WO2012079310A1

WO2012079310A1 - 复方海参制剂及其制备方法

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Publication number: WO2012079310A1
Application number: PCT/CN2011/071475
Authority: WO
Inventors: 焦健; 邵俊杰
Original assignee: 大连海晏堂生物有限公司
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2011-03-03
Publication date: 2012-06-21
Also published as: US20120309710A1; EP2514432A4; CN102008528A; EP2514432A1; EP2514432B1; CA2787154C; US8927523B2; CA2787154A1; CN102008528B

Description

说明书复方海参制剂及其制备方法技术领域

本发明属于来源于软体动物的提取物和植物的医药配制品，涉及到酶的应用和多糖的提取技术，以及配制品的剂型的制备。

背景技术

海参，是我国的海味八珍之一，其滋补价值为人们所公认。其中海参多糖是海参中最为重要的活性成分，具有多种生理活性，根据实验研究表明，海参多糖在对抗心脑血管方面疾病的效果显著。将海参纳米化后，直接进行开发，不仅可充分利用海参多糖等重要的活性成分，同时，可将海参蛋白、脂质等成分共同进行充分利用。

三七为云南南部特产的人参属植物，根茎肉质如姜块状，民间用于治疗跌打损伤、活血祛瘀等疾患。三七的主要功能成分是三七总皂苷，在医药保健领域有广泛的应用，医药企业利用三七这种特殊的功效，研制开发了很多如云南白药、血塞通系列、复方丹参滴丸、片仔癀等知名药品。其中，以三七总皂苷为原料制成的药物通称 "血塞通"，目前市场上有血塞通粉针、血塞通片、血塞通胶囊、血塞通颗粒等。血塞通是全国医院急诊科室必备中成药，也主要用于心脑血管方面的疾病。

现代科技发展已经确定了海参和三七的活性成分和对人体的作用，而且有相当数量的药品、保健品生产和上市。但是目前对于利用海参和三七等各自的特点进行复配能否起到更为有利人体健康作用，是当前重要研究课题。

海参复方制剂，目前市场基本还属于空白，仅有少数如专利 200710114414.7 复方海参糖肽口服液，其是利用海参，配以蜂王桨以及中药提取液而开发的一种复方海参口服液，其针对人群不清，效果不明确。

发明内容

本发明的目的在于利用低分子化后的海参纳米粉提取的多糖，直接配以三七或三七皂苷提取物，开发一种比单用海参或三七更好治疗和保健效果的产品。

本发明的技术方案是将海参先进行胶化处理，胶化处理的海参在冷冻干燥后逐步经粗粉碎、超微粉碎、纳米粉碎成纳米颗粒，纳米海参颗粒经酶解和分离制得提取物（有效成分：海参多糖），用海参提取物与三七皂甙进行复配而成。本方面的具体操作步骤为：

( 1 ) 原料处理：将剪开、清洗干净鲜活海参或水发海参置于密闭容器中；鲜活海参将其剪开，取出内脏，将其分别充分清洗干净，可以仅是用海参体壁，也可以连同海参内脏一起绞碎，置于密闭容器中。鲜活海参或水发海参品种为海刺参、叶瓜参等常见食用海参；所述水发海参为干海参、半干海参或盐渍海参进行水发或脱盐水发而成。

(2 )加热胶化：加热，温度为 70〜130°C，时间为 lmii！〜 20h。优选 100〜105°C， lh。

(3 )冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分小于 10%。为了利于后续的粉碎过程，干燥后得水分越低越好，优选水分小于 3%。

(4 ) 粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。粗粉碎选择的设备以功率大的为佳，粉碎时间很短，一般在 l〜20min内可以得到细度为 10〜300目不等的海参粉。

( 5 ) 超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，粉碎细度为 100〜3000目的海参超微粉。

( 6 ) 纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为 4〜20h，优选 10〜12h，细度可达到 10〜 1000nm。其中用 X-射线检测粒度分布，在 0〜300nm范围，它的平均粒径是 100〜200nm。

(7 ) 酶解及分离：纳米海参粉与水以 1 : 3〜10质量比加水溶解，按纳米海参粉：蛋白酶为 lg:0.1〜1010mg的比例加入蛋白酶在相应的 pH值下于 40〜70°C 进行 l〜5h的酶解，而后加温灭酶， 0〜10°C高速离心，取上清液；酶解所选用的蛋白酶可以是各种酶，如菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，风味蛋白酶，胰蛋白酶等，同时可以是单种酶酶解，也可以是选用两种或两种以上的蛋白酶进行酶解。优选纳米海参粉末与水按照 1 : 7的比例进行混匀，用碱性蛋白酶 Acalase与胰酶进行双酶解。酶解温度为 40〜70°C，先将 pH调为 7〜 8 , 按照纳米海参粉末与酶的质量比（1克： 0.1〜10mg)加入碱性蛋白酶 Acalase, 进行酶解 0.1h〜5h后，将 pH调节到 8〜10，按照纳米海参粉末与酶的质量比（1 克： 10mg〜1000mg)加入胰蛋白酶进行 2次酶解 0.1〜5h ，酶解温度为 40〜70°C。酶反应结束后将酶解反应液于 90〜100°C加热 l〜20min灭酶。将酶解产物进行过滤离心分离，取酶解上清液，将上清液进行干燥处理，即得纳米海参粉提取物。 ( 8 ) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 99%~70%： 1%~30%的比例进行混合。

该产品为一种灰白色或浅棕或棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 2.5%~8.0%，三七总皂甙含量为 0.3%~21%。

混合后即可制成各种型剂，如胶囊、片剂、冲剂等。

根据目前的研究显示，海参多糖不仅具有抗凝功能，同时可以从骨髓动员肝细胞的能力，而三七总皂甙则可促进被动员的干细胞转化或分化为新生的心肌细胞或脑细胞，以替代因缺血而引发的心肌或脑组织的坏死。纳米海参和三七总皂甙复合制剂在药理作用上可起到互补和协同，海参多糖对血小板促聚的副作用，可以通过与三七总皂甙的复合剂而得以消除。利用低分子化后的海参纳米粉进行提取后，直接配以三七总皂甙提取物，能够大大提高海参或三七单一组方的药理功能，可用于抗凝、糖尿病等多种药用用途。

具体实施方式

一. 复合海参制剂的制造

实施例 1

( 1 )原料处理：将鲜活海刺参剪开，取出内脏，将海参体壁分别充分清洗干净，置于密闭容器中。

(2) 胶化：将上述容器于 70〜80°C，加热 20h。

(3 ) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 0.1%。

(4) 粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。得到细度为 10〜300目不等的海参粉。

(5 ) 超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，得到粉碎细度为 100〜3000目的海参超微粉。

(6) 纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为 4h。

(7)酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1 : 3的比例加入后，搅匀，加入菠萝蛋白酶按照纳米海参粉末与菠萝蛋白酶酶的质量比 lg:10mg， pH6— 7, 酶解温度为 40 °C，进行酶解 5h后，酶反应结束后将酶解反应液于 90°C加热 20min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取物。 (8) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 99%: 1%的比例进行混合。

产品为一种浅棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 7.8% , 三七总皂甙含量为 0.5%。

本实施例产品进行了小鼠灌胃对凝血时间参数 TT、 RT的影响的效果实验。其结果见表 1.

将其装入胶囊，每囊 0.3克。

实施例 2

( 1 ) 原料处理：将鲜活叶瓜参剪开，取出内脏，将海参体壁，内脏分别充分清洗干净，一起置于密闭容器中。

(2) 胶化：将上述容器于 80〜90°C，加热 15h。

(3 ) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 1%。

(6) 纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为 8h。

(7)酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1 : 4的比例加入后，搅匀，加入碱性蛋白酶按照纳米海参粉末与碱性蛋白酶的质量比 lg:0.5mg， pH7〜8，酶解温度为 65°C，进行酶解 2h后，酶反应结束后将酶解反应液于 95°C加热 15min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取物。

(8) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 90%: 10%的比例进行混合。

该产品为一种浅棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 4.6% , 三七总皂甙含量为 6.2%。

用单纯海参纳米粉与本实施例产品对小鼠进行不同途径给药后对 TT值和 RT值的影响，结果见表 2. 混合后制成胶囊，每囊 0.3克。

实施例 3

(1) 原料处理：取干海刺参，在水中浸泡软后，将体壁剪开，清洗干净，置于密闭容器中。

(2) 胶化：将上述容器于 90〜100°C，加热 10h。

(3) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 3%。

(4) 粗粉碎、（5) 超微粉碎与（6) 纳米粉碎均同实施例 2。

(7)酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1: 5的比例加入后，搅匀，加入胰蛋白酶按照纳米海参粉末与胰蛋白酶的质量比 lg:10mg， pH8〜9，酶解温度为 45°C，进行酶解 5h后，酶反应结束后将酶解反应液于 100°C加热 10min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取

(8) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 80%: 20%的比例进行混合。

产品为棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 6.3%, 三七总皂甙含量为 10.9%。

本实施例复方海参制剂对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠空腹血糖的影响进行了实验，结果见表 3.

混合后的粉末制成胶囊，每囊 0.3克。

实施例 4

(1) 原料处理：取盐渍干海刺参，在水中除去海参体内的盐分，浸泡软后，将体壁剪开，清洗干净，置于密闭容器中。

(2) 胶化：将上述容器于 100〜105°C，加热 5h。

(3) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 5%。

(4) 粗粉碎与（5) 超微粉碎均同实施例 2。

(6) 纳米粉碎将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为 12h。

(7)酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1: 6的比例加入后，搅匀，加入中性蛋白酶按照纳米海参粉末与中性蛋白酶的质量比 lg:lmg， pH6.7〜7，酶解温度为 50°C，进行酶解 lh后，酶反应结束后将酶解反应液于 100°C加热 5min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取物。

( 8 ) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 70%: 30%的比例进行混合。

产品为一种棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 5.4% , 三七总皂甙含量为 15.2%。

混合后的粉末制成胶囊，每囊 0.3克。

实施例 5

( 1 ) 原料处理：取盐渍干海刺参，浸泡软后，在 90〜100°C在水加热 lh，将体壁剪开，清洗干净，用纯净水除去海参体内的盐分，同时起到发制海参的作用。置于密闭容器中。

(2) 胶化：将上述容器于 105〜110°C，加热 2h。

(3 ) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 7%。

(4) 粗粉碎与（5 ) 超微粉碎同实施例 1。

(6) 纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为 16h。

(7)酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1 : 7的比例加入后，搅匀，加入碱性性蛋白酶按照纳米海参粉末与碱性蛋白酶的质量比 lg:0.1mg， pH7〜8，酶解温度为 65°C，进行酶解 3h后，再将温度调整为 45°C，加入胰蛋白酶，加入胰蛋白酶按照纳米海参粉末与胰酶的重量比 lg: 10mg,pH 8〜9，进行酶解 3h，酶反应结束后将酶解反应液于 100°C加热 10min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取物。

( 8 ) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 80%: 20%的比例进行混合。

产品为一种棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 4.4% , 三七总皂甙含量为 7.9%。

混合后按照原料：辅料为 2: 1的比例制成片剂。

实施例 6

( 1 ) 原料处理：取干叶瓜参，浸泡软后，将体壁剪开，清洗干净。置于密闭容器中。

(2) 胶化：将上述容器于 110〜120°C，加热 lh。

(3 ) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 9%

(4) 粗粉碎与（5 ) 超微粉碎均同实施例 1。

(6) 纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为 18h。

(7)酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1 : 8的比例加入后，搅匀，加入碱性性蛋白酶按照纳米海参粉末与碱性蛋白酶的质量比 lg:0.1mg， pH7〜8，酶解温度为 65°C，进行酶解 lh后，再加入碱性蛋白酶，加入碱性蛋白酶按照纳米海参粉末与碱性蛋白酶的质量比 lg:0.1mg,pH 7〜8，温度 65°C，进行酶解 3h，酶反应结束后将酶解反应液于 100°C加热 10min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取物。

( 8 ) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 90%: 10%的比例进行混合。

产品为一种棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 2.6% , 三七总皂甙含量为 3.2%。

混合后按照原料：辅料为 1 : 1的比例制成冲剂。

实施例 7

( 1 ) 原料处理：取鲜活海刺参，去除内脏后，将海参体壁清洗干净，置于密闭容器中。

(2) 胶化：将上述容器于 120〜130°C，加热 10min。

(3 ) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 10%。

(4) 粗粉碎与（5 ) 超微粉碎均同实施例 1。

(6) 纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为 20h。

(7) 酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1 : 10的比例加入后，搅匀，加入中性性蛋白酶按照纳米海参粉末与中性性蛋白酶的质量比 lg:0.8mg， pH6.7〜7，酶解温度为 50°C，进行酶解 lh后，再加入碱性蛋白酶，加入碱性蛋白酶按照纳米海参粉末与碱性蛋白酶的质量比 lg:l mg,pH 7〜8，温度 65°C，进行酶解 lh，再将温度调整为 45°C，加入胰蛋白酶，加入胰蛋白酶按照纳米海参粉末与胰酶的质量比 lg:10mg,pH 8〜9，进行酶解 lh，酶反应结束后将酶解反应液于 100°C加热 10min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取物。

( 8 ) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 95%: 5%的比例进行混合。

产品为一种棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 7.5% , 三七总皂甙含量为 3.2%。

混合后的粉末制成胶囊，每囊 0.3克。

实施例 8

(2) 胶化：将上述容器于 105〜110°C，加热 40min。

(3 ) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 9%。

(4) 粗粉碎、（5 ) 超微粉碎与（6) 纳米粉碎均同实施例 7。

(7)酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1 : 9的比例加入后，搅匀，加入碱性蛋白酶，加入碱性蛋白酶按照纳米海参粉末与碱性蛋白酶的质量比 lg:10 mg,pH 7〜8，温度 65°C，进行酶解 lh，再将温度调整为 45°C，加入胰蛋白酶，加入胰蛋白酶按照纳米海参粉末与胰酶的质量比 lg: 100mg,pH 8〜9，进行酶解 lh，酶反应结束后将酶解反应液于 100°C加热 10min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取物。

( 8) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 80%: 20%的比例进行混合。

产品为一种棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 3.3% , 三七总皂甙含量为 6.8%。

混合后的粉末按照原料：辅料为 1 : 1的比例制成冲剂。

实施例 9

( 1 ) 原料处理：取鲜活海参，去除内脏后，将海参体壁与内脏分别清洗干净，置于密闭容器中。

(2) 胶化：将上述容器于 100〜105°C，加热 120min。 (3 ) 真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为 3%。

(4) 粗粉碎、（5 ) 超微粉碎与（6) 纳米粉碎均同实施例 7。

(7)酶解：将纳米海参粉末与水（重量比）按照比例 1 : 6的比例加入后，搅匀，加入碱性蛋白酶，加入碱性蛋白酶按照纳米海参粉末与碱性蛋白酶的质量比 lg:5 mg,pH 7〜8，温度 65°C，进行酶解 lh，再将温度调整为 45°C，加入胰蛋白酶，加入胰蛋白酶按照纳米海参粉末与胰酶的质量比 lg: 1000mg,pH 8〜9，进行酶解 lh，酶反应结束后将酶解反应液于 100°C加热 10min。将酶解产物进行离心分离，取酶解上清液，直接进行干燥后，即得纳米海参提取物。

混合后按照原料：辅料为 2: 1的比例制成片剂。

产品为一种棕色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙（以 Rl+Rbl+Rgl成分总含量来计算），海参多糖含量为 4.7% , 三七总皂甙含量为 4.1%。

二.纳米海参提取物与三七总皂甙提取物混合物的实验室效果实验。

1. 小鼠灌胃对凝血时间参数 TT、 RT的影响：见表 1

表 1. 小鼠灌胃复方海参制剂 3天后对 ΤΤ及 RT的影响（_n=10， x±s) 组别剂量 TT ( s) TT延长％ RT ( s) RT延长％

NS 5.64±0.62 12.8±10.2

复方海参制

0.3g/kg 7.08±0.64*** 25.5 67.0±8.5*** 423.4 剂

复方海参制

0.15g/kg 6.56±0.53*** 16.3 50.3±11.3*** 293.0 剂

注： Ρ<0.001与生理盐水组比较

2.单纯海参纳米粉与复方海参制剂小鼠不同途径给药后对 TT值和 RT值的影响：

(1)小鼠：昆明种，雄性，体重 23~25g。

(2)凝血酶时间 (TT) 的测定：

依次在血凝仪测定杯中加入待测血桨 5(^L， 0.1mol/LpH7.4Tris-HCL缓冲液和 5u/ml的凝血酶溶液各 50μΙ^，加入凝血酶溶液的同时血凝仪开始自动记录凝血时间。自加入凝血酶溶液至凝血形成这段时间被记录为血桨凝血酶凝结时间，简称凝血酶时间。

( 复钙时间（RT) 的测定：在血凝仪测定杯中加入待测血浆 1 OO L，再加入 0.025mol/L的 CaCl₂溶液 ΙΟΟμΙ^, 加入 CaCl₂溶液的同时血凝仪开始自动记录凝血时间即复钙时间。

(4)动物实验

①小鼠尾静脉注射给药：

精确称取海参纳米粉或复方海参制剂 lOOmg, 加蒸馏水 5ml，以 2800r/min旋混 30秒，然后以 3000r/min离心 15分钟，取上清夜即海参纳米粉或复方海参制剂的水提物备用。

昆明种小鼠 45只，随机分为三组，即生理盐水组、纳米海参粉组，复方海参制剂组，每组 15只。生理盐水组由尾静脉注射生理盐水 O.lml/lOg体重，海参纳米粉组和复方海参制剂组分别尾静脉注射上述配制的海参水提物 O.lml/lOg体重，注射 15分钟后小鼠眼球采血 0.45ml，加入 0.05ml3.8%枸橼酸钠抗凝，再加入 0.2ml 生理盐水，混匀

后 3000r/min离心 10min，取上清液测定其 TT及 RT值。

②小鼠腹腔注射给药：

昆明种小鼠 18只，随机分为三组，即生理盐水组、海参纳米粉组和复方海参制剂组，每组 6只。生理盐水组腹腔注射生理盐水 0.2ml/10g体重，海参纳米粉组和复方海参制剂组分别腹腔注射 50mg/ml的海参普通及纳米粉混悬液 0.2ml/10g体重，腹腔注射 30分钟后小鼠眼球采血 0.45ml，加入 0.05ml3.8%枸橼酸钠抗凝，再加入 0.2ml生理盐水，混匀后 3000r/min离心 10min，取上清液测定其 TT及 RT值。

③小鼠灌胃给药：

昆明种小鼠 60只，随机分为六组，即生理盐水组，海参纳米粉组和复方海参制剂组各两组，分别灌胃给药一周和两周，每组 10只。生理盐水组灌胃生理盐水 0.2ml/10g体重，海参纳米粉组和复方海参制剂组分别灌胃 50mg/ml的海参纳米粉和复方海参制剂混悬液 0.2ml/10g体重，（lg/kg体重），每日 2次，末次灌胃 1 小时后小鼠眼球采血 0.45ml，加入 0.05ml3.8%枸橼酸钠抗凝，再加入 0.2ml生理盐水，混匀后 3000r/min离心 10min，取上清液测定其 TT及 RT值。

(5)结果

如表 2所示，小鼠尾静脉注射、腹腔注射及两周灌胃给药后，海参纳米粉组与 NS组比较 RT值分别延长了 1259.46%、 236.54%和 284.04%,复方海参制剂组与 NS组比较 RT值分别延长了 1895.95%、 698.08%和 717.02%,且均具有统计学意义 (PO.Ol),复方海参制剂的 RT延长较纳米粉的 RT延长更为显著；复方海参制剂组 RT值较纳米粉组分别延长了 46.82%、 137.14%和 112.74%,且两者之间差异具统计学意义 (P<0.01)。与 NS组比较，注射给药及口服后 TT值虽有延长趋势，但无统计学意义 (P>0.05)。小鼠一周灌胃给药后，海参纳米粉组和复方海参制剂组与 NS 比较 RT值均显著延长，分别延长了 641.18%和 905.88%, 且具有统计学意义；纳米粉组虽较普通粉组 RT延长了 35.71%,但两者之间差异无统计学意义（P>0.05 )。其实验详细总结见表 2:

表 2. 小鼠不同途径给药后 TT值及 RT值的影响

NS 组纳米海参粉复方海参制剂

给药 TT RT TT RT RT延长 TT RT RT延长 RT延长途径 ( %，与 (%，与 NS

NS 组比组比较）粉组比较）较）

静脉 18.4 7.4 23.8 100.6** 15.6 147.7⁴

注射 Δ

士士士士 1259.46 士士 1895.95 46.82

6.1 1.8 8.3 19.6 2.4 32.0 腹腔 15.7 5.2 24.7 17.5** 25.5 41.5*⁴

注射士士士士 236.54 士士 698.08 137.14

0.8 1.5 2.3 3.1 2.5 2.2 灌胃 14.7 5.1 18.2 37.8** 19.1 51.3*⁴

一周士士士士 641.18 士士 905.88 35.71

7.0 1.9 7.4 36.3 7.6 38.3 灌胃 13.8 9.4 18.5 36.1* 18.2 76.8*

两周士士士士 284.04 士士 717.02 112.74

6.2 8.9 5.0 34.6 3.6 42.1

*P<0.05与生理盐水组比较； **P<0.01与与生理盐水组比较； ΔΡΟ.01与纳米粉组比较

3. 复方海参制剂对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠空腹血糖的影响：

A. 实验的设计：

A-1.小鼠高血糖模型建立：取雄性， 18-22g昆明种小鼠，随机取其中 10只为正常对照组。其余小鼠于禁食（不禁水） 16h后，经尾静脉注射四氧嘧啶 50mg/kg，稳定 15天后测定小鼠空腹 5h的血糖值（FPG) ， FPG>10mmol/L的小鼠即为高血糖模型小鼠。

A-2. 动物分组及给药：正常对照组小鼠 10只。取高血糖小鼠 40只，随机分为高血糖模型组、复方海参制剂高剂量（0.5g/kg)组、复方海参制剂低剂量（0.25g/kg) 组和阳性对照药二甲双胍 200mg/kg组。

复方海参制剂高剂量组和复方海参制剂低剂量组小鼠分别灌胃给予 0.025g/mL和 0.0125g/mL复方海参制剂生理盐水混悬液 0.2mL/10gBW，二甲双胍 200mg/kg组小鼠灌胃给予 lOmg/mL二甲双胍生理盐水溶液 0.2mL/10gBW，正常对照组和高血糖模型组小鼠灌胃给予等容量生理盐水。各组小鼠均每日给药 2次

(b.i.d. ) ，连续给药 4周。

A-3. FBG测定：以德国罗氏优越 IV型血糖仪测定各组小鼠给药第 7、 14、 21和 28 天空腹 5h的血糖值（FPG) ，并记录小鼠体重。

B. 复方海参制剂对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠糖耐量的影响：

小鼠高血糖模型的建立、动物分组及给药方法均同上所述。各组小鼠于给药第 28天以德国罗氏优越 IV型血糖仪测定空腹 5h的血糖值（FPG) 后，经腹腔注射给予葡萄糖 2g/kg，测定葡萄糖负荷后 30min、 60min、 120min和 240min血糖值，并按梯形面积法如下式计算糖耐量曲线下面积（AUC ) ：

n-l Q + C

AUC (mmol-h/L) = J ¹ ^ ⁱ⁺¹ · At

式中， C为血糖值（mmol/L) ， t为葡萄糖负荷后时间（h) ， i为血糖值序号；

C。、 d、 C₂、 C₃、 C₄分别为葡萄糖负荷前（Omin)及葡萄糖负荷后 30min、 60min、 120min和 240min的血糖值。

C. 复方海参制剂对胰岛素抵抗 HepG₂细胞模型的作用：

C-1.细胞株

人肝癌细胞株 HepG₂由大连医科大学提供，接种于含 10%体积分数胎牛血清的 DMEM培养基中 (补充青霉素、链霉素各 lOO Ui—¹ ) ,置于 37 °C含有 5% C0₂ 的细胞培养箱中培养。 HepG₂细胞呈贴壁生长，采用 0.25%胰酶进行消化，每 3 d传代 1次，取对数生长期的细胞用于实验。

C-2.溶液的配置

海参 N粉溶液的配置：用 DMEM培养液溶解，配成浓度为 1600mg/ L的母液, 再根据具体情况将此母液等比稀释成所需的浓度。

二甲双胍溶液的配置：用 DMEM培养液溶解，浓度为 30mg/L。

C-3.胰岛素抵抗 HepG₂细胞模型的建立

用 0.25%胰酶消化单层培养 HepG₂细胞，以含 10%胎牛血清的 DMEM培养液制成单个细胞悬液，调整细胞浓度至 Sx l O^ml ¹,每孔总量 20(^L接种于 96孔细胞培养板。于培养箱 37 °C， 5% C0₂ 条件下孵育 8 h，使之形成单层贴壁细胞。以不含胎牛血清的 DMEM培养液洗涤细胞 2 次后，用含有 S x l O^mol ¹胰岛素的培养液于 37 °C , 5% C0₂ 培养箱中孵育细胞 16 ho 此以含胰岛素培养液孵育 16h的 HepG₂细胞即为模型细胞。

C-4.分组、给药及指标测定

将制备好的细胞悬液计数,调整细胞浓度至 5χ 10⁴·ηιΐ 接种于 96孔细胞培养板,每组设 8个复孔，每孔总量 200μΙ^。实验分 5组:正常对照组、胰岛素抵抗模型组、复方海参制剂高、低剂量组和二甲双胍阳性对照组。除正常对照组外,其余各组在培养液中加入终浓度为 Sx lO^moH ¹胰岛素后孵育 16 h以造成胰岛素抵抗模型。造模后细胞换不含胰岛素的培养液孵育，各给药组分别以终浓度为复方海参制剂 2.5g_lA 复方海参制剂 5.0g_lA 二甲双胍 30 mg ¹的培养液孵育。给药 24 h后，用葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖,以未接种细胞空白复孔的糖含

% K

量均值相减,计算各孔细胞的葡萄糖消耗量。用 GPO-POD酶法测定培养液中甘油的含量，以未接种细胞空白复孔的甘油含量均值相减,计算各孔细胞的甘油消耗

C-5. MTT法测定药物对细胞增殖的影响

将 Sg.L 的 MTT原液与无血清 DMEM培养液按体积 1 :9配成 MTT培养液，待细胞葡萄糖消耗试验和甘油消耗实验结束待测培养液移出后,每孔加入 MTT培养液， 37 °C继续培养， 4h后终止培养,并小心吸弃孔内的培养上清液，每孔加 200 L 二甲基亚砜,震荡 10min，使结晶物充分溶解，于波长 570nm下，在酶标仪中测定各孔的吸光度值，计算细胞的存活％以评价药物对细胞增殖的影响。 ¾体药

后重天

D. 结果：

D-1 复方海参制剂对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠空腹血糖的影响

表 3 复方海参制剂对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠空腹血糖的影响

(n=10， x± s )

空腹血糖（FPG， mmol/L)

药后 7天药后 14天药后 21天 ί后 28天

IT夂 At IT夂 At IT夂/ α

降低降低降低降低

FPG FPG FPG FPG

% % % % g

7.18± 6.91± 7.19± 7.35± 38.12 空白对照组

0.74 0.83 0.58 0.62 ±1.70 24.01 29.65 30.05 30.16 25.64 高血糖模型

±3.02 ±2.07 ±2.07 ±2.40 ±4.10 组 Δ Δ Δ Δ Δ

18.80 24.59 21.18 20.72 31.76 二甲双胍 21.7 29.5 31.3

±2.77 ±4.17 ±3.12 ±3.03 ±1.74 200mg/kg % % % 23.62

复方海参制 21.54 10.3 26.79 21.4 28.6

9.6% ±2.86

齐 IJ 0.5g/kg ±3.58 % ±2.21 % % 复方海参制

剂 0.25g/kg

注：与高血糖模型组相比 *p<0.05， **p<0.01，与空白对照组相比 ^Δρ<0.01

D-2复方海参制剂对卜 O四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠糖耐量的影响

表 4. 复方海参制剂对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠糖耐量的影响（n=10， x ± s) 糖负荷

糖负荷后血糖（mmol/L)

空腹血曲线下糖面积

AUC降

低⁰ /₀ mmol/L 30min 60min 120min 240min

) mmol-h/

L)

空白对照 7.35±0. 20.40±2 19.22±4 10.37±2 6.86±0. 48.87±7

组 62 .42 .08 .31 46 .00

高血糖模 30.16±2 33.30±0 33.30±0 33.30±0 30.47±2 129.59士

型组 ·40^Δ .00 .00 .00 .31 2.57^Δ

二甲双胍 20.72±3 31.68±2 31.19±3 27.43±4 20.49±2 106.05士

18.2% 200mg/kg .03** .78 .42 .37 .58 12.0**

复方海参 33.30±0

21.54±3 33.30±0 30.59±3 20.94±3 113.84±

制剂 .00 12.2%

•43** .00 .37 .68 7.73**

0.5g/kg j ra

复方海参

25.00±4 33.30±0 33. _{Λ Λ} 3.25±0 28.63±1 126.38士

制剂 2.5%

.00 .16 .98 2.42

0-25g/kg

注：与高血糖模型组相比 *p〈0. 05， **p〈0. 01，与空白对照组相比 ^Δρ〈0. 01

D-3 复方海参制剂对胰岛素抵抗 HepG₂细胞葡萄糖消耗量及甘油消耗量的影响: 见表 5、 6：

表 5 复方海参制剂对体外胰岛素抵抗 HepG₂细胞糖消耗量及甘油消耗量影响葡萄糖消

葡萄糖消耗量甘油消耗量甘油消耗组别耗

(mmol/L) (mmol/L)

增加％

空白对照组 3.60±0.27 0.51±0.05

模型组 1.32±0.13 ^A 0.15±0.01 ^A

二甲双胍

2.83±0.14** 115.10% 0.39±0.02** 165.97%

30mg/L

复方海参制剂

2.59±0.15** 96.60% 0.38±0.02** 162.82%

2.5g/L 2.82±0.15** 114.24% 0.39±0.02** 167.02% 注：与模型组相比 *p<0.05， **p<0.01 ; 与空白对照组相比 ^Ap<0.01 表 6复方海参制剂对体外胰岛素抵抗 11 0₂细胞增殖的影响组别细胞存活％细胞增长％

空白对照组 100±0

模型组 98.72±1.37^A -1.28% 二甲双胍 30mg/L 100.28±1.93^Δ 0.28%

复方海参制剂 2.5g/L 104.17±6.78^Δ 4.17%

复方海参制剂 5.0g/L 105.96±5.80* 5.96%

注：与模型组相比 *ρ〈0. 05， ^Δρ〉0. 05，与空白对照组相比 ^Αρ〉0. 05 由表 5和表 6可知，复方海参制剂在浓度为 2. 5g/L和 5. Og/L时可使胰岛素抵抗 11印^细胞的葡萄糖消耗量分别增加 96. 6%和 114. 2% (p〈0. 01 ) ，甘油消耗量分别增加 162%和 167% (p〈0. 01 )。在此浓度时，细胞增殖仅为 4%_6%，故可认为，上述葡萄糖及甘油消耗量的增加不是由于细胞的增殖所致，而主要是复方海参制剂中活性成分对糖代谢生化过程的直接影响所致。

Claims

权利要求书

1、一种复方海参制剂，其特征在于主要由 99~70wt%纳米海参提取物和 l~30wt%三七总皂甙提取物组成；产品为一种灰白色或浅棕或棕色粉末，海参多糖含量为 2.5~8.0wt%，三七总皂甙含量为 0.3~21.0wt%_;

所述纳米海参提取物是按如下步骤提取：

( 1 ) 原料处理：将剪开、清洗干净鲜活海参或水发海参置于密闭容器中；

(2 ) 加热胶化：温度为 70〜130°C，胶化 lmii！〜 20h;

(3 ) 冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，至水分小于 10wt%；

(4)粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎， l〜20min得到细度为 10〜300 目不等的海参粉；

( 5 ) 超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，粉碎细度为 100〜3000目的海参超微粉；

( 6 ) 纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为 4〜20h，细度可达到 10〜1000nm;

(7 ) 酶解及分离：纳米海参粉与水以 1 : 3〜10质量比加水溶解，按纳米海参粉：蛋白酶为 lg: 0.1〜1010mg的比例加入蛋白酶在相应的 pH值下于 40〜70°C 进行 l〜5h的酶解，而后加温灭酶， 0〜10°C高速离心，取上清液进行干燥处理，即得纳米海参粉提取物；

( 8 ) 纳米海参提取物与三七总皂甙提取物按照纳米海参提取物：三七总皂甙提取物为 99~70wt%： l~30wt%的比例进行混合。

2、根据权利要求 1所述复方海参制剂，其特征在于制品为含有纳米海参提取物和三七总皂甙提取物的胶囊、片剂和冲剂。

3、根据权利要求 1所述复方海参制剂，其特征在于所述鲜活海参或水发海参品种为海刺参或叶瓜参；所述水发海参为干海参、半干海参或盐渍海参。

4、如权利要求 1所述复方海参制剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：

( 1 ) 原料处理：将剪开、分清洗干净鲜活海参或水发海参置于密闭容器中；

(2 ) 加热胶化：温度为 70〜130°C，胶化 lmii！〜 20h;

(4) 粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎， l〜20min得到细度为 10〜 300目不等的海参粉； ( 5 ) 超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，粉碎细度为 100〜3000目的海参超微粉；

5、根据权利要求 4所述复方海参制剂的制备方法，其特征在于步骤（1 ) 中的鲜活海参或水发海参品种为海刺参或叶瓜参；所述水发海参为干海参、半干海参或盐渍海参进行水发或脱盐水发而成。

6、根据权利要求 4所述复方海参制剂的制备方法，其特征在于步骤（2 ) 加热胶化为： 100〜105°C， lho

7、根据权利要求 4所述复方海参制剂的制备方法，其特征在于步骤（3 ) 冷冻干燥至水分小于 3%。

8、根据权利要求 4所述复方海参制剂的制备方法，其特征在于步骤（7 ) 酶解及分离中酶解所选用的蛋白酶为菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，风味蛋白酶，胰蛋白酶中 1~3种酶解。

9、根据权利要求 4所述复方海参制剂的制备方法，其特征在于步骤（7 ) 酶解及分离为：

纳米海参粉末与水按照 1 : 7的质量比例进行混匀，用碱性蛋白酶 Acalase与胰酶进行双酶解：酶解温度为 40〜70°C，先将 pH调为 7〜8，按照纳米海参粉末与酶的质量比为 1克： 0.1〜10mg加入碱性蛋白酶 Acalase,进行酶解 0.1h〜5h后，将 pH调节到 8〜10，按照纳米海参粉末与酶的质量比为 1克： 10mg〜1000mg加入胰蛋白酶进行 2次酶解 0.1〜5h ，酶解温度为 40〜70°C，酶反应结束后灭酶，后将酶解产物进行过滤离心分离，取酶解上清液进行干燥处理，得纳米海参粉提取