17 is driven during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution). It may be executed in the same manner as the light intensity measurement step in FCS or FIDA.
  • the operation process typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 starts irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution in accordance with a program stored in a storage device (not shown).
  • This program includes a procedure for changing the optical path to change the position of the light detection region in the sample solution (change procedure), and a procedure for detecting light from the light detection region while moving the position of the light detection region (light Detection procedure).
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanometer mirror) to move the position of the light detection region in the well 10 under the control of the processing operation according to the program of the computer 18.
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18.
  • the computer 18 generates and stores time-series light intensity data from the transmitted optical signal in an arbitrary manner.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, so that the light detection is performed sequentially for a predetermined unit time (BINTIME) over a predetermined time.
  • BINTIME predetermined unit time
  • the time-series light intensity data may be time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region passes is required. Accordingly, the movement of the position of the light detection region is executed in a manner in which the movement distance is grasped. Since it is easier to interpret the measurement results when the elapsed time during measurement and the movement distance of the position of the light detection area are in a proportional relationship, the movement speed is basically preferably a constant speed. It is not limited to.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to quantitatively and accurately perform individual detection of the observation target particles from the measured time-series light intensity data or counting of the number of observation target particles. For this reason, it is preferable that the moving speed is set to a value faster than the random movement of the observation target particle, that is, the moving speed due to the Brownian movement.
  • the observation target particle is a conjugate of the particle and the luminescent probe or a luminescent probe which is decomposed and released after the binding to the particle.
  • the target particle bonded to the luminescent probe is used. It is.
  • the observation target particle of the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely at random, the position moves with time by Brownian motion. Therefore, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement due to the Brownian motion of the particle, the particle randomly moves in the region as schematically illustrated in FIG. 3A. As a result, the light intensity changes randomly as shown in FIG. 3B, and it becomes difficult to identify a significant change in light intensity corresponding to each observation target particle T. Specifically, as described above, the intensity of the excitation light in the light detection region decreases outward with the center of the region as a vertex. Therefore, preferably, as illustrated in FIG.
  • the particles (the fluorescent dye F and the target particle T) cross the light detection region in a substantially straight line.
  • the light intensity change profile corresponding to each particle becomes substantially uniform.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set faster than the average moving speed (diffusion moving speed) due to the Brownian motion of the particles so that the correspondence between the individual observation target particles T and the light intensity can be easily specified. Is done.
  • the profile of the change in light intensity is substantially the same as the excitation light intensity distribution.
  • an observation target particle having a diffusion coefficient D (more precisely, a conjugate of a particle and a luminescent probe, or a luminescent probe that is decomposed and released after binding to the particle) has a photodetection region having a radius Wo due to Brownian motion.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to a value sufficiently faster than that with reference to the diffusion moving speed Vdif.
  • Wo is about 0.62 ⁇ m
  • Vdif is 1.0 ⁇ Since it is 10 ⁇ 3 m / s
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s, which is approximately 10 times that.
  • the profile of the change in light intensity is set by variously setting the moving speed of the position of the light detection region, and the expected profile (typically, the excitation light intensity distribution is approximately the same).
  • a preliminary experiment for finding the condition may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 performs processing according to the program stored in the storage device (light signals from the individual luminescent particles are individually detected from the detected light). According to the detection procedure (optical signal detection procedure), an analysis of light intensity may be performed as described below.
  • the trajectory when one observation target particle passes through the light detection region is substantially linear as shown in FIG. 4A.
  • the change in the light intensity corresponding to the particle is a profile (usually approximately bell) reflecting the light intensity distribution in the light detection region (determined by the optical system), as schematically depicted in FIG. 6A. Shape). Therefore, in one method of detecting the observation target particle, when the threshold Io is set for the light intensity and the time width ⁇ in which the light intensity exceeding the threshold continues is within a predetermined range, the profile of the light intensity is It may be determined that one particle has passed through the light detection region, and one observation target particle may be detected.
  • the predetermined range for the threshold value Io and the time width ⁇ for the light intensity is a combination of the observation target particle and the luminescent probe that moves relative to the light detection region at a predetermined speed (or is decomposed after the combination with the particle). It is determined based on the profile assumed as the intensity of light emitted from a free luminescent probe.
  • the specific value may be arbitrarily set experimentally, and is selectively determined according to the characteristics of the conjugate of the observation target particle and the luminescent probe (or the luminescent probe that has been decomposed and released after binding to the particle). It's okay.
  • I A ⁇ exp ( ⁇ 2t 2 / a 2 ) (4)
  • the light intensity profile may be determined to correspond to one observation target particle passing through the light detection region, and one observation target particle may be detected.
  • the intensity A and the width a are outside the predetermined ranges, they may be ignored in the analysis as noise or foreign matter.
  • Counting of observation target particles is performed by counting the number of particles detected by the above-mentioned detection method of observation target particles by any method (a procedure for counting the number of luminescent particles). May be. However, when the number of particles is large, the processing illustrated in FIGS. 5 and 6B may be performed, for example.
  • the light intensity measurement described above that is, depending on the light detection region
  • the time series optical signal data photon count data
  • the time series optical signal data (FIG. 6B, uppermost stage “detection result (unprocessed) ”) Is subjected to a smoothing process (step 110,“ smoothing ”in the upper part of FIG. 6B).
  • the light emitted from the combination of the particle and the luminescent probe or the light emitted from the luminescent probe is stochastically emitted, and a missing data value may occur in a minute time. However, the missing data value can be ignored by the smoothing process.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example. Parameters for executing the smoothing processing, such as the number of data points averaged at a time in the moving average method and the number of moving averages, are the moving speed (scanning speed) of the position of the photodetection area at the time of optical signal data acquisition, BIN It may be set as appropriate according to TIME.
  • a first-order differential value for the time of the time-series optical signal data after the smoothing process is calculated.
  • the time differential value of the time-series optical signal data has a large change in value at the time of change of the signal value, as illustrated in the lower “time differential” in FIG. 6B. Therefore, it is possible to advantageously determine the start point and end point of a significant signal (peak signal) by referring to such a time differential value.
  • a significant signal is sequentially detected on the time-series optical signal data, and it is determined whether or not the detected peak signal is a signal corresponding to the observation target particle.
  • peak signal a significant signal
  • the start point and the end point of one peak signal are searched and determined, A peak presence region is identified (step 130).
  • the bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series optical signal data in the peak existence region (“bell-shaped function fitting” in the lower part of FIG. 6B).
  • parameters such as the peak intensity Imax, peak width (full width at half maximum) w of the bell-shaped function, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function.
  • the calculated bell-shaped function parameter is assumed as a bell-shaped profile parameter drawn by an optical signal detected when a combination of one particle and the light-emitting probe or the light-emitting probe passes through the light detection region. It is determined whether it is within the range, that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range (step 150). As shown on the left side of FIG.
  • the calculated signal of the bell-shaped function is determined to be within an expected range in the optical signal corresponding to one particle and the combination of the luminescent probe or the luminescent probe. Is determined to be a signal corresponding to one observation target particle. Thereby, one observation target particle is detected and counted as one particle (the number of particles is counted up, step 160).
  • the peak signal (the signal labeled “noise”) whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is a signal due to noise or a foreign object. Ignored as there is.
  • the search and determination of the peak signal in the processing of the above steps 130 to 160 is repeatedly performed over the entire time-series optical signal data, and is counted as a particle every time one observation target particle is detected.
  • the particle count value obtained so far is set as the number of observation target particles detected in the time series optical signal data.
  • (Iii) Determination of the number density or concentration of the observation target particles
  • the total volume of the region through which the light detection region passes during acquisition of time-series optical signal data is used.
  • the number density or concentration of the particles is determined.
  • the effective volume of the light detection region varies depending on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system, it is generally difficult to calculate from the design value. Accordingly, it is not easy to calculate the total volume of the region through which the light detection region passes. Therefore, typically, for a solution (reference solution) with a known particle concentration, the light intensity measurement, particle detection, and counting described above are performed under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined.
  • the total volume of the region through which the light detection region has passed that is, the relationship between the number of detected particles and the concentration may be determined.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed may be given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method.
  • information on the relationship between the concentration C of various standard particles and the number N of particles is assumed for the assumed movement pattern of the light detection region.
  • the information may be stored in advance in the storage device of the computer 18 so that the user can use the information of the relationship appropriately stored when performing optical analysis.
  • a method for quantifying target particles according to an embodiment of the present invention is a method for quantifying target particles that are dispersed in a sample solution and move randomly, and the target particles in the sample solution are bound by a luminescent probe for labeling. Let The concentration of the target particles in the sample solution is then calculated from the number of target particles bound to the luminescent probe counted by the scanning molecule counting method, based on a calibration curve prepared using a standard sample with a known target particle concentration. Is calculated (concentration calculation procedure).
  • the scanning molecule counting method is a measurement method that can measure luminescent particles on a particle-by-particle basis when the molecules are in a discrete state.
  • the target particle quantification method can count target particles with high sensitivity even when the concentration of the target particles to be analyzed in the sample solution is very low. . Furthermore, the target particle quantification method according to one embodiment of the present invention detects target particles through binding to a luminescent probe. However, since a calibration curve is used, it is simpler and easier in a sample solution. The concentration of target particles can be determined.
  • the target particle quantification method may include a procedure for determining the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution based on the number of detected luminescent particles.
  • the target particle quantification method includes the following steps (a) to (c).
  • a calibration approximating the correlation between the concentration or amount of the target particles in the sample solution and the number of target particles. Calculating the concentration of the target particles in the sample solution from the number of the target particles counted in the step (b) based on a line.
  • the step (b) uses a confocal microscope or a multiphoton microscope optical system to move the position of the light detection region of the optical system in the sample solution;
  • step (a) a sample solution containing target particles and a luminescent probe that binds to the target particles is prepared, and the target particles and the luminescent probe are bound in the sample solution.
  • the term “particles dispersed in a sample solution and randomly moving” refers to particles such as atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution (light-emitting particles or non-light-emitting particles). It may be any of particles), and means a particle that is not fixed to a substrate or the like and is freely performing Brownian motion in the solution.
  • the target particles are particles that are dispersed in the sample solution and move randomly, and are intended particles for quantifying the concentration in the sample solution.
  • target particles include biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, nucleic acid analogs, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate biological objects such as viruses and cells, or non-living objects. And the like (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.).
  • the nucleic acid may be DNA, RNA, or an artificially amplified polymer such as cDNA.
  • Nucleic acid-like substances are labeled with a substance in which the side chain of a natural nucleotide (naturally occurring nucleotide) such as DNA or RNA is modified with a functional group such as an amino group, or a protein or a low molecular weight compound. Substances and the like. More specifically, for example, Bridged Nucleic Acid (BNA), nucleotides in which the 4′-position oxygen atom of natural nucleotides is substituted with sulfur atoms, and hydroxyl groups in the 2′-position of natural ribonucleotides are substituted with methoxy groups. Nucleotides, Hexitol Nucleic Acid (HNA), peptide nucleic acid (PNA) and the like.
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • HNA Hexitol Nucleic Acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • the luminescent probe used in one embodiment of the present invention is a substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to a target particle, and is a state in which the target probe is bound to the target particle or is present alone.
  • the material is not particularly limited.
  • the luminescent substance may be bound to a substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to the target particle.
  • the luminescent substance is typically a fluorescent substance, but may be a substance that emits light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the fluorescent substance is not particularly limited as long as it emits fluorescence by emitting light of a specific wavelength, and can be appropriately selected from fluorescent dyes used in FCS, FIDA, and the like. .
  • the luminescent probe binds a luminescent substance such as a fluorescent substance or a substance obtained by binding a luminescent substance such as a fluorescent substance to an oligonucleotide that hybridizes with the target particle.
  • a luminescent substance such as a fluorescent substance or a substance obtained by binding a luminescent substance such as a fluorescent substance to an oligonucleotide that hybridizes with the target particle.
  • the oligonucleotide may be DNA, RNA, or an artificially amplified polymer such as cDNA, and may be a nucleotide chain or base similar to a natural nucleobase. A part or all of the nucleic acid analogs capable of forming a pair may be included.
  • the target particle is a protein
  • a substance obtained by labeling an antigen or antibody for the target particle, a ligand or receptor for the target particle with a luminescent substance such as a fluorescent substance can be used as the luminescent probe.
  • the binding of the luminescent substance to a substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to target particles such as nucleic acids and proteins can be performed by a conventional method.
  • the luminescent probe used in one embodiment of the present invention may be a substance that non-specifically binds to the target particle, but specifically binds from the viewpoint of the accuracy of detection and quantification of the target particle.
  • a substance is preferred.
  • the luminescent probe that specifically binds to the target particle may be any substance that binds preferentially to the target particle over other substances similar in physical or chemical properties to the target particle. It is not necessary to be a substance that does not bind to the substance at all.
  • the target particle is a nucleic acid
  • the oligonucleotide labeled with a luminescent substance used as a luminescent probe may have a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the target particle. It may have a base sequence having a mismatch with the sequence.
  • the emission characteristics of the luminescent probe differ between the state of being bound to the target particle and the state of being alone, that the specific wavelength is different between the state of being bound to the target particle and the state of being alone. It means that the intensity of light is different.
  • the intensity of light of a specific wavelength for example, by varying the fluorescence intensity
  • both of them can be detected in the scanning molecule counting method. It can be distinguished and detected.
  • the target particle is a protein
  • a dye whose fluorescence intensity or fluorescence wavelength is changed by binding to the protein and changing the surrounding environment for example, a fluorescent dye such as a hydrophobic probe ANS, MANS, or TNS
  • the light emitting probe may not emit light itself.
  • the luminescent probe is an oligonucleotide that hybridizes with the target particle, and the fluorescence that specifically binds to the double-stranded structure together with the luminescent probe in the sample solution Add double stranded nucleic acid binding substance.
  • the luminescence characteristics can be made different between a state where the luminescent probe is present alone (unbound state) and a state where the luminescent probe is bound to the target particle (bound state).
  • the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to the double-stranded structure include a fluorescent intercalator and a groove binder to which a fluorescent substance is bound.
  • a luminescent probe there is a substance composed of at least two components, and a substance that emits fluorescence by changing the position of the at least two components by binding to a target particle. It may be adopted. Examples of such substances are fluorescent proteins that emit strong fluorescence when bound to a particle, or molecules that aggregate to form a fluorescent metal complex when bound to a particle ( Complex ligand). According to this configuration, in any case, the luminescent probe alone or the luminescent probe that is not bound to the target particle emits little light, or even if it emits light, the wavelength of the conjugate of the target particle and the luminescent probe is different. It becomes possible to selectively detect light from the conjugate of the target particle and the luminescent probe.
  • the luminescence characteristics of the luminescent probe present alone in the sample solution and the luminescent probe bonded to the target particle can be made different. it can.
  • a substance that binds to a target particle becomes an energy donor in FRET under the condition that FRET occurs when the luminescent probe is present alone and FRET does not occur when bound to the target particle.
  • a fluorescent substance and a substance that becomes an energy acceptor (fluorescent substance or quenching substance) are combined. Thereby, this binding substance can be used as a luminescent probe. Since FRET does not occur from the luminescent probe bound to the target particle, fluorescence is emitted from the fluorescent material serving as an energy donor.
  • fluorescence emitted from a fluorescent substance serving as an energy donor is not detected or attenuated from a luminescent probe that exists alone. Therefore, by detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor, the target particles bound to the luminescent probe can be detected separately from the luminescent probe existing alone.
  • FRET occurs in the state of a single-stranded nucleic acid molecule, and in the state of an aggregate formed by hybridizing with another single-stranded nucleic acid molecule Binds a fluorescent substance that becomes an energy donor and a substance that becomes an energy acceptor in FRET to an oligonucleotide that forms an intramolecular structure in the state of a single-stranded nucleic acid molecule under conditions where FRET does not occur
  • This molecular beacon probe can be preferably used as a luminescent probe.
  • a fluorescent substance serving as an energy donor or a substance serving as an energy acceptor is bound to the 3 ′ end side, and the remaining one is bound to the 5 ′ end side, and 3 ′
  • the regions complementary to each other that form the intramolecular base pair of the molecular beacon probe may be present so as to sandwich the region that hybridizes with the target particle, and the region on the 3 ′ end side and the region on the 5 ′ end side are:
  • Each of the regions may include a 3 ′ end or a 5 ′ end, or may not include a region.
  • the number of bases and the base sequence in the region forming the base pair are lower than the stability of the formed base pair compared to the stability of the aggregate with the target particle, and can form a base pair under measurement conditions. Any degree is acceptable.
  • a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to a double-stranded structure is used, and FRET is caused between the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and a fluorescent substance labeled with a luminescent probe. It is possible to distinguish between a luminescent probe present alone and a luminescent probe bound to a target particle. That is, one of the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and the fluorescent substance that labels the luminescent probe serves as an FRET energy donor, and the other serves as an FRET energy acceptor. Fluorescence emitted from the fluorescent substance that labels the luminescent probe is detected from the luminescent probe present alone.
  • the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance binds to the luminescent probe bound to the target particle, the fluorescence emitted by FRET is detected from the conjugate, and as a result, it exists alone. It can be detected separately from the luminescent probe.
  • the luminescent probe it is preferable to design the luminescent probe so that the region forming the double strand in the aggregate of the luminescent probe and the target particle is 400 bp or less.
  • two types of luminescent probes may be used.
  • two types of luminescent probes are designed to hybridize adjacent to each other when the target particle is a nucleic acid or nucleic acid analog. Then, one luminescent probe is labeled with a fluorescent substance serving as an energy donor in FRET, and the other luminescent probe is labeled with a substance serving as an energy acceptor in FRET.
  • FRET does not occur with a single luminescent probe, but the two types of luminescent probes come close to each other by binding to the target particle (for example, the interval between the two types of luminescent probes is about 1 to 2). 10 nm), FRET occurs. Therefore, the target particles can be detected by detecting the fluorescence emitted by the FRET.
  • step (a) first, target particles and a luminescent probe are added to an appropriate solvent to prepare a sample solution.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not hinder the detection of light emitted from the luminescent probe and the detection of the luminescent probe by the scanning molecule counting method, and a buffer generally used in this technical field. Can be appropriately selected and used.
  • the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • the target particle and the luminescent probe can coexist in the same solution and can be bound to each other, after preparing the sample solution, simply incubating the sample solution for a predetermined time if necessary.
  • the target particle and the luminescent probe can be bound in the sample solution.
  • the target particle or the luminescent probe is a nucleic acid having a double-stranded structure or a nucleic acid-like substance
  • “Denature nucleic acid or nucleic acid analog” means dissociating base pairs. For example, a base pair formed by mutually complementary base sequences in a molecular beacon probe is dissociated and the intramolecular structure is released to form a single-stranded structure, or a double-stranded nucleic acid molecule is converted to a single-stranded nucleic acid molecule. It means to do.
  • the luminescent probe is an oligonucleotide containing a nucleic acid-like substance such as PNA, even if the target particle is a double-stranded nucleic acid molecule, this luminescent probe and target particle can be combined without any special denaturation treatment. In some cases, coalescence can be formed.
  • the denaturation treatment examples include denaturation by high temperature treatment (thermal denaturation) and denaturation by low salt concentration treatment.
  • thermal denaturation high temperature treatment
  • low salt concentration treatment it is preferable to perform heat denaturation because the influence on a luminescent substance such as a fluorescent substance is relatively small and the operation is simple.
  • the heat denaturation can denature nucleic acids and the like in the sample solution by treating the sample solution at a high temperature. Generally, it can be denatured by keeping it at 90 ° C. for DNA and 70 ° C. for RNA for several seconds to 2 minutes, but the temperature for denaturation varies depending on the base length of the target particle. As long as it can be modified, it is not limited to this temperature.
  • denaturation by low salt concentration treatment can be performed by adjusting the sample solution to have a sufficiently low salt concentration by, for example, diluting with purified water or the like.
  • the target particles in the sample solution are associated with the luminescent probe.
  • the temperature of the sample solution is lowered to a temperature at which the target particles and the luminescent probe can specifically hybridize, thereby appropriately associating both in the sample solution.
  • the salt concentration of the sample solution is increased to a concentration at which the target particles and the luminescent probe can specifically hybridize by adding a salt solution or the like.
  • the two in the sample solution can be appropriately associated.
  • the temperature at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize can be determined from the melting curve of the aggregate composed of both.
  • the melting curve can be obtained, for example, by changing the temperature of a solution containing only both from a high temperature to a low temperature and measuring the absorbance and fluorescence intensity of the solution. From the obtained melting curve, the temperature ranges from the temperature at which the two denatured single-stranded nucleic acid molecules started to form an aggregate to the temperature at which almost all became an aggregate. It can be set as the temperature which can be soybean.
  • the salt concentration in the solution from a low concentration to a high concentration instead of the temperature, the melting curve is determined in the same manner, and the concentration at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize is determined. Can be sought.
  • the temperature at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize can generally be substituted with a Tm value (melting temperature).
  • Tm value melting temperature
  • the Tm value of the region that hybridizes with the target particle 50% of double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA
  • Temperature can be calculated.
  • the temperature of the sample solution in order to suppress non-specific hybridization, it is preferable to lower the temperature of the sample solution relatively slowly when forming an aggregate. For example, after denaturing nucleic acid molecules by setting the temperature of the sample solution to 70 ° C. or higher, the liquid temperature of the sample solution can be lowered at a rate of temperature decrease of 0.05 ° C./second or higher.
  • a surfactant such as a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, urea or the like to the sample solution in advance.
  • These compounds may be added alone or in combination of two or more. By adding these compounds, nonspecific hybridization can be made difficult to occur in a relatively low temperature environment.
  • step (b) the number of target particles in the prepared sample solution is counted by a scanning molecule counting method. Specifically, the sample solution after binding the target particles to the labeling probe is placed in the optical analyzer for the scanning molecule counting method, and the light emitted from the labeling probe by the above-described method. Is detected and analyzed. Thereby, the number of target particles is calculated.
  • the complex is recovered from the sample solution by separating from the luminescent probe not bound to the target particles.
  • a photoanalysis technique that individually detects target particles labeled with a luminescent probe
  • light from a luminescent probe that is not bound to a target particle such as a free luminescent probe, is used.
  • the detection accuracy of the target particles is deteriorated. Therefore, in the step (d), luminescent probes that are not bound to target particles including free luminescent probes are removed from the complex.
  • the method for recovering the complex by separating it from a luminescent probe that is not bound to the target particle is not particularly limited, and utilizes differences in size or molecular weight, affinity for any substance, charged state, etc.
  • the separation method include operations including adsorption / extraction or washing. Specific examples include chromatography (hydrophilic / hydrophobic chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, etc.), ultrafiltration, electrophoresis, phase separation, centrifugation, solvent extraction, filter adsorption, and the like.
  • the complex can be recovered by separating from the luminescent probe that is not bound to the target particle.
  • a separation probe is further added to the sample solution to form a complex including target particles, a luminescent probe, and a separation probe.
  • the complex is separated from the luminescent probe not bound to the target particle and recovered by utilizing the interaction between the separation probe in the complex and other substances.
  • the separation probe is not particularly limited as long as it is a substance that binds or adsorbs specifically or non-specifically independently of the target particle and the luminescent probe.
  • the separation probe may be indirectly bound to the target particle via another substance, but is preferably directly bound to the target particle.
  • the substances that can be directly or specifically bound or adsorbed to the target particles, which can be used as the separation probe, are the same as those before the luminescent substance is bound among those mentioned for the luminescent probe.
  • the target particle when it is a nucleic acid molecule or nucleic acid analog, it is an oligonucleotide that hybridizes with the target particle, and when the target particle is a protein, an antigen or antibody against the target particle, a ligand against the target particle or It is a receptor.
  • the separation probe used in one embodiment of the present invention has a site that binds to a solid phase carrier, and further binds directly or indirectly to the solid phase carrier in a state of binding to the target particle. Preferably there is.
  • the separation probe is used, the recovery of the complex in the step (d) and the recovery of the free luminescent probe in the subsequent step (e) are performed directly or indirectly with the separation probe. It can be carried out more easily by solid-liquid separation using a phase carrier.
  • the shape, material, etc. of the solid phase carrier are not particularly limited as long as it is a solid having a site that binds to the separation probe.
  • particles that can be suspended in water such as beads and can be separated from the liquid by a general solid-liquid separation process, a membrane, a container, a chip substrate, etc. Good.
  • Specific examples of the solid support include, for example, magnetic beads, silica beads, agarose gel beads, polyacrylamide resin beads, latex beads, polystyrene beads, and other plastic beads, ceramic beads, zirconia beads, silica membranes, silica filters, and plastic plates. Etc.
  • a bead or filter in which an oligonucleotide that hybridizes to a region other than the region that hybridizes to the target particle in the oligonucleotide is bound to the surface may be used as a solid phase carrier. it can.
  • the separation probe has biotin as a site that binds to the solid phase carrier, beads or filters having avidin or streptavidin bound to the surface can be used as the solid phase carrier. .
  • bonded with the solid-phase carrier in a separation probe is glutathione (Glutathione), DNP (dinitrophenol), digoxigenin (digoxigenin, Dig), digoxin (digoxin), the sugar chain which consists of 2 or more sugars, 4 or more
  • glutathione glutathione
  • DNP dinitrophenol
  • digoxigenin digoxigenin, Dig
  • digoxin digoxin
  • the sugar chain which consists of 2 or more sugars, 4 or more
  • a filter can be used as a solid support.
  • the solid phase carrier may be nonspecifically bound to the separation probe, but is preferably specifically bound from the viewpoint of the accuracy of target particle detection and quantification.
  • a complex containing the target particle, the luminescent probe, and the separation probe in the sample solution is contained in the complex. It couple
  • the solid-liquid separation process is not particularly limited as long as it is a method capable of separating and recovering the solid phase carrier in the sample solution from the liquid component.
  • the known processes used for the solid-liquid separation process Can be appropriately selected and used.
  • the suspension containing the solid phase carrier may be centrifuged to precipitate the solid phase carrier and remove the supernatant.
  • the sample solution may be filtered using a filter paper or a filter to recover the solid phase carrier remaining on the surface of the filter paper or the like.
  • the solid phase carrier is a magnetic bead
  • a magnet is brought close to the container in which the sample solution is placed, and after the solid phase carrier is converged on the surface of the container closest to the magnet, Qing may be removed.
  • the container whose inner wall is coated with a substance that binds to the separation probe is a solid phase carrier
  • the sample solution containing the complex is injected into the container, incubated as necessary, and then the liquid in the container Is discharged.
  • the solid phase carrier is a membrane or a filter
  • the sample solution containing the complex is allowed to permeate the solid phase carrier, thereby binding the solid phase carrier to the complex and light emission not bound to the target particle. Separation and recovery of the complex from the probe can be performed in one operation.
  • step (a) the solid phase carrier is added to the sample solution in advance together with the target particle, the luminescent probe and the separation probe, and the target particle and the luminescent probe bound to the solid phase carrier. And the separation probe is separated from the luminescent probe that is not bound to the target particle, and then recovered by a solid-liquid separation process.
  • a sample solution may be prepared by adding a separation probe preliminarily bound to a solid phase carrier, target particles, and a luminescent probe. The separation probe used at this time may be reversibly bound to the solid phase carrier or may be bound irreversibly.
  • a sample solution containing the complex bound to the solid phase carrier is prepared by adding an appropriate solvent to the recovered solid phase carrier.
  • the recovered solid phase carrier is subjected to step (e) as a sample solution containing the carrier.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not hinder detection of light emitted from the luminescent probe in a later step.
  • the buffer can be appropriately selected from buffers generally used in the technical field. Examples of the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • the recovered solid phase carrier may be washed with a suitable solvent before the step (e). By washing, the free luminescent probe can be separated and removed more strictly from the complex bound to the solid phase carrier.
  • the solvent for washing the solid phase carrier is not limited as long as the binding between the complex and the solid phase carrier is not impaired.
  • the solvent may be the same type or a different solvent.
  • step (e) the luminescent probe is dissociated from the complex recovered in step (d), and then the free luminescent probe and the target particle are separated and recovered.
  • the method for dissociating the luminescent probe in the complex is not particularly limited as long as it can eliminate the bond between the target particle and the luminescent probe in the complex.
  • the target particle is an oligonucleotide composed of a nucleic acid molecule or a nucleic acid-like substance
  • the site that binds to the target particle in the luminescent probe is an oligonucleotide that consists of a nucleic acid molecule or a nucleic acid-like substance and hybridizes with the target particle
  • the temperature of the sample solution containing the complex is sufficiently higher than the specific association conditions of the target particle and the luminescent probe, or the salt concentration of the sample solution containing the complex is changed to the specific association of the target particle and the luminescent probe. Set sufficiently lower than the conditions. Thereby, the coupling
  • the method for separating and recovering the dissociated luminescent probe and the target particles forming a single substance or a complex from each other is not particularly limited, and the luminescent probe and a single target particle or a complex containing target particles In consideration of a difference in size, a difference in affinity for an arbitrary substance, and the like, it can be carried out by appropriately selecting from methods for separating substances usually performed in the technical field. Specific examples include chromatography (hydrophilic / hydrophobic chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, etc.), ultrafiltration, electrophoresis, phase separation, centrifugation, solvent extraction, filter adsorption, and the like.
  • FIG. 8 is a diagram schematically showing an aspect in which the separation probe D and the solid phase carrier S that binds to the separation probe D are used.
  • the target particle T, the luminescent probe E, and the separation probe D are combined to form a complex C.
  • the free luminescent probe E is removed by washing, the luminescent probe E is dissociated from the complex C, and the free luminescent probe is released.
  • E and the target particles T bound to the solid phase carrier S are separated and collected via the separation probe D.
  • step (b) based on a calibration curve that approximates the correlation between the concentration or amount of the target particles in the solution and the number of target particles bound to the luminescent probe counted from the solution, the step (b)
  • the concentration of the target particles in the sample solution is calculated from the number of target particles counted in (1).
  • the concentration of the target particles in the sample solution can be easily obtained from the number of target particles detected via the luminescent probe.
  • a standard sample series having different target particle concentrations is prepared for the calibration curve.
  • the standard sample series can be prepared, for example, by stepwise diluting a solution having a known target particle concentration with a solvent such as water or a buffer.
  • the number of standard sample solutions constituting the standard sample series is not particularly limited, and is preferably about 3 to 20 types.
  • the concentration of the target particles in each standard sample solution is not particularly limited. Considering the type of target particles, the affinity between the luminescent probe and the target particles, the expected concentration of the target particles in the sample solution to be analyzed, and the like. Can be appropriately prepared.
  • the concentration of target particles in each standard sample solution may be set at equal intervals, or may be set at unequal intervals.
  • the steps (a) and (b) are performed under the same conditions for the sample solution to be analyzed, and a luminescent probe present in each standard sample solution Count the number of target particles bound to. That is, a measurement solution is prepared by adding each standard sample solution and a luminescent probe so as to have the same concentration as the sample solution in the same type of solvent as the sample solution to be analyzed. And the target particle
  • a series of measurements for each standard sample solution may be performed substantially simultaneously with steps (a) and (b), may be performed in advance before step (a), or may be performed after step (b). Also good.
  • a continuous differentiable function that approximates the relationship between both can be determined from the number of target particles bound to the luminescent probe counted for each standard sample solution and the concentration of the target particles in the standard sample solution.
  • the obtained continuously differentiable function is used as a calibration curve.
  • the method for creating the calibration curve is not particularly limited, and it may be created using any of the arithmetic analysis methods used for creating an approximate line of the relationship between two types of quantitative data. For example, data obtained from each standard sample solution is plotted on a graph in which the horizontal axis is the concentration of target particles and the vertical axis is the number of target particles.
  • a calibration curve can be created by performing a least square method or the like on each plot. In many cases, a calibration curve close to a sigmoid curve can be created by plotting the measured values on a semilogarithmic graph in which the concentration of the target particle is logarithmically displayed.
  • Steps (b) to (c) can be performed by using an optical analysis apparatus for scanning molecule counting method and a program for the apparatus, which further includes a configuration and a procedure for performing step (c). This can be done with the above apparatus.
  • the light from the light-emitting particles that are dispersed and randomly moved in the sample solution using the optical analyzer used in the scanning molecule counting method described above that is, the optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a photo-detecting device for detecting wherein the photo-analyzing device moves a position of the photo-detecting region of the optical system in the sample solution by changing an optical path of the optical system;
  • a light detection unit for detecting light from the light detection region, and light from each of the luminescent particles detected by the light detection unit while moving the position of the light detection region in the sample solution A signal for individually detecting signals, counting the number of the light signals from the individually detected light emitting particles, and counting the number of the light emitting particles detected during the movement of the position of the light detection region
  • a processing unit for individually detecting signals, counting the number of the light signals from the individually detected light emitting particles, and counting the number of the light emitting particles detected during the movement of the position of the light detection region.
  • the optical analyzer includes a storage unit that stores a calibration curve that approximates a correlation between the concentration or amount of the luminescent particles in the sample solution and the number of the luminescent particles counted from the sample solution, and the calibration Based on the line, a concentration calculator that calculates the concentration of the luminescent particles in the sample solution from the number of the luminescent particles counted in the signal processing unit, and in the sample solution calculated by the concentration calculator And a display unit for displaying the concentration of the luminescent particles.
  • the computer 18 may include the signal processing unit, the storage unit, and the concentration calculator.
  • the concentration of the luminescent particles in the sample solution calculated from the calibration curve is displayed regardless of the format such as a numerical value, a table, a graph, and the like. It is also preferable that the calibration curve itself or the number of the luminescent particles counted in the signal processing unit is displayed. 9 and 10 show one mode of data displayed on the display unit.
  • the display section also includes conditions for detecting light from the light detection region (amount of sample solution, temperature in the measurement environment, wavelength and intensity of light emitted from the optical system, position of the light detection region, light The movement speed (scanning speed) of the position of the light detection region at the time of signal data acquisition may be displayed.
  • a known image display device such as a liquid crystal display can be used.
  • Steps (b) to (c) can be performed by an apparatus including a display (display unit) 19 that displays the calculated concentration of the luminescent particles in the sample solution.
  • the storage device and the computing device can use the computer 18 shown in FIG. 1A.
  • the processing procedure for counting particles from the time change of the photon count light intensity measured by the scanning molecule counting method is further added to the light emission in the sample solution.
  • the concentration of target particles in this solution is calculated from the number of luminescent particles counted.
  • the excitation light was irradiated at 1 mW using 633 nm laser light, and the detection light wavelength was 660 to 710 nm using a bandpass filter.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is 15 mm / sec, the BIN TIME is 10 ⁇ sec, and the measurement time is 100 pM, 10 pM, and 1 pM for 2 seconds, 100 fM and 10 fM samples. For 20 seconds (the number of peaks in the graph is converted to 2 seconds).
  • the measurement was performed 5 times for each sample, and the average was calculated.
  • the optical signals detected in the time series data were counted from the time series photon count data acquired for each sample solution.
  • the number of data points averaged at a time was set to nine, and the moving average process was repeated five times.
  • a Gaussian function was fitted to the time series data by the least square method, and the peak intensity (in the Gaussian function), the peak width (full width at half maximum), and the correlation coefficient were determined.
  • the peak determination process the following conditions: 20 ⁇ sec ⁇ peak width ⁇ 400 ⁇ sec, Peak intensity> 1 (photon / 10 ⁇ sec), Correlation coefficient> 0.95, Only the peak signal satisfying the above condition was determined to be an optical signal corresponding to the observation target molecule. On the other hand, peak signals that do not satisfy the above conditions were ignored as noise, and the number of signals determined to be optical signals corresponding to the observation target molecule was counted as the “peak number”.
  • FIG. 12 is a graph in which the count value of each sample solution is plotted with the horizontal axis representing the concentration of the fluorescent substance ATTO633 in the sample solution and the vertical axis representing the number of peaks (log scale display). As a result, it was confirmed that the relationship between the concentration of ATTO633 and the number of peaks is proportional.
  • FIG. 13 is a graph in which the graph of FIG. 12 is displayed as a normal scale. As a result, there is a strong positive correlation between the concentration of the fluorescent substance ATTO633 in the solution and the number of peaks counted, and the concentration is unknown by using a calibration curve (shown in FIG. 13) obtained from each measured value. It was found that the concentration of each sample could be easily determined. For example, when the number of peaks when measuring a sample of unknown concentration is 100, the concentration of ATTO 633 in this sample can be calculated as 2.5 pM.
  • Example 1 As the target particle, a nucleic acid having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 was used. Hereinafter, in this example, this nucleic acid is referred to as a target nucleic acid. Further, as a luminescent probe that binds to the target nucleic acid, a molecular beacon in which Alexa Fluor 488 is added to the 5 ′ end of the oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and BHQ-1 is added to the 3 ′ end A probe was used. These oligonucleotides were synthesized at the request of Sigma Genosys. Table 1 shows the base sequences of the target nucleic acid and molecular beacon probe. In Table 1, the underlined bases in the molecular beacon probe are regions that hybridize with each other when forming an intramolecular structure.
  • the molecular beacon probe By dissolving the molecular beacon probe in Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, pH 8.0) so that the molecular beacon probe is 100 pM and the target nucleic acid is 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, or 10 pM.
  • a standard sample solution for preparing a calibration curve was prepared. Each standard sample solution was denatured by heating at 95 ° C. for 5 minutes, and then the liquid temperature was gradually lowered to 20 ° C. to form an association in which the target nucleic acid and the molecular beacon probe were bound.
  • the cooling rate is 0.1 ° C./second, 90 ° C. for 5 minutes, 80 ° C. for 10 minutes, 70 ° C. for 10 minutes, 60 ° C. for 10 minutes, 50 ° C. for 10 minutes, 40 ° C. for 10 minutes. For 10 minutes at 30 ° C. for 10 minutes.
  • the number of molecules of aggregates in each standard sample solution after the temperature lowering treatment was counted by a scanning molecule counting method.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Co., Ltd.) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device. Time-series photon count data were obtained. At that time, excitation light was irradiated at 300 ⁇ W using 488 nm laser light, and a detection light wavelength was 510 to 560 nm using a bandpass filter.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the standard sample solution was 15 mm / second, BINTIME was 10 ⁇ sec, and the measurement time was 2 seconds. The measurement was performed 5 times for each sample, and the average and standard deviation were calculated. After the measurement of the light intensity, the optical signals detected in the time series data were counted from the time series photon count data acquired for each standard sample solution. In the smoothing of the data by the moving average method, the number of data points averaged at a time was set to nine, and the moving average process was repeated five times. In the fitting, a Gaussian function was fitted to the time series data by the least square method, and the peak intensity (in the Gaussian function), the peak width (full width at half maximum), and the correlation coefficient were determined.
  • the peak determination process the following conditions: 20 ⁇ sec ⁇ peak width ⁇ 400 ⁇ sec, Peak intensity> 1 (photon / 10 ⁇ sec), Correlation coefficient> 0.95, Only the peak signal that satisfies the above condition is determined to be an optical signal corresponding to the observation target nucleic acid, while the peak signal that does not satisfy the above condition is ignored as noise, and the signal is determined to be the optical signal corresponding to the observation target nucleic acid Were counted as “peak number”.
  • FIG. 14 is a graph plotting the count values obtained from each standard sample solution with the horizontal axis representing the concentration of the target nucleic acid in the standard sample solution and the vertical axis representing the number of peaks. As a result, it was confirmed that the number of peaks changed depending on the concentration of the target nucleic acid.
  • the approximate curve of each plot was used as a calibration curve, and the target nucleic acid concentration of a sample solution with an unknown concentration was determined.
  • a molecular beacon probe is added to an unknown sample solution in the same manner as the standard sample solution to form an association with the molecular beacon probe, and then measured using a photoanalyzer. was calculated.
  • the number of peaks counted from this unknown sample solution was 421.
  • the target nucleic acid concentration of this unknown sample solution could be calculated to be 1.4 nM.
  • Example 2 A nucleic acid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 was used as the target particle.
  • the nucleic acid is referred to as target nucleic acid 2.
  • a fluorescent probe was used as a luminescent probe
  • a biotin probe was used as a separation probe
  • magnetic beads coated with streptavidin were used as a solid phase carrier.
  • the luminescent probe that binds to the target nucleic acid 2 a fluorescent probe in which ATTO 647N was added to the 5 ′ end of the oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 was used.
  • biotin probe in which biotin was added to the 3 ′ end of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 that binds to the target nucleic acid 2 was used.
  • These oligonucleotides were synthesized at the request of Sigma Genosys. Table 2 shows the base sequences of the target nucleic acid 2, the fluorescent probe, and the biotin probe.
  • the target nucleic acid 2 is 30 fM, 10 fM, 3 fM, or 1 fM in a Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, 0.05% Triton X-100), the fluorescent probe is 20 pM, the biotin probe is 200 pM, and Poly (deoxyinosinic-deoxycyticlicic). )
  • a sample solution 100 ⁇ L was prepared so that acid (Sigma-Aldrich) was 0.1 U / mL (1 U is an amount in which the absorbance at 260 nm is 1.0 in water (optical path length is 1 cm)).
  • a sample not containing the target nucleic acid 2 was also prepared.
  • sample solutions were heated at 95 ° C. for 5 minutes and then brought to 25 ° C. at a rate of 0.1 ° C./min. 1 ⁇ L of 0.1% BSA (bovine serum albumin) was added and reacted with 10 ⁇ g of magnetic beads coated with streptavidin (Invitrogen, Cat. No. 650) at 25 ° C. for 90 minutes while shaking.
  • BSA bovine serum albumin
  • a single molecule fluorescence measuring device MF20 (Olympus Co., Ltd.) equipped with a confocal fluorescence microscope optical system and a photon counting system is used as an optical analyzer, and the above-mentioned supernatant is subjected to time series photon counting. I got the data.
  • the excitation light was irradiated at 1 mW using 642 nm laser light, and the detection light wavelength was 660 to 710 nm using a bandpass filter.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 67.5 mm / second, BIN TIME was 10 ⁇ sec, and the measurement time was 600 seconds.
  • the measurement was performed 5 times, and the average and standard deviation were calculated.
  • the optical signals detected in the time-series data were counted from the time-series photon count data acquired for each supernatant.
  • 11 data points were averaged at a time, and the moving average process was repeated 5 times.
  • a Gaussian function was fitted to the time series data by the least square method, and the peak intensity (in the Gaussian function), the peak width (full width at half maximum), and the correlation coefficient were determined.
  • FIG. 14 is a graph in which the count values obtained from each standard sample solution are plotted with the horizontal axis representing the concentration of the target nucleic acid 2 in the standard sample solution and the vertical axis representing the number of peaks.
  • the target nucleic acid concentration of a sample solution with an unknown concentration was determined. Specifically, a sample for measurement was prepared for a sample solution with unknown concentration in the same manner as the standard sample solution, measured using an optical analyzer, and the number of peaks was calculated. As a result, the number of peaks counted from the sample solution with unknown concentration was 724. Referring to the calibration curve shown in FIG. 14, the target nucleic acid concentration of the sample solution with unknown concentration could be calculated to be 4.6 fM.
  • the above target particle quantification method can be used to quantitatively measure the concentration of target particles that exist only in a very low concentration in the sample solution by scanning molecular counting. It can be used in the field of analysis / inspection of samples whose target substance concentration is very small.

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Abstract

　この標的粒子の定量方法は、前記標的粒子と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と；（ｂ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、前記試料溶液内において前記光学系の前記光検出領域の前記位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、直接的または間接的に前記標的粒子を個別に検出する検出工程と、（ｃ）前記検出工程において検出された、前記標的粒子の数を計数する計数工程及び前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と前記標的粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された前記標的粒子の前記数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する算出工程とを有する。

Description

標的粒子の定量方法、光分析装置及び光分析用コンピュータプログラム
　本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子の濃度を求める方法に関する。
　本願は、２０１１年０４月１８日に、日本に出願された特願２０１１－０９２１６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能である。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１～３参照）に於いては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為される。その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象が検出される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成される。そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値とが算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定される。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測する。そして、微弱光によりフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術が提案されている。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６号公報 特開２００８－２９２３７１号公報 日本国特許第４０２３５２３号公報 国際公開第２００８／０８０４１７号 特開２００７－２０５６５号公報 特開２００８－１１６４４０号公報 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質 核酸 酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１～１４３８ページ。 メイヤー－アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４～２２４ページ。 加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１～２７７ページ。
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生する。このため、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなる。この結果、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。
　特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定できる。これにより、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができない。例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出し、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではない。したがって、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含む。これにより、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。
　本発明は、上述した問題点に鑑み案出されたものであり、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されている統計的処理を含まず、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術により、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法であって、試料溶液中にて分散しランダムに運動する観測対象粒子（具体的には、標的粒子と結合した発光プローブ、または発光プローブをいう。以下同じ。）から放出される光を指標として検出する場合において、以下の２点を見出し、本発明を完成させた。すなわち、（１）観測対象粒子の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料溶液中の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、感度よく標的粒子を検出することができること、（２）観測対象の粒子の濃度が既知である標準試料溶液の測定結果から作成された検量線を用いることにより、走査分子計数法により求められた観測対象粒子の数から、試料溶液中の標的粒子の濃度を算出可能であること。
　ここで、走査分子計数法は、特願２０１０－０４４７１４に於いて、本願出願人により提案されている新規な光分析技術である。
　すなわち、本発明の第１の態様に係る標的粒子の定量方法によれば、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法であって、（ａ）前記標的粒子と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と；（ｂ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、前記試料溶液内において前記光学系の前記光検出領域の前記位置を移動させながら、前記光検出領域中の記発光プローブから放出される光信号を検出して、直接的、または、間接的に前記標的粒子を個別に検出する検出工程と、（ｃ）前記検出工程において検出された、前記標的粒子の数を計数する計数工程及び前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と前記標的粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された前記標的粒子の前記数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する算出工程と；を備えること。
　本発明の第２の態様によれば、前記第１の態様において、前記移動工程に於いて、前記光検出領域の前記位置を所定の速度にて移動することが好ましい。
　本発明の第３の態様によれば、前記第１の態様または前記第２の態様において、前記移動工程に於いて、前記光検出領域の前記位置を、前記発光プローブ、又は前記発光プローブと結合した標的粒子のいずれか速い方の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することが好ましい。
　本発明の第４の態様によれば、前記第１の態様から前記第３の態様のいずれか１態様において、前記検出工程に於いて、検出された時系列の前記光信号の形状に基づいて、前記発光プローブ、又は発光プローブと結合した前記標的粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することが好ましい。
　本発明の第５の態様によれば、前記第１の態様から前記第４の態様のいずれか１態様において、前記発光プローブが、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギー・ドナー部位とエネルギー・アクセプター部位とを有し；前記発光プローブが前記標的粒子に結合した結合状態と前記標的粒子に結合していない非結合状態との間で前記エネルギー・ドナー部位と前記エネルギー・アクセプター部位との距離が異なり；前記結合状態と、前記非結合状態との、前記発光プローブから放出される光の発光特性が異なることが好ましい。
　本発明の第６の態様によれば、前記第１の態様から前記第５の態様のいずれか１態様において、前記標的粒子が核酸であり；前記発光プローブが、前記標的粒子と特異的にハイブリダイズし、且つ蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質の少なくとも一つが結合している１本鎖核酸であることが好ましい。
　本発明の第７の態様によれば、前記第１の態様から前記第６の態様のいずれか１態様において、（ｄ）前記工程（ａ）の後、前記試料溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体を回収する工程を有することが好ましい。
　本発明の第８の態様によれば、前記第７の態様の態様において、（ｅ）前記工程（ｄ）において回収された前記複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する工程を有することが好ましい。
　本発明の第９の態様に係る光分析装置によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する複数の発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と；前記光検出領域における前記発光粒子の光を検出する光検出部と、前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の前記位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記発光粒子の各々からの前記光の光信号を個別に検出し、前記個別に検出された前記発光粒子からの前記光信号の数を計数して前記光検出領域の前記位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する信号処理部と、前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度又は量と前記試料溶液から計数される前記発光粒子の前記数との相関関係を近似する検量線を記憶する記憶部と；前記検量線に基づいて、前記信号処理部において計数された前記発光粒子の前記数から前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を算出する濃度計算部と；前記濃度計算部により算出された前記試料溶液中の前記発光粒子の前記濃度を表示する表示部と；を含む。
　本発明の第１０の態様によれば、前記第９の態様において、前記光検出領域移動部が所定の速度にて前記光検出領域の前記位置を移動させることが好ましい。
　本発明の第１１の態様によれば、前記第９の態様または前記第１０の態様において、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の前記位置を移動させることが好ましい。
　本発明の第１２の態様によれば、前記第９の態様から記第１１の態様のいずれか１態様において、前記光検出部にて検出された時系列の前記光信号の形状に基づいて、前記信号処理部は、前記発光粒子のうちの１つが前記光検出領域に入ったことを検出することが好ましい。
　本発明の第１３の態様によれば、前記第１２の態様において、所定の閾値より大きい強度を有する前記光信号が検出されたときに、前記信号処理部は、前記発光粒子のうちの１つが前記光検出領域に入ったことを検出することが好ましい。
　本発明の第１４の態様によれば、前記第９の態様から前記第１３の態様のいずれか１態様において、前記信号処理部が前記検出された前記発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の前記発光粒子の数密度又は濃度を決定することが好ましい。
　本発明の第１５の態様によれば、前記第９の態様から前記第１４の態様のいずれか１態様において、前記発光粒子が、発光プローブと結合した標的粒子であり；前記光検出部において検出される光が、前記標的粒子と結合した状態の前記発光プローブから放出される光である；ことが好ましい。
　本発明の第１６の態様によれば、前記第９の態様から前記第１４の態様のいずれか1態様において、前記光検出部において検出される光が、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体から遊離した前記発光プローブから放出される光であることが好ましい。
　本発明の第１７の態様に係る光分析用コンピュータプログラムによれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する複数の発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって；前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動するために、前記光学系の光路を変更する変更手順と、前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の前記位置の移動中に前記光検出領域における前記発光粒子の前記光を検出する光検出手順と、前記検出された前記発光粒子の各々からの前記光の光信号を個別に検出する光信号検出手順と、前記個別に検出された前記発光粒子からの前記光の前記光信号の数を計数して前記光検出領域の前記位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する発光粒子数計数手順と、前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度又は量と前記試料溶液から計数される前記発光粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記計数された複数の発光粒子の前記数から前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する濃度算出手順と、をコンピュータに実行させる。
　本発明の第１８の態様によれば、前記第１７の態様において、前記変更手順に於いて、前記光検出領域の前記位置が所定の速度にて移動されることが好ましい。
　本発明の第１９の態様によれば、前記第１７の態様または前記第１８の態様において、前記変更手順に於いて、前記光検出領域の前記位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることが好ましい。
　本発明の第２０の態様によれば、前記第１７の態様から前記第１９の態様のいずれか１態様において、前記光信号検出手順に於いて、検出された時系列の前記光信号の形状に基づいて、前記発光粒子のうちの１つが前記光検出領域に入ったことが検出されることが好ましい。
　本発明の第２１の態様によれば、前記第１７の態様から前記第２０の態様のいずれか１態様において、前記光信号検出手順に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する前記光信号を検出したときに、前記発光粒子のうちの１つが前記光検出領域に入ったことを検出することが好ましい。
　本発明の第２２の態様によれば、前記第１７の態様から前記第２１の態様のいずれか１態様において、更に、前記検出された前記発光粒子の前記数に基づいて、前記試料溶液中の前記発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことが好ましい。
　本発明の第２３の態様によれば、前記第１７の態様から前記第２２の態様のいずれか１態様において、前記光検出手順に於いて、前記光検出領域から検出される光が、前記標的粒子と結合した状態の前記発光プローブから放出される光であることが好ましい。
　本発明の第２４の態様によれば、前記第１７の態様から前記第２２の態様のいずれか１態様において、前記光検出手順に於いて、前記光検出領域から検出される光が、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体から遊離した前記発光プローブから放出される光であることが好ましい。

　上記の標的粒子の定量方法において、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。したがって、上記の標的粒子の定量方法により、解析対象である標的粒子が試料中に極微量にしか存在していない場合であっても、試料中の標的粒子の濃度を求めることができる。さらに、上記の標的粒子の定量方法では、標的粒子の濃度既知の標準試料から作成された検量線を用いることにより、計数された標的粒子の数から、試料溶液中の標的粒子の濃度をより簡便に求めることができる。
走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。 反射ミラーの向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 同走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。 計測される光強度の時間変化の模式図である。 観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図３Ａにおけるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図４Ａにおけるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 観測対象粒子に対応する光強度の変化を模式的に示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。 分離用プローブと、前記分離用プローブと結合する固相担体とを用いた態様を模式的に示した図である。 本発明の一実施形態に係る装置の表示部において表示されるデータの一態様を示した図である。 本発明の装置の表示部において表示されるデータの一態様を示した図である。 走査分子計数法による試料溶液中の発光粒子（発光プローブと結合した標的粒子）の計数から試料溶液中の標的粒子の濃度測定までの処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 参考例１において、横軸を試料溶液中の蛍光物質ＡＴＴＯ６３３の濃度、縦軸をピーク数とし、各試料溶液の計数値をプロットし、作成された検量線を示したグラフである（対数目盛表示）。 参考例１において、横軸を試料溶液中の蛍光物質ＡＴＴＯ６３３の濃度、縦軸をピーク数とし、各試料溶液の計数値をプロットし、作成された検量線を示したグラフである（通常目盛表示）。 実施例１において、横軸を標準試料溶液中の標的核酸の濃度、縦軸をピーク数とし、各標準試料溶液の計数値をプロットし、作成された検量線を示したグラフである。 実施例１において、横軸を標準試料溶液中の標的核酸の濃度、縦軸をピーク数とし、各標準試料溶液の計数値をプロットし、作成された検量線を示したグラフである。
　まず、本発明の一実施形態に係る走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出する。これにより、走査分子計数法は、試料溶液中の複数の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよい。また、測定時間が短く、しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
　発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子を意味する。本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法においては、標的粒子と発光プローブとが結合し、発光粒子となる。
　本発明の一実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。この光検出領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
　試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。光の検出が行われると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出される。これにより、一つの粒子の存在が検出される。このとき、検出したい粒子（標的粒子）の存在は、直接的に検出されてもよく、間接的に検出されてもよい。直接的に検出される場合とは、標的粒子と結合した発光プローブを検出することにより行うものである。間接的に検出される場合とは、発光プローブが一旦標的粒子と結合した後、粒子から解離した発光プローブの光を検出することにより行うものである。これらの場合、逐次的に検出された光において発光プローブからの光信号を個別に検出することにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、溶液内での粒子の状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。この構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量とを組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。これにより、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である。このとき、試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１～数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
　上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、発光プローブが光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。この発光プローブは、１つの発光プローブが１つの粒子に結合している場合、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している場合、及び、実施の態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した場合の発光プローブを含む。以下同様である。
　実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。ここで、所定の閾値とは、予め設定された光強度の値であり、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された値である。
　また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解される如く、発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、発光プローブから得られる光量は低減することとなるので、発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
　更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる標的粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、検出したい粒子の存在を表す光信号が検出されてしまう。この結果、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定する。具体的には、標的粒子と結合した状態の発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定する。また発光プローブから放出される光信号を検出して、間接的に標的粒子を検出する場合（つまり、観測対象粒子が発光プローブである場合）には、発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定する。すなわち、光検出領域の位置は、発光プローブ、又は発光プローブと結合した標的粒子の拡散移動速度のいずれか速い方よりも速い速度にて移動されるように設定する。これにより、発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。拡散移動速度は、観測対象粒子によって変わるので、上記の如く、観測対象粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。
例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
　また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出する。これにより、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。発光プローブを個別に検出し、その数を計数して粒子濃度を決定する上記の標的粒子の定量方法によれば、試料溶液中の発光プローブの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、標的粒子を定量的に測定することが可能である。
　更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する形態によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測する。一般的に、試料に流れを与える場合には、常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となる。また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。本実施形態によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに観測を行うため、例えば、試料に流れを発生させる場合に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上する。また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行える。
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
　走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図１Ａに模式的に例示されているように、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１Ａに示すように、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とを備えている。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよい。光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射される。放射された光は、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されている。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、この粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子（実施の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光される。集光された光は、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器（光検出部）１６に到達する。そして、光検出器１６において、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後述する光分析のための処理が為される。当業者に於いて知られているように、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図１Ｂに模式的に示されているように、レーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２ となる面を境界とする略楕円球体の体積である）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出される。このため、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。この構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。この光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されているように、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。このミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するためのミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい。すなわち、コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなる。この結果、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
　粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図示するように、複数の励起光源２が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出する構成でも良い。
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
　ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。したがって、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすい。さらには、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
　走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（光検出領域移動部：ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２Ａにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。例えば、図２Ａに示すように、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０～ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとしての蛍光色素Ｆが対象粒子Ｔと結合）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれているように、有意な光強度（Ｅｍ）が検出される。上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光プローブ、又は発光プローブの結合した標的粒子が個別に検出される。本実施形態では、直接的に検出される場合、すなわち、標的粒子と結合した発光プローブを検出する場合について説明するが、間接的に検出される場合、すなわち、発光プローブが一旦標的粒子と結合した後、粒子から解離した発光プローブの光も検出可能である。
検出された粒子の数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できる。この走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出される。これにより、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報を取得することが可能となる。
　また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって或る蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなる（Ｓ／Ｎ比の悪化）。この結果、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度が算出される。これにより、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できる。
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
　走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力する。コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラムに従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。このプログラムには、試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順（変更手順）と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順（光検出手順）とが含まれている。この計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信する。コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングである。時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となる。したがって、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、観測対象粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。観測対象粒子とは、より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブであり、本発明の一実施形態においては、発光プローブと結合した標的粒子である。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と共に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれているように、粒子が領域内をランダムに移動する。これにより、光強度が、図３Ｂに示すように、ランダムに変化し、個々の観測対象粒子Ｔに対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。具体的には、上述したように、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。そこで、好適には、図４Ａに描かれているように、粒子（蛍光色素Ｆ及び対象粒子Ｔ）が光検出領域を略直線に横切る。これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示されるように、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となる。また、個々の観測対象粒子Ｔと光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。ここで、粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２ ＝６Ｄ・Δｔ　　 …（１）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２ ／６Ｄ 　　…（２）
となるので、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　…（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、拡散移動速度Ｖdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順（光信号検出手順））により、下記に示すように光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
　時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されているように、略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれているように、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
　また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２ ／ａ２ ） 　　…（４）
であると仮定でき、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。一方、強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。
（ii）観測対象粒子のカウンティング
　観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数する（発光粒子数計数手順）ことにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により為されてよい。
　図５及び図６Ｂを参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例においては、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）が取得された後（ステップ１００）、かかる時系列光信号データ（図６Ｂ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６Ｂ中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出され、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得るが、前記のデータ値の欠落は、スムージング処理によって無視することができる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂ中下段「時間微分」に例示されているように、信号値の変化時点における値の変化が大きくなる。したがって、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
　その後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われる（図６Ｂ下段「釣鐘型関数フィッティング」）。そして、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されているように、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号（「ノイズ」と付された信号）は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
　上記のステップ１３０～１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
　観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行う。検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されてもよい。
　参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、

Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　 …（５）

により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されてもよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、

ｃ＝ｎ／Ｖｔ 　　…（６）

により与えられる。光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられてもよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できる構成であってもよい。
＜標的粒子の定量方法＞
　本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法であって、試料溶液中の標的粒子を発光プローブで結合させて標識させる。その後、走査分子計数法によって計数した発光プローブと結合した標的粒子の数から、標的粒子の濃度が既知の標準試料を用いて作成された検量線に基づいて、この試料溶液中の標的粒子の濃度を算出する（濃度算出手順）ことを特徴とする。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、標的粒子を高感度に計数することができる。さらに、本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法は、標的粒子を、発光プローブとの結合を介して検出しているが、検量線を用いるため、より簡便かつ容易に、試料溶液中の標的粒子の濃度を求めることができる。
　また、標的粒子の定量方法は、検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の前記発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含んでいても良い。
　具体的には、本発明の一実施形態に係る標的粒子の定量方法は、下記工程（ａ）～（ｃ）を有する。
（ａ）前記標的粒子と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された溶液中に存在する、前記標的粒子の数を計数する工程（ｃ）前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と前記標的粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された前記標的粒子の前記数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する工程。
　さらに、前記工程（ｂ）が、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、前記試料溶液内において前記光学系の前記光検出領域の前記位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、前記標的粒子を個別に検出する検出工程と、を有する。　以下、工程ごとに説明する。
　まず、工程（ａ）として、標的粒子と、この標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、この試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる。
　本発明の一実施形態において、「試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光する粒子又は発光しない粒子のいずれであってもよい）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
　標的粒子は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子であって、この試料溶液中の濃度を定量する目的の粒子である。標的粒子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させた高分子であってもよい。
　核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾された物質や、タンパク質や低分子化合物等で標識された物質等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
　また、本発明の一実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であって、標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とにおいて、放出される光の発光特性が異なる物質であれば、特に限定されない。例えば、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質に、発光物質を結合させてもよい。発光物質としては、典型的には、蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する物質であってもよい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されず、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。
　例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブは、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質等の発光物質を結合させた物質、蛍光物質等の発光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する色素分子等が挙げられる。このオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させた高分子であってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含んでもよい。また、標的粒子がタンパク質である場合には、発光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを、蛍光物質等の発光物質で標識した物質を用いることができる。核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への発光物質の結合は、常法により行うことができる。
　本発明の一実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等する物質であってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等する物質であることが好ましい。標的粒子と特異的に結合する発光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合する物質であればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しない物質である必要はない。例えば、標的粒子が核酸である場合には、発光プローブとして用いる発光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、標的粒子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、標的粒子の塩基配列とミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
　また、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とにおいて、発光プローブの発光特性が異なるとは、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とで、特定の波長の光の強度が異なることを意味する。発光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、特定の波長の光の強度を異ならせる（例えば、蛍光強度を異ならせる）ことにより、走査分子計数法において両者を区別して検出することができる。
　標的粒子がタンパク質である場合には、タンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素（例えば、疎水性プローブＡＮＳ、ＭＡＮＳ、ＴＮＳといった蛍光色素）を、発光プローブとして用いることができる。また、発光プローブは、それ自体が発光していなくてもよい。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブを標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとし、試料溶液中にこの発光プローブとともに、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を添加する。これにより、発光プローブが単独で存在している状態（非結合状態）と、標的粒子と結合した状態（結合状態）とで、発光特性を異ならせることができる。２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。
　その他にも、例えば、発光プローブとして、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、標的粒子に結合することにより、前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が採用されてもよい。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造が変化して強い蛍光を放出する蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子（錯体の配位子）が挙げられる。この構成によれば、いずれの場合も、発光プローブ単体若しくは標的粒子に結合していない発光プローブは、殆ど発光しないか、発光しても、標的粒子及び発光プローブの結合体と波長が異なるため、標的粒子及び発光プローブの結合体からの光を選択的に検出することが可能となる。
　また、蛍光エネルギー移動現象（ＦＲＥＴ）を利用することにより、試料溶液中に於いて単独で存在している発光プローブと、標的粒子に結合した状態である発光プローブとの発光特性を異ならせることができる。例えば、発光プローブが単独で存在している状態ではＦＲＥＴが生じ、かつ、標的粒子と結合した状態ではＦＲＥＴが生じなくなるような条件で、標的粒子と結合する物質に、ＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーになる蛍光物質及びエネルギー・アクセプターになる物質（蛍光物質や消光物質）を結合させる。これにより、この結合物質は、発光プローブとして用いられることができる。標的粒子と結合した発光プローブからは、ＦＲＥＴが起こらないため、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から蛍光が放出される。一方で、単独で存在している発光プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、発光プローブと結合した標的粒子を、単独で存在している発光プローブと区別して検出することができる。
　例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、かつ、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないような条件で、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドに、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーになる蛍光物質とエネルギー・アクセプターになる物質とを、結合させて分子ビーコンプローブが作られる。この分子ビーコンプローブは、発光プローブとして好ましく用いることができる。本発明の一実施形態においては、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム－ループ構造）を形成する物質が好ましい。分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的粒子とハイブリダイズする領域を挟むようにして存在していればよく、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的粒子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。
　また、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用い、この蛍光性２本鎖核酸結合物質と発光プローブを標識した蛍光物質との間にＦＲＥＴを起こすことによっても、単独で存在している発光プローブと、標的粒子と結合している発光プローブとを区別することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と発光プローブを標識する蛍光物質とのいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方がこのＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している発光プローブからは、この発光プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、標的粒子と結合している発光プローブには蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、結合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している発光プローブとは区別して検出することができる。
　発光プローブと標的粒子との会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、発光プローブと標的粒子との会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、発光プローブを設計することが好ましい。
　その他、本発明の一実施形態においては、発光プローブを２種類使用してもよい。例えば、２種類の発光プローブを、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合に、標的粒子に対して互いに隣接してハイブリダイズするように設計する。そして、一方の発光プローブをＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質で標識し、他方の発光プローブをこのＦＲＥＴにおけるエネルギー・アクセプターと成る物質で標識させる。この場合、単独で存在している発光プローブではＦＲＥＴは起こらないが、標的粒子に結合することにより、前記２種類の発光プローブは互いに近接し（例えば、２種類の発光プローブの間隔が約１～１０ｎｍ）、ＦＲＥＴが起こる。このため、このＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、標的粒子を検出することができる。
　具体的には、工程（ａ）は、まず、標的粒子及び発光プローブを適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。この溶媒は、発光プローブから放出される光の検出、及び、走査分子計数法による発光プローブの検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されず、この技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。このバッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
　標的粒子及び発光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、試料溶液を調製した後、必要に応じて所定時間、この試料溶液をインキュベートするだけで、この試料溶液中で、標的粒子と発光プローブとを結合させることができる。
　一方で、標的粒子や発光プローブが二本鎖構造の核酸又は核酸類似物質である場合には、試料溶液中の核酸等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。「核酸又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。発光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、この発光プローブと標的粒子とからなる会合体を形成することができる場合がある。
　変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、この試料溶液を、高温処理をすることにより、この試料溶液中の核酸等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定されない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、この試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
　必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の標的粒子と発光プローブを会合させる。熱変性を行った場合には、高温処理後、この試料溶液の温度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、この試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、この試料溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、この試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。
　２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、この溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
　２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、発光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、この試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
　その後、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中の標的粒子の数を、走査分子計数法により計数する。具体的には、標的粒子を標識用プローブと結合させた後の試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、標識用プローブから放出される光を検出し解析する。これにより、標的粒子の数を算出する。
　工程（ａ）の後、工程（ｄ）として、前記試料溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記複合体を回収する。発光プローブで標識された標的粒子を個別に検出する光分析技術を用いた本発明の一実施形態の方法においては、遊離の発光プローブをはじめとする標的粒子と結合していない発光プローブからの光が、発光プローブからの光と区別なく検出されてしまうと、標的粒子の検出精度が悪化してしまう。そこで、工程（ｄ）において、遊離の発光プローブをはじめとする標的粒子と結合していない発光プローブを、前記複合体から除去する。
　標的粒子と結合していない発光プローブと分離して前記複合体を回収する方法は、特に限定されるものではなく、大きさ又は分子量、任意の物質に対する親和性、帯電状態等の違いを利用して複数の物質を物理的に分離する際に前記技術分野で通常行われる物質の分離方法の中から、適宜選択して実施することができる。前記分離方法としては、例えば、吸着・抽出又は洗浄を含む操作が挙げられる。具体的には、クロマトグラフィー（親水／疎水性クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）、限外濾過、電気泳動、相分離、遠心分離、溶媒抽出、フィルター吸着等が挙げられる。
　発光プローブとは独立して標的粒子と結合する分離用プローブを利用して、標的粒子と結合していない発光プローブから分離して前記複合体を回収することもできる。具体的には、工程（ａ）において、前記試料溶液にさらに分離用プローブを添加し、標的粒子と発光プローブと分離用プローブとを含む複合体を形成する。次いで工程（ｄ）において、前記複合体中の分離用プローブとその他の物質との相互作用を利用して、前記複合体を、標的粒子と結合していない発光プローブと分離して回収する。
　分離用プローブは、標的粒子と、発光プローブとは独立して、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であれば、特に限定されるものではない。前記分離用プローブは、他の物質を介して間接的に標的粒子と結合してもよいが、標的粒子と直接結合するものが好ましい。分離用プローブとして使用可能な、標的粒子と直接、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質としては、発光プローブで挙げられたもののうち、発光物質が結合する前のものと同様である。例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質である場合には、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、標的粒子がタンパク質である場合には、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターである。
　本発明の一実施形態において用いられる分離用プローブとしては、固相担体と結合する部位を有しており、標的粒子と結合した状態でさらに固相担体と直接的又は間接的に結合するものであることが好ましい。前記分離用プローブを用いた場合には、工程（ｄ）における複合体の回収、及び以降の工程（ｅ）における遊離の発光プローブの回収を、分離用プローブと直接的又は間接的に結合する固相担体を用いた固液分離処理により、より簡便に行うことができる。
　固相担体としては、分離用プローブと結合する部位を備えている固体であれば、その形状、材質等は特に限定されるものではない。例えば、ビーズ等の水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子であってもよく、メンブレンであってもよく、容器やチップ基板等であってもよい。固相担体としては具体的には、例えば、磁気ビーズ、シリカビーズ、アガロースゲルビーズ、ポリアクリルアミド樹脂ビーズ、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ等のプラスチックビーズ、セラミックスビーズ、ジルコニアビーズ、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート等が挙げられる。
　例えば、分離用プローブがオリゴヌクレオチドの場合、前記オリゴヌクレオチド中の標的粒子とハイブリダイズする領域以外の領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、分離用プローブが、固相担体と結合する部位として、ビオチン(ｂｉｏｔｉｎ)を有している場合、アビジンやストレプトアビジンが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、分離用プローブ中の固相担体と結合する部位が、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、Ｄｉｇ)、ジゴキシン(ｄｉｇｏｘｉｎ)、２以上の糖からなる糖鎖、４以上のアミノ酸からなるポリペプチド、オーキシン、ジベレリン、ステロイド、タンパク質、親水性有機化合物、及び、それらの類縁体等である場合、これらの物質に対する抗体、抗原、リガンド、若しくはレセプターが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。なお、固相担体は、分離用プローブと非特異的に結合等してもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等することが好ましい。
　具体的には、前記試料溶液に固相担体を接触させ、必要に応じてインキュベートすることにより、前記試料溶液中の標的粒子と発光プローブと分離用プローブとを含む複合体が、前記複合体中の分離用プローブを介して固相担体と結合する。その後、固液分離処理を行うことにより、固相担体と結合した複合体を、遊離の発光プローブ等の、液相に存在する標的粒子と結合していない発光プローブと分離して回収することができる。
　固液分離処理としては、試料溶液中の固相担体を液体成分とは分離して回収可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、固液分離処理に用いられる公知の処理の中から適宜選択して用いることができる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、固相担体を含む懸濁液に対して遠心分離処理を行い、固相担体を沈殿させ、上清を除去してもよい。また、前記試料溶液を濾紙又は濾過フィルターを用いて濾過し、濾紙等の表面に残留した固相担体を回収してもよい。また、固相担体が磁気ビーズである場合には、前記試料溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、前記容器の前記磁石に最も近接する面に固相担体を収束させた後、上清を除去してもよい。内壁が分離用プローブと結合する物質で被覆された容器が固相担体である場合、前記複合体を含む試料溶液を前記容器内に注入し、必要に応じてインキュベートした後、前記容器内の液体を排出する。なお、固相担体がメンブレンやフィルターの場合、前記複合体を含む試料溶液を前記固相担体に透過させることにより、固相担体と前記複合体との結合と、標的粒子と結合していない発光プローブからの前記複合体の分離回収を、一の操作で行うことができる。
　本発明の一実施形態においては、工程（ａ）において、固相担体を、標的粒子と発光プローブと分離用プローブと共に予め試料溶液に添加しておき、固相担体と結合した標的粒子と発光プローブと分離用プローブを含む複合体を形成し、その後に固液分離処理することにより、固相担体と結合した前記複合体を、標的粒子と結合していない発光プローブから分離して回収してもよい。また、工程（ａ）において、予め固相担体と結合した状態の分離用プローブと、標的粒子と発光プローブとを添加して試料溶液を調製してもよい。なお、この際に用いる分離用プローブは、固相担体と可逆的に結合していてもよく、不可逆的に結合していてもよい。
　回収された固相担体に適当な溶媒を添加することにより、固相担体と結合した複合体を含む試料溶液が調製される。回収された固相担体は、これを含む試料溶液として、工程（ｅ）に供される。前記溶媒は、後の工程において発光プローブから放出される光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されない。前記技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。前記バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
　回収された固相担体は、工程（ｅ）の前に、適当な溶媒により洗浄してもよい。洗浄により、遊離の発光プローブをより厳密に、固相担体と結合した複合体から分離して除去することができる。固相担体を洗浄する溶媒は、複合体と固相担体との結合を損なわなければ、限定されず、工程（ｅ）に供される固相担体と結合した複合体を含む試料溶液の調製に用いる溶媒と同種であってもよく、異なる溶媒であってもよい。
　その後、工程（ｅ）として、工程（ｄ）において回収された複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する。
　複合体中の発光プローブを解離させる方法は、前記複合体中の標的粒子と発光プローブとの結合を解消し得る方法であれば特に限定されない。
　例えば、標的粒子が核酸分子又は核酸類似物質からなるオリゴヌクレオチドであり、発光プローブ中の標的粒子と結合する部位が、核酸分子又は核酸類似物質からなり標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである場合、前記複合体を含む試料溶液の温度を、標的粒子と発光プローブの特異的会合条件よりも充分に高くしたり、前記複合体を含む試料溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブの特異的会合条件よりも充分に低くする。これにより、発光プローブと標的粒子の結合を解消させ、前記複合体から発光プローブを解離させることができる。
　解離した発光プローブと、単体又は複合体を形成している標的粒子とを互いに分離して回収する方法は、特に限定されず、発光プローブと、単体の標的粒子又は標的粒子を含む複合体との大きさの差や、任意の物質に対する親和性の差等を考慮して、前記技術分野で通常行われる物質の分離方法の中から、適宜選択して実施することができる。具体的には、クロマトグラフィー（親水／疎水性クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）、限外濾過、電気泳動、相分離、遠心分離、溶媒抽出、フィルター吸着等が挙げられる。
　図８は、分離用プローブＤと、前記分離用プローブＤと結合する固相担体Ｓとを用いた態様を模式的に示した図である。まず、標的粒子Ｔと、発光プローブＥと、分離用プローブＤとが結合し、複合体Ｃを形成する。前記複合体Ｃを、分離用プローブＤを介して固相担体Ｓに結合させた後、洗浄により遊離の発光プローブＥを除去した後、複合体Ｃから発光プローブＥを解離させ、遊離の発光プローブＥと、分離用プローブＤを介して固相担体Ｓと結合した標的粒子Ｔとが分離回収される。
　最後に工程（ｃ）として、溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と溶液から計数される発光プローブと結合した標的粒子の数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された標的粒子の数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する。本発明の一実施形態においては、検量線を用いることにより、発光プローブを介して検出された標的粒子の数から、試料溶液中の標的粒子の濃度を容易に求めることができる。
　検量線は、具体的には、まず、標的粒子の濃度が異なる標準試料系列を調製する。標準試料系列は、例えば、標的粒子の濃度が既知の溶液を、水やバッファー等の溶媒で段階的に希釈することによって調製することができる。標準試料系列を構成する標準試料溶液の数は、特に限定されず、３～２０種類程度であることが好ましい。また、各標準試料溶液の標的粒子の濃度も特に限定されず、標的粒子の種類や、発光プローブと標的粒子の親和性、解析対象の試料溶液中の期待される標的粒子の濃度等を考慮して、適宜調製することができる。標準試料系列は、各標準試料溶液の標的粒子の濃度が等間隔に設定されていてもよく、不等間隔に設定されていてもよい。
　次いで、標準試料系列のそれぞれの標準試料溶液に対して、解析対象である試料溶液に対して同じ条件で、工程（ａ）及び（ｂ）を行い、各標準試料溶液中に存在する、発光プローブと結合した標的粒子の数を計数する。すなわち、解析対象の試料溶液と同種の溶媒に、各標準試料溶液と、この試料溶液と等濃度になるように発光プローブとを添加して測定用溶液を調製する。そして、工程（ａ）と同じ処理を行うことにより、各測定用溶液中で標的粒子と前記発光プローブとを結合させる。その後、工程（ｂ）と同じ装置、プログラムを用いて走査分子計数法による測定を行い、標識用プローブと結合した標的粒子の数を算出する。各標準試料溶液に対する一連の測定は、工程（ａ）及び（ｂ）と実質的に同時に行ってもよく、工程（ａ）の前に予め行っていてもよく、工程（ｂ）の後に行ってもよい。
　各標準試料溶液に対して計数された発光プローブと結合した標的粒子の数、及び前記標準試料溶液の標的粒子の濃度から、両者の関係を近似する連続微分可能関数を求めることができる。得られた連続微分可能関数を検量線として用いる。検量線の作成方法は、特に限定されず、通常、２種類の量的データの関係の近似線を作成する際に用いられる演算解析方法のいずれを用いて作成してもよい。例えば、横軸を標的粒子の濃度とし、縦軸を標的粒子の数としたグラフに、各標準試料溶液から得られたデータをプロットする。各プロットに対して最小二乗法等を行うことにより、検量線を作成することができる。多くの場合には、標的粒子の濃度を対数表示した片対数グラフに測定値をプロットすることにより、シグモイド曲線に近い検量線を作成することができる。
＜本実施形態の装置及びプログラム＞
　走査分子計数法のための光分析装置及びこの装置のためのプログラムに、さらに工程（ｃ）を行うための構成及び手順を追加した装置等を用いることにより、工程（ｂ）～（ｃ）を上記の装置で行うことができる。
　具体的には、前述の走査分子計数法に用いられる光分析装置、すなわち、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、光分析装置は、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の前記位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記発光粒子の各々からの光信号を個別に検出し、前記個別に検出された前記発光粒子からの前記光信号の数を計数して前記光検出領域の前記位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する信号処理部とを有する。さらに、光分析装置は、試料溶液中の前記発光粒子の濃度又は量とこの試料溶液から計数される前記発光粒子の前記数との相関関係を近似する検量線を記憶する記憶部と、前記検量線に基づいて、前記信号処理部において計数された前記発光粒子の前記数から前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を算出する濃度計算部と、前記濃度計算部により算出された前記試料溶液中の前記発光粒子の前記濃度を表示する表示部とを備える。
　例えば、コンピュータ１８が、上記信号処理部、記憶部、濃度計算器を備えていても良い。
　前記表示部においては、検量線より算出された試料溶液中の発光粒子の濃度が、数値、表、グラフ等、形式を問わず表示される。また、検量線自体や、前記信号処理部において計数された前記発光粒子の数が表示されることも好ましい。図９及び図１０に、この表示部において表示されるデータの一態様を示す。この表示部にはその他にも、光検出領域からの光を検出する条件（試料溶液の量、測定環境時の温度、光学系から放射される光の波長や強度、光検出領域の位置、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）等）を表示させてもよい。この表示部としては、液晶ディスプレイ等の公知の画像表示装置を用いることができる。
　例えば、図１に示すような、走査分子計数法に用いられる光分析装置にさらに、検量線を記憶する記憶装置と、検量線に基づいて試料溶液中の発光粒子の濃度を算出する演算装置と、算出された試料溶液中の発光粒子の濃度を表示するディスプレイ（表示部）１９とを備えた装置により、工程（ｂ）～（ｃ）を行うことができる。この記憶装置及び演算装置は、図１Ａに示すコンピュータ１８を利用することができる。
　また、図１１に示したフローチャートで表されるように、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント光強度の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順に、さらに、試料溶液中の前記発光粒子の濃度（又は量）と試料溶液から計数される前記発光粒子の数との相関関係を近似する検量線を参照し、計数された発光粒子の数から、この溶液中の標的粒子の濃度を算出する手順を有するプログラムにより、工程（ｂ）～（ｃ）を上記の装置で行うことができる。
　次に実施例等を示して本発明の実施の形態をさらに詳細に説明するが、本発明の実施の形態は以下の実施例に限定されない。
［参考例１］
　濃度が異なる蛍光色素を用いて、走査分子計数法の計測値に基づく検量線作成が可能であることを示す実験を行った。
　計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムとを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いた。
　まず、ＡＴＴＯ（登録商標）６３３（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）を、リン酸緩衝液（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－１２７を含む）を用いて１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、又は１０ｆＭとなるようにそれぞれ調製した。次に、光分析装置の光学調整を行った後、上記の各試料溶液について計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザ光を用いて１ｍＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０～７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、１００ｐＭ、１０ｐＭ、及び１ｐＭの試料については２秒間、１００ｆＭ及び１０ｆＭの試料については２０秒間（グラフ中のピーク数は２秒間換算）とした。また、測定は各試料について５回行い、その平均を算出した。光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから、時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒、
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）、
相関係数＞０．９５、
を満たすピーク信号のみを観測対象分子に対応する光信号であると判定した。一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象分子に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。
　図１２は、横軸を試料溶液中の蛍光物質ＡＴＴＯ６３３の濃度、縦軸をピーク数とし、各試料溶液の計数値をプロットしたグラフである（対数目盛表示）。この結果、ＡＴＴＯ６３３の濃度とピーク数の関係は比例関係にあることが確認された。
　また、図１３は、図１２のグラフを通常目盛表示としたグラフである。この結果、溶液中の蛍光物質ＡＴＴＯ６３３の濃度と計数されるピーク数とは強い正の相関があり、各測定値から求められた検量線（図１３内に示す。）を用いることにより、濃度未知の試料の濃度を容易に決定できることがわかった。例えば、濃度未知の試料を測定した際のピーク数が１００だった場合には、この試料のＡＴＴＯ６３３の濃度は２．５ｐＭと算出することができる。
［実施例１］
　標的粒子として、配列番号１で表される塩基配列からなる核酸を用いた。以下、本実施例においては、この核酸を標的核酸という。また、この標的核酸と結合する発光プローブとして、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８が付加され、３’末端にＢＨＱ－１が付加された分子ビーコンプローブを用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。標的核酸及び分子ビーコンプローブの塩基配列を表１に示す。表１において、分子ビーコンプローブ中の下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の分子ビーコンプローブを１００ｐＭ、標的核酸を１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、若しくは１０ｐＭとなるように、トリス緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，４００ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）に溶解することにより、検量線作成のための標準試料溶液を調製した。
　各標準試料溶液を、９５℃で５分間加熱することにより変性させた後、２０℃まで徐々に液温を低下させて、標的核酸と分子ビーコンプローブが結合した会合体を形成させた。具体的には、降温速度を０．１℃／秒とし、９０℃で５分間、８０℃で１０分間、７０℃で１０分間、６０℃で１０分間、５０℃で１０分間、４０℃で１０分間、３０℃で１０分間の降温処理を行った。
　降温処理後の各標準試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各標準試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、４８８ｎｍのレーザ光を用いて３００μＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５１０～５６０ｎｍとした。標準試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。また測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各標準試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから、時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒、
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）、
相関係数＞０．９５、
を満たすピーク信号のみを観測対象核酸に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象核酸に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。
　図１４は、横軸を標準試料溶液中の標的核酸の濃度、縦軸をピーク数とし、各標準試料溶液から得られた計数値をプロットしたグラフである。この結果、標的核酸の濃度依存的にピーク数が変化していることが確認された。
　各プロットの近似曲線を検量線とし、濃度未知の試料溶液の標的核酸濃度を求めた。具体的には、未知試料溶液に対して、上記標準試料溶液と同様にして分子ビーコンプローブを添加し、分子ビーコンプローブとの会合体を形成した後、光分析装置を用いて測定し、ピーク数を算出した。この結果、この未知試料溶液から計数されたピーク数は４２１であった。図１３に示す検量線を参照し、この未知試料溶液の標的核酸濃度は、１．４ｎＭであると算出することができた。
［実施例２］
　標的粒子として、配列番号３で表される塩基配列からなる核酸を用いた。以下、本実施例においては、前記核酸を標的核酸２という。また、発光プローブとして、蛍光プローブを用い、分離用プローブとして、ビオチンプローブを用い、固相担体として、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを用いた。
　また、前記標的核酸２と結合する発光プローブとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＡＴＴＯ ６４７Ｎが付加された蛍光プローブを用いた。さらに、前記標的核酸２と結合する、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの３’末端にビオチンが付加されたビオチンプローブを用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。標的核酸２及び蛍光プローブ、ビオチンプローブの塩基配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　トリス緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，４００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）に標的核酸２が３０ｆＭ、１０ｆＭ、３ｆＭ、若しくは１ｆＭ、蛍光プローブが２０ｐＭ、ビオチンプローブが２００ｐＭ、Ｐｏｌｙ（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｉｃ－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ）ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）が０．１Ｕ／ｍＬ（１Ｕは、水中(光路長は１ｃｍ)で２６０ｎｍの吸光度が１．０となる量）となるように試料溶液（１００μＬ）を調製した。標的核酸２を含まない試料も用意した。それらの試料溶液を９５℃で５分間加熱後、０．１℃／分の速度で２５℃にした。０．１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１μＬ加え、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｔ．ｎｏ．６５０）１０μｇと２５℃で９０分間、振とうさせながら反応させた。続いて、磁石を用いて５００μＬの洗浄バッファ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，４００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）によって３回洗浄した後、１００μＬの溶出バッファ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）を加え、５０℃で５分間放置した。磁石で磁気ビーズを集めた後、上清を回収し、それらを標準試料溶液として、走査分子計数法によって計測した。
　計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の上清について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、６４２ｎｍのレーザ光を用いて１ｍＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０～７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、６７．５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、６００秒間とした。また測定は各５回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各上清について取得された時系列のフォトンカウントデータから時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は１１個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、
　下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９０
を満たすピーク信号のみを蛍光プローブに対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、蛍光プローブに対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。
　図１４は、横軸を標準試料溶液中の標的核酸２の濃度、縦軸をピーク数とし、各標準試料溶液から得られた計数値をプロットしたグラフである。この結果、標的核酸２の濃度依存的にピーク数が変化していることが確認された。
　各プロットの近似曲線を検量線とし、濃度未知の試料溶液の標的核酸濃度を求めた。具体的には、濃度未知試料溶液に対して、上記標準試料溶液と同様にして測定用試料を作製し、光分析装置を用いて測定し、ピーク数を算出した。この結果、前記濃度未知試料溶液から計数されたピーク数は７２４であった。図１４に示す検量線を参照し、前記濃度未知試料溶液の標的核酸濃度は、４．６ｆＭであると算出することができた。
　上記の標的粒子の定量方法により、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない標的粒子の濃度を、走査分子計数法により定量的に測定することができるため、臨床検体等の、解析対象物質の濃度が微量である試料の解析・検査等の分野で利用が可能である。
Ｆ…蛍光色素（発光プローブ）
Ｔ…対象粒子（標的粒子）
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器（光検出領域移動部）
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
１９…ディスプレイ（表示部）

Claims (24)

  1. 　試料溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を定量する方法であって、
    （ａ）前記標的粒子と、前記標的粒子に結合する発光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブとを結合させる工程と；
    （ｂ）共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、前記試料溶液内において前記光学系の前記光検出領域の前記位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記発光プローブから放出される光信号を検出して、直接的または間接的に前記標的粒子を個別に検出する検出工程と、
    （ｃ）前記検出工程において検出された、前記標的粒子の数を計数する計数工程及び前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度又は量と前記標的粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記工程（ｂ）において計数された前記標的粒子の前記数から、前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する算出工程と；
    を備える
    標的粒子の定量方法。
  2. 　前記移動工程に於いて、前記光検出領域の前記位置を所定の速度にて移動する
    請求項１に記載の標的粒子の定量方法。
  3. 　前記移動工程に於いて、前記光検出領域の前記位置を、前記発光プローブ、又は前記発光プローブと結合した標的粒子のいずれか速い方の拡散移動速度よりも速い速度にて移動する
    請求項１又は２に記載の標的粒子の定量方法。
  4. 　前記検出工程に於いて、検出された時系列の前記光信号の形状に基づいて、前記発光プローブ、又は発光プローブと結合した前記標的粒子が前記光検出領域に入ったことを検出する
    請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の標的粒子の定量方法。
  5. 　前記発光プローブが、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギー・ドナー部位とエネルギー・アクセプター部位とを有し；
    　前記発光プローブが前記標的粒子に結合した結合状態と前記標的粒子に結合していない非結合状態との間で前記エネルギー・ドナー部位と前記エネルギー・アクセプター部位との距離が異なり；
    　前記結合状態と、前記非結合状態との、前記発光プローブから放出される光の発光特性が異なる；
    請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の標的粒子の定量方法。
  6. 　前記標的粒子が核酸であり；
    前記発光プローブが、前記標的粒子と特異的にハイブリダイズし、且つ蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質の少なくとも一つが結合している１本鎖核酸である；
    請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の標的粒子の定量方法。
  7. （ｄ）前記工程（ａ）の後、前記試料溶液から、前記標的粒子と結合していない発光プローブと分離して、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体を回収する工程を有する請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の標的粒子の定量方法。
  8. （ｅ）前記工程（ｄ）において回収された前記複合体から前記発光プローブを解離させた後、遊離の発光プローブと前記標的粒子とを、互いに分離して回収する工程を有する請求項７に記載の標的粒子の定量方法。
  9. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    　前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と；
    　前記光検出領域における前記発光粒子の光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の前記位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記発光粒子の各々からの前記光の光信号を個別に検出し、前記個別に検出された前記発光粒子からの前記光信号の数を計数して前記光検出領域の前記位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する信号処理部と、
    　前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度又は量と前記試料溶液から計数される前記発光粒子の前記数との相関関係を近似する検量線を記憶する記憶部と；
    　前記検量線に基づいて、前記信号処理部において計数された前記発光粒子の前記数から前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を算出する濃度計算部と；
    　前記濃度計算部により算出された前記試料溶液中の前記発光粒子の前記濃度を表示する表示部と；
    を含む装置。
  10. 　前記光検出領域移動部が所定の速度にて前記光検出領域の前記位置を移動させる
    請求項９に記載の装置。
  11. 　前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の前記位置を移動させる
    請求項９または請求項１０に記載の装置。
  12. 　前記光検出部にて検出された時系列の前記光信号の形状に基づいて、前記信号処理部は、前記発光粒子のうちの１つが前記光検出領域に入ったことを検出する
    請求項９から請求項１１のいずれか１項に記載の装置。
  13. 　所定の閾値より大きい強度を有する前記光信号が検出されたときに、前記信号処理部は、前記発光粒子のうちの１つが前記光検出領域に入ったことを検出する
    請求項１２に記載の装置。
  14. 　前記信号処理部が前記検出された前記発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の前記発光粒子の数密度又は濃度を決定する
    請求項９から請求項１３のいずれか１項に記載の装置。
  15. 　前記発光粒子が、発光プローブと結合した標的粒子であり；
    　前記光検出部において検出される光が、前記標的粒子と結合した状態の前記発光プローブから放出される光である；
    請求項９から請求項１４のいずれか１項に記載の装置。
  16. 　前記光検出部において検出される光が、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体から遊離した前記発光プローブから放出される光である
    請求項９から請求項１４のいずれか一項に記載の装置。
  17. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって；
    前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動するために、前記光学系の光路を変更する変更手順と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の前記位置の移動中に前記光検出領域における前記発光粒子の前記光を検出する光検出手順と、
    　前記検出された前記発光粒子の各々からの前記光の光信号を個別に検出する光信号検出手順と、
    　前記個別に検出された前記発光粒子からの前記光の前記光信号の数を計数して前記光検出領域の前記位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する発光粒子数計数手順と、
    　前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度又は量と前記試料溶液から計数される前記発光粒子の前記数との相関関係を近似する検量線に基づいて、前記計数された発光粒子の前記数から前記試料溶液中の前記標的粒子の濃度を算出する濃度算出手順と、
    をコンピュータに実行させる；
    コンピュータプログラム。
  18. 　前記変更手順に於いて、前記光検出領域の前記位置が所定の速度にて移動される
    請求項１７に記載のコンピュータプログラム。
  19. 　前記変更手順に於いて、前記光検出領域の前記位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される
    請求項１７又は請求項１８に記載のコンピュータプログラム。
  20. 　前記光信号検出手順に於いて、検出された時系列の前記光信号の形状に基づいて、前記発光粒子のうちの１つが前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とする請求項１７から請求項１９のいずれか１項に記載のコンピュータプログラム
  21. 　前記光信号検出手順に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する前記光信号を検出したときに、前記発光粒子のうちの１つが前記光検出領域に入ったことを検出する
    請求項１７から請求項２０のいずれか１項に記載のコンピュータプログラム。
  22. 　更に、前記検出された前記発光粒子の前記数に基づいて、前記試料溶液中の前記発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含む
    請求項１７から請求項２１のいずれか１項に記載のコンピュータプログラム。
  23. 　前記光検出手順に於いて、前記光検出領域から検出される光が、前記標的粒子と結合した状態の前記発光プローブから放出される光である
    請求項１７から請求項２２のいずれか１項に記載のコンピュータプログラム。
  24. 　前記光検出手順に於いて、前記光検出領域から検出される光が、前記標的粒子と前記発光プローブとを含む複合体から遊離した前記発光プローブから放出される光である
    請求項１７から請求項２２のいずれか１項に記載のコンピュータプログラム。
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