WO2012008063A1 - 発泡性発酵飲料の製造方法 - Google Patents

発泡性発酵飲料の製造方法 Download PDF

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soybean protein
sparkling
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克哉 佐々木
浩一郎 高橋
洋生 山口
秀俊 富田
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Asahi Breweries Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G3/00—Preparation of other alcoholic beverages
    • C12G3/02—Preparation of other alcoholic beverages by fermentation

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sparkling fermented beverage using a specific protein degradation product as a raw material.
  • soy protein when soy protein is added as it is, the liquid viscosity increases and production problems such as delayed filtration are caused. In addition, soy protein has a problem of low solubility and poor utilization efficiency. Thus, by using a soybean protein degradation product, foam retention can be improved without causing problems in production.
  • a soybean protein degradation product As a method of using a soybean protein degradation product as a raw material for beer, for example, (1) in a method for producing a fermented alcoholic beverage such as beer or miscellaneous sake, beer such as wheat gluten or soy protein is used as a part of the raw material.
  • beer such as wheat gluten or soy protein
  • a yeast high-availability amino acid-rich protein raw material degradation product or its preparation it promotes fermentation by brewer's yeast, enhances taste and flavor, and has a refreshing taste with no off-flavors or immature odors.
  • a method for producing a fermented alcoholic beverage having a body feeling for example, see Patent Document 1.
  • an enzyme degradation product of protein such as soybean protein is prepared using an alkaline protease (for example, see Patent Document 2). This is because protein degradation efficiency is better when the protein is denatured under alkaline conditions. Generally commercially available soybean peptides are also degraded by alkaline protease.
  • JP 2006-158268 A Japanese Patent No. 3547532
  • soy protein and its decomposition products As the amount of soy protein and its decomposition products increases, the effect of improving the foam retention of sparkling liquor and beer-like sparkling alcoholic beverages increases.
  • soy protein decomposed product As the amount of soy protein decomposed product increases, there is a problem that aroma unfavorable to beer (mainly ginjo incense, sake-like odor) becomes stronger. For this reason, the use of soybean protein degradation products is limited, and the foam retention cannot be sufficiently improved.
  • the present invention aims to provide a method for producing an effervescent fermented beverage with improved foam retention while suppressing the influence on aroma.
  • the present inventors have obtained an unfavorable aroma by using a soy protein hydrolyzate degraded by a neutral protease instead of a soy protein hydrolyzate degraded by an alkaline protease.
  • the inventors found that an effervescent fermented beverage with improved foam retention can be produced while suppressing the present invention and completed the present invention.
  • the present invention (1) Effervescent fermentation in which soybean protein, defatted soybean, or soybean protein degradation product obtained by degrading concentrated soybean protein with neutral protease is added to and mixed with the raw material of the fermentation raw material liquid before fermentation with yeast.
  • a method for producing a beverage (2) The method for producing a sparkling fermented beverage according to (1), wherein the phenylalanine content of the soy protein breakdown product is 5% or less based on the total nitrogen content, (3) The method for producing a sparkling fermented beverage according to (1) or (2), wherein the soy protein hydrolyzate has a weight average molecular weight of 6000 or more, (4)
  • the step of adding and mixing the soybean protein degradation product to the raw material of the fermentation raw material liquid before fermentation with yeast is performed during the step of boiling the fermentation raw material liquid or before the boiling step.
  • the method for producing an effervescent fermented beverage according to the present invention can produce an effervescent fermented beverage having excellent flavor and good foam. Foaming is an important factor for consumers to select a sparkling beverage, and it is expected that the sparkling fermented beverage manufactured by the manufacturing method according to the present invention will provide superior appearance quality.
  • Example 1 it is the figure which showed the chart obtained about each soybean protein degradation product.
  • the effervescent fermented beverage means a beverage that has effervescence by carbon dioxide gas and is manufactured through a fermentation process.
  • the sparkling fermented beverage may be an alcoholic beverage or a so-called non-alcoholic beverage or low alcoholic beverage having an alcohol content of less than 1% by volume. It may be a non-alcoholic beverage.
  • the drink which uses malt as a raw material may be sufficient, and the drink which does not use malt as a raw material may be sufficient.
  • Specific examples of the sparkling fermented beverage include beer, sparkling liquor made from malt, sparkling alcoholic beverages that do not use malt, low alcoholic beverages, non-alcoholic beer, and the like.
  • liqueurs obtained by mixing malt as a raw material and a beverage produced through a fermentation process with an alcohol-containing distillate may be used.
  • the alcohol-containing distillate is a solution containing alcohol obtained by a distillation operation, and one that is generally classified as distilled liquor can be used.
  • spirits, whiskey, brandy, vodka, lamb, tequila, gin, shochu and the like can be used.
  • the alcohol-containing distillate is more preferably a spirit because it has little influence on taste.
  • the method for producing an effervescent fermented beverage according to the present invention is characterized in that a soy protein degradation product obtained by degrading soy protein or defatted soybean with a neutral protease is used as a raw material for a fermentation raw material liquid before fermentation by yeast.
  • a soy protein degradation product obtained by degrading soy protein or defatted soybean with a neutral protease is used as a raw material for a fermentation raw material liquid before fermentation by yeast.
  • soybean protein degradation product obtained by a conventional alkaline protease When a soybean protein degradation product obtained by a conventional alkaline protease is added before the fermentation step, phenethyl alcohol and its ester (such as ⁇ -phenethyl acetate) are likely to be produced by yeast metabolism.
  • the soybean proteolysate obtained by neutral protease has a very low phenylalanine content compared to that obtained by alkaline protease, and even when used as a raw material for fermentation raw material liquid.
  • an effervescent fermented beverage with a sufficiently reduced aroma that is particularly unfavorable for beer, such as ginjo aroma and sake-like odor is obtained.
  • the soybean protein degradation product obtained by neutral protease has many fractions with large molecular weight compared with what was obtained by alkaline protease, Therefore It is guessed that foam retention is improved notably.
  • Effervescent fermented beverages that use malt such as beer and happoshu as raw materials are manufactured in the following steps.
  • warm water is added to the crushed material of malt, which is the main ingredient, and starch, such as rice and corn starch, which is the auxiliary ingredient, mixed and heated, and the starch is saccharified mainly using malt enzymes.
  • Hops are added to the filtrate obtained by filtering this saccharified solution and boiled. Alternatively, hops can be mixed at any stage from the start of boiling to the end of boiling. After boiling, precipitates such as hop cake are removed in a tank called a whirlpool and cooled to an appropriate fermentation temperature with a plate cooler. The cooled filtrate is inoculated with yeast and fermented.
  • yeast and proteins are removed by filtration to obtain the desired sparkling fermented beverage.
  • liquid sugar containing a carbon source, nitrogen source as an amino acid-containing material other than wheat or malt, hops, pigments, etc. are mixed with warm water, and a liquid sugar solution To prepare.
  • the liquid sugar solution is boiled in the same manner as in the production process of an effervescent fermented beverage using malt as a raw material, and precipitates such as hop koji are removed, cooled, inoculated with yeast, fermented, and filtered.
  • Hops may be mixed with the liquid sugar solution during boiling, not before the start of boiling.
  • a so-called low alcoholic beverage having an alcohol content of less than 1% by volume can be produced.
  • Raw materials such as crushed malt used in the present invention, starch such as rice and corn starch, hops, liquid sugar containing carbon source, nitrogen source as amino acid-containing material other than wheat or malt, pigments and the like are particularly limited. What is normally used when manufacturing an effervescent fermented drink can be used in the quantity normally used.
  • the soybean protein degradation product used in the present invention is obtained by degrading soybean protein, defatted soybean, or concentrated soybean protein with a neutral protease. Soybeans have excellent nutritional properties and good digestion and absorption, so that they can meet the increasing consumer health orientation in recent years.
  • the state of the soy protein degradation product is not particularly limited, and may be a degradation product solution or a dry powder.
  • Concentrated soybean protein refers to a product obtained by removing whey components from defatted soybean. For example, what is obtained by elution and removal of whey components from defatted soybeans with water-containing ethanol and drying.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it is a neutral protease.
  • any commercially available neutral protease may be used, or these may be used in combination.
  • Enzymes with high exo-protease activity produce a large amount of short-chain peptides and free amino acids. Therefore, enzymes with high endo-type protease activity are better than enzymes with high exo-protease activity to partially degrade proteins. preferable.
  • a neutral protease means an enzyme having an optimum pH value for protease activity in a neutral region (for example, pH 5.0 to 8.0). Specific examples of such neutral protease include neutral protease derived from Bacillus genus.
  • the soybean protein degradation product used in the present invention preferably has a phenylalanine content of 5% or less, more preferably 4% or less, and more preferably 1.4% or less, based on the total nitrogen content. It is preferably 1% or less.
  • the phenylalanine content of a soybean protein degradation product can be made into a preferable range by adjusting suitably the kind and addition amount of neutral protease used for enzyme reaction, reaction time, etc.
  • the amount of neutral protease added to the reaction solution for the decomposition reaction may be 0.5 to 5% based on the weight of soybean protein, defatted soybean, or concentrated soybean protein.
  • the weight average molecular weight of the soybean protein degradation product used in the present invention is preferably 6000 or more, more preferably 6000 to 35000, and further preferably 8000 to 35000.
  • the weight average molecular weight is 6000 or more, foam retention of the obtained sparkling fermented beverage is improved.
  • the soy protein degradation product is used as a raw material for a fermentation raw material liquid before fermentation with yeast. That is, the soybean protein degradation product is added to or mixed with the fermentation raw material liquid at an arbitrary time before the fermentation process.
  • the fermentation raw material liquid is a filtrate obtained by filtering the saccharified solution
  • the liquid sugar It is a liquid sugar solution in which etc. are mixed.
  • soy protein degradation product may be mixed with a saccharified solution or a liquid sugar solution before filtration, or may be mixed with a filtrate obtained by filtering the saccharified solution or the like. May be mixed after boiling, before removal of the precipitate, or after cooling and before fermentation.
  • a soybean protein degradation product may contain an insoluble matter. In this invention, it is preferable to mix with a fermentation raw material liquid by the time of completion of the boiling process of a fermentation raw material liquid.
  • the amount of soybean protein degradation product used as a part of the fermentation raw material liquid is not particularly limited, but is preferably 0.01% (weight / volume) to 3% (weight / volume) in the fermentation raw material liquid.
  • Example 1 An effervescent fermented beverage made from malt was produced by the method for producing an effervescent fermented beverage of the present invention. First, 25 L of water and 1.5% by weight of neutral protease derived from Bacillus were added to 0.7 kg of purified soybean protein. While stirring, the enzyme reaction was carried out at 50 ° C. for 2 hours to obtain a soybean protein hydrolyzate solution. In addition, as a control, the same procedure was used except that an alkaline protease was used instead of a neutral protease and that the pH of the purified soy protein aqueous solution was adjusted to 9.0 with potassium hydroxide before the addition of the alkaline protease. A protein degradation product solution was obtained.
  • the total nitrogen content and phenylalanine content of these soybean protein degradation product solutions were measured, and the ratio of the phenylalanine content to the total nitrogen content was calculated.
  • the results are shown in Table 1.
  • the soy proteolysate solution obtained by neutral protease (test) is slightly less in total nitrogen than the soy proteolysate solution obtained by alkaline protease (control), but has a phenylalanine content. Remarkably little, the ratio of phenylalanine content to total nitrogen content was also very low.
  • the effervescent fermented drink was manufactured using the soy protein hydrolyzate solution (test) or the soy protein hydrolyzate solution (control). Specifically, to the wort prepared using 5 kg of pulverized malt and 80 L of warm water, 40 kg of liquid sugar, 0.5 kg of yeast extract, 0.02 kg of hops, and any of the soy proteolysate solutions prepared above were added. The whole amount was mixed and about 85 L of warm water was added to prepare about 200 L of fermentation raw material liquid. After the said fermentation raw material liquid was boiled at 100 degreeC for 90 minute (s), the hop koji was removed with the whirlpool.
  • test soy protein hydrolyzate solution
  • control soy protein hydrolyzate solution
  • the amount of ⁇ -phenethyl alcohol and NIBEM values of the two types of sparkling fermented beverages obtained were measured.
  • the NIBEM value is a value obtained by measuring the collapse rate of the poured foam by electric conductivity, and is generally used for evaluation of foam retention of beer and the like.
  • the sensory test of these sparkling fermented drinks was also performed. The sensory test was conducted in accordance with the sensory evaluation method adopted by both the ASBC and EBC organizations, which are also international standards for beer sensory evaluation (by the Beer Brewery Association, “BCOJ Sensory Evaluation Method” 2002). Specifically, the panel was composed of 10 beer brewing engineers and evaluated the taste, beer-like flavor (beer taste), and foam texture in five stages. The results are shown in Table 2.
  • the amount of ⁇ -phenethyl alcohol in the sparkling fermented beverage (test) added with the soy protein hydrolyzate solution (test) was higher than that in the sparkling fermented beverage (control) added with the soy protein decomposed solution (control).
  • the NIBEM value was 136 for the sparkling fermented beverage (control)
  • the obtained filtrate was passed through a Shodex (registered trademark) PROTEIN KW-802.5 column (80 ⁇ 300 mm, Showa Denko KK) at a flow rate of 0.4 mL / min, and the soybean protein degradation product was eluted using the above phosphate buffer. did.
  • the soy protein degradation product was detected by measuring the absorbance at 220 nm. Thereby, the weight average molecular weight of the proteolysate separated and purified in each fraction was calculated from a chart obtained using GPC software (manufactured by Hitachi).
  • Molecular weight markers are 75,000 (Conalbmin, manufactured by GE Healthcare), 43,000 (Ovalbumin, manufactured by GE Healthcare), 29,000 (Carbonic anhydrase, manufactured by GE Healthcare), 13,700 (Ribonuclease A). GE Healthcare), 5,733 (Insulin, manufactured by SIGMA), 1,672 (Neurotensin, manufactured by SIGMA), and 475 (Leupeptin hemisulfate salt, manufactured by SIGMA) were used.
  • FIG. 1 is a chart obtained for each soybean protein degradation product.
  • the soy protein hydrolyzate degraded by alkaline protease control
  • the soy protein hydrolyzate degraded by neutral protease test
  • Example 2 An effervescent fermented beverage that does not use malt as a raw material was produced using soybean protein degradation products that were decomposed using various proteases. Neutase (manufactured by Novozymes) and alphalase (manufactured by Danisco) were used as neutral proteases, and Esperase (manufactured by Novozymes) and alcalases (manufactured by Novozymes) were used as alkaline proteases. These enzymes are all enzymes derived from the genus Bacillus.
  • the total amount of nitrogen in the soybean protein degradation product solution was slightly larger when alkaline protease was used, but there was no significant difference.
  • the phenylalanine content of the soy proteolysate solution using neutral proteases such as neutralase and alpharase was significantly lower than that using alkaline proteases such as esperase and alcalase.
  • test groups 1 to 4 using the soybean protein hydrolyzate prepared using the neutral protease have less ester and sake-like aromas than the test groups 5 and 6 using the alkaline protease. Excellent flavor. From these results, it was found that as the ratio of phenylalanine content to the total nitrogen content in the soy proteolysate used increased, the aroma like ester and sake became stronger and the sensory score also decreased.
  • the test sections 1 to 3 have a very high sensory evaluation, so that the phenylalanine content relative to the total nitrogen amount is 1% or less, so that a very good beer-like sparkling fermented beverage can be obtained. I found out that
  • Example 3 An effervescent fermented beverage made from malt was produced by the method for producing an effervescent fermented beverage of the present invention.
  • the sparkling fermented drink was manufactured using the obtained soybean protein degradation product solution.
  • 40 kg of liquid sugar, 0.5 kg of yeast extract, 0.02 kg of hops, and the soybean protein hydrolyzate solution prepared above are mixed in a wort prepared using 5 kg of crushed malt and 80 L of warm water.
  • about 85 L of warm water was added to prepare about 200 L of fermentation raw material liquid.
  • the hop koji was removed with the whirlpool.
  • 20 L of warm water was added to about 180 L of the fermentation raw material liquid after the removal to adjust the sugar content to 12.0%, and then cooled to 5 ° C. with a plate cooler.
  • Example 5 In the same manner as in Example 1, the amount of ⁇ -phenethyl alcohol and the NIBEM value of the obtained sparkling fermented beverage were measured, and a sensory test was also performed. The results are shown in Table 5. As a result, the effervescent fermented beverage to which the soy protein hydrolyzate solution was added had a small amount of ⁇ -phenethyl alcohol, a small ester-like sake flavor, and an excellent beer-like flavor. Furthermore, the NIBEM value was 191, and it was confirmed that the foam retention of the sparkling fermented beverage was remarkably improved by using a soybean protein hydrolyzate degraded by neutral protease.
  • Example 4 To 1.5 kg of concentrated soybean protein, 25 L of water and a neutral protease derived from the genus Bacillus were added by 1.5% by weight based on the weight of the concentrated soybean protein. The enzyme reaction was carried out at 50 ° C. for 2 hours with stirring to obtain a soybean protein degradation solution. The total nitrogen and phenylalanine contents of these soy protein hydrolyzate solutions were measured, and the ratio of the phenylalanine content to the total nitrogen content was calculated. The results are shown in Table 6. The soy proteolytic solution (test) obtained with neutral protease had a very low ratio of phenylalanine content to total nitrogen content.
  • the sparkling fermented drink was manufactured using the obtained soybean protein degradation product solution.
  • wort prepared using 5 kg of pulverized malt and 80 L of warm water was mixed with 40 kg of liquid sugar, 0.5 kg of yeast extract, 0.02 kg of hops, and the soy proteolysis solution prepared above, and heated water was added approximately.
  • 85 L about 200 L fermentation raw material liquid was prepared.
  • the fermentation raw material liquid was boiled at 100 ° C. for 90 minutes, and then hop koji was removed with a whirlpool.
  • 20 L of warm water was added to about 180 L of the fermentation raw material liquid after removal to adjust the sugar content to 12.0%, and then cooled to 5 ° C. with a plate cooler.
  • the obtained cooled fermentation raw material liquid was transferred to a fermentation tank, inoculated with 25 ⁇ 10 6 muddy yeast per 1 ml of the juice, and fermented at 10 ° C. for 168 hours.
  • the obtained fermentation broth was aged (post-fermented) for 7 days at -1 ° C.
  • the obtained fermented liquor was subjected to diatomaceous earth filtration using a candle filter to remove yeast, protein, and the like, and an intended sparkling fermented beverage was obtained.
  • the amount of ⁇ -phenethyl alcohol and NIBEM value of the sparkling beverage obtained in the same manner as in Example 1 were measured, and further a sensory test was performed.
  • the results are shown in Table 7.
  • the effervescent fermented beverage to which the soy protein hydrolyzate solution was added had a small amount of ⁇ -phenethyl alcohol, a small ester-like sake flavor, and an excellent beer-like flavor.
  • the NIBEM value was 205, and it was confirmed that the foam retention of the sparkling fermented beverage was remarkably improved by using a soybean protein hydrolyzate degraded by neutral protease.
  • the method for producing sparkling fermented beverages of the present invention can produce sparkling fermented beverages with excellent aroma and foam retention, and can be used in the field of manufacturing beverages such as beer, sparkling liquor and non-alcoholic beer. is there.

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Abstract

本発明は、香気への影響を抑制しつつ、泡持ちが改善された発泡性発酵飲料を製造する方法提供することを目的とする。本発明の発泡性発酵飲料の製造方法においては、大豆タンパク、脱脂大豆、又は濃縮大豆タンパクを中性プロテアーゼにより分解することにより得られる大豆タンパク分解物を、酵母による発酵前に発酵原料液の原料とすることを特徴とするし、大豆タンパク分解物のフェニルアラニン含量は、全窒素量に対して５％以下であることが好ましい。

Description

発泡性発酵飲料の製造方法
　本発明は、特定のタンパク分解物を原料として用いた発泡性発酵飲料の製造方法に関する。
　近年、ビールに続く新たなアルコール飲料として、米やコーンスターチ等の麦芽以外の原料を多く使用した発泡酒や、麦芽を一切使用しないビール様発泡性アルコール飲料（ビールのような風味を有する発泡性アルコール飲料）が開発された。しかしながら、発泡酒やビール様発泡性アルコール飲料は、ビールに比べ、香味や泡品質等が劣るという問題がある。特に、泡は、ビール類にとって重要な外観品質であり、泡持ちが劣ることは、消費者にとっての発泡酒等の魅力を半減させてしまうものであり、泡品質の改善が強く望まれている。
　発泡酒等の香味や泡品質等の問題を解決すべく、種々の方法が開示されている。例えば、ビールの泡は麦芽由来の泡タンパク質によるものであるため、起泡性タンパク質の欠乏を補うべく、大豆タンパクを添加することにより、泡持ちを改善する方法がある。
　しかしながら、大豆タンパクをそのまま添加すると、液粘性が上がり、濾過が遅延する等の製造上の問題が引き起こされてしまう。また、大豆タンパクは溶解度が低く、利用効率が劣るという問題もある。そこで、大豆タンパクの分解物を用いることにより、製造上の問題を引き起こすことなく、泡持ちを改善することができる。
　ビール等の原料として大豆タンパクの分解物を用いる方法としては、例えば、（１）ビールや雑酒のような発酵アルコール飲料の製造方法において、原料の一部に小麦グルテンや大豆タンパクのようなビール酵母高資化性アミノ酸高含有蛋白原料の分解物又はその調製物を用いることにより、ビール酵母による発酵を促進して、味覚・風味を増進させ、異臭や未熟臭のない、すっきりとした味覚であり、しかもボディ感のある発酵アルコール飲料を製造する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。その他、（２）平均分子量２００～４，０００のペプチドを主発酵の初期以前の時点で発酵原料液に添加して発酵を行うことにより、従来にない香味を有するビールを製造し得ることを特徴とする、新規ビールの製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
　通常、大豆タンパク等のタンパクの酵素分解物は、アルカリプロテアーゼを用いて調製される（例えば、特許文献２参照）。これは、アルカリ条件下でタンパクを変性させた方が、タンパク分解効率が良いためである。一般に市販されている大豆ペプチドもアルカリプロテアーゼによって分解されている。
特開２００６－１５８２６８号公報 特許第３５４７５３２号公報
　添加する大豆タンパクやその分解物の量が多いほど、発泡酒やビール様発泡性アルコール飲料の泡持ち改善効果は高くなる。しかしながら、大豆タンパク分解物の添加量が多くなるにつれ、ビール類にとって好ましくない香気（主に吟醸香、日本酒様臭）が強くなるという問題がある。このため、大豆タンパク分解物の使用は限定的なものとなっており、泡持ちを十分に向上させることが出来なかった。
　本発明は、香気への影響を抑制しつつ、泡持ちが改善された発泡性発酵飲料を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、アルカリプロテアーゼにより分解された大豆タンパク分解物ではなく、中性プロテアーゼにより分解された大豆タンパク分解物を用いることにより、好ましくない香気を抑制しつつ、泡持ちを向上させた発泡性発酵飲料を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
（１）　大豆タンパク、脱脂大豆、又は濃縮大豆タンパクを中性プロテアーゼにより分解して得られた大豆タンパク分解物を、酵母による発酵前に、発酵原料液の原料に添加・混合する、発泡性発酵飲料の製造方法、
（２）　前記大豆タンパク分解物のフェニルアラニン含量が、全窒素量に対して５％以下である前記（１）に記載の発泡性発酵飲料の製造方法、
（３）　前記大豆タンパク分解物の重量平均分子量が６０００以上である、前記（１）又は（２）に記載の発泡性発酵飲料の製造方法、
（４）　前記大豆タンパク分解物を酵母による発酵前に発酵原料液の原料に添加・混合する工程が、発酵原料液を煮沸する工程中又は当該煮沸工程の前に行われる、前記（１）～（３）のいずれか一つに記載の発泡性発酵飲料の製造方法、
（５）　前記中性プロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の中性プロテアーゼである、前記（１）～（４）のいずれか一つに記載の発泡性発酵飲料の製造方法、
を提供するものである。
　本発明の発泡性発酵飲料の製造方法により、香味に優れ、かつ泡持ちの良好な発泡性発酵飲料を製造することができる。泡持ちは、消費者が発泡性飲料を選択する上で重要な要素であり、本発明に係る製造方法により製造された発泡性発酵飲料には、外観品質上の優位性がもたらされると期待される。
実施例１において、各大豆タンパク分解物について得られたチャートを示した図である。
　本発明及び本願明細書において、発泡性発酵飲料とは、炭酸ガスによる発泡性を有し、かつ発酵工程を経て製造される飲料を意味する。発泡性発酵飲料は、アルコール飲料であってもよく、アルコール含量が１容量％未満であるいわゆるノンアルコール飲料又はローアルコール飲料であってもよい。ノンアルコール飲料であってもよい。また、麦芽を原料とする飲料であってもよく、麦芽を原料としない飲料であってもよい。発泡性発酵飲料としては、具体的には、ビール、麦芽を原料とする発泡酒、麦芽を使用しない発泡性アルコール飲料、ローアルコール飲料、ノンアルコールビール等が挙げられる。その他、麦芽を原料とし、発酵工程を経て製造された飲料を、アルコール含有蒸留液と混和して得られたリキュール類であってもよい。
　なお、アルコール含有蒸留液とは、蒸留操作により得られたアルコールを含有する溶液であり、一般に蒸留酒に分類されるものを用いることができる。例えば、スピリッツ、ウィスキー、ブランデー、ウオッカ、ラム、テキーラ、ジン、焼酎等を用いることができる。呈味に対する影響が少ないため、本発明においては、該アルコール含有蒸留液は、スピリッツであることがより好ましい。
　本発明の発泡性発酵飲料の製造方法は、大豆タンパク又は脱脂大豆を中性プロテアーゼにより分解することにより得られる大豆タンパク分解物を、酵母による発酵前の発酵原料液の原料とすることを特徴とする。従来のアルカリプロテアーゼにより得られた大豆タンパク分解物に代えて、中性プロテアーゼによって分解された大豆タンパク分解物を用いることにより、エステル香が少なく、泡持ちが顕著に改善された発泡性発酵飲料が得られる。このような効果が得られる理由は明らかではないが、以下のように推察される。従来のアルカリプロテアーゼにより得られた大豆タンパク分解物を発酵工程前に添加した場合には、酵母代謝によりフェネチルアルコール、及びそのエステル（酢酸βフェネチル等）が生成されやすい。これに対して、中性プロテアーゼにより得られた大豆タンパク分解物は、アルカリプロテアーゼにより得られたものに比べて、フェニルアラニン含量が非常に少なく、このために、発酵原料液の原料として用いた場合でも、発酵工程におけるフェネチルアルコール等の生成が抑制される結果、吟醸香、日本酒様臭といった、特にビール類にとって好ましくない香気が十分に低減された発泡性発酵飲料が得られる。また、中性プロテアーゼにより得られた大豆タンパク分解物は、アルカリプロテアーゼにより得られたものに比べて分子量の大きい画分が多く、このため、泡持ちが顕著に改善されると推察される。
　まず、一般的な発泡性発酵飲料の製造工程を示す。麦芽を原料として使用する場合と、麦芽を原料として使用しない場合を、それぞれ分けて示す。
　ビールや発泡酒等の麦芽を原料として使用する発泡性発酵飲料は、次の工程で製造される。まず、主原料である麦芽の破砕物と、副原料である米やコーンスターチ等の澱粉質に、温水を加えて混合・加温し、主に麦芽の酵素を利用して、澱粉質を糖化させる。この糖化液を濾過して得られた濾液にホップを加え、煮沸する。又は、ホップを煮沸開始から煮沸終了前のどの段階において混合することもできる。煮沸後、ワールプールと呼ばれる槽でホップ粕等の沈殿物を除去し、プレートクーラーにより適切な発酵温度まで冷却する。冷却した濾液に酵母を接種して、発酵を行う。次いで得られた発酵液を熟成させた後、濾過により酵母及びタンパク質等を除去して、目的の発泡性発酵飲料を得る。
　麦芽を使用しない発泡性発酵飲料を製造する場合には、炭素源を含有する液糖、麦又は麦芽以外のアミノ酸含有材料としての窒素源、ホップ、色素等を、温水と共に混合し、液糖溶液を調製する。該液糖溶液を、麦芽を原料として使用する発泡性発酵飲料の製造工程と同様に、煮沸し、ホップ粕等の沈殿物を除去して冷却後、酵母を接種して発酵させ、濾過することにより、目的の発泡性発酵飲料を得る。ホップは煮沸開始前ではなく、煮沸中に、該液糖溶液に混合してもよい。
　また、工程におけるアルコール発酵を抑制し、発酵により生成されるアルコール含量を低減することにより、アルコール含量が１容量％未満であるいわゆるローアルコール飲料を製造することもできる。
　本発明において用いられる麦芽の破砕物、米やコーンスターチ等の澱粉質、ホップ、炭素源を含有する液糖、麦又は麦芽以外のアミノ酸含有材料としての窒素源、色素等の原料は、特に限定されるものではなく、通常発泡性発酵飲料を製造する場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。
　本発明において用いられる大豆タンパク分解物は、大豆タンパク、脱脂大豆、又は濃縮大豆タンパクを中性プロテアーゼにより分解することにより得られる。大豆は非常に優れた栄養的性質を有しており、消化吸収性も良いため、近年高まっている消費者の健康志向にも添う。大豆タンパク分解物の状態は特に限定されるものではなく、分解物溶液の状態でもよく、乾燥粉末の状態でもよい。なお、濃縮大豆タンパクとは、脱脂大豆からホエー成分を除いたものをいう。例えば、含水エタノールにより脱脂大豆からホエー成分を溶出、除去した後に乾燥して得られるものが挙げられる。
　該酵素は、中性プロテアーゼであれば、特に限定されるものではない。例えば、市販されている中性プロテアーゼのうち、いずれの酵素を用いても良く、またこれらを組み合わせて用いることもできる。エキソ型プロテアーゼ活性の高い酵素は、短鎖ペプチドや遊離アミノ酸を多く産生するため、タンパク質を部分分解するためには、エキソ型プロテアーゼ活性の高い酵素よりも、エンド型プロテアーゼ活性の高い酵素の方が好ましい。なお、本発明及び本願明細書において、中性プロテアーゼとは、プロテアーゼ活性の至適ｐＨ値が中性領域（例えば、ｐＨ５．０～８．０）にある酵素を意味する。このような中性プロテアーゼとしては、具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の中性プロテアーゼ等が挙げられる。
　本発明において用いられる大豆タンパク分解物は、フェニルアラニン含量が、全窒素量に対して５％以下であることが好ましく、４％以下であることがより好ましく、１．４％以下であることがさらに好ましく、１％以下であることが特に好ましい。なお、大豆タンパク分解物のフェニルアラニン含量は、酵素反応に用いる中性プロテアーゼの種類や添加量、及び反応時間等を適宜調整することにより、好ましい範囲内とすることができる。例えば、分解反応の反応液に添加する中性プロテアーゼの量は、大豆タンパク重量、脱脂大豆、又は濃縮大豆タンパクの重量に対して０．５～５％とすることができる。
　本発明において用いられる大豆タンパク分解物の重量平均分子量は、６０００以上であることが好ましく、６０００～３５０００であることがより好ましく、８０００～３５０００であることがさらに好ましい。重量平均分子量が６０００以上であることにより、得られた発泡性発酵飲料の泡持ちが改善される。
　大豆タンパク分解物は、酵母による発酵前の発酵原料液の原料として用いられる。つまり、大豆タンパク分解物は、発酵工程前の任意の時点で、発酵原料液に添加又は混合される。なお、発酵原料液は、麦芽を原料として使用する発泡性発酵飲料の場合には、糖化液を濾過して得られた濾液であり、麦芽を使用しない発泡性発酵飲料の場合には、液糖等を混合した液糖溶液である。
　例えば、大豆タンパク分解物を、濾過前の糖化液や液糖溶液に混合してもよく、糖化液等を濾過して得られた濾液に混合してもよく、この濾液を煮沸前及び煮沸中に混合してもよく、煮沸終了後沈殿物除去前に混合してもよく、冷却後発酵前に混合してもよい。なお、大豆タンパク分解物は不溶物を含むものであってもよい。本発明においては、発酵原料液の煮沸処理完了時までに発酵原料液に混合することが好ましい。
　発酵原料液の一部として用いる大豆タンパク分解物量は、特に限定されるものではないが、発酵原料液に０．０１％（重量／体積）～３％（重量／体積）が好ましい。
　次に実施例及び参考例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。なお、以下の実施例等において、大豆タンパク分解溶液及び発泡性発酵飲料の物理化学分析は、ＡＳＢＣ（American Society of Brewing Chemists）及びＥＢＣ（European Brewery Convention）の両組織に採用されており、ビール分析の国際基準とされている分析法に準じて行った（ビール酒造組合著、「ＢＣＯＪビール分析法」１９９６年）。
［実施例１］
　本発明の発泡性発酵飲料の製造方法により、麦芽を原料とした発泡性発酵飲料を製造した。
　まず、精製大豆タンパク０．７kｇに、水を２５Ｌと、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の中性プロテアーゼを大豆タンパク重量に対して１．５％重量とを添加した。攪拌しながら５０℃で２時間酵素反応を行い、大豆タンパク分解物溶液を得た。
　また、対照として、中性プロテアーゼに変えてアルカリプロテアーゼを用いたこと、及びアルカリプロテアーゼ添加前に水酸化カリウムにて精製大豆タンパク水溶液のｐＨを９．０に調製したこと以外は同様にして、大豆タンパク分解物溶液を得た。
　これらの大豆タンパク分解物溶液の全窒素量及びフェニルアラニン含量を測定し、全窒素量に対するフェニルアラニン含量の割合を算出した。結果を表１に示す。中性プロテアーゼにより得られた大豆タンパク分解物溶液（試験）は、とアルカリプロテアーゼにより得られた大豆タンパク分解物溶液（対照）と比べて、全窒素量は若干少ないだけであるが、フェニルアラニン含量が顕著に少なく、全窒素量に対するフェニルアラニン含量の割合も非常に低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次いで、大豆タンパク分解物溶液（試験）又は大豆タンパク分解物溶液（対照）を用いて、発泡性発酵飲料を製造した。具体的には、粉砕麦芽５ｋｇ及び温水８０Ｌを用いて調製した麦汁に、 液糖４０ｋｇ、酵母エキス０．５ｋｇ、ホップ０．０２ｋｇ、及び上述にて調製したいずれかの大豆タンパク分解物溶液を全量混合し、さらに温水を約８５Ｌ加えることにより、約２００Ｌの発酵原料液を調製した。当該発酵原料液を１００℃で９０分間煮沸した後、ワールプールでホップ粕を除去した。除去後の発酵原料液約１８０Ｌに温水２０Ｌを加えて糖度１２．０％に調製した後、プレートクーラーにより５℃まで冷却した。得られた冷却された発酵原料液約１７０Ｌを発酵タンクに移し、液汁１ｍＬあたり２５×１０６個の泥状酵母を接種し、１０℃で１６８時間発酵を行った。得られた発酵液を、－１℃で７日間熟成（後発酵）させた。得られた発酵液を、キャンドルフィルターを用いて珪藻土濾過を行い、酵母及びタンパク等を除去し、目的の発泡性発酵飲料を得た。
　得られた２種類の発泡性発酵飲料のβフェネチルアルコール量及びＮＩＢＥＭ値を測定した。なお、ＮＩＢＥＭ値は、注がれた泡の崩壊速度を電気伝導度で測定したものであり、ビール等の泡持ち評価に一般的に用いられているものである。さらに、これらの発泡性発酵飲料の官能検査も行った。官能検査は、やはりビール官能評価の国際基準であるＡＳＢＣ及びＥＢＣの両組織に採用されている官能評価法に準じて行った（ビール酒造組合著、「ＢＣＯＪ官能評価法」２００２年）。具体的には、ビール醸造技術者１０名のパネリストで行い、味感、ビールらしい香味（ビールテイスト）や泡の質感について５段階で評価した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この結果、大豆タンパク分解物溶液（試験）を添加した発泡性発酵飲料（試験）は、大豆タンパク分解物溶液（対照）を添加した発泡性発酵飲料（対照）と比べて、βフェネチルアルコール量が少なく、かつ、エステルや日本酒的な香味が少なく、ビールらしい香味に優れていた。さらに、ＮＩＢＥＭ値が、発泡性発酵飲料（対照）が１３６であったのに対して、発泡性発酵飲料（試験）では２０３であり、中性プロテアーゼにより分解された大豆タンパク分解物を用いることにより、発泡性発酵飲料の泡持ちが顕著に改善されることが確認された。
［参考例］
　実施例１で用いた大豆タンパク分解物溶液（試験）及び大豆タンパク分解物溶液（対照）中の大豆タンパク分解物の重量平均分子量を測定した。
　まず、５０ｍＭリン酸緩衝液（１％（重量／体積）ＳＤＳ、１．１７％（重量／体積）ＮａＣｌ、ｐＨ７．０ ）を用いて希釈調整した大豆タンパク分解物溶液を、１０分間超音波処理を行った後、０．２μｍフィルターを用いて濾過した。得られた濾液を、Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＫＷ－８０２．５カラム（８０ｘ３００ｍｍ、昭和電工社製）に流速０．４ｍＬ／分で通し、上記リン酸緩衝液を用いて大豆タンパク分解物を溶出した。大豆タンパク分解物の検出は２２０ｎｍの吸光度を測定して行った。これにより、各画分に分離精製されたタンパク分解物の重量平均分子量を、ＧＰＣソフトウェア（日立社製）を使用して得られたチャートから算出した。分子量マーカーは、７５，０００（Ｃｏｎａｌｂｍｉｎ、ＧＥヘルスケア社製）、４３，０００（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＧＥヘルスケア社製）、２９,０００（Ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ、ＧＥヘルスケア社製）、１３,７００（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ａ、ＧＥヘルスケア社製）、５,７３３（Ｉｎｓｕｌｉｎ、ＳＩＧＭＡ社製）、１，６７２（Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ、ＳＩＧＭＡ社製）、４７５（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ　ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ　ｓａｌｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
　図１は、各大豆タンパク分解物について得られたチャートである。この結果、アルカリプロテアーゼで分解した大豆タンパク分解物（対照）とは異なり、中性プロテアーゼで分解した大豆タンパク分解物（試験）では、溶出時間２０分付近にピークがあった。また、それぞれの重量平均分子量を調べたところ、大豆タンパク分解物（対照）は５７００であり、大豆タンパク分解物（試験）は９１００であった。
［実施例２］
　各種プロテアーゼを用いて分解した大豆タンパク分解物を用いて、麦芽を原料としない発泡性発酵飲料を製造した。中性プロテアーゼとしてニュートラーゼ（ノボザイムス社製）及びアルファラーゼ（ダニスコ社製）を、アルカリプロテアーゼとしてエスペラーゼ（ノボザイムス社製）及びアルカラーゼ（ノボザイムス社製）を用いた。これらの酵素は、いずれもＢａｃｉｌｌｕｓ属由来の酵素である。
　まず、精製大豆タンパク６ｇに、水を２００ｍＬと、表３に記載のプロテアーゼとを添加した。試験区５及び６については、酵素添加前に水酸化ナトリウムを用いてｐＨをそれぞれ、１１．０、９．０に調整した。攪拌しながら５０℃で２時間酵素反応を行った後、２０分間煮沸して大豆タンパク分解物溶液を得た。なお、表３中、「プロテアーゼの添加量（重量％）」は、大豆タンパク重量に対する割合（％重量）を意味する。
　これらの大豆タンパク分解物溶液の全窒素量及びフェニルアラニン含量を測定し、全窒素量に対するフェニルアラニン含量の割合を算出した。算出結果を表３に示す。この結果、大豆タンパク分解物溶液の全窒素量は、アルカリプロテアーゼを用いた場合のほうが、若干多いものの、大きな違いはなかった。しかしながら、中性プロテアーゼであるニュートラーゼやアルファラーゼを用いた場合の大豆タンパク分解物溶液のフェニルアラニン含量は、いずれも、アルカリプロテアーゼであるエスペラーゼやアルカラーゼを用いた場合よりも顕著に少なかった。
　次いで、液糖４００ｇ、酵母エキス５ｇ、及び上述にて調製した各大豆タンパク分解物溶液を全量混合し、温水を約１４００ｍＬ加えることにより、約２０００ｍＬの発酵原料液を調製した。当該発酵原料液を１００℃で９０分間煮沸した後、５℃まで冷却した。当該冷却済発酵原料液を２Ｌの発酵容器に移し、液汁１ｍＬあたり２５×１０６個の泥状酵母を接種し、１２℃で１５０時間発酵を行った。得られた各発泡性発酵飲料の官能検査を行った。官能検査の結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　この結果、中性プロテアーゼを用いて調製された大豆タンパク分解物を用いた試験区１～４は、アルカリプロテアーゼを用いた試験区５や６に比べて、エステルや日本酒的な香気が少なく、ビールらしい香味に優れていた。これらの結果から、用いた大豆タンパク分解物中の、全窒素量に対するフェニルアラニン含量の割合が大きくなるにつれて、エステルや日本酒的な香気が強くなり、かつ官能評点も低下することがわかった。加えて、特に試験区１～３が非常に高い官能評価が得られたことから、全窒素量に対するフェニルアラニン含量が１％以下であることにより、非常に良好なビール様の発泡性発酵飲料が得られることが分かった。
［実施例３］
　本発明の発泡性発酵飲料の製造方法により、麦芽を原料とした発泡性発酵飲料を製造した。
　まず、脱脂大豆３．０kｇに、水を２５Ｌと、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の中性プロテアーゼを脱脂大豆重量に対して１．５％重量添加した。攪拌しながら５０℃で２時間酵素反応を行い、大豆タンパク分解物溶液を得た。
　これらの大豆タンパク分解物溶液の全窒素量及びフェニルアラニン含量を測定し、全窒素量に対するフェニルアラニン含量の割合を算出した。結果を表４に示す。中性プロテアーゼにより得られた大豆タンパク分解物溶液（試験）は、全窒素量に対するフェニルアラニン含量の割合が非常に低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　　　　　　　　　　　　　　　　　 
　次いで、得られた大豆タンパク分解物溶液を用いて、発泡性発酵飲料を製造した。具体的には、粉砕麦芽５ｋｇ及び温水８０Ｌを用いて調製した麦汁に、 液糖４０ｋｇ、酵母エキス０．５ｋｇ、ホップ０．０２ｋｇ、及び上述にて調製した大豆タンパク分解物溶液を全量混合し、さらに温水を約８５Ｌ加えることにより、約２００Ｌの発酵原料液を調製した。当該発酵原料液を１００℃で９０分間煮沸した後、ワールプールでホップ粕を除去した。除去後の発酵原料液約１８０Ｌに温水２０Ｌを加えて糖度１２．０％に調製した後、プレートクーラーにより５℃まで冷却した。得られた冷却された発酵原料液約１７０Ｌを発酵タンクに移し、液汁１ｍＬあたり２５×１０６個の泥状酵母を接種し、１０℃で１６８時間発酵を行った。得られた発酵液を、－１℃で７日間熟成（後発酵）させた。得られた発酵液を、キャンドルフィルターを用いて珪藻土濾過を行い、酵母及びタンパク等を除去し、目的の発泡性発酵飲料を得た。
　実施例１と同様にして、得られた発泡性発酵飲料のβフェネチルアルコール量及びＮＩＢＥＭ値を測定し、さらに官能検査も行った。結果を表５に示す。
　この結果、大豆タンパク分解物溶液を添加した発泡性発酵飲料は、βフェネチルアルコール量が少なく、かつ、エステルや日本酒的な香味が少なく、ビールらしい香味に優れていた。さらに、ＮＩＢＥＭ値が１９１であり、中性プロテアーゼにより分解された大豆タンパク分解物を用いることにより、発泡性発酵飲料の泡持ちが顕著に改善されることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
[実施例４]
濃縮大豆タンパク１．３kｇに水を25L及びＢａｃｉｌｌｕｓ属由来の中性プロテアーゼを濃縮大豆タンパク重に対して1.5%重量添加した。攪拌しながら50℃で２時間酵素反応を行い、大豆タンパク分解溶液を得た。
これらの大豆タンパク分解物溶液の全窒素及びフェニルアラニン含量を測定し、全窒素量に対するフェニルアラニン含量の割合を算出した。結果を表６に示す。中性プロテアーゼにより得られた大豆タンパク分解溶液（試験）は、全窒素量に対するフェニルアラニン含量の割合が非常に低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
次いで、得られた大豆タンパク分解物溶液を用いて、発泡性発酵飲料を製造した。具体的には、粉砕麦芽5kg及び温水80Lを用いて調製した麦汁に、 液糖40kg、酵母エキス0.5kg、ホップ0.02kg及び上述にて調製した大豆タンパク分解溶液を全量混合し、温水を約85L加えることにより約200Lの発酵原料液を調製した。当該発酵原料液を100℃で90分間煮沸した後、ワールプールでホップ粕を除去した。除去後の発酵原料液約１８０L に温水２０L を加え、糖度12.0%に調製した後、プレートクーラーにより5℃まで冷却した。得られた冷却された発酵原料液約１７０Ｌを発酵タンクに移し、液汁1mlあたり２５×106個の泥状酵母を接種し、10℃で168時間発酵を行った。得られた発酵液を、－１℃で7日間熟成（後発酵）させた。得られた発酵液をキャンドルフィルターを用いて珪藻土濾過を行い、酵母及びタンパク等を除去し、目的の発泡性発酵飲料を得た。
実施例１と同様にして得られた発泡性飲料のβフェネチルアルコール量及びＮＩＢＥＭ値を測定し、さらに官能検査を行った。結果を表７に示す。
この結果、大豆タンパク分解物溶液を添加した発泡性発酵飲料は、βフェネチルアルコール量が少なく、かつ、エステルや日本酒的な香味が少なく、ビールらしい香味に優れていた。さらにＮＩＢＥＭ値が２０５であり、中性プロテアーゼにより分解された大豆タンパク分解物を用いることにより、発泡性発酵飲料の泡持ちが顕著に改善されることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明の発泡性発酵飲料の製造方法により、香気と泡持ちに優れた発泡性発酵飲料を製造することができるため、ビール、発泡酒、ノンアルコールビール等の飲料の製造分野で利用が可能である。

Claims (5)

  1. 　大豆タンパク、脱脂大豆、又は濃縮大豆タンパクを中性プロテアーゼにより分解して得られた大豆タンパク分解物を、酵母による発酵前に、発酵原料液の原料に添加・混合する工程を有する、発泡性発酵飲料の製造方法。
  2. 　前記大豆タンパク分解物のフェニルアラニン含量が、全窒素量に対して５％以下である、請求項１に記載の発泡性発酵飲料の製造方法。
  3. 　前記大豆タンパク分解物の重量平均分子量が６０００以上である、請求項１又は２に記載の発泡性発酵飲料の製造方法。
  4. 　前記大豆タンパク分解物を酵母による発酵前に発酵原料液の原料に添加・混合する工程が、発酵原料液を煮沸する工程中又は当該煮沸工程の前に行われる、請求項１～３に記載の発泡性発酵飲料の製造方法。
  5. 　前記中性プロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の中性プロテアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の発泡性発酵飲料の製造方法。
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