WO2012057333A1 - 低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法及び測定用キット - Google Patents

低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法及び測定用キット Download PDF

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WO2012057333A1
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cholesterol
polyoxyethylene
hlb
ether
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PCT/JP2011/074965
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今井敏博
濱隆志
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アークレイ株式会社
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    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring cholesterol in a low density lipoprotein (hereinafter referred to as “LDL”) and a measurement kit.
  • LDL low density lipoprotein
  • LDL is a lipoprotein that plays a role in transporting cholesterol synthesized in the liver to peripheral tissues.
  • Cholesterol in LDL (hereinafter also referred to as “LDL cholesterol”) is known to be one of the causative agents of arteriosclerosis. For this reason, the amount of LDL cholesterol has been added since April 2008 as an inspection item for health examination based on the Industrial Safety and Health Act.
  • LDL As a method for measuring LDL cholesterol, for example, by ultracentrifugation, LDL is also called other lipoprotein (for example, high density lipoprotein (hereinafter also referred to as “HDL”), very low density lipoprotein (hereinafter also referred to as “VLDL”). ) And the like, and then a method of measuring only LDL cholesterol using an enzyme, a method of separating LDL by electrophoresis, staining a lipid, and measuring its color intensity, etc. However, these methods are available. Since the method is complicated in operation and it is difficult to process a large number of specimens, it is difficult to use the method in clinical examinations.
  • HDL high density lipoprotein
  • VLDL very low density lipoprotein
  • Patent Document 1 there is a method of measuring LDL cholesterol by increasing the specificity of the enzyme for LDL cholesterol with cyclodextrin and a surfactant.
  • Patent Document 2 As an erasing method, a method in which cholesterol derived from lipoproteins other than LDL is preferentially enzymatically reacted with a polyanion and a divalent metal ion, and then LDL cholesterol is measured (patent document 2).
  • Patent Document 3 There is a method in which LDL cholesterol is measured after enzymatic reaction of cholesterol derived from lipoproteins other than LDL in a state in which a soluble complex is formed by binding to.
  • Patent Document 4 There is a method of measuring LDL cholesterol after enzymatic reaction of cholesterol derived from lipoproteins other than LDL in a buffer containing amine.
  • the present invention provides a new method capable of measuring LDL cholesterol and a kit used for the measurement.
  • the present invention is a process in which a surfactant A1, a surfactant B1, and a surfactant B2 are present in a reaction solution containing a sample subjected to high-density lipoprotein elimination treatment, and cholesterol in low-density lipoprotein is enzymatically reacted.
  • a method for measuring cholesterol in a low-density lipoprotein in a sample comprising (I), wherein the surfactant A1 is a polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.5 or less, and the interface
  • the activator B1 is a polyoxyethylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.6 or more, a polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 12.7 or more and 14.5 or less, and an HLB of 12.0 or more and 14.5 or less.
  • At least one selected from the group consisting of polyoxyethylene styrenated phenyl ether B2 is at least one selected from the group consisting of polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene myristyl ether, and polyoxyethylene (35-40) octylphenyl ether having an HLB of 16.9 or more.
  • the present invention relates to a method for measuring cholesterol.
  • the present invention is a kit used for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, wherein the surfactant A1 is a polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.5 or less, and the HLB is 12 .6 or more polyoxyethylene polycyclic phenyl ether, HLB 12.7 to 14.5 polyoxyethylene distyrenated phenyl ether, and HLB 12.0 to 14.5 polyoxyethylene styrenated phenyl ether
  • a surfactant B1 which is at least one selected from the group consisting of polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene myristyl ether and polyoxyethylene (35-40) octylphenyl ether having an HLB of 16.9 or more At least one selected from the group That relates to a kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein containing a surfactant B2.
  • a new method for measuring LDL cholesterol can be provided.
  • FIG. 1 is a graph showing an example of the result of Reference Example 1.
  • 2A and 2B are graphs showing an example of the result of Reference Example 3.
  • FIG. 3A and 3B are graphs showing an example of the result of Reference Example 4.
  • 4A and 4B are graphs showing an example of the result of Example 1.
  • FIG. 5A to 5C are graphs showing an example of the result of Example 2.
  • FIG. 6A and 6B are graphs showing an example of the correlation between the measured value of Example 3 and the measured value of the conventional method.
  • the present invention is a sample containing at least LDL and VLDL in the presence of the above-mentioned surfactant A1, surfactant B1 and surfactant B2, preferably LDL, VLDL and chylomicron (hereinafter also referred to as “CM”). It is based on the knowledge that LDL cholesterol can be measured because an enzyme reaction can be performed selectively on a sample containing, more preferably a biological sample subjected to HDL elimination treatment.
  • the surfactant B1 selectively solubilizes LDL in the presence of the surfactant A1
  • the surfactant B2 in the presence of the surfactant A1 and the surfactant B1 is a liposome other than LDL such as VLDL and CM.
  • LDL cholesterol can be selectively enzymatically reacted.
  • the present invention is not limited to this mechanism.
  • the present invention [1] A sample comprising a step (I) in which a surfactant A1, a surfactant B1, and a surfactant B2 are present in a reaction solution containing a sample subjected to HDL erasing treatment, and the cholesterol in LDL is enzymatically reacted.
  • a method for measuring cholesterol in a low density lipoprotein wherein the surfactant A1 is a polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.5 or less, and the surfactant B1 is an HLB 12.6 or more polyoxyethylene polycyclic phenyl ether, HLB 12.7 to 14.5 polyoxyethylene distyrenated phenyl ether, and HLB 12.0 to 14.5 polyoxyethylene styrenated phenyl ether
  • the surfactant B2 is at least one selected from the group consisting of ethers, and the surfactant B2 is a polymer having an HLB of 16.9 or more.
  • Alkoxy polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene myristyl ether, and polyoxyethylene (35-40) method for measuring cholesterol in at least one is a low-density lipoprotein is selected from the group consisting of octyl phenyl ether;
  • the HDL erasing treatment includes mixing the surfactant A1, the surfactant A2, and the sample to cause an enzyme reaction of cholesterol in the HDL in the sample, and the surfactant A2 is an HLB.
  • the surfactant B2 and the surfactant B3 are present, and the cholesterol in LDL is enzymatically reacted, and the surfactant B3 is at least one of polyoxyethylene alkyl ether sulfate salt and alkylbenzene sulfonate salt.
  • a method for measuring cholesterol in lipoproteins comprising a surfactant A1 which is a polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.5 or less, and a polyoxyethylene polycycle having an HLB of 12.6 or more At least one selected from the group consisting of phenyl ether, polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 12.7 to 14.5, and polyoxyethylene styrenated phenyl ether having an HLB of 12.0 to 14.5 And at least one selected from the group consisting of polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene myristyl ether and polyoxyethylene (35-40) octylphenyl ether having an HLB of 16.9 or more.
  • a surfactant A1 which is a polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.5 or less, and a polyoxyethylene polycycle having an HLB of 12.6 or more
  • Low density lipotamper containing certain surfactant B2 Kit for cholesterol measurement in quality [7] The low surfactant according to [6], further comprising a surfactant A2 which is at least one selected from the group consisting of polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 18.0 or more and polyoxyethylene myristyl ether Kit for measuring cholesterol in density lipoprotein; [8] The kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to [6] or [7], further comprising a surfactant B3 which is at least one of polyoxyethylene alkyl ether sulfate and alkylbenzene sulfonate; [9] The kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to any one of [6] to [8], further comprising a reagent for measuring cholesterol; [10] The kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to [9], wherein the reagent for measuring cholesterol comprises cholesterol dehydrogenase and cholesterol esterase;
  • low density lipoprotein includes both LDL in a broad sense having a specific gravity of 1.006 to 1.063 and LDL in a narrow sense having a specific gravity of 1.019 to 1.063.
  • high density lipoprotein refers to a lipoprotein having a specific gravity of 1.063 to 1.21.
  • examples of the sample include biological samples, and specifically include body fluids and body components of humans and mammals other than humans.
  • body fluids and body components include, but are not limited to, whole blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, saliva, urine, sweat, amniotic fluid, pancreatic juice, tears, mucous membranes, etc., among which whole blood, plasma, Serum is preferred.
  • the sample may be used as it is, diluted and used, or may be separated by centrifugation or the like.
  • the “sample subjected to high density lipoprotein (HDL) elimination treatment” refers to a sample from which HDL and / or cholesterol derived from HDL (hereinafter also referred to as “HDL cholesterol”) has been eliminated. Without limitation, it can include, for example, samples from which HDL and / or HDL cholesterol have been removed or degraded.
  • the removal includes, but is not particularly limited to, removal by enzymatic reaction, and the like, for example, includes liberating cholesterol from HDL and oxidizing / reducing the liberated cholesterol to generate cholesteinone by enzymatic reaction.
  • the sample subjected to the HDL erasing treatment is preferably a sample in which the surfactant A1 and the surfactant A2 are mixed with the sample to dissolve HDL in the sample and the HDL cholesterol is reacted with the enzyme.
  • the sample subjected to the HDL erasing treatment preferably contains surfactant A1 and surfactant A2, more preferably surfactant A1 and surfactant A2, and LDL and / or LDL cholesterol.
  • the sample subjected to the HDL erasing treatment does not substantially contain HDL and / or HDL cholesterol.
  • substantially free of HDL and / or HDL cholesterol means that the amount of HDL and / or HDL cholesterol contained in the sample subjected to HDL elimination treatment does not affect the measurement of cholesterol in LDL by the measurement method of the present invention. It is said to be a range.
  • enzyme reaction of LDL cholesterol includes, for example, contacting cholesterol with an enzyme for measuring cholesterol, and preferably including contacting an enzyme for measuring cholesterol and a color former with cholesterol.
  • HLB hydrophilic lipophilic balance
  • HLB a value described in a catalog or the like of a surfactant manufacturer can be used.
  • Surfactant A1 is a polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.5 or less.
  • the HLB of polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether is 12.5 or less from the viewpoint of more selectively solubilizing HDL among lipoproteins present in human blood, and is not limited to 12.3 to 12. It is preferably 5 or less, more preferably about 12.5.
  • Examples of the polycyclic phenyl in the polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether include, but are not limited to, for example, a phenyl group substituted at two or more positions by a substituent having one aromatic ring, and a substitution having two or more aromatic rings Examples thereof include a phenyl group substituted at one or more positions with a group.
  • Examples of the substituent having one aromatic ring include, but are not limited to, benzyl, 1- (phenyl) ethyl, and the like.
  • Examples of the substituent having two or more aromatic rings include, but are not limited to, naphthyl and the like.
  • polyoxyalkylene in the polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether examples include, but are not limited to, for example, polyoxyethylene, polyoxypropylene, polyoxybutylene, and the like, and among them, different polyoxyalkylenes are polymerized. More preferably, polyoxyethylene and polyoxypropylene are polymerized. For this reason, the polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether is preferably polyoxyethylene polyoxypropylene polycyclic phenyl ether.
  • the polymerization mode of polyoxyethylene and polyoxypropylene is not particularly limited, and may be, for example, block polymerization or random polymerization.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.5 or less include, but are not limited to, New Coal 2608F (trade name, HLB: 12.5, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), New Co., Ltd. Cole 707F (trade name, HLB: 12.5, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.) and the like.
  • Surfactant B1 is a polyoxyethylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.6 or more, a polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 12.7 or more and 14.5 or less, and an HLB of 12.0 or more and 14.5. It is selected from the group consisting of the following polyoxyethylene styrenated phenyl ethers. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the HLB of polyoxyethylene polycyclic phenyl ether is 12.6 or more, and in the presence of the surfactant A1, the LDL solubilization ability is higher than VLDL and CM, and more selectively. From the viewpoint of solubilizing LDL, it is preferably 12.6 to 13.6, more preferably 12.6 to 13.3, still more preferably 12.6 to 13.2, and even more preferably about 12.6. It is.
  • Examples of the polycyclic phenyl in the polyoxyethylene polycyclic phenyl ether include, but are not limited to, for example, a phenyl group substituted at two or more positions by a substituent having one aromatic ring, and a substitution having two or more aromatic rings Examples thereof include a phenyl group substituted at one or more positions with a group.
  • Examples of the substituent having one aromatic ring include, but are not limited to, benzyl, 1- (phenyl) ethyl, and the like.
  • Examples of the substituent having two or more aromatic rings include, but are not limited to, naphthyl and the like.
  • polyoxyalkylene in the polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether examples include, but are not limited to, for example, polyoxyethylene, polyoxypropylene, polyoxybutylene, and the like, and among them, different polyoxyalkylenes are polymerized. More preferably, polyoxyethylene and polyoxypropylene are polymerized. For this reason, the polyoxyalkylene polycyclic phenyl ether is preferably polyoxyethylene polyoxypropylene polycyclic phenyl ether.
  • the polymerization mode of polyoxyethylene and polyoxypropylene is not particularly limited, and may be, for example, block polymerization or random polymerization.
  • polyoxyethylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.6 or more examples include, but are not limited to, New Coal 2609 (trade name, HLB: 12.6, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), New Coal 2614 (Product) Name, HLB: 14.7, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), New Coal 610 (trade name, HLB: 13.8, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), and the like.
  • the HLB of polyoxyethylene distyrenated phenyl ether is 12.7 or more and 14.5 or less, and the solubilizing ability of LDL is higher than VLDL and CM in the presence of surfactant A1. From the viewpoint of more selective solubilization of LDL, it is preferably about 12.8.
  • polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 12.7 or more and 14.5 or less include, but are not limited to, Emulgen A60 (product name, HLB: 12.8, manufactured by Kao Corporation), Emulgen A90 (product name, HKB: 14.5, manufactured by Kao Corporation) and the like.
  • the HLB of the polyoxyethylene styrenated phenyl ether is 12.0 or more and 14.5 or less, and the LDL solubilization ability is high in the presence of the surfactant A1 as compared with VLDL and CM. From the viewpoint of more selective solubilization of LDL, it is preferably about 12.7.
  • polyoxyethylene styrenated phenyl ether having an HLB of 12.0 or more and 14.5 or less include Braunon TSP16 (trade name, HLB: 12.7, manufactured by Aoki Yushi Co., Ltd.).
  • Surfactant B2 is selected from the group consisting of polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene myristyl ether and polyoxyethylene (35-40) octyl phenyl ether having an HLB of 16.9 or more. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the HLB of polyoxyethylene lauryl ether polyoxyethylene is 16.9 or more, which inhibits the solubilization of VLDL and CM in the presence of the surfactant A1 and the surfactant B1, and is more selective. From the point of solubilizing LDL, it is preferably 16.9 to 18.4, more preferably 16.9 to 18.1, more preferably 16.9 to 17.9, and even more preferably about 16. Nine.
  • the degree of polymerization of polyoxyethylene lauryl ether polyoxyethylene having an HLB of 16.9 or more is not particularly limited, but is, for example, 23 to 50, preferably 23 to 30.
  • polyoxyethylene lauryl ether polyoxyethylene having an HLB of 16.9 or more include, but are not limited to, Emulgen 123P (product name, HLB: 16.9, manufactured by Kao Corporation), Emulgen 130K (product name) HLB: 18.1, manufactured by Kao Corporation), Emulgen 150 (product name, HLB: 18.4, manufactured by Kao Corporation), and the like.
  • polyethylene myristyl ether for example, polyethylene myristyl ether having an HLB of 18.9 can be used.
  • polyoxyethylene myristyl ether include, but are not limited to, Emulgen 4085 (trade name, HLB18.9, manufactured by Kao Corporation) and the like.
  • polyoxyethylene octyl phenyl ethers the average degree of polymerization of polyoxyethylene inhibits solubilization of VLDL and CM in the presence of surfactant A1 and surfactant B1, and more selectively solubilizes LDL. From 35 to 40, preferably about 40.
  • Specific examples of polyoxyethylene (35-40) octylphenyl ether include, but are not limited to, Triton (registered trademark) X-405 (trade name, degree of polymerization: 40, manufactured by Nacalai Tesque). .
  • Surfactant B3 is at least one of a polyoxyethylene alkyl ether sulfate ester salt and an alkylbenzene sulfonate salt. These may be used alone or in combination of two or more. Examples of the salt include, but are not limited to, ammonium salt, lithium salt, sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt and the like.
  • the solubilization rate of LDL by the surfactant B1 is promoted, for example, 1-10.
  • the polyoxyethylene alkyl ether sulfate ester salt include, but are not limited to, sodium polyoxyethylene lauryl ether sulfate and the like.
  • polyoxyethylene alkyl ether sulfate salts include, but are not limited to, EMAL 20C (trade name, manufactured by Kao Corporation), New Coal 2308SF (trade name, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), New Coal 2320SN (Product) Name, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.).
  • alkyl benzene sulfonate examples include, but are not limited to, sodium dodecyl (lauryl) benzene sulfate (manufactured by Nacalai Co., Ltd.) and the like.
  • Surfactant A2 is selected from the group consisting of polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 18.0 or more, polyoxyethylene lauryl ether having a HLB of 16.9 or more, and polyoxyethylene myristyl ether. These may be used alone or in combination of two or more.
  • HLB of polyoxyethylene distyrenated phenyl ether is 18.0 or more, preferably from the viewpoint of inhibiting solubilization of lipoproteins other than HDL contained in the sample by surfactant A1. It is 18.0 to 19.0, more preferably about 18.0.
  • Specific examples of polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 18.0 or more include, but are not limited to, Emulgen A500 (product name, HLB: 18.0, manufactured by Kao Corporation) and the like.
  • the polyoxyethylene lauryl ether polyoxyethylene has an HLB of 16.9 or more, preferably from the viewpoint of inhibiting the solubilization of lipoproteins other than HDL contained in the sample by the surfactant A1. 16.9 to 18.4, more preferably 16.9 to 18.1, still more preferably 16.9 to 17.9, and even more preferably about 16.9.
  • the degree of polymerization of polyoxyethylene lauryl ether polyoxyethylene having an HLB of 16.9 or more is, for example, 23 to 50 from the viewpoint of inhibiting solubilization of lipoproteins other than HDL contained in the sample by the surfactant A1. Preferably, it is 23-30.
  • polyoxyethylene lauryl ether polyoxyethylene having an HLB of 16.9 or more include, but are not limited to, Emulgen 123P (product name, HLB: 16.9, manufactured by Kao Corporation), Emulgen 130K (product name) HLB: 18.1, manufactured by Kao Corporation), Emulgen 150 (product name, HLB: 18.4, manufactured by Kao Corporation), and the like.
  • Polyoxyethylene myristyl ether is not limited to these.
  • polyethylene myristyl ether having an HLB of 18.9 can be used.
  • Specific examples of polyoxyethylene myristyl ether include, but are not limited to, Emulgen 4085 (trade name, HLB18.9, manufactured by Kao Corporation) and the like.
  • the reagent for measuring cholesterol is a reagent used for measuring cholesterol and includes an enzyme for measuring cholesterol.
  • the enzyme for measuring cholesterol refers to an enzyme used for measuring cholesterol, and includes, but is not limited to, cholesterol dehydrogenase, cholesterol ester hydrolase, and coenzyme.
  • known enzymes can be used as the enzyme for measuring cholesterol.
  • the cholesterol measuring enzyme is preferably used in combination with cholesterol dehydrogenase, cholesterol ester hydrolase and coenzyme.
  • the origin of cholesterol dehydrogenase and cholesterol ester hydrolyzing is not particularly limited, and may be derived from, for example, a microorganism, an animal or a plant, or may be produced by genetic manipulation. Further, it may be chemically modified.
  • the cholesterol hydrolase may be any enzyme capable of hydrolyzing cholesterol ester, and is not limited to these, and examples thereof include cholesterol esterase and lipoprotein lipase. Among them, cholesterol esterase is preferable. A commercially available cholesterol esterase may be used, and its origin is not particularly limited. In the present invention, two or more kinds of cholesterol hydrolases may be used in combination.
  • oxidized coenzyme examples include, but are not limited to, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), thio NAD, thio NADP, and the like.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • thio NAD thio NADP
  • the cholesterol measurement reagent may further contain, for example, a reduced color former in addition to the cholesterol measurement enzyme.
  • a reduced color former for example, one that forms a dye by the action of diaphorase can be used.
  • Examples of reduced color formers include tetrazolium compounds.
  • Examples of tetrazolium compounds include, but are not limited to, 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), 2- (4-iodophenyl)- 3- (4-Nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt (WST-1), 2- (4-iodophenyl) -3- (2,4-dinitro Phenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt (WST-3).
  • the LDL cholesterol measuring method of the first aspect In the LDL cholesterol measurement method of the present invention, as a first aspect, the surfactant A1, the surfactant B1, and the surfactant B2 are present in the reaction solution containing the sample subjected to the HDL elimination treatment, and cholesterol in LDL is present. Step (I). Hereinafter, the LDL cholesterol measuring method of the first aspect will be described.
  • step (I) surfactant A1, surfactant B1, and surfactant B2 are present in the reaction solution containing the sample subjected to the HDL erasing treatment, and cholesterol in LDL is reacted with the enzyme in the sample. Cholesterol is measured in LDL.
  • HDL erasing treatment uses a sample that has been subjected to HDL erasing.
  • examples of the HDL erasing treatment include a method in which surfactant A1 and surfactant A2 are mixed with a sample, HDL in the sample is dissolved, and HDL-derived cholesterol is enzymatically reacted.
  • the concentration of the surfactant B1 in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 0.44 to 0.97% by weight, and compared with VLDL and CM in the presence of the surfactant A1 when used alone. In view of high LDL solubilization ability and more selective solubilization of LDL, it is preferably 0.62 to 0.79% by weight.
  • the concentration of the surfactant B2 in the reaction solution is not particularly limited, and is, for example, 0.01 to 0.04% by weight. Solubilization of VLDL and CM in the presence of the surfactant A1 and the surfactant B1 From the point of inhibiting LDL and solubilizing LDL more selectively, it is preferably 0.018 to 0.03% by weight.
  • the weight percent ratio (B1: B2) between the surfactant B1 and the surfactant B2 in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 44: 1 to 97: 4, preferably 31: 1 to 79: 3.
  • Step (I) includes adding surfactant A1, surfactant B1, and surfactant B2 to a reaction solution containing a sample in which HDL is solubilized and HDL-derived cholesterol is erased. May be.
  • the sample subjected to the HDL erasing treatment contains the same surfactant as the surfactant A1, the surfactant contained in the sample is used as the surfactant A1 without adding the surfactant A1.
  • the surfactant A1 may be further added in the step (I).
  • the surfactant contained in the sample is used as the surfactant B2 without adding the surfactant B2. It may be used, or surfactant B2 may be further added in step (I).
  • a reagent for measuring cholesterol may be added to the reaction solution.
  • the cholesterol measurement reagent can include, for example, cholesterol measurement enzymes such as cholesterol dehydrogenase and cholesterol hydrolase, coenzymes and reduced color formers, diaphorase, and the like.
  • cholesterol measurement enzymes such as cholesterol dehydrogenase and cholesterol hydrolase
  • coenzymes and reduced color formers such as cholesterol dehydrogenase and cholesterol hydrolase
  • diaphorase a reagent for measuring cholesterol
  • the reduced color former and diaphorase detection with visible light on the longer wavelength side becomes possible by the dye derived from the reduced color former generated by the reaction via the reduced coenzyme and diaphorase.
  • the concentration of cholesterol dehydrogenase is not particularly limited.
  • the rate of reaching the reaction end point is maximized. Therefore, it is preferably 2.9 to 4.35 U / mL.
  • the concentration of cholesterol hydrolase in the reaction solution is not particularly limited.
  • the concentration of cholesterol in the reaction solution is 0.012 mM, the reaction endpoint is 0.19 to 0.58 U / mL. From the point of reaching the maximum speed, it is preferably 0.29 to 0.58 U / mL.
  • the concentration of the coenzyme in the reaction solution is, for example, 0.29 to 0.97 mM, preferably 0.73 to 0.97 mM, accompanying the concentration range of the cholesterol dehydrogenase.
  • the concentration of diaphorase in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 1.74 to 4.35 U / mL, and preferably 2.9 to 4.35 U / mL.
  • the concentration with the reduced color former is, for example, 0.10 to 0.29 mM, preferably 0.19 to 0.29 mM.
  • the reaction in step (I) is preferably carried out in a buffer solution, for example, in order to maintain the buffer capacity in the reaction solution and maintain the target pH.
  • the buffer used in the buffer include Good's buffer, phosphate buffer, and Tris buffer.
  • Good buffers include, but are not limited to, for example, N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2 -Hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA), piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N -(2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO), 3-morpholino
  • the concentration may be a concentration that maintains the buffer capacity in the reaction solution and can maintain the target pH.
  • the pH in the reaction solution may be appropriately selected in consideration of the pH stability of the enzyme used and the optimal reaction. In this measurement method, for example, it is 6.5 to 10.0, preferably 7.5 to 8.0.
  • surfactant B3 is preferably added, and the enzyme reaction is preferably performed in the presence of surfactant A1, surfactant B1, surfactant B2, and surfactant B3.
  • concentration of the surfactant B3 in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 0.03 to 0.07% by weight, and is preferably 0.04 to 0.00 from the viewpoint of further promoting the solubilization of LDL. 06% by weight.
  • the reaction temperature in step (I) is not particularly limited, but the reaction temperature when measuring human blood components, particularly biochemical items, is usually about 37 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, it is, for example, 180 to 300 seconds.
  • LDL cholesterol in human blood can be sufficiently quantified even at a concentration near 500 mg / dL, and preferably 240 to 270 seconds.
  • LDL cholesterol can be measured, for example, by measuring the absorbance of the reaction solution.
  • the absorbance may be measured by measuring the absorbance of the dye produced by the hydrogen peroxide measuring reagent.
  • the sample, surfactant A1, surfactant A2, and cholesterol measurement reagent are mixed and the cholesterol in HDL in the sample is reacted enzymatically (i) And (ii) measuring the cholesterol in the LDL in the sample by causing the surfactant B1 and the surfactant B2 to be present in the reaction solution after the step (i) and causing the cholesterol in the LDL to undergo an enzyme reaction. Including.
  • LDL cholesterol can be measured by selectively reacting HDL cholesterol and LDL cholesterol in this order by the LDL cholesterol measurement method of this embodiment. That is, the surfactant A1 selectively solubilizes HDL as compared with lipoproteins other than HDL such as LDL, VLDL, and CM, and the surfactant A2 is dissolved in the presence of the HDL in the presence of the surfactant A1. In order to inhibit solubilization of other lipoproteins, HDL cholesterol can be selectively reacted with enzymes.
  • the surfactant B1 selectively solubilizes LDL in comparison with lipoproteins other than LDL such as VLDL and CM in the reaction solution after the reaction, and the surfactant B2
  • LDL cholesterol can be selectively reacted with enzymes.
  • surfactant A2 it is not necessary to add surfactant B2 newly in process (ii).
  • the present invention is not limited to this mechanism.
  • Step (i) First, in the step (i), the sample, the surfactant A1, the surfactant A2, and the cholesterol measurement reagent are mixed and the cholesterol in HDL in the sample is subjected to an enzyme reaction.
  • the order of mixing the sample, the surfactant A1, the surfactant A2, and the cholesterol measurement reagent is not particularly limited, and after mixing the sample and a part of the cholesterol measurement reagent in advance, the surfactant A1, the surfactant A2 and the remainder of the cholesterol measurement reagent may be added, or the sample, surfactant A1, surfactant A2, and cholesterol measurement reagent may be mixed simultaneously.
  • the concentration of the surfactant A1 in the reaction solution in the step (i) is not particularly limited, but is, for example, 0.22 to 0.30% by weight, and solubilizes HDL more selectively. In this respect, it is preferably 0.22 to 0.28% by weight.
  • the concentration of the surfactant A2 in the reaction solution is not particularly limited. For example, it is 0.02% by weight or more, and the lipoprotein other than HDL is suppressed while suppressing the influence of the surfactant A1 on the solubilization of HDL. From the standpoint of inhibiting solubilization, it is preferably 0.04 to 0.10% by weight, more preferably 0.06 to 0.09% by weight.
  • the weight ratio (A1: A2) between the surfactant A1 and the surfactant A2 in the reaction solution is not particularly limited, and is, for example, 11: 1 to 15: 1. Solubilization of HDL by the surfactant A1 In view of inhibiting solubilization of lipoproteins other than HDL and suppressing HDL more selectively, while suppressing the influence on HDL, the ratio is preferably 10: 2.4 to 10: 3.7.
  • the composition of the reagent for measuring cholesterol and the concentration of each component are the same as in the step of the first aspect.
  • the reaction in step (i) is preferably performed in a buffer solution in order to maintain the buffer capacity in the reaction solution and maintain the target pH, and the buffer and pH are the same as in the first embodiment. It is.
  • the reaction temperature in step (i) is not particularly limited, but the reaction temperature for measuring human blood components, particularly biochemical items, is usually about 37 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 200 to 270 seconds. In this reaction system, HDL cholesterol in human blood can be sufficiently eliminated even at a concentration near 150 mg / dL, and preferably 240 to 270 seconds.
  • step (ii) Next, in step (ii), surfactant B1 and surfactant B2 are present in the reaction solution after step (i), and the cholesterol in LDL is subjected to an enzymatic reaction to thereby convert cholesterol in LDL in the sample. taking measurement.
  • Step (ii) may include adding surfactant B1 and surfactant B2 to the reaction solution after step (i).
  • the surfactant B2 may be further added in the step (ii) or without further addition.
  • the surfactant A2 used in the step (i) may be used as it is as the surfactant B2.
  • the concentrations of the surfactants B1 and B2 in the reaction solution and the weight percent ratio of the surfactant B1 and the surfactant B2 are the same as in the step (I) of the first aspect.
  • the weight percentage (A1: B1: B2) of the surfactant A1, the surfactant B1, and the surfactant B2 in the reaction solution is not particularly limited, but for example, 19: 44: 1 to 25: 97: 4 Preferably, it is 19: 62: 2 to 23: 79: 3.
  • a cholesterol measurement reagent may be further added, or the cholesterol measurement reagent used in step (i) may be used as it is without further addition.
  • step (ii) it is preferable that surfactant B3 is further added to the reaction solution after step (i), and the enzyme reaction is performed in the presence of surfactant B1, surfactant B2, and surfactant B3.
  • surfactant B3 selective solubilization of LDL can be promoted, and more preferably, the influence of VLDL can be further suppressed.
  • concentration of surfactant B3 in the reaction solution is the same as in step (I) of the first aspect.
  • reaction temperature and reaction time in step (ii) are the same as in step (I) of the first aspect.
  • LDL cholesterol can be measured, for example, by measuring the absorbance of the reaction solution.
  • the absorbance may be measured by measuring the absorbance of the dye produced by the hydrogen peroxide measuring reagent.
  • the kit for measuring LDL cholesterol of the present invention is a kit used for measuring cholesterol in LDL, and comprises surfactant A1, surfactant B1, and surfactant B2 (hereinafter referred to as “this” Also referred to as “invention kit”).
  • the kit of the present invention can be used for the method for measuring LDL cholesterol of the present invention.
  • Surfactant A1, Surfactant B1 and Surfactant B2 are the same as in the LDL cholesterol measurement method of the present invention.
  • the kit of the present invention may contain a reagent for measuring cholesterol.
  • the cholesterol measurement reagent is the same as the LDL cholesterol measurement method of the present invention.
  • the kit of the present invention may contain a surfactant B3.
  • Surfactant B3 is the same as the LDL cholesterol measurement method of the present invention.
  • the kit of the present invention may contain a surfactant A2.
  • Surfactant A2 is the same as the LDL cholesterol measurement method of the present invention.
  • the kit of the present invention is a kit used for measuring cholesterol in LDL, and includes surfactant A1, surfactant A2, and surfactant B1.
  • the LDL cholesterol measurement kit of this embodiment may contain a surfactant B2, or may contain a surfactant B3 and a cholesterol measurement reagent.
  • Surfactant A1, Surfactant A2, Surfactant B1, Surfactant B2, Surfactant B3, and Cholesterol Measuring Reagent are the same as in the LDL cholesterol measuring method of the present invention.
  • kits of the present invention examples include a 2-reagent kit, a 3-reagent kit, a 4-reagent kit, and the like.
  • cholesterol dehydrogenase is preferably contained only in the first reagent.
  • the cholesterol esterase may be contained in at least one of the first reagent and the second reagent, and is preferably contained only in the second reagent.
  • the surfactants A1 and A2 are each contained only in the first reagent.
  • Surfactants B1, B2, and B3 are preferably included only in the second reagent.
  • cholesterol dehydrogenase and surfactants A1 and A2 are, for example, at least one of only the first reagent, the second reagent, and the first reagent as a combination of reagents that prioritizes the first reaction. May be included.
  • Cholesterol esterase may be contained in, for example, the first reagent, the second reagent, the third reagent, and at least one of them, and is preferably contained only in the reagent that prioritizes the second reaction.
  • Surfactants B1, B2, and B3 may be included in at least one of only the second reagent, the third reagent, and the third reagent, for example, as a combination of reagents that prioritizes the second reaction.
  • a preferable measurement kit is a measurement having a first reagent containing cholesterol dehydrogenase, a second reagent containing cholesterol esterase, surfactant A1 and surfactant A2, and a third reagent containing surfactant B1. Kit for use.
  • the kit of the present invention includes an instruction manual describing a method for measuring LDL cholesterol using the above reagent.
  • the kit of the present invention may also include a case where the instructions are provided on the web without the measurement kit of the present invention being included.
  • a reagent for measuring cholesterol, surfactant A1, surfactant A2, surfactant B1, and the like may be stored in a reagent pack.
  • the reagent pack is preferably in the form of a disposable cartridge, for example, and more preferably includes two or more types of tanks in which the reagent can be placed.
  • the kit of the present invention is preferably a reagent pack in which the first reagent, the second reagent, and the third reagent are arranged in separate tanks.
  • the reagent pack may further include, for example, a reaction tank, a specimen tank, a dispensing chip, an optical cell for reaction, a waste tank, and the like.
  • CHDH Cholesterol dehydrogenase (trade name: CHDH “Amano” 5, manufactured by Amano Enzyme)
  • Diaphorase Dihydrolipoamide dehydrogenase (trade name: Diaphorase I, manufactured by Unitika)
  • BES N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (manufactured by Dojin Chemical)
  • CE cholesterol esterase (trade name: COE-311, manufactured by Toyobo)
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (manufactured by Dojin Chemical)
  • BSA Bovine serum albumin (manufactured by Sigma)
  • NAD Nicotinamide adenine dinucleotide (made by Oriental Yeast)
  • LDL cholesterol in the sample was measured using Reagents 1-1 to 1-4 and Reagent 2 shown in Table 1 below.
  • VLDL and LDL collected from human serum by ultracentrifugation were added to human serum containing no lipoprotein and diluted 20-fold with reagent 1-3 (LDL concentration: 83 mg / dl, VLDL concentration: 61 mg / dL).
  • Reagent 1-1 (90 ⁇ L), Reagent 1-2 (30 ⁇ L) and Reagent 1-4 (15 ⁇ L) were sequentially added to 20 ⁇ L of the sample, and reacted at 37 ° C. for 240 seconds.
  • 15 ⁇ L of a reagent 2 containing a surfactant shown in Table 2 below was added, and the absorbance was measured using a general-purpose automatic analyzer (trade name: BioMagesty-8, manufactured by JEOL Ltd.) to obtain a measured LDL cholesterol value. .
  • the results are shown in Table 2 below.
  • the surfactant of reagent 2 is a polyoxyethylene polycyclic phenyl ether having an HLB of 12.6, a polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 12.8, or an HLB of 12.7.
  • polyoxyethylene styrenated phenyl ether was used, all of the obtained LDL measurement values had a small deviation from the assay value (83 mg / dl). Further, the deviation from the test value was also small (data not shown) even for the sample with a high LDL concentration (LDL concentration: 141 mg / dL).
  • Reagent 1-1, reagent 1-2, and reagent 1-4 were added to the sample in order and reacted at 37 ° C. for 240 seconds, and then a general-purpose automatic analyzer (trade name: BioMajesty-8, manufactured by JEOL Ltd.) was used. The absorbance was measured to obtain a measured value of HDL cholesterol. The result is shown in FIG. 2A.
  • LDL preparation collected from human serum by ultracentrifugation and concentrated to an appropriate concentration was added to physiological saline ( LDL concentration: 347 mg / dL) was used as a sample, and the same measurement as described above was performed except that LDL cholesterol measurement was performed. The result is shown in FIG. 2B.
  • FIG. 2A shows an example of the results of erasing HDL using various concentrations of surfactant A2 (final concentrations: 0, 0.02, 0.04, 0.06, and 0.11 wt%).
  • FIG. 2B is a graph showing an example of the results of the presence or absence of LDL solubilization using various concentrations of surfactant A2.
  • the vertical axis represents absorbance and the horizontal axis represents measurement time.
  • 2A and 2B 1 Pt. Means 9 seconds.
  • the sample containing HDL was treated with an enzyme in the presence of the surfactants A1 and A2, whereby most of the HDL contained in the sample was allowed to react with the enzyme and erased. Further, as shown in FIG.
  • the solubilization of LDL is sufficiently suppressed in the presence of the surfactants A1 and A2, and in particular, the addition concentration of the surfactant is 0.3% by weight (final concentration: 0.06% by weight). ), LDL solubilization could be more effectively suppressed.
  • FIGS. 3A and 3B are graphs showing an example of the result of erasing HDL in the presence of surfactants A1 and A2, and FIG. 3A is an example of the result using a sample containing HDL and TG.
  • FIG. 3B is an example of a result using a sample containing HDL and VLDL.
  • the vertical axis indicates the difference from the HDL measurement value obtained by the sample not containing TG or VLDL
  • the horizontal axis indicates the concentration of TG or VLDL.
  • FIGS. 3A and B when HDL was enzymatically reacted in the presence of surfactants A1 and A2, solubilization of TG and VLDL was sufficiently suppressed.
  • Example 1 Reagents 1-1 to 1-4 shown in Table 1 above and surfactant B1 (polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 12.8, trade name: Emulgen A60, manufactured by Kao Corporation, concentration 8% by weight ) And Reagent 2 (three types) containing a surfactant (any one) shown in Table 5 below, LDL cholesterol was measured. The results are shown in FIGS. 4A and 4B.
  • surfactant B1 polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 12.8, trade name: Emulgen A60, manufactured by Kao Corporation, concentration 8% by weight
  • Reagent 2 three types containing a surfactant (any one) shown in Table 5 below, LDL cholesterol was measured. The results are shown in FIGS. 4A and 4B.
  • LDL cholesterol was measured by the same method as in Reference Example 1.
  • the concentration of polyoxyethylene distyrenated phenyl ether having an HLB of 12.8 was 8% by weight (final concentration in the reaction system: 0.71% by weight).
  • the concentration of the surfactant shown in Table 5 below was 0% by weight, 0.1% by weight, 0.2% by weight or 0.4% by weight.
  • samples two types of samples were prepared: a sample containing only LDL (LDL concentration: 50 mg / dL) and a sample containing LDL and VLDL (LDL concentrations: 52 mg / dL, VLDL: 156 mg / dL).
  • FIG. 4A is a graph showing an example of a result using polyoxyethylene lauryl ether having an HLB of 16.9
  • FIG. 4B shows an example of a result using polyoxyethylene myristyl ether having an HLB of 18.9. It is a graph.
  • the vertical axis indicates absorbance
  • the horizontal axis indicates measurement time.
  • 1 Pt. Means 9 seconds.
  • the concentration of polyoxyethylene lauryl ether having an HLB of 16.9 or polyoxyethylene myristyl ether having an HLB of 18.9 is 0.2% by weight (final concentration in the reaction solution: 0. 018 wt%), the same behavior as the sample not containing VLDL (white squares in FIGS. 4A and 4B) was exhibited.
  • a similar tendency was obtained when polyoxyethylene (35-40) octylphenyl ether was used. For this reason, in the case of this condition, it was found that the optimum concentration of these surfactants was 0.2% by weight (final concentration in the reaction solution: 0.018% by weight).
  • Example 2 LDL cholesterol was measured in the same manner as in Reference Example 1 using the reagents 1-1 to 1-4 shown in Table 1 above and the reagent (Reagent 2) having the composition shown in Table 6 below. The results are shown in FIGS. 5A to 5C.
  • the concentration of the surfactant B3 is 0%, 0.30% by weight (final concentration in the reaction solution: 0.026% by weight) or 0.60% by weight (final concentration in the reaction solution: 0.053% by weight). %).
  • the sample is a sample having an LDL concentration of 51 mg / dL (VLDL concentration: 0 mg / dL), a sample having an LDL concentration of 136 mg / dL (VLDL concentration: 0 mg / dL), an LDL concentration of 49 mg / dL, and a VLDL concentration of A sample that was 156 mg / dL was used.
  • FIG. 5A is a graph showing an example of a result using a sample having an LDL concentration of 136 mg / dL
  • FIG. 5B is a graph showing an example of a result using a sample having an LDL concentration of 51 mg / dL
  • FIG. 5C is a graph showing an example of results obtained using a sample with an LDL concentration of 49 mg / dL and a VLDL concentration of 156 mg / dL.
  • the vertical axis represents absorbance
  • the horizontal axis represents measurement time
  • 1 Pt Means 9 seconds.
  • LDL cholesterol can be selectively and efficiently measured by carrying out an enzyme reaction in the presence of surfactant A1, surfactant B1, surfactant B2 and surfactant B3.
  • Example 3 LDL cholesterol was measured in the same manner as in Reference Example 1 except that the reagents 1-1 to 1-4 and reagent 2 shown in Table 7 below were used, and a routine test sample was used as a sample. The measured value of the reagent for measuring cholesterol was compared. The results are shown in FIGS. 6A and B.
  • Determiner LDL trade name, manufactured by Kyowa Medex
  • Coretest LDL trade name, manufactured by Sekisui Medical
  • FIG. 6A is a graph showing an example of correlation with Determiner LDL (trade name, manufactured by Kyowa Medex), and FIG. 6B is a graph showing an example of correlation with Coretest LDL (trade name, manufactured by Sekisui Medical). It is. 6A and 6B, the vertical axis represents the LDL cholesterol measurement value of Example 3, and the horizontal axis represents the LDL cholesterol measurement value of a commercially available cholesterol measurement reagent.
  • the measured value of LDL cholesterol using the reagent of Example 3 and the measured value of a commercially available cholesterol measuring reagent show a good correlation, and the correlation with the measured value of determiner LDL.
  • the number was 0.9799, and the correlation coefficient with the measured value of Coretest LDL was 0.9794. Therefore, it was shown that the LDL cholesterol measurement method of the present invention can measure LDL cholesterol with the same accuracy as a commercially available reagent for LDL measurement.
  • the sample analysis method of the present invention is useful in various fields such as the medical field and the clinical laboratory field.

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Abstract

簡便かつ正確にＬＤＬコレステロールを測定可能な新たな測定方法の提供。ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる工程を含む試料中のＬＤＬコレステロールの測定方法である。界面活性剤Ａ１はＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルであり、界面活性剤Ｂ１はＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択され、界面活性剤Ｂ２はＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される。

Description

低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法及び測定用キット
　本発明は、低密度リポタンパク質（以下、「ＬＤＬ」という）中のコレステロールの測定方法及び測定用キットに関する。
　ＬＤＬは、肝臓で合成されたコレステロールを末梢組織へ運搬する役割を担うリポタンパク質である。ＬＤＬ中のコレステロール（以下、「ＬＤＬコレステロール」ともいう）は、動脈硬化の原因物質の一つであることが知られている。このため、労働安全衛生法に基く健康診断の検査項目として、ＬＤＬコレステロール量は２００８年４月から追加されている。
　ＬＤＬコレステロールの測定方法としては、例えば、超遠心分離によりＬＤＬを他のリポタンパク質（例えば、高密度リポタンパク質（以下、「ＨＤＬ」ともいう）、超低密度リポタンパク質（以下、「ＶＬＤＬ」ともいう）等と分離した後、酵素を用いてＬＤＬコレステロールのみを測定する方法や、電気泳動によってＬＤＬを分離した後、脂質の染色を行い、その発色強度を測定する方法等がある。しかしながら、これらの方法は操作が煩雑であり、多数の検体を処理することが困難であるため、臨床検査等において使用することは困難である。
　そこで、酵素を用いたＬＤＬコレステロールの測定方法が種々開発されている。酵素を用いた測定方法としては、ＬＤＬコレステロールそのものを直接測定する直接法や、第一反応でＬＤＬ以外のリポタンパク質由来のコレステロールを反応させてこれらを消去し、第二反応で残ったＬＤＬコレステロールを反応させることによってＬＤＬコレステロール量を測定する消去法等がある。
　より具体的には、直接法としては、例えば、シクロデキストリン及び界面活性剤によってＬＤＬコレステロールに対する酵素の特異性を高めてＬＤＬコレステロールを測定する方法がある（特許文献１）。消去法としては、ポリアニオンと２価金属イオンによってＬＤＬ以外のリポタンパク質由来のコレステロールを優先的に酵素反応させた後、ＬＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献２）、硫酸カリクスアレンやポリアニリン等をＬＤＬコレステロールに結合させて可溶性複合体を形成させた状態でＬＤＬ以外のリポタンパク質由来のコレステロールを酵素反応させた後、ＬＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献３）等がある。アミンを含む緩衝液中でＬＤＬ以外のリポタンパク質由来のコレステロールを酵素反応させた後、ＬＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献４）等がある。
特許第３０９１２３０号公報 特許第３１９３６３４号公報 特許第３８２２３４０号公報 特許第３０５８６０２号公報
　本発明は、ＬＤＬコレステロールを測定可能な新たな方法及び測定に用いるキットを提供する。
　本発明は、高密度リポタンパク質消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、低密度リポタンパク質中のコレステロールを酵素反応させる工程（Ｉ）を含む、試料中の低密度リポタンパク質中のコレステロールを測定する方法であって、前記界面活性剤Ａ１は、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルであり、前記界面活性剤Ｂ１は、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つであり、前記界面活性剤Ｂ２は、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法に関する。
　本発明は、その他の態様として、低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定に用いるキットであって、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである界面活性剤Ａ１と、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ１と、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ２とを含む低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キットに関する。
　本発明によれば、ＬＤＬコレステロールの新たな測定方法を提供できる。
図１は、参考例１の結果の一例を示すグラフである。 図２Ａ及びＢは、参考例３の結果の一例を示すグラフである。 図３Ａ及びＢは、参考例４の結果の一例を示すグラフである。 図４Ａ及びＢは、実施例１の結果の一例を示すグラフである。 図５Ａ～Ｃは、実施例２の結果の一例を示すグラフである。 図６Ａ及びＢは、実施例３の測定値と従来法の測定値との相関関係の一例を示すグラフである。
　本発明は、上記の界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２の存在下で、少なくともＬＤＬ及びＶＬＤＬを含む試料、好ましくはＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びカイロミクロン（以下、「ＣＭ」ともいう）を含む試料、より好ましくはＨＤＬ消去処理を施した生体試料を酵素処理することによって、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させることができるため、ＬＤＬコレステロールを測定することができるという知見に基づく。
　本発明のＬＤＬコレステロール測定方法によって、ＬＤＬコレステロールを測定できるメカニズムの詳細は明らかではないが、下記のように推測される。すなわち、界面活性剤Ａ１の存在下で界面活性剤Ｂ１がＬＤＬを選択的に可溶化し、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下で界面活性剤Ｂ２がＶＬＤＬ及びＣＭといったＬＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害するため、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させることができる。但し、本発明はこのメカニズムに限定されない。
　すなわち、本発明は、
[１] ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる工程（Ｉ）を含む、試料中の低密度リポタンパク質中のコレステロールを測定する方法であって、前記界面活性剤Ａ１は、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルであり、前記界面活性剤Ｂ１は、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つであり、前記界面活性剤Ｂ２は、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[２] 前記ＨＤＬ消去処理は、前記界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ａ２と試料とを混合して前記試料中のＨＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることを含み、前記界面活性剤Ａ２は、ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである[１]記載の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[３] 前記工程（Ｉ）は、前記ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ｂ３を添加することにより、前記反応液に前記界面活性剤Ａ１、前記界面活性剤Ｂ１、前記界面活性剤Ｂ２及び前記界面活性剤Ｂ３を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることを含み、前記界面活性剤Ｂ３は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一つである[１]又は[２]に記載の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[４] 前記ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルである[１]から[３]のいずれかに記載の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[５] 前記工程（Ｉ）における酵素反応は、試料中の低密度リポタンパク質と、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステラーゼとを酵素反応させることを含む[１]から[４]のいずれかに記載の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[６] ＬＤＬ中のコレステロールの測定に用いるキットであって、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである界面活性剤Ａ１と、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ１と、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ２とを含む低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[７] ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ａ２をさらに含む[６]記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[８] ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一つである界面活性剤Ｂ３をさらに含む[６]又は[７]に記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[９] コレステロール測定用試薬をさらに含む[６]から[８]のいずれかに記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[１０] 前記コレステロール測定用試薬は、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステラーゼを含む[９]記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[１１] 前記コレステロールデヒドロゲナーゼを含む第１試薬と、前記コレステロールエステラーゼ、前記界面活性剤Ａ１及び前記界面活性剤Ａ２を含む第２試薬と、前記界面活性剤Ｂ１を含む第３試薬とを有する[１０]記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
に関する。
　本明細書において「低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）」は、比重が１．００６～１．０６３である広義のＬＤＬ、及び、比重が１．０１９～１．０６３である狭義のＬＤＬの何れも含む。本明細書において「高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）」は、比重が１．０６３～１．２１であるリポタンパク質のことをいう。
　本明細書において試料としては、例えば、生体試料が挙げられ、具体的にはヒト及びヒトを除く哺乳動物の体液及び体成分が挙げられる。体液及び体成分としては、これらに限定されないが、例えば、全血、血漿、血清、髄液、唾液、尿、汗、羊水、膵液、涙液、粘膜等が挙げられ、中でも全血、血漿、血清が好ましい。また、試料は、そのまま使用してもよいし希釈して使用してもよく、また、遠心分離等によって分離されたものであってもよい。
　本明細書において「高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）消去処理を施した試料」とは、ＨＤＬ及び又はＨＤＬ由来のコレステロール（以下、「ＨＤＬコレステロール」ともいう）が消去された試料のことをいい、特に限定されないが、例えば、ＨＤＬ及び又はＨＤＬコレステロールが除去又は分解された試料を含みうる。除去には、特に限定されないが、酵素反応による除去等を含み、例えば、酵素反応により、ＨＤＬからコレステロールを遊離させ、遊離したコレステロールを酸化／還元してコレステノンを生じさせることを含む。ＨＤＬ消去処理を施した試料は、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ａ２と試料とを混合して試料中のＨＤＬを溶解し、ＨＤＬコレステロールを酵素反応させた試料が好ましい。このため、ＨＤＬ消去処理を施した試料は、界面活性剤Ａ１、及び界面活性剤Ａ２を含むことが好ましく、より好ましくは界面活性剤Ａ１、及び界面活性剤Ａ２、並びにＬＤＬ及び又はＬＤＬコレステロールを含む。また、ＨＤＬ消去処理を施した試料は、ＨＤＬ及び又はＨＤＬコレステロールを実質的に含まないことがより好ましい。ＨＤＬ及び又はＨＤＬコレステロールを実質的に含まないとは、ＨＤＬ消去処理を施した試料に含まれるＨＤＬ及び又はＨＤＬコレステロールの量が、本発明の測定方法によるＬＤＬ中のコレステロールの測定に影響を及ぼさない範囲であることをいう。
　本明細書において「ＬＤＬコレステロールを酵素反応させる」とは、例えば、コレステロールとコレステロール測定用酵素とを接触させることを含み、好ましくはコレステロールにコレステロール測定用酵素及び発色剤を接触させることを含む。
　本明細書において「ＨＬＢ」は、ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｂａｌａｎｃｅの略であって、例えば、グリフィン式を用いて算出することができる。また、ＨＬＢとしては、界面活性剤の製造メーカのカタログ等に記載されている値を使用することもできる。
　［界面活性剤Ａ１］
　界面活性剤Ａ１は、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである。ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルのＨＬＢは、ヒト血中に存在するリポタンパク質のうちＨＤＬをより選択的に可溶化させる点から、１２．５以下であり、限定されないが、１２．３以上１２．５以下であることが好ましく、より好ましくは略１２．５である。
　ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとしては、これらに限定されないが、例えば、１つの芳香環を有する置換基によって２箇所以上置換されているフェニル基、２つ以上の芳香環を有する置換基によって１又は複数箇所置換されているフェニル基等が挙げられる。１つの芳香環を有する置換基としては、これらに限定されないが、例えば、ベンジル、１－（フェニル）エチル等が挙げられる。２つ以上の芳香環を有する置換基としては、これに限定されないが、例えば、ナフチル等が挙げられる。ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、これらに限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン及びポリオキシブチレン等が挙げられ、中でも異なるポリオキシアルキレンが重合されているものが好ましく、より好ましくはポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとが重合されたものである。このため、ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルとしては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルが好ましい。ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの重合形式は特に制限されず、例えば、ブロック重合、ランダム重合の何れであってもよい。
　ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルの具体例としては、これらに限定されないが、ニューコール２６０８Ｆ（商品名、ＨＬＢ：１２．５、日本乳化剤株式会社製）、ニューコール７０７Ｆ（商品名、ＨＬＢ：１２．５、日本乳化剤株式会社製）等が挙げられる。
　［界面活性剤Ｂ１］
　界面活性剤Ｂ１は、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される。これらは１種類で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　界面活性剤Ｂ１において、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルのＨＬＢは１２．６以上であり、界面活性剤Ａ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭと比較してＬＤＬの可溶化能が高く、より選択的にＬＤＬを可溶化させる点から、好ましくは１２．６～１３．６であり、より好ましくは１２．６～１３．３、さらに好ましくは１２．６～１３．２、さらにより好ましくは略１２．６である。
　ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとしては、これらに限定されないが、例えば、１つの芳香環を有する置換基によって２箇所以上置換されているフェニル基、２つ以上の芳香環を有する置換基によって１又は複数箇所置換されているフェニル基等が挙げられる。１つの芳香環を有する置換基としては、これらに限定されないが、例えば、ベンジル、１－（フェニル）エチル等が挙げられる。２つ以上の芳香環を有する置換基としては、これに限定されないが、例えば、ナフチル等が挙げられる。ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、これらに限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン及びポリオキシブチレン等が挙げられ、中でも異なるポリオキシアルキレンが重合されているものが好ましく、より好ましくはポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとが重合されたものである。このため、ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルとしては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルが好ましい。ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの重合形式は特に制限されず、例えば、ブロック重合、ランダム重合の何れであってもよい。
　ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルとしては、これらに限定されないが、例えば、ニューコール２６０９（商品名、ＨＬＢ：１２．６、日本乳化剤株式会社製）、ニューコール２６１４（商品名、ＨＬＢ：１４．７、日本乳化剤株式会社製）、ニューコール６１０（商品名、ＨＬＢ：１３．８、日本乳化剤株式会社製）等が挙げられる。
　界面活性剤Ｂ１において、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルのＨＬＢは１２．７以上１４．５以下であり、界面活性剤Ａ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭと比較してＬＤＬの可溶化能が高く、より選択的なＬＤＬの可溶化を行う点から、好ましくは略１２．８である。
　ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルの具体例としては、これらに限定されないが、エマルゲンＡ６０（製品名、ＨＬＢ：１２．８、花王株式会社製）、エマルゲンＡ９０（製品名、ＨＫＢ：１４．５、花王株式会社製）等が挙げられる。
　界面活性剤Ｂ１において、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルのＨＬＢは１２．０以上１４．５以下であり、界面活性剤Ａ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭと比較してＬＤＬの可溶化能が高く、より選択的なＬＤＬの可溶化を行う点から、好ましくは略１２．７である。
　ＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルの具体例としては、ブラウノンＴＳＰ１６（商品名、ＨＬＢ：１２．７、青木油脂株式会社製）等が挙げられる。
　［界面活性剤Ｂ２］
　界面活性剤Ｂ２は、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される。これらは１種類で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　界面活性剤Ｂ２において、ポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンのＨＬＢは１６．９以上であり、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭの可溶化を阻害し、より選択的にＬＤＬを可溶化させる点から、好ましくは１６．９～１８．４であり、より好ましくは１６．９～１８．１、さらに好ましくは１６．９～１７．９、さらにより好ましくは略１６．９である。ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンの重合度としては、特に限定されないが、例えば、２３～５０であり、好ましくは２３～３０である。ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンの具体例としては、これらに限定されないが、エマルゲン１２３Ｐ（製品名、ＨＬＢ：１６．９、花王株式会社製）、エマルゲン１３０Ｋ（製品名、ＨＬＢ：１８．１、花王株式会社製）、エマルゲン１５０（製品名、ＨＬＢ：１８．４、花王株式会社製）等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンミリスチルエーテルとしては、例えば、ＨＬＢが１８．９のポリエチレンミリスチルエーテルが使用できる。ポリオキシエチレンミリスチルエーテルの具体例としては、これに限定されないが、エマルゲン４０８５（商品名、ＨＬＢ１８．９、花王株式会社製）等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルのうちポリオキシエチレンの平均重合度は、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭの可溶化を阻害し、より選択的にＬＤＬを可溶化させる点から、３５～４０であり、好ましくは略４０である。ポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルの具体例としては、これに限定されないが、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－４０５（商品名、重合度：４０、ナカライテスク株式会社製）等が挙げられる。
　［界面活性剤Ｂ３］
　界面活性剤Ｂ３は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一方である。これらは１種類で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。塩としては、これらに限定されないが、例えば、アンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩におけるポリオキシエチレンの重合度としては、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下において、界面活性剤Ｂ１によるＬＤＬの可溶化速度を促進させる点から、例えば、１～１０である。ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としては、これに限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としては、これらに限定されないが、例えば、エマール２０Ｃ（商品名、花王株式会社製）、ニューコール２３０８ＳＦ（商品名、日本乳化剤株式会社製）、ニューコール２３２０ＳＮ（商品名、日本乳化剤株式会社製）等が挙げられる。
　アルキルベンゼンスルホン酸塩としては、これらに限定されないが、ドデシル（ラウリル）ベンゼン硫酸ナトリウム（ナカライ株式会社製他）等が挙げられる。
　［界面活性剤Ａ２］
　界面活性剤Ａ２は、ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される。これらは１種類で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　界面活性剤Ａ２において、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルのＨＬＢは１８．０以上であり、界面活性剤Ａ１による試料中に含まれるＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害する点から、好ましくは１８．０～１９．０、より好ましくは略１８．０である。ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルの具体例としては、これに限定されないが、エマルゲンＡ５００（製品名、ＨＬＢ：１８．０、花王株式会社製）等が挙げられる。
　界面活性剤Ａ２において、ポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンのＨＬＢは１６．９以上であり、界面活性剤Ａ１による試料中に含まれるＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害する点から、好ましくは１６．９～１８．４であり、より好ましくは１６．９～１８．１、さらに好ましくは１６．９～１７．９、さらにより好ましくは略１６．９である。ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンの重合度としては、界面活性剤Ａ１による試料中に含まれるＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害する点から、例えば、２３～５０であり、好ましくは２３～３０である。ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンの具体例としては、これらに限定されないが、エマルゲン１２３Ｐ（製品名、ＨＬＢ：１６．９、花王株式会社製）、エマルゲン１３０Ｋ（製品名、ＨＬＢ：１８．１、花王株式会社製）、エマルゲン１５０（製品名、ＨＬＢ：１８．４、花王株式会社製）等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンミリスチルエーテルとしては、これらに限定されないが、例えば、ＨＬＢが１８．９のポリエチレンミリスチルエーテルが使用できる。ポリオキシエチレンミリスチルエーテルの具体例としては、これらに限定されないが、エマルゲン４０８５（商品名、ＨＬＢ１８．９、花王株式会社製）等が挙げられる。
　［コレステロール測定用試薬］
　コレステロール測定用試薬は、コレステロールの測定に用いる試薬であって、コレステロール測定用酵素を含む。コレステロール測定用酵素とは、コレステロールの測定に用いる酵素のことをいい、これらに限定されないが、例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステル加水分解酵素及び補酵素等が挙げられる。コレステロール測定用酵素は、公知のものが使用できる。また、コレステロール測定用酵素は、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステル加水分解酵素及び補酵素を組み合わせて使用することが好ましい。コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステル加水分解酵の由来は特に制限されず、例えば、微生物、動物又は植物由来であってもよく、また、遺伝子操作によって作られたものでもよい。また、化学的に修飾されていてもよい。
　コレステロール加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解可能な酵素であればよく、これらに限定されないが、例えば、コレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等が挙げられ、中でもコレステロールエステラーゼが好ましい。コレステロールエステラーゼは、市販品を使用してもよく、特にその由来は制限されない。また、本発明において、２種類以上のコレステロール加水分解酵素を組み合わせて使用してもよい。
　酸化型補酵素としては、これらに限定されないが、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ等が挙げられる。
　コレステロール測定用試薬は、コレステロール測定用酵素に加えて、例えば、還元型発色剤をさらに含んでいてもよい。還元型発色剤としては、例えば、ジアホラーゼの作用により色素を形成するもの等が使用できる。
　還元型発色剤としては、例えば、テトラゾリウム化合物が挙げられる。テトラゾリウム化合物としては、これらに限定されないが、例えば、３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ－１）、２－（４－ヨードフェニル）－３－（２，４－ジニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ－３）等が挙げられる。
　［ＬＤＬコレステロール測定方法］
　（第１の態様のＬＤＬコレステロール測定方法）
　本発明のＬＤＬコレステロール測定方法は、第１の態様として、ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる工程（Ｉ）を含む。以下、第１の態様のＬＤＬコレステロール測定方法について説明する。
　工程（Ｉ）において、ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることにより、試料中のＬＤＬ中のコレステロールを測定する。
　試料は、ＨＤＬ消去処理を施した試料を使用する。ＨＤＬ消去処理としては、例えば、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ａ２と試料とを混合して前記試料中のＨＤＬを溶解し、ＨＤＬ由来のコレステロールを酵素反応させる方法等が挙げられる。
　反応液中における界面活性剤Ｂ１の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．４４～０．９７重量％であり、単独での使用で、界面活性剤Ａ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭと比較してＬＤＬの可溶化能が高く、より選択的にＬＤＬを可溶化する点から、好ましくは０．６２～０．７９重量％である。反応液中における界面活性剤Ｂ２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１～０．０４重量％であり、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭの可溶化を阻害し、より選択的にＬＤＬを可溶化する点から、好ましくは０．０１８～０．０３重量％である。反応液中における界面活性剤Ｂ１と界面活性剤Ｂ２との重量％比率（Ｂ１：Ｂ２）は、特に限定されないが、例えば、４４：１～９７：４であり、好ましくは３１：１～７９：３である。
　工程（Ｉ）では、ＨＤＬを可溶化し、ＨＤＬ由来のコレステロールの消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を添加することを含んでいてもよい。ＨＤＬ消去処理を施した試料が界面活性剤Ａ１と同じ界面活性剤を含有している場合は、界面活性剤Ａ１を添加することなく試料に含まれている界面活性剤を界面活性剤Ａ１としてそのまま使用してもよいし、工程（Ｉ）において界面活性剤Ａ１をさらに添加してもよい。ＨＤＬ消去処理を施した試料が界面活性剤Ｂ２と同じ界面活性剤を含有している場合は、界面活性剤Ｂ２を添加することなく試料に含まれている界面活性剤を界面活性剤Ｂ２としてそのまま使用してもよいし、工程（Ｉ）において界面活性剤Ｂ２をさらに添加してもよい。
　工程（Ｉ）において、反応液にコレステロール測定用試薬を添加してもよい。コレステロール測定用試薬は、例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロール加水分解酵素等のコレステロール測定用酵素、補酵素及び還元型発色剤、ジアホラーゼ等を含み得る。還元型発色剤、ジアホラーゼを含むことにより、還元型補酵素、ジアホラーゼを介した反応により生じた還元型発色剤に由来する色素により、より長波長側の可視光での検出が可能となる。
　コレステロールデヒドロゲナーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、１．７４～４．３５Ｕ／ｍＬであり、反応液中のコレステロール濃度が０．０１２ｍＭの場合において、反応エンドポイントに達する速度が最大となる点から、好ましくは２．９～４．３５Ｕ／ｍＬである。反応液中におけるコレステロール加水分解酵素の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１９～０．５８Ｕ／ｍＬであり、反応液中のコレステロールの濃度が０．０１２ｍＭの場合において、反応エンドポイントに達する速度が最大となる点から、好ましくは０．２９～０．５８Ｕ／ｍＬである。反応液中の補酵素の濃度は、上記コレステロールデヒドロゲナーゼの濃度範囲に付随して、例えば、０．２９～０．９７ｍＭであり、好ましくは０．７３～０．９７ｍＭである。
　反応液中におけるジアホラーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、１．７４～４．３５Ｕ／ｍＬであり、好ましくは２．９～４．３５Ｕ／ｍＬである。還元型発色剤との濃度は、例えば０．１０～０．２９ ｍＭであり、好ましくは０．１９～０．２９ ｍＭである。
　工程（Ｉ）の反応は、例えば、反応溶液中の緩衝能を保持し、目的となるｐＨを保持するために緩衝液中で行うことが好ましい。緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えば、グッドの緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤等が挙げられる。グッドの緩衝剤としては、これらに限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。濃度は、反応溶液中の緩衝能を保持し、目的となるｐＨを保持できる濃度にすればよい。反応液中のｐＨは、使用する酵素のｐＨ安定性や反応至適を考慮し、適宜選択すればよい。本測定方法においては、例えば、６．５～１０．０であり、好ましくは７．５～８．０である。
　工程（Ｉ）において、界面活性剤Ｂ３を添加し、酵素反応を界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１、界面活性剤Ｂ２及び界面活性剤Ｂ３の存在下で行うことが好ましい。これにより、例えば、ＬＤＬの選択的な可溶化を促進させることができ、より好ましくはＶＬＤＬの影響をより抑制することができる。反応液中における界面活性剤Ｂ３の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０３～０．０７重量％であり、ＬＤＬの可溶化をより促進させる点から、好ましくは０．０４～０．０６重量％である。
　工程（Ｉ）の反応温度は、特に限定されないが、ヒト血液中成分、特に生化学項目を測定する際の反応温度は、通常３７℃程度である。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１８０～３００秒であり、本反応系において、ヒト血中のＬＤＬコレステロールが５００ｍｇ／ｄＬ付近の濃度でも十分に定量可能である点から、好ましくは２４０～２７０秒である。
　ＬＤＬコレステロールの測定は、例えば、反応液の吸光度を測定することにより行うことができる。吸光度の測定は、例えば、過酸化水素測定用試薬により生じた色素の吸光度を測定してもよい。
　（第２の態様のＬＤＬコレステロール測定方法）
　本発明のＬＤＬコレステロール測定方法は、第２の態様として、試料、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬を混合して試料中のＨＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる工程（ｉ）と、工程（ｉ）後の反応液に界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることにより、前記試料中のＬＤＬ中のコレステロールを測定する工程（ｉｉ）とを含む。
　本態様のＬＤＬコレステロール測定方法によって、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロールをこれらの順で選択的に酵素反応させ、ＬＤＬコレステロールを測定できるメカニズムの詳細は明らかではないが、下記のように推測される。すなわち、上記界面活性剤Ａ１がＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭといったＨＤＬ以外のリポタンパク質と比較してＨＤＬを選択的に可溶化するとともに、上記界面活性剤Ａ２が上記界面活性剤Ａ１の存在下で上記ＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害するため、ＨＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させることができる。さらに、上記反応後、上記界面活性剤Ｂ１が上記反応後の反応液においてＶＬＤＬ及びＣＭといったＬＤＬ以外のリポタンパク質と比較してＬＤＬを選択的に可溶化するとともに、上記界面活性剤Ｂ２が界面活性剤Ｂ１の存在下でＬＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害するため、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させることができる。なお、界面活性剤Ｂ２として界面活性剤Ａ２と同じものを使用する場合、工程（ｉｉ）において界面活性剤Ｂ２を新たに加える必要はない。但し、本発明はこのメカニズムに限定されない。
　以下、第２の態様のＬＤＬコレステロール測定方法について説明する。
　［工程（ｉ）］
　まず、工程（ｉ）において、試料、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬を混合して試料中のＨＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる。
　試料、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬を混合する順番は特に限定されず、予め試料とコレステロール測定用試薬の一部とを混合した後、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬の残部を添加してもよいし、試料、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬を同時に混合してもよい。
　工程（ｉ）（ＨＤＬ消去工程）の反応液中における界面活性剤Ａ１の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．２２～０．３０重量％であり、ＨＤＬをより選択的に可溶化させる点で、好ましくは０．２２～０．２８重量％である。反応液中における界面活性剤Ａ２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０２重量％以上であり、界面活性剤Ａ１によるＨＤＬの可溶化への影響を抑制しつつ、ＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害する点で、好ましくは０．０４～０．１０重量％、より好ましくは０．０６～０．０９重量％である。反応液中における界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ａ２との重量比（Ａ１：Ａ２）は、特に限定されないが、例えば、１１：１～１５：１であり、界面活性剤Ａ１によるＨＤＬの可溶化への影響を抑制しつつ、ＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害し、ＨＤＬをより選択的に可溶化させる点で、好ましくは１０：２．４～１０：３.７である。
　コレステロール測定用試薬の組成、各成分の濃度は、第１の態様の工程と同様である。また、工程（ｉ）の反応は、反応溶液中の緩衝能を保持し、目的となるｐＨを保持するために緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝剤及びｐＨは、第１の態様と同様である。
　工程（ｉ）の反応温度は、特に限定されないが、ヒト血液中成分、特に生化学項目を測定する際の反応温度は、通常３７℃程度である。反応時間は、特に限定されないが、例えば、２００～２７０秒であり、本反応系において、ヒト血中のＨＤＬコレステロールが１５０ｍｇ／ｄＬ付近の濃度でも十分に消去可能である点から、好ましくは２４０～２７０秒である。
　［工程（ｉｉ）］
　つぎに、工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）後の反応液に界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることにより、試料中のＬＤＬ中のコレステロールを測定する。
　工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）後の反応液に界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を添加することを含んでいてもよい。また、工程（ｉｉ）の界面活性剤Ｂ２として界面活性剤Ａ２と同じ界面活性剤を使用する場合は、工程（ｉｉ）において界面活性剤Ｂ２をさらに添加してもよいし、さらに添加することなく工程（ｉ）で使用した界面活性剤Ａ２を界面活性剤Ｂ２としてそのまま使用してもよい。
　反応液中における界面活性剤Ｂ１及びＢ２の濃度、界面活性剤Ｂ１と界面活性剤Ｂ２との重量％比率は、第１の態様の工程（Ｉ）と同様である。反応液中における界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ｂ１と界面活性剤Ｂ２との重量％比率（Ａ１：Ｂ１：Ｂ２）は、特に限定されないが、例えば、１９：４４：１～２５：９７：４であり、好ましくは１９：６２：２～２３：７９：３である。
　工程（ｉｉ）において、コレステロール測定用試薬をさらに添加してもよいし、さらに添加することなく工程（ｉ）で使用したコレステロール測定用試薬をそのまま使用してもよい。
　工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）後の反応液にさらに界面活性剤Ｂ３を添加し、酵素反応を界面活性剤Ｂ１、界面活性剤Ｂ２及び界面活性剤Ｂ３の存在下で行うことが好ましい。これにより、例えば、ＬＤＬの選択的な可溶化を促進させることができ、より好ましくはＶＬＤＬの影響をより抑制することができる。反応液中における界面活性剤Ｂ３の濃度は、第１の態様の工程（Ｉ）と同様である。
　工程（ｉｉ）における反応温度及び反応時間は、第１の態様の工程（Ｉ）と同様である。
　ＬＤＬコレステロールの測定は、例えば、反応液の吸光度を測定することにより行うことができる。吸光度の測定は、例えば、過酸化水素測定用試薬により生じた色素の吸光度を測定してもよい。
　［ＬＤＬコレステロール測定用キット］
　本発明のＬＤＬコレステロール測定用キットは、一つの態様において、ＬＤＬ中のコレステロールの測定に用いるキットであって、界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ｂ１と界面活性剤Ｂ２とを含む（以下、「本発明のキット」ともいう）。本発明のキットは、本発明のＬＤＬコレステロールの測定方法に用いることができる。界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
　本発明のキットは、コレステロール測定用試薬を含んでいてもよい。コレステロール測定用試薬は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
　本発明のキットは、界面活性剤Ｂ３を含んでいてもよい。界面活性剤Ｂ３は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
　本発明のキットは、界面活性剤Ａ２を含んでいてもよい。界面活性剤Ａ２は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
　本発明のキットは、その他の態様において、ＬＤＬ中のコレステロールの測定に用いるキットであって、界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ａ２と界面活性剤Ｂ１とを含む。本態様のＬＤＬコレステロール測定用キットは、界面活性剤Ｂ２を含んでいてもよく、また、界面活性剤Ｂ３及びコレステロール測定用試薬を含んでいてもよい。界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２、界面活性剤Ｂ１、界面活性剤Ｂ２、界面活性剤Ｂ３及びコレステロール測定用試薬は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
　本発明のキットとしては、例えば、２試薬系のキット、３試薬系のキット、４試薬系のキット等が挙げられる。
　コレステロールデヒドロゲナーゼを含む２試薬系のキットにおいて、コレステロールデヒドロゲナーゼは、第１試薬のみに含まれることが好ましい。コレステロールエステラーゼは、例えば、第１試薬及び第２試薬のうちの少なくとも一つに含まれていてもよく、好ましくは第２試薬のみに含まれることが好ましい。界面活性剤Ａ１及びＡ２は、それぞれ、第１試薬のみに含まれることが好ましい。界面活性剤Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、第２試薬のみに含まれることが好ましい。
　３試薬系のキットにおいては、コレステロールデヒドロゲナーゼ、界面活性剤Ａ１及びＡ２は、例えば、第１反応を優先する試薬の組み合わせとして、第１試薬、第２試薬及び第１試薬のみのうちの少なくとも一つに含まれていてもよい。コレステロールエステラーゼは、例えば、第１試薬、第２試薬及び第３試薬並びにこれらのうちの少なくとも一つに含まれていてもよく、好ましくは第２反応を優先する試薬のみに含まれることである。界面活性剤Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、例えば、第２反応を優先する試薬の組み合わせとして、第２試薬、第３試薬及び第３試薬のみのうちの少なくとも一つに含まれていてもよい。
　好ましい測定用キットの形態としては、コレステロールデヒドロゲナーゼを含む第１試薬と、コレステロールエステラーゼ、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ａ２を含む第２試薬と、界面活性剤Ｂ１を含む第３試薬とを有する測定用キットが挙げられる。
　本発明のキットは、上記試薬を用いてＬＤＬコレステロールを測定する方法等が記載された取扱い説明書を含むことが好ましい。本発明のキットは、説明書が本発明の測定キットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。
　本発明のキットとしては、例えば、コレステロール測定用試薬、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及び界面活性剤Ｂ１等が試薬パックに収納されていてもよい。試薬パックは、例えば、使い捨て可能なカートリッジ形状であることが好ましく、上記試薬を配置可能な槽を２種類以上備えることがより好ましい。本発明のキットとしては、上記第１試薬、第２試薬及び第３試薬が個別の槽に配置された試薬パックが好ましい。試薬パックは、例えば、反応槽、検体槽、分注チップ、反応用光学セル、廃棄槽等をさらに含んでいてもよい。このような試薬パックを用いることにより、例えば、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法をより一層簡便に実施することができ、また、自動化装置への適用も極めて容易することができる。
　以下に、参考例及び実施例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。
　なお、下記の実施例において、以下の略語を使用する。
ＣＨＤＨ：コレステロールデヒドロゲナーゼ（商品名：ＣＨＤＨ“Ａｍａｎｏ”５、天野エンザイム製）
Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ：ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（商品名：ＤｉａｐｈｏｒａｓｅＩ、ユニチカ製）
ＢＥＳ　：Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（同仁化学製）
ＣＥ　　：コレステロールエステラーゼ（商品名：ＣＯＥ－３１１、東洋紡製）
ＭＴＴ　：３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（同仁化学製）
ＢＳＡ　：ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ製）
ＮＡＤ　：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母製）
　（参考例１）
　下記表１に示す試薬１－１～１－４及び試薬２を用いて試料中のＬＤＬコレステロールの測定を行った。試料としては、ヒト血清から超遠心分画法により回収したＶＬＤＬ及びＬＤＬを、リポタンパク質を含まないヒト血清に添加し、それを試薬１－３で２０倍希釈したものを使用した（ＬＤＬ濃度：８３ｍｇ／ｄｌ、ＶＬＤＬ濃度：６１ｍｇ／ｄＬ）。
　試料２０μＬに試薬１－１　９０μＬ、試薬１－２　３０μＬ及び試薬１－４　１５μＬを順番に加え、３７℃で２４０秒間反応させた。ついで、下記表２に示す界面活性剤を含む試薬２　１５μＬを加え、汎用自動分析装置（商品名：ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ－８、日本電子社製）を用いて吸光度を測定し、ＬＤＬコレステロール測定値を得た。その結果を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記表２に示すように、試薬２の界面活性剤としてＨＬＢが１２．６のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル又はＨＬＢが１２．７のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルを使用した場合、得られたＬＤＬ測定値はいずれも検定値（８３ｍｇ／ｄｌ）からの乖離が小さかった。また、ＬＤＬ濃度が高い試料（ＬＤＬ濃度：１４１ｍｇ／ｄＬ）であっても同様に検定値からの乖離が小さかった(data not shown)。したがって、ＨＬＢが１２．６のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル又はＨＬＢが１２．７のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルを用いることによって、界面活性剤Ａ１の存在下でＬＤＬを選択的に可溶化できることがわかった。
　（参考例２）
　試薬２の界面活性剤として、ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル（商品名：エマルゲンＡ６０、花王株式会社製、濃度８重量％（終濃度：０.７１重量％））を用い、下記表３に示す組成の試料ａ～ｆを用いて、参考例１と同様に吸光度の測定を行った。その結果を図１に示す。なお、図１において、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間を示し、１Ｐｔ．は９秒を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図１に示すように、ＶＬＤＬ濃度が１００ｍｇ／ｄＬ未満の試料ｃ及びｄでは、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下で酵素反応させることによって、ＬＤＬを選択的に可溶化できることが確認された。一方、ＶＬＤＬ濃度が１００ｍｇ／ｄＬを超える試料ｅ及びｆでは、測定時間の経過とともにＬＤＬのみならずＶＬＤＬが可溶化されることが確認された。
　（参考例３）
　下記表４に示す試薬１－１～１－４を用いて試料中のＨＤＬコレステロールの消去処理を行った。ヒト血清から超遠心分画法により回収し、適宜濃度に濃縮したＨＤＬ標品を、生理食塩水に添加したもの（ＨＤＬ濃度：１６０ｍｇ／ｄｌ）を試料として使用した。
　試料に試薬１－１、試薬１－２及び試薬１－４を順番に加え、３７℃で２４０秒間反応させた後、汎用自動分析装置（商品名：ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ－８、日本電子社製）を用いて吸光度を測定し、ＨＤＬコレステロール測定値を得た。その結果を図２Ａに示す。
　また、ＨＤＬ消去処理の際のＬＤＬの可溶化の有無を確認するために、ヒト血清から超遠心分画法により回収し、適宜濃度に濃縮したＬＤＬ標品を、生理食塩水に添加したもの（ＬＤＬ濃度：３４７ｍｇ／ｄＬ）を試料として使用し、ＬＤＬコレステロール測定を行った以外は、上記と同様の測定を行った。その結果を図２Ｂに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図２Ａは、各種濃度の界面活性剤Ａ２（終濃度：０、０．０２、０．０４、０．０６、及び０．１１重量％）を用いてＨＤＬの消去処理を行った結果の一例を示すグラフであり、図２Ｂは、各種濃度の界面活性剤Ａ２を用いてＬＤＬの可溶化の有無を行った結果の一例を示すグラフである。図２Ａ及びＢにおいて、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間を示す。なお、図２Ａ及びＢにおいて１Ｐｔ．は９秒を意味する。図２Ａに示すように、界面活性剤Ａ１及びＡ２の存在下でＨＤＬを含む試料を酵素処理することにより、試料に含まれるＨＤＬのほとんどを酵素と反応させて消去することができた。また、図２Ｂに示すように、界面活性剤Ａ１及びＡ２の存在下ではＬＤＬの可溶化は十分抑制され、特に界面活性剤の添加濃度が０．３重量％（終濃度：０．０６重量％）であれば、より効果的にＬＤＬの可溶化を抑制できた。
　（参考例４）
　試薬１－２の界面活性剤の添加濃度を０．３重量％（終濃度：０．０５３重量％）とし、試料としてヒト血清（ＨＤＬ：６８ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ：９３ｍｇ／ｄＬ）にＴＧ（５０～１２００ｍｇ／ｄＬ）又はＶＬＤＬ（０～１２５ｍｇ／ｄＬ）を添加し、それを試薬１－３で希釈したもの（ＨＤＬ：６８ｍｇ／ｄＬ、ＴＧ：５０～１２００ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬ：０～１２５ｍｇ／ｄＬ）を使用した以外は参考例３と同様にして、ＨＤＬを酵素と反応させてＨＤＬの消去処理を行った。その結果を図３に示す。
　図３Ａ及びＢは、界面活性剤Ａ１及びＡ２の存在下でＨＤＬの消去処理を行った結果の一例を示すグラフであり、図３ＡはＨＤＬとＴＧとを含む試料を用いた結果の一例であり、図３ＢはＨＤＬとＶＬＤＬとを含む試料を用いた結果の一例である。図３Ａ及びＢにおいて、縦軸はＴＧ又はＶＬＤＬを含まない試料により得られたＨＤＬ測定値との差を示し、横軸はＴＧ又はＶＬＤＬの濃度を示す。図３Ａ及びＢに示すように、界面活性剤Ａ１及びＡ２の存在下でＨＤＬを酵素反応させる際、ＴＧ及びＶＬＤＬの可溶化は十分抑制されていた。
　（実施例１）
　上記表１に示す試薬１－１～１－４と、界面活性剤Ｂ１（ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、商品名：エマルゲンＡ６０、花王株式会社製、濃度８重量％）及び下記表５に示す界面活性剤（いずれか一つ）を含む試薬２（３種類）とを用いてＬＤＬコレステロールの測定を行った。その結果を図４Ａ及びＢに示す。
　ＬＤＬコレステロールの測定は、参考例１と同様の方法で行った。ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルの濃度は、８重量％とした（反応系での終濃度：０．７１重量％）。下記表５に示す界面活性剤の濃度は、０重量％、０．１重量％、０．２重量％又は０．４重量％とした。試料としては、ＬＤＬのみの試料（ＬＤＬ濃度：５０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬとＶＬＤＬを含む試料（ＬＤＬ濃度：５２ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬ：１５６ｍｇ／ｄＬ）の２種類の試料を準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図４Ａは、ＨＬＢが１６．９のポリオキシエチレンラウリルエーテルを用いた結果の一例を示すグラフであり、図４Ｂは、ＨＬＢが１８．９のポリオキシエチレンミリスチルエーテルを用いた結果の一例を示すグラフである。図４において、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間を示す。なお、図４において１Ｐｔ．は９秒を意味する。
　図４Ａ及びＢに示すように、ＨＬＢが１６．９のポリオキシエチレンラウリルエーテル又はＨＬＢが１８．９のポリオキシエチレンミリスチルエーテルを添加することによって、測定時間の経過に伴う吸光度の上昇が抑制された。ポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルを用いた場合も、同様の傾向が得られた(data not shown)。このため、界面活性剤Ｂ２であるこれらの界面活性剤を添加することによって、ＶＬＤＬの可溶化を抑制し、ＬＤＬを選択的に可溶化して測定できることが確認できた。したがって、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２の存在下で酵素反応させることによって、ＬＤＬを選択的に可溶化し、ＬＤＬコレステロールを選択的に測定できた。
　図４Ａ及びＢに示すように、ＨＬＢが１６．９のポリオキシエチレンラウリルエーテル又はＨＬＢが１８．９のポリオキシエチレンミリスチルエーテルの濃度が０．２重量％（反応液中の終濃度：０．０１８重量％）である場合、ＶＬＤＬを含まない試料（図４Ａ及びＢにおける白四角）と同様の挙動を示した。ポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルを用いた場合も、同様の傾向が得られた。このため、本条件の場合、これらの界面活性剤の最適濃度は０．２重量％（反応液中の終濃度：０．０１８重量％）であることがわかった。
　（実施例２）
　上記表１に示す試薬１－１～１－４と、下記表６に示す組成の試薬（試薬２）を使用し、参考例１と同様にＬＤＬコレステロールの測定を行った。その結果を図５Ａ～Ｃに示す。なお、界面活性剤Ｂ３の濃度は、０％、０．３０重量％（反応液中の終濃度：０．０２６重量％）又は０．６０重量％（反応液中の終濃度：０．０５３重量％）とした。試料は、ＬＤＬ濃度が５１ｍｇ／ｄＬである試料（ＶＬＤＬ濃度：０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ濃度が１３６ｍｇ／ｄＬである試料（ＶＬＤＬ濃度：０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ濃度が４９ｍｇ／ｄＬでありＶＬＤＬ濃度が１５６ｍｇ／ｄＬである試料を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図５Ａは、ＬＤＬ濃度が１３６ｍｇ／ｄＬである試料を用いた結果の一例を示すグラフであり、図５Ｂは、ＬＤＬ濃度が５１ｍｇ／ｄＬである試料を用いた結果の一例を示すグラフであり、図５Ｃは、ＬＤＬ濃度が４９ｍｇ／ｄＬでありＶＬＤＬ濃度が１５６ｍｇ／ｄＬである試料を用いた結果の一例を示すグラフである。図５Ａ～Ｃにおいて、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間を示し、また１Ｐｔ．は９秒を意味する。
　図５Ａ～Ｃに示すように、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム又はラウリルベンゼン硫酸ナトリウムを添加することにより、ＬＤＬの可溶化を促進できることが確認できた。したがって、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１、界面活性剤Ｂ２及び界面活性剤Ｂ３の存在下で酵素反応させることによって、ＬＤＬコレステロールを選択的かつ効率よく測定できることが確認された。
　（実施例３）
　下記表７に示す試薬１－１～１－４及び試薬２を用い、試料としてルーチン検査検体を用いた以外は、参考例１と同様にＬＤＬコレステロールの測定を行い、その測定値を市販のＬＤＬコレステロール測定用試薬の測定値と比較した。その結果を図６Ａ及びＢに示す。市販の測定用試薬としては、デタミナーＬＤＬ（商品名、協和メデックス製）、コレテストＬＤＬ（商品名、積水メディカル製）を使用した。なお、ルーチン検査検体とは、検査センターや院内の検査室で日常的に取り扱われる実検体のことをいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　図６Ａは、デタミナーＬＤＬ（商品名、協和メデックス製）との相関関係の一例を示すグラフであり、図６Ｂは、コレテストＬＤＬ（商品名、積水メディカル製）との相関関係の一例を示すグラフである。図６Ａ及びＢにおいて、縦軸が実施例３のＬＤＬコレステロール測定値であり、横軸は市販のコレステロール測定用試薬のＬＤＬコレステロール測定値である。
　図６Ａ及びＢに示すように、実施例３の試薬を用いたＬＤＬコレステロールの測定値と市販のコレステロール測定用試薬の測定値とは良好な相関関係を示し、デタミナーＬＤＬの測定値との相関係数は０．９７９９であり、コレテストＬＤＬの測定値との相関係数は０．９７９４であった。したがって、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法は、市販のＬＤＬ測定用試薬と同等の精度でＬＤＬコレステロールを測定できることが示された。
　本発明の試料分析方法は、例えば、医療分野、臨床検査の分野等の様々な分野に有用である。

Claims (11)

  1. 高密度リポタンパク質消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、低密度リポタンパク質中のコレステロールを酵素反応させる工程（Ｉ）を含み、
    前記界面活性剤Ａ１は、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルであり、
    前記界面活性剤Ｂ１は、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つであり、
    前記界面活性剤Ｂ２は、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである、試料中の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法。
  2. 前記高密度リポタンパク質消去処理は、前記界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ａ２と試料とを混合して前記試料中の高密度リポタンパク質中のコレステロールを酵素反応させることを含み、
    前記界面活性剤Ａ２は、ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１記載の測定方法。
  3. 前記工程（Ｉ）は、前記高密度リポタンパク質消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ｂ３を添加することにより、前記反応液に前記界面活性剤Ａ１、前記界面活性剤Ｂ１、前記界面活性剤Ｂ２及び前記界面活性剤Ｂ３を存在させ、低密度リポタンパク質中のコレステロールを酵素反応させることを含み、
    前記界面活性剤Ｂ３は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一つである、請求項１又は２に記載の測定方法。
  4. 前記ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルである、請求項１から３のいずれかに記載の測定方法。
  5. 前記工程（Ｉ）における酵素反応は、試料中の低密度リポタンパク質と、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステラーゼとを酵素反応させることを含む、請求項１から５のいずれかに記載の測定方法。
  6. ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである界面活性剤Ａ１と、
    ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ１と、
    ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５－４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ２とを含む、低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット。
  7. ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ａ２をさらに含む、請求項６記載のキット。
  8. ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一つである界面活性剤Ｂ３をさらに含む、請求項６又は７に記載のキット。
  9. コレステロール測定用試薬をさらに含む、請求項６から８のいずれかに記載のキット。
  10. 前記コレステロール測定用試薬は、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステラーゼを含む、請求項９記載のキット。
  11. 前記コレステロールデヒドロゲナーゼを含む第１試薬と、
    前記コレステロールエステラーゼ、前記界面活性剤Ａ１及び前記界面活性剤Ａ２を含む第２試薬と、
    前記界面活性剤Ｂ１を含む第３試薬とを有する、請求項１０記載のキット。
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