WO2011065751A2 - 다공성 필름이 부착되어 있는 멤브레인 바이오센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법 - Google Patents

다공성 필름이 부착되어 있는 멤브레인 바이오센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법 Download PDF

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김민곤
신용범
오영경
정효암
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한국생명공학연구원
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing

Definitions

  • the present invention relates to a membrane sensor and a method for measuring an immune response or an enzyme reaction using the same, and more particularly, to a membrane sensor for rapidly measuring an antigen-antibody response and a method for measuring an immune response or an enzyme reaction using the same.
  • LFA Lateral flow assay
  • the antibody immobilized on the membrane and the antibody immobilized on the gold nanoparticles, which can selectively bind to the sample material, are configured to be bonded in a sandwich form to the sample material.
  • the absorption pad is made of a material that can absorb a liquid sample well.
  • the sensitivity that can be measured by the conventional LFA method is about 1 ng / mL of the antigenic protein, which is difficult to measure in the case of a sample requiring higher sensitivity.
  • Membrane strip biosensor system for field diagnosis as a membrane type sensor Kerrea Patent No. 599420; Composite sensor membrane (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-507511); Electrochemical membrane strip biosensor (Korean Patent 348351); Method for Determining Concentration of Multiple Analytes in a Single Fluid Sample (US Pat. No. 7494818); A sensor having a membrane and a method of manufacturing the same (Korean Patent No. 591390); Various forms such as a Test Device for Simultaneous Measurement of Multiple Analytes in a Single Sample (US Patent Publication No. 2005-214161) have been disclosed.
  • the sensitivity of the sensor is improved by adjusting the sensitivity of the sensor using a porous film, the multi-component material is detected at the same time, and the sample usage time and the analyte detection time are measured by vertical injection of the sample. No technique has been proposed to reduce.
  • the present inventors made an effort to manufacture a highly sensitive membrane biosensor using techniques that were not implemented in the prior art. As a result, after fabricating a membrane biosensor in which a porous film is bonded to the membrane to which the receptor is fixed, the sample is used. In the case of analyzing, it was confirmed that the sample analysis is possible in a short time even with a small amount of samples, and thus, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a highly sensitive membrane biosensor capable of simultaneously detecting several kinds of immune or enzyme reactions.
  • the present invention is to provide a method for measuring an immune response or enzyme reaction using the high sensitivity membrane biosensor.
  • the present invention provides a membrane biosensor, characterized in that a porous film having a plurality of holes on the membrane is attached, the receptor is fixed on the membrane corresponding to each hole position.
  • the present invention is also characterized in that a porous film having a plurality of pores is attached to the membrane, a receptor is fixed on the membrane corresponding to each pore position, and a conjugate pad is formed on the porous film.
  • a membrane biosensor Provided is a membrane biosensor.
  • the present invention also provides a method for measuring immune response comprising using a membrane biosensor, injecting a sample vertically into the membrane biosensor.
  • the present invention also provides a method for measuring enzymatic reaction comprising using the membrane biosensor, injecting a sample vertically into the membrane biosensor.
  • the present invention it is possible to control the sensitivity of the membrane biosensor by adjusting the pore size of the porous film, to measure the analyte with high sensitivity using only a small amount of sample, and attach various kinds of receptors to the membrane sensor. It is possible to measure various types of analytes simultaneously.
  • FIG. 1 is an example of a membrane biosensor according to the present invention.
  • FIG. 2 is another example of a membrane biosensor according to the present invention.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of analysis by injecting a sample after fixing three different receptors to the membrane biosensor according to the present invention.
  • Figure 4 is a photograph showing the results of detecting the CRP using the membrane biosensor according to the present invention (Control: anti-mouse IgG fixation, Test: anti-CRP polyclonal antibody fixation).
  • Figure 5 is a graph showing the results of measuring the absorbance of the concentration and time of the CRP using the membrane biosensor according to the present invention.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of detecting the CRP using the LFA biosensor as a comparative example.
  • FIG. 7 is a graph showing a result of measuring the absorbance according to the concentration of CRP using the membrane biosensor and LFA biosensor according to the present invention (FTH: membrane biosensor according to the present invention, LFA: LFA biosensor).
  • Figure 8 is a photograph showing the results of detecting the CRP by enzyme-chemiluminescence reaction using the membrane biosensor according to the present invention (Control: anti-mouse IgG fixation, Test: anti-CRP polyclonal antibody fixation).
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the concentration of the CRP and the luminescence over time by enzyme-chemiluminescence reaction using the membrane biosensor according to the present invention.
  • FIG. 10 is a photograph showing the result of detecting D-glucose by enzyme-chemiluminescence reaction using the membrane biosensor according to the present invention (Control: fix peroxidase only, Test: fix glucose oxidase and peroxidase).
  • 11 is a graph showing the results of measuring the luminescence according to the concentration of D-glucose by enzyme-chemiluminescence reaction using the membrane biosensor according to the present invention.
  • FIG. 12 is a photograph showing the result of measuring the total cholesterol of the control serum by the enzyme-color reaction using the membrane biosensor according to the present invention.
  • T moiety in which cTnI antibody is immobilized as a receptor
  • the present invention relates to a membrane biosensor characterized in that a porous film is attached to a membrane on which a receptor is fixed (FIG. 1).
  • the present invention relates to a membrane biosensor, wherein a porous film is attached to a membrane on which a receptor is fixed, and a conjugate pad is formed on the porous film (FIG. 2).
  • the present invention by manufacturing a biosensor by attaching a porous film to the membrane, it is possible to adjust the sensitivity of the sensor according to the pore size of the porous film, and to measure the analyte of the multi-component according to the number of pores of the porous film It is characterized by.
  • the membrane biosensor according to the present invention uses a Flow Through Hole (FTH) method to drop the sample vertically when measuring the immune response or enzyme reaction, so that the reaction can be measured in a short time with a small amount of sample.
  • FTH Flow Through Hole
  • the term “porous” means having a plurality of holes
  • “porous film” means a film in which a plurality of holes are formed.
  • hole refers to a hole that is large enough to serve as a reaction well so that the sample and the receptor can react in the hole.
  • the membrane may use a membrane capable of absorbing the sample solution, and the specific type of membrane may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the membrane may be characterized in that the nitrocellulose membrane (nitrocellulose membrane).
  • nitrocellulose membrane nitrocellulose membrane
  • Dropping a sample, such as a protein, onto the nitrocellulose membrane causes the protein to be immobilized without large diffusion at the initial distant location. Therefore, when a sample is injected into the pores of the porous film bonded on the nitrocellulose membrane, a selective reaction between the receptor and the sample occurs at the membrane below each hole to measure the signal.
  • the method of immobilizing the receptor on the membrane can use both a physical adsorption method and a chemical method, and the specific immobilization method can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the size of the hole of the porous film may be characterized in that 10 ⁇ m ⁇ 5000 ⁇ m, but is not limited thereto, 10 ⁇ 4000 ⁇ m, 10 ⁇ 3000 ⁇ m, 10 ⁇ 2000 ⁇ m, 10 ⁇ 1000 ⁇ m, 50-5000 ⁇ m, 50-4000 ⁇ m, 50-3000 ⁇ m, 50-2000 ⁇ m, 50-1000 ⁇ m, 100-5000 ⁇ m, 100-4000 ⁇ m, 100-3000 ⁇ m, 100-2000 ⁇ m, 100-1000 200 ⁇ m, 200 ⁇ m to 5000 ⁇ m, 200 ⁇ m to 4000 ⁇ m, 200 ⁇ m to 3000 ⁇ m, 200 ⁇ m to 2000 ⁇ m, or 200 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the porous film may be made of a material that is easy to hole processing, for example, may be made of a material such as polymer, glass, elastomer, silicon, but is not limited thereto.
  • a material such as polymer, glass, elastomer, silicon, but is not limited thereto.
  • the porous film may have a thickness of 0.01 to 1 mm, 0.01 to 0.8 mm, 0.01 to 0.6 mm, 0.01 to 0.4 mm, 0.01 to 0.2 mm, 0.05 to 1 mm, 0.05 to 0.8 mm , 0.05 to 0.6 mm, 0.05 to 0.4 mm, or 0.05 to 0.2 mm, but is not limited thereto.
  • the porous film may be an adhesive film having an adhesive applied to the surface in contact with the membrane.
  • the porous film can be attached simply by cutting the porous film to an appropriate size and then covering the membrane.
  • the present invention is not limited thereto, and various methods for attaching the porous film and the membrane are well known in the art and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the receptor is preferably reacted selectively with the analyte, and specifically, antibodies, antigens, enzymes, peptides, proteins, DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNA) and aptamers (aptamers). It may be characterized in that selected from the group consisting of.
  • selective refers to a property to which two specific materials specifically bind to each other, and may be used interchangeably with the term "specific”.
  • the sample used in the membrane biosensor may further comprise a conjugate of a substance and a signal generating material that selectively bind to the analyte.
  • the sample used in the membrane biosensor according to the present invention may be, for example, any sample with or without an analyte, and the sample with or without such an analyte is selective for the analyte.
  • the sample may be a mixture of a conjugate of a substance and a signal generating substance that bind to each other.
  • a conjugate of a substance selectively binding to an analyte and a signal generating substance may be injected into a membrane biosensor after injection of a sample separately from the sample, or applied to a conjugate pad or a sample pad and then dried.
  • the "substance that selectively binds to the analyte” is a substance that specifically binds to the analyte, for example antibodies, antigens, enzymes, peptides, proteins, DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNA) and It may be selected from the group consisting of aptamers.
  • the "material selectively binding to the analyte” may be the same material as the receptor fixed to the membrane of the biosensor, or may be a different material from the receptor.
  • the signal generating material may be a metal nanoparticle, a quantum dot nanoparticle, a magnetic nanoparticle, an enzyme, an enzyme substrate, an enzymatic reaction generating material, an absorbing material, a fluorescent material or a luminescent material.
  • a metal nanoparticle a quantum dot nanoparticle, a magnetic nanoparticle, an enzyme, an enzyme substrate, an enzymatic reaction generating material, an absorbing material, a fluorescent material or a luminescent material.
  • the analyte may be detected through the color change of the metal nanoparticle by a selective reaction between the receptor and the analyte, and the analyte selectively bound to the receptor on the membrane.
  • the analyte can be quantitatively analyzed by measuring the absorbance and electrical conductivity of the conjugate of the metal nanoparticles.
  • metal nanoparticles may be, for example, gold nanoparticles, silver nanoparticles, copper nanoparticles, and the like, but are not limited thereto.
  • the analyte may be detected through fluorescence of the quantum dot nanoparticle by a selective reaction between the receptor and the analyte.
  • the analyte may be detected through a change in the magnetic field caused by the selective reaction between the receptor and the analyte.
  • a redox reaction is performed by reacting the analyte or receptor with the enzyme, enzyme substrate, or enzyme reaction product by a selective reaction between a receptor and an analyte. Enzymatic reactions such as, etc. may be caused, and the analyte may be detected by measuring absorption, fluorescence, and luminescence of the product by the enzyme reaction.
  • enzymes may be, for example, but not limited to, glucose oxidase, glucose dehydrogenase, alkaline phosphatase, peroxidase, and the like
  • the enzyme substrate may be, for example, but not limited to, glucose, hydrogen peroxide, and the like.
  • the signal generating material a light absorbing material, a fluorescent material, or a light emitting material known in the art may be used, and a specific kind thereof may be appropriately selected by those skilled in the art. According to one embodiment of the present invention, luminol may be used, but is not limited thereto.
  • an antibody selective to the protein is immobilized on the membrane as a receptor
  • a sample may use a mixture of the protein antigen and an antibody-gold nanoparticle conjugate selective to the protein antigen.
  • the antibody of the conjugate and the antibody immobilized on the membrane selectively bind to the protein antigen, which is an analyte, respectively, and the sandwich of the antibody-protein antigen-conjugate of the antibody-protein antigen-conjugate immobilized on the membrane Gold nanoparticles are coupled to the nanoparticles, thereby detecting the analyte due to the color change of the gold nanoparticles.
  • different receptors are fixed for each hole of the porous film, different analytes can be detected for each hole, so that the analyte of multiple components can be measured according to the number of holes.
  • a conjugate pad is formed on the porous film, and the conjugate pad includes a signal generating material;
  • the conjugate may be dried after being coated with a conjugate of a substance and a signal generating substance that selectively bind to the analyte.
  • the receptor reacts with the signaling material on a membrane together with a receptor.
  • the analyte may be measured as a signal of a signal generating agent by an enzyme reaction.
  • the conjugate pad is dried after being coated with a conjugate of a substance and a signal generating substance that selectively binds the analyte to the conjugate pad, when only the analyte is dropped vertically on the membrane sensor, the "receptor-analyte-conjugate pad is applied.”
  • the analyte is measured by the signal of the signal generating material by the selective reaction between the receptor and the analyte, which is combined in the order of "conjugate of a substance and a signal generating material selectively binding to the analyte applied and dried on the target material.” can do.
  • the conjugate pad may be used as long as the conjugate pad is wetted with a liquid after the conjugate pad is applied and dried, and the conjugate pad is a substance falling easily from the conjugate pad, and any conjugate pad generally used in an LFA system. Can be used.
  • a sample pad may be formed on the bonded pad.
  • the sample pad filters out foreign substances in the analyte, which enables more accurate measurement than the sensor.
  • the sample pad serves to filter out blood cells or platelets contained in the blood (FIG. 2).
  • the sample pad can use all the sample pads used in the LFA system.
  • the sample pad includes a signal generating material;
  • the conjugate may be dried after being coated with a conjugate of a substance and a signal generating substance that selectively bind to the analyte.
  • the membrane biosensor may be characterized by sandwiching the membrane to improve the flow of fluid between the conjugate pad and the porous film.
  • a screen mesh Zonyl FSN 100, SEFAR
  • a vivid membrane Pall, Vivid Plasma Separation-GR
  • the membrane biosensor may be characterized by partitioning the membrane into an area including each hole of the porous film. That is, the membrane may be partitioned so that one membrane region includes one hole so as not to interfere with each other in the flow of the sample flowing under each hole of the porous film.
  • the partitioning of the regions allows separation of the regions of the membrane under each of the pores of the porous film from each other, so that samples flowing under each of the pores do not affect each other, thereby increasing the reproducibility of the measurement.
  • the method of partitioning a region in the membrane may be used by any method known in the art and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a laser processor may be used to partition the area of the membrane.
  • the present invention relates to a method for measuring immune response, comprising using a membrane biosensor and vertically injecting a sample into the membrane biosensor.
  • the present invention relates to a method for measuring enzyme reaction, comprising using a membrane biosensor and vertically injecting a sample into the membrane biosensor.
  • glucose oxidase and peroxidase are fixed to the membrane under the porous film as a receptor, and a conjugate pad dried by applying a chromogenic substrate of peroxidase (for example, luminol) is applied.
  • a chromogenic substrate of peroxidase for example, luminol
  • the membrane biosensor by injecting a sample vertically into the membrane biosensor, not only can the analyte be measured with high sensitivity using a small amount of sample but also the analyte can be detected in a short time. Do.
  • the membrane biosensor may be characterized in that a different type of receptor is fixed to each hole.
  • a different type of receptor is fixed to each hole.
  • Nitrocellulose membranes (Millipore, 180 sec Nitrocellulose) were cut into squares approximately 2.5 cm in length and width. Thereafter, a 0.1 mm thick polyacrylic double-sided tape was cut into squares of about 1 cm in width and length, and three holes of about 0.4 mm in diameter were formed to form a hole to prepare a porous film. Attached to.
  • CTnI antibody anti-troponin I polyclonal antibody, Hytest, FIN
  • anti-mouse IgG anti-mouse IgG
  • FIG. 3 is a magnified image of the sample injection surface (a), the opposite surface of the sample injection (b), and the opposite surface of the sample injection (c) measured 3 minutes after the sample is injected, and B (a portion where the BSA is fixed as a receptor).
  • B a portion where the BSA is fixed as a receptor
  • C where the anti-mouse IgG is fixed as a receptor
  • T where the cTnI antibody polyclonal antibody is immobilized as a receptor increases as cTnI concentration increases.
  • 0.1 mL of 0.1 M boric acid buffer pH 8.5 was added to 1 mL of gold nanoparticle colloid solution (20 nm, BBInternational, GB), and 10 ⁇ l of 1 mg / mL anti-CRP antibody (Abcam) was added for 30 minutes. I was. After the reaction, 1% (w / v) of BSA (protease free Bovine serum albumin, Fitzerald) dissolved in phosphate buffered saline (PBS, Gibco, USA) was added and reacted at 4 ° C. for 60 minutes. After the reaction, centrifuged at 10,000 rpm and 4 ° C.
  • BSA prote free Bovine serum albumin
  • Nitrocellulose membrane (Millipore, 240 sec Nitrocellulose) was cut to a size of about 15 ⁇ 15mm, and a laser-shaped wire was drawn on the membrane.
  • a 0.1 mm thick polyacrylic double-sided adhesive tape was cut to a size of 10 ⁇ 10 mm, and a film was prepared to form two holes by drilling two holes of 0.5 mm size left and right, and then attached to the membrane. In this case, the two holes of the adhesive were arranged to each of the left and right in the shape of a worker engraved on the membrane. The reason for doing this is to ensure that each flow does not affect each other as the liquid sample flows through the two holes.
  • the sensor of the present invention has a wider measurable range compared to the measurement area of a general LFA sensor. These results are a characteristic of the sensor of the present invention can obtain a stable measurement results in a short time, there is an advantage that has a wider measurement range compared to the conventional sensor.
  • Gold nanoparticle-antibody conjugate synthesis and conjugate pads were prepared in the same manner as in Example 2-2, Example 2 above.
  • the nitrocellulose membrane (Millipore, 180 sec Nitrocellulose) was cut into 25 mm x 300 mm and attached to an adhesive 300 mm x 60 mm plastic card (Millipore).
  • a 1 mg / ml anti-mouse IgG (sigma), a bed speed of 7.0 cm / sec, a pump speed of 0.8 ul / cm and a volume of 50 ul were applied to the control line in a nitrocellulose membrane using a dispenser (zeta co.) 1 mg / ml anti-CRP polyclonal antibody (abcam), bed speed 7.0 cm / sec, pump speed 0.8 ul / cm, volume 50 ul were applied.
  • the absorbent pad (Millipore) was attached to the plastic card so as to overlap about 0.2 mm in the upper direction of the nitrocellulose membrane, and cut into 3.5 mm x 60 mm.
  • 3.8 mm x 60 mm inter pads (MF1, whatman), fused pads (fusion 5, whatman), and sample pads (Millipore), which were dried with gold nanoparticle-antibody conjugates, in the downward direction of the nitrocellulose membrane of the cut structure. It was attached to the plastic card so as to overlap about 0.2 mm.
  • the completed structure was inserted into an LFA case (Inforpia) to prepare an LFA biosensor.
  • the CRP signal was analyzed in the same manner as in Example 2-3 of the previous example.
  • Figure 6 shows the CRP analysis using the LFA biosensor, the CRP concentration was detected in the range of 0.1 ⁇ 10 ⁇ g / mL CRP.
  • Table 3 shows the results of absorbance analysis in the same manner as in Example 1-3.
  • the LFA sensor does not show a difference in absorbance in proportion to the concentration when the CRP concentration is 0.1 to 10 ⁇ g / mL, whereas the membrane sensor according to the present invention has a CRP concentration of 0 to 5 ⁇ g / mL. In this case, the absorbance also increased with increasing concentration.
  • the sensor of the present invention has a wider measurable range with respect to the concentration of the analyte. It can be seen that it can be measured quantitatively. Therefore, the sensor of the present invention has a merit that it is possible not only to obtain a stable measurement result in a short time, but also to provide accurate quantitative analysis because the detection range is wider and the sensitivity is higher than that of a conventional LFA sensor.
  • D-glucose (Duchefa Biochemie) and luminol (Sigma) were dissolved in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.0) to 50 mM, respectively, and 20 ⁇ l of the sample pad (Milipore) cut into 7.5 ⁇ 3.5 mm was injected and dried. .
  • the anti-CRP antibody-peroxidase complex (Abcam) was dissolved in PBS buffer at a concentration of 20 ⁇ g / mL, and then, on a vivid membrane (Pall, Vivid Plasma Separation-GR) cut to a size of about 7.5 ⁇ 3.5 mm, about 7 ⁇ L was injected and dried.
  • Nitrocellulose membrane (Millipore, 240 sec Nitrocellulose) was cut to a size of about 15 ⁇ 15mm, and a laser-shaped wire was drawn on the membrane.
  • a 0.1 mm thick polyacrylic double sided adhesive tape was cut into 10 ⁇ 10 mm sizes, and a film was prepared to form two holes by drilling two holes of 0.5 mm size left and right, and then attached to the membrane. In this case, the two holes of the adhesive were arranged to each of the left and right in the shape of a worker engraved on the membrane.
  • one hole contains 0.5 mg / mL of anti-CRP polyclonal antibody (Abcam) and 250 U / mL mixture of glucose oxidase (Sigma) as a receptor, and the other hole has 0.5 1 ⁇ l of a mixture of mg / mL, anti-mouse IgG (Sigma, DE), and 250 U / mL of glucose oxidase were injected, 5 ⁇ l of BSA dissolved in PBS buffer at a concentration of 10 mg / mL, and 10 ⁇ l of PBS buffer. It was injected and dried in order.
  • Luminol (Sigma) was dissolved in 0.1 M Carbonate buffer (pH 9.0) to 50 mM, respectively, and 20 ⁇ L of the sample pad (Milipore) cut into 7.5 ⁇ 3.5 mm was injected and dried.
  • Nitrocellulose membrane (Millipore, 240 sec Nitrocellulose) was cut to a size of about 15 ⁇ 15mm, and a laser-shaped wire was drawn on the membrane.
  • a 0.1 mm thick double-sided adhesive tape was cut into 10 ⁇ 10 mm sizes, and a film was prepared to form two holes by right and left holes of 0.5 mm size, and then attached to the membrane. In this case, the two holes of the adhesive were arranged to each of the left and right in the shape of a worker engraved on the membrane.
  • the nitrocellulose membrane (Millipore, 240 sec Nitrocellulose) was cut to a size of about 15 ⁇ 15 mm, and three circles were drawn in a regular triangular array so that the membrane was 2 mm in diameter with a laser processor.
  • a reaction solution for measuring total cholesterol was prepared on the nitrocellulose membrane where laser processing was completed, and 2 ⁇ L of each circle was dried and dried.
  • composition and content of the reaction solution used for measuring total cholesterol are shown in Table 5 below.
  • a 0.1 mm thick double-sided adhesive tape was cut into 10 ⁇ 10 mm sizes, and a film was prepared to form three holes by forming three holes having a size of 1 mm at the center of each circle, Attached to the membrane, was prepared by laminating a sample pad (Milipore) cut to a size 5 ⁇ 5mm.
  • Lipids control human serum Level 1 and Level 2 (Liquichek TM , BIO-RAD) were injected into the prepared biosensors to compare the degree of color development of Level 1 and Level 2.
  • Level 1 and Level 2 control serum used are quality control serum, Level 1 contains normal concentration and Level 2 abnormal concentration of high cholesterol.

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Abstract

본 발명은 다공성 필름이 부착되어 있는 멤브레인 센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 리셉터가 고정되어 있는 멤브레인상에 다공성 필름이 결합되어 있는 멤브레인 센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 다공성 필름의 구멍 크기를 조절하여 멤브레인 바이오센서의 감도를 조절할 수 있고, 이에 따라 적은 양의 시료만을 이용해서 고감도로 분석대상물질을 측정할 수 있고, 멤브레인 센서에 여러 종류의 리셉터를 부착하여 다양한 종류의 분석대상물질을 동시에 측정할 수 있다.

Description

다공성 필름이 부착되어 있는 멤브레인 바이오센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법
본 발명은 멤브레인 센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 항원-항체 반응을 신속하게 측정하는 멤브레인 센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법에 관한 것이다.
항체-항원 반응을 신속하게 측정하는 방법으로 LFA (lateral flow assay) 시스템이 많이 사용된다. LFA는 일반적으로 액체 시료가 모세관 현상으로 흐를 수 있는 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류층에는 접합체 패드와 시료 패드가 연결되어 있고, 멤브레인의 하류층에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 접합체 패드에는 시료물질과 선택적으로 결합할 수 있는 항체가 고정화된 금 나노입자 접합체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 시료물질과 선택적으로 반응하는 항체 및 금 나노입자에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화되어 있다. 상기 시료물질과 선택적으로 결합할 수 있는, 멤브레인에 고정화된 항체와 금 나노입자에 고정화된 항체는 시료물질에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 잘 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 LFA 장치에 액체 시료용액을 샘플 패드에 떨어뜨리면, 시료가 존재할 경우 시료에 선택성을 가지는 항체-금 나노입자와 멤브레인에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다.
그러나, 종래의 LFA 방법으로 측정할 수 있는 감도는 항원 단백질 약 1ng/mL정도로서, 더 높은 감도를 요구하는 시료의 경우 측정하기 어려운 단점이 있다. 또한 보다 간편하게 측정하기 위해 시료의 부피를 줄이고 측정시간을 더 줄일 필요성이 있다.
멤브레인형 센서로서 현장진단용 멤브레인 스트립 바이오센서 시스템 (한국등록특허 599420); 복합센서 멤브레인(일본공개특허 2006-507511); 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서(한국등록특허 348351); Method for Determining Concentration of Multiple Analytes in a Single Fluid Sample (미국등록특허 7494818); 멤브레인을 갖는 센서 및 그 제조방법(한국등록특허 591390); Test Device for Simultaneous Measurement of Multiple Analytes in a Single Sample(미국공개특허 2005-214161) 등과 같이 다양한 형태가 공개된 바 있다. 그러나, 상기 공개된 특허들에서는 다공성 필름을 이용하여 센서의 감도를 조절함으로써 센서의 감도를 향상시키고, 다성분의 물질을 동시에 검출하며, 시료의 수직 주입에 의해 시료 사용량 및 분석대상물질 검출시간을 감소시킬 수 있는 기술이 제시된 바 없었다.
이에 본 발명자들은 종래 기술에서 구현하지 못했던 기술들을 이용하여 고감도의 멤브레인 바이오센서를 제작하고자 예의 노력한 결과, 리셉터가 고정되어 있는 멤브레인에 다공성 필름을 결합시킨 멤브레인 바이오센서를 제작한 후, 이를 이용하여 시료를 분석할 경우, 소량의 시료만으로도 빠른 시간 안에 시료분석이 가능하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 여러 종류의 면역반응 또는 효소반응을 동시에 검출할 수 있는 고감도의 멤브레인 바이오센서를 제공하고자 한다. 본 발명은 상기 고감도의 멤브레인 바이오센서를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 멤브레인상에 다수의 구멍을 가진 다공성 필름이 부착되어 있고, 각 구멍 위치에 해당하는 멤브레인상에 리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 또한, 멤브레인상에 다수의 구멍을 가진 다공성 필름이 부착되어 있고, 각 구멍 위치에 해당하는 멤브레인상에 리셉터가 고정되어 있으며, 상기 다공성 필름상에 접합체 패드가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 멤브레인 바이오센서를 이용하되, 상기 멤브레인 바이오센서에 시료를 수직으로 주입하는 단계를 포함하는 면역반응 측정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 멤브레인 바이오센서를 이용하되, 상기 멤브레인 바이오센서에 시료를 수직으로 주입하는 단계를 포함하는 효소반응 측정방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 다공성 필름의 구멍 크기를 조절하여 멤브레인 바이오센서의 감도를 조절할 수 있고, 적은 양의 시료만을 이용해서 고감도로 분석대상물질을 측정할 수 있으며, 멤브레인 센서에 여러 종류의 리셉터를 부착하여 다양한 종류의 분석대상물질을 동시에 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서의 일예이다.
도 2는 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서의 다른 예이다.
도 3은 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서에 3가지의 다른 리셉터를 고정한 후, 시료를 주입하여 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서를 이용하여 CRP를 검출한 결과를 나타낸 사진이다(Control: anti-mouse IgG 고정, Test: anti-CRP 폴리클로날 항체 고정).
도 5는 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서를 이용하여 CRP의 농도 및 시간에 따른 흡광도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 비교예로서 LFA 바이오센서를 이용하여 CRP를 검출한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서와 LFA 바이오센서를 이용하여 CRP의 농도에 따른 흡광도를 측정한 비교 결과를 보여주는 그래프이다(FTH: 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서, LFA: LFA 바이오센서).
도 8은 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서를 이용하여 효소-화학발광 반응으로 CRP를 검출한 결과를 나타낸 사진이다(Control: anti-mouse IgG 고정, Test: anti-CRP 폴리클로날 항체 고정).
도 9는 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서를 이용하여 효소-화학발광 반응으로 CRP의 농도 및 시간에 따른 발광도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서를 이용하여 효소-화학발광 반응으로 D-글루코스를 검출한 결과를 나타낸 사진이다(Control: 퍼옥시다제만 고정, Test: 글루코스 옥시다아제 및 퍼옥시다제 고정).
도 11은 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서를 이용하여 효소-화학발광 반응으로 D-글루코스의 농도에 따른 발광도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서를 이용하여 효소-발색 반응으로 control serum의 총 콜레스테롤을 측정한 결과를 보여주는 사진이다.
<도면 부호의 상세한 설명>
1: 멤브레인 / 11: 다공성 필름
21, 31 : 리셉터 / 41: 시료
51: 접합체 패드 / 61: 샘플 패드
T: 리셉터로서 cTnI 항체가 고정된 부분
C: 리셉터로서 anti-mouse IgG가 고정된 부분
B: 리셉터로서 BSA가 고정된 부분
본 발명은 일 관점에서, 리셉터가 고정되어 있는 멤브레인상에 다공성 필름이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서에 관한 것이다 (도 1).
본 발명은 다른 관점에서, 리셉터가 고정되어 있는 멤브레인상에 다공성 필름이 부착되어 있고, 상기 다공성 필름상에 접합체 패드가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서에 관한 것이다 (도 2).
본 발명은 멤브레인에 다공성 필름을 부착시켜 바이오센서를 제조함으로써, 상기 다공성 필름의 구멍 크기에 따라 센서의 감도를 조절하고, 상기 다공성 필름의 구멍 개수에 따라 다성분의 분석대상물질을 측정할 수 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서는 면역반응 또는 효소반응 측정시 시료를 수직으로 떨어뜨려 측정하는 Flow Through Hole (FTH) 방식을 이용하므로, 적은 양의 시료로 단시간 내에 반응을 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "다공성"은 다수의 구멍을 갖는다는 의미이며, "다공성 필름"은 다수의 구멍이 형성되어 있는 필름을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "구멍"은 동 구멍 안에서 시료와 리셉터가 반응할 수 있도록 반응웰(well)의 역할을 할 수 있을 정도의 크기를 갖는 구멍을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 멤브레인은 시료 용액을 흡수할 수 있는 멤브레인을 사용할 수 있으며, 구체적인 멤브레인의 종류는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로오즈 멤브레인(nitrocellulose membrane)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 니트로세룰로오즈 멤브레인에 시료, 예를 들어, 단백질을 떨어뜨리면 단백질은 초기 떨어진 위치에서 크게 확산되지 않고 고정된다. 따라서, 상기 니트로셀룰로오즈 멤브레인 상에 결합되어 있는 다공성 필름의 구멍에 시료를 주입하면 각 구멍 아래의 멤브레인에서 리셉터와 시료와의 선택적인 반응이 일어나게 하여 신호를 측정하도록 한다.
본 발명에 있어서, 리셉터를 멤브레인상에 고정화시키는 방법은 물리적인 흡착 방법 및 화학적 방법을 모두 사용 가능하며, 구체적인 고정화 방법은 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 필름의 구멍의 크기는 10㎛~5000㎛인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 10~4000㎛, 10~3000㎛, 10~2000㎛, 10~1000㎛, 50~5000㎛, 50~4000㎛, 50~3000㎛, 50~2000㎛, 50~1000㎛, 100~5000㎛, 100~4000㎛, 100~3000㎛, 100~2000㎛, 100~1000㎛, 200~5000㎛, 200~4000㎛, 200~3000㎛, 200~2000㎛ 또는 200~1000㎛일 수 있다. 상기 다공성 필름의 구멍의 크기가 작을수록 시료가 좁은 영역에서 리셉터와 반응하여 센서의 감도는 높게 나오지만, 10㎛ 미만일 경우에는 구멍의 크기가 더 작아질 경우 시료 흐름의 장애가 생길 수 있고, 5000㎛를 초과하면 센서의 감도가 현저하게 낮아지는 문제점이 있다. 따라서, 다공성 필름의 구멍의 크기를 10㎛~5000㎛로 하여, 센서의 감도를 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 필름은 구멍 가공이 용이한 재질로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 폴리머, 유리, 엘라스토머, 실리콘 등의 재질로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 폴리이미드, 알루미늄, 폴리아크릴, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티렌(PS), 폴리카보네이트(PC), 폴리염화비닐(PVC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 필름은 필름의 두께가 0.01 내지 1 mm일 수 있으며, 0.01 내지 0.8 mm, 0.01 내지 0.6 mm, 0.01 내지 0.4mm, 0.01 내지 0.2 mm, 0.05 내지 1 mm, 0.05 내지 0.8 mm, 0.05 내지 0.6 mm, 0.05 내지 0.4mm 또는 0.05 내지 0.2 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 필름은 멤브레인과 접촉하는 면에 접착제가 도포되어 있는 접착 필름일 수 있다. 이 경우 다공성 필름을 적당한 크기로 자른 후 상기 멤브레인 위에 덮어 올림으로써 간단하게 다공성 필름을 부착시킬 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니며, 다공성 필름과 멤브레인을 부착시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있어서 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리셉터는 분석대상물질과 선택적으로 반응하는 것이 바람직하며, 구체적으로는, 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids) 및 압타머(aptamer)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 "선택적"이란 용어는 특정한 두 물질이 서로 특이적으로 결합하려는 성질을 의미하며, "특이적"이란 용어와 혼용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 멤브레인 바이오센서에 사용되는 시료는 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본 발명의 멤브레인 바이오센서에 사용되는 시료는, 예를 들어 분석대상물질이 포함되거나 포함되지 않은 임의의 시료일 수 있으며, 이러한 분석대상물질이 포함되거나 포함되지 않은 시료에 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체가 혼합된 시료일 수도 있다. 전자의 경우 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체는 시료와 별도로 시료주입 후에 멤브레인 바이오센서에 주입할 수도 있고, 접합체 패드 또는 샘플패드에 도포한 후 건조시켜서 이용할 수도 있다. 후자의 경우 별도의 접합체 패드 또는 샘플패드 없이 멤브레인 및 다공성 필름으로만 구성된 바이오센서에 적용할 수 있으며, 시료 내에서 미리 분석대상물질-분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질-신호발생물질의 접합체가 생성되어 멤브레인 상에 고정된 리셉터와 선택적으로 결합함으로써 분석대상물질의 검출이 가능하다.
상기 "분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질"은 분석대상물질과 특이적인 결합반응을 하는 물질로서, 예를 들면 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids) 및 압타머(aptamer)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 "분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질"은 바이오센서의 멤브레인에 고정된 리셉터와 동일한 물질일 수도 있으나, 리셉터와는 상이한 물질일 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질, 효소반응 생성물질, 흡광물질, 형광물질 또는 발광물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 신호발생물질이 금속 나노입자일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의한 금속 나노입자의 색변화를 통해 분석대상물질을 검출할 수 있으며, 멤브레인 상에서 리셉터에 선택적으로 결합된 분석대상물질과 금속 나노입자의 결합체의 흡광도, 전기 전도도 등을 측정함으로써 분석대상물질을 정량적으로 분석할 수 있도 있다. 이러한 금속 나노입자는, 예를 들어, 금 나노입자, 은 나노입자, 구리 나노입자 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신호발생물질이 퀀텀닷 나노입자일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의한 퀀텀닷 나노입자의 형광을 통해 분석대상물질을 검출할 수 있다.
상기 신호발생물질이 자기 나노입자일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의한 자기장의 변화를 통해 분석대상물질을 검출할 수 있다.
상기 신호발생물질이 효소, 효소 기질 또는 효소반응 생성물질일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의해 분석대상물질 또는 리셉터와 상기 효소, 효소 기질 또는 효소반응 생성물질이 반응하여 산화환원 반응 등과 같은 효소반응을 일으키게 되는데, 이 때 상기 효소 반응에 의한 생성물의 흡광, 형광, 발광 등을 측정함으로써 분석대상물질을 검출할 수 있다. 이러한 효소는, 예를 들어 글루코스 옥시다아제, 글루코스 탈수소효소, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 효소 기질은, 예를 들어 글루코스, 과산화수소 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이외에도 상기 신호발생물질로서 당업계에 공지된 흡광물질, 형광물질 또는 발광물질을 사용할 수 있으며, 구체적인 종류는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 루미놀(luminol)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 분석대상물질이 단백질 항원일 경우, 리셉터로서 상기 단백질에 선택적인 항체가 멤브레인에 고정되고, 시료는 상기 단백질 항원과 상기 단백질 항원에 선택적인 항체-금 나노입자 접합체의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 접합체의 항체와 멤브레인에 고정된 항체는 각각 분석대상물질인 단백질 항원과 선택적으로 결합하며, 멤브레인에 고정된 항체 위치에서 샌드위치 형태(멤브레인에 고정된 항체-단백질 항원-접합체의 항체-접합체의 금 나노입자)로 금 나노입자가 결합되어, 상기 금 나노입자의 색 변화로 인하여 분석대상물질을 검출할 수 있다. 이 때, 다공성 필름의 각 구멍마다 상이한 리셉터를 고정시키면, 각 구멍마다 상이한 분석대상물질을 검출해낼 수 있으므로, 구멍 개수에 따라 다성분의 분석대상물질을 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다공성 필름상에 접합체 패드가 형성되어 있고, 상기 접합체 패드에는 신호발생물질; 또는 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체가 도포된 후 건조되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 접합체 패드에 신호발생물질이 도포된 후 건조되어 있는 경우는, 예를 들어 상기 신호발생물질이 효소, 효소 기질 또는 화학발광물질인 경우에, 멤브레인 상에 리셉터와 함께 상기 신호발생물질에 반응하는 효소 기질 또는 효소 등을 미리 주입 또는 흡착시킨 후 시료를 주입함으로써 효소반응에 의한 신호발생물질의 신호로 분석대상물질을 측정할 수 있다. 상기 접합체 패드에 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체가 도포된 후 건조되어 있는 경우에는, 멤브레인 센서에 분석대상물질만을 수직으로 떨어뜨리면, "리셉터-분석대상물질-접합체 패드에 도포되어 건조되어 있는 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체"의 순서대로 결합되어, 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의한 신호발생물질의 신호로 분석대상물질을 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 패드로는 접합체를 도포하여 건조한 후, 상기 접합체 패드가 액체에 젖을 경우 접합체가 접합체 패드로부터 쉽게 떨어지는 물질이면 모두 사용할 수 있으며, LFA 시스템에서 일반적으로 사용되는 접합체패드라면 모두 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 패드상에 샘플패드가 형성되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 샘플패드는 분석대상물질의 이물질을 걸러주는 역할을 하여 센서에 의한 것보다 정확한 측정을 가능하게 한다. 예를 들어, 분석대상물질이 혈액인 경우, 샘플패드는 혈액에 포함되어 있는 혈구 또는 혈소판을 걸러주는 역할을 한다 (도 2). 본 발명에 있어서 샘플 패드는 LFA 시스템에서 사용하는 샘플패드를 모두 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 샘플 패드에는 신호발생물질; 또는 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체가 도포된 후 건조되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 멤브레인 바이오센서는 상기 접합체 패드와 다공성 필름 사이에 유체의 흐름을 좋게 하는 멤브레인을 끼워 넣는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 예를 들어, 스크린 메쉬(Zonyl FSN 100, SEFAR), vivid 멤브레인(Pall, Vivid Plasma Separation-GR) 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 멤브레인 바이오센서는 상기 멤브레인을 다공성 필름의 각 구멍을 포함하는 영역으로 구획하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉 다공성 필름의 각 구멍 아래로 흐르는 시료의 흐름을 서로 방해하지 않기 위해 하나의 멤브레인 영역이 하나의 구멍을 포함하도록 멤브레인을 구획할 수 있다. 이러한 영역의 구획으로 인해 다공성 필름의 각 구멍 아래에 있는 멤브레인의 영역을 서로 분리되게 하여, 각 구멍 아래로 흐르는 시료가 상호 영향을 주지 않게 하여 측정의 재현성을 높일 수 있다.
상기 멤브레인에 영역을 구획하는 방법은 당업계에 공지된 어떠한 방법을 사용하여도 무방하며 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 멤브레인의 영역을 구획하기 위하여 레이저 가공기를 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 멤브레인 바이오센서를 이용하되, 상기 멤브레인 바이오센서에 시료를 수직으로 주입하는 단계를 포함하는 면역반응 측정방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 멤브레인 바이오센서를 이용하되, 상기 멤브레인 바이오센서에 시료를 수직으로 주입하는 단계를 포함하는 효소반응 측정방법에 관한 것이다.
예를 들어, 글루코스를 측정하기 위하여, 다공성 필름 아래의 멤브레인에 리셉터로서 글루코스 산화효소와 퍼옥시다제를 고정하고, 퍼옥시다제의 발색기질(예를 들어, 루미놀)이 도포되어 건조된 접합체 패드를 상기 다공성 필름상에 형성한 후, 글루코스가 포함되어 있는 시료를 수직으로 떨어뜨리면, 글루코스 산화효소에 의해 생성된 과산화수소수와 상기 발색기질이 퍼옥시다제에 의해 발광을 유발하여 글루코스를 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 멤브레인 바이오센서는 상기 멤브레인 바이오센서에 시료를 수직으로 주입함으로써, 적은 양의 시료만을 이용해서 고감도로 분석대상물질을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 빠른 시간 안에 분석대상 물질을 검출하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 멤브레인 바이오센서는 각 구멍마다 서로 다른 종류의 리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 시료를 상기 멤브레인 바이오센서에 수직으로 떨어뜨리면 각 구멍에 고정된 서로 다른 종류의 리셉터에 각각 선택적으로 결합하는 여러 가지 분석대상물질을 동시에 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 멤브레인 바이오센서 제조 및 이를 이용한 cTnI분석
1-1. 금 나노입자-항체 접합체 합성
금 나노입자 콜로이드 용액(20 nm, BBInternational, GB) 1 mL에 0.1 M 의 Borate buffer (pH 8.5) 0.1 mL를 넣고, 1 mg/mL의 anti-cTnI 항체(Hytest, FIN) 10㎕를 넣어 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 1%(w/v)의 BSA(Bovine serum albumin, Sigma, DE)를 인산완충식염수(PBS, Gibco, USA)에 녹인 용액 0.1 mL를 첨가하여 15분 상온에서 반응시켰다. 상기 반응 후, 10,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 하여 3차례에 걸쳐 10 mM의 PBS에 녹인 1 mg/mL의 BSA 용액 1 mL을 넣어 정제·회수하여, 금 나노입자-항체 접합체를 합성하였다.
1-2. 멤브레인 바이오센서 제조
니트로셀룰로오즈 멤브레인(Millipore, 180 sec Nitrocellulose)을 가로, 세로 약 2.5 cm 크기의 정사각형으로 절단하였다. 그 후, 0.1 mm 두께의 폴리아크릴 양면 테이프를 가로, 세로 약 1 cm 크기의 정사각형으로 절단하고, 지름이 약 0.4 mm 크기의 구멍 3개를 뚫어 구멍을 형성하여 다공성 필름을 제조한 다음, 상기 멤브레인에 부착하였다.
상기 멤브레인에 결합된 다공성 필름의 3개의 구멍을 통하여 리셉터로서 cTnI 항체(anti-troponin I 폴리클로날 항체, Hytest, FIN) 0.1 mg/mL, anti-mouse IgG (Sigma, DE) 0.1 mg/mL 및 BSA 1.0 mg/mL을 각각 0.5㎕씩 주입하여 건조하였다. 1.0 mg/mL 농도의 BSA로 상기 다공성 필름이 결합된 멤브레인을 적셔 다시 건조함으로서, 다공성 필름을 포함하는 멤브레인 바이오센서를 제조하였다.
1-3. cTnI 분석
0, 0.1, 1 및 10 ng/mL의 농도로 cTnI를 녹인 가상 혈장(10 mM PBS, 1 mg/mL HSA, 10 mM EDTA-2Na) 15㎕와 상기 1-1에서 제조된 금 나노입자-항체 접합체 용액 10㎕를 혼합하여 10분 동안 정치하여 시료 용액을 제조하였다. 상기 시료 용액을 1-2에서 제조된 멤브레인 바이오센서의 다공성 필름에 수직으로 주입하였다. 상기 다공성 필름의 구멍을 통하여 시료 용액이 주입되었으며, 3분 정도가 지나면 거의 모든 시료 용액이 구멍을 통하여 주입되었다.
도 3은 시료를 주입하고 3분 경과 후 측정한 시료주입 면(가), 시료 주입 반대면(나) 및 시료주입 반대면의 확대 이미지(다)로서, B(리셉터로서 BSA가 고정된 부분), C(리셉터로서 anti-mouse IgG가 고정된 부분)는 일정한 반면, T(리셉터로서 cTnI 항체폴리클로날 항체가 고정된 부분)는 cTnI 농도가 증가함에서 따라 진해지는 것을 확인할 수 있었다.
이에 대하여 다음과 같이 흡광도 분석을 수행하였다. 반응 완료 후, 이미지를 얻어 이미지 분석 프로그램(Multi gauge, Fuji Photo Film Co., Ltd)을 이용하여 결과값을 분석하였다. 신호 분석은 반응부(Signal)와 반응부 주위(back ground)의 화소 명암도(pixel intensity)의 평균값을 구하여 두 값의 차를 최종 결과값으로 사용하였다. 흡광도 분석 결과는 표 1과 같이 나타났다.
표 1 cTnI 농도에 따른 흡광도 분석
cTnI 농도(ng/mL) 0 0.1 1 10
T 11.27 11.53 23.23 30.4
C 19.95 24.23 19.23 24.82
B 10.81 11.11 10.08 10.73
실시예 2: 멤브레인 바이오센서 제조 및 이를 이용한 C-reactive protein(CRP) 농도 분석
2-1. 금 나노입자-항체 접합체 합성 및 접합체 패드 제조
금 나노입자 콜로이드 용액(20 nm, BBInternational, GB) 1 mL에 0.1 M 의 붕산 버퍼 (pH 8.5) 0.1 mL를 넣고, 1 mg/mL의 anti-CRP 항체(Abcam) 10㎕ 를 넣어 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 1%(w/v)의 BSA(protease free Bovine serum albumin, Fitzerald)를 인산완충식염수(PBS, Gibco, USA)에 녹인 용액 0.1 mL를 첨가하여 60분 동안 4℃에서 반응시켰다. 상기 반응 후, 10,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 하여 3차례에 걸쳐 10 mM의 PBS에 녹인 1 mg/mL의 BSA 용액 1 mL을 넣어 정제·회수하여 금 나노입자-항체 접합체를 합성하였다. 합성된 금 나노입자-항체 접합체를 2.5배 농축시킨 후, 약 7.5×3.5mm로 절단된 접합체 패드(fusion 5, whatman)에 10 uL씩 주입하여 건조하였다.
2-2. 멤브레인 바이오센서 제조
니트로셀룰로오즈 멤브레인(Millipore, 240 sec Nitrocellulose)을 약 15×15mm 의 크기로 절단하였고, 레이저 가공기로 멤브레인에 工자 형태의 선을 그어 주었다. 0.1 mm 두께의 폴리아크릴 양면 접착제 테이프를 10×10mm 크기로 절단하고, 0.5mm 크기의 구멍을 좌.우로 2개를 뚫어 구멍을 형성하도록 필름을 제조한 다음, 상기 멤브레인에 부착하였다. 이 경우 접착제의 두 구멍이 상기 멤브레인에 새겨진 工자 형태의 좌우 각각 배치되도록 하였다. 이와 같은 것을 수행한 이유는 두 구멍을 통해 액체 시료가 흐를 때 각 흐름에 서로 영향을 주지 않도록 하기 위한 것이다. 상기 멤브레인에 결합된 접착 필름의 한 구멍에는 리셉터로서 anti-CRP 폴리클로날 항체(Abcam) 0.2 mg/mL를, 또 다른 한 구멍에는 anti-mouse IgG (Sigma) 0.2mg/mL를 각각 5 ㎕씩 주입하고, PBS 버퍼에 10 mg/mL의 농도로 녹인 BSA를 5 ㎕, PBS버퍼를 10 ㎕ 순으로 주입하여 건조하였다. 건조된 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 6×3mm 크기로 절단된 스크린 메쉬 (Zonyl FSN 100, SEFAR), 7.5×3.5mm 크기의 vivid 멤브레인, 2-1에서 제조된 금 나노입자-항체 접합체가 건조된 접합체 패드(fusion 5, whatman), 7.5×3.5mm 크기의 샘플 패드(Millipore) 순으로 멤브레인의 구멍을 덮도록 적층하여 바이오 센서를 제조 하였다.
2-3. CRP 분석 및 신호 분석
0, 0.01, 0.1, 1, 5 및 10 μg/mL의 농도로 CRP를 녹인 인간 혈장(CRP free serum) 50 ㎕를 센서에 주입하고, 반응 시간 경과에 따른 흡광도를 측정하였다.
도 4의 Control 영역(왼쪽, anti-mouse IgG가 고정된 부분)의 경우 CRP 농도와 상관없이 모두 높은 반응을 나타내고 있는 반면, Test 영역(오른쪽, anti-CRP 폴리클로날 항체가 고정된 부분)의 경우 CRP 농도가 0~5 ㎍/mL의 범위에서는 농도 증가에 따라 신호가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
이에 대하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 흡광도 분석을 한 결과 표 2와 같이 나타났다.
표 2 CRP 농도에 따른 흡광 신호 결과
농도(μg/mL) 3분 경과 5분 경과 7분 경과 10분 경과
0 -3.61 -3.12 -4.28 -3.1
0.01 1.15 1.31 2.03 2.79
0.1 16.47 20.79 22.81 29.42
1 41.85 43.89 52.4 52.49
5 74.17 75.91 81.02 81.07
10 60.21 63.05 60.66 60.9
도 5에서 측정 시간이 경과됨에 따라 신호의 크기는 증가하나, 반응 초기 3분이 경과한 후에는 반응이 종료되며 약 10분 경과 후에도 그 최종 완료된 반응 흡광도가 거의 변하지 않는 것을 관찰하였다. 이것은 반응 시작 후 약 3분 이내의 빠른 시간에 측정 결과를 도출할 수 있으며, 반응 종료 후에도 일정시간 동안 최종 완료된 반응 신호가 유지된다는 사실을 보여준다.
추가적으로 도 6에서 보는 바와 같이 일반적인 LFA 센서의 측정 영역에 비하여 본 발명의 센서가 더 넓은 측정 가능 범위를 갖는다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과들은 본 발명의 센서가 갖는 특성으로 빠른 시간에 안정된 측정 결과를 얻을 수 있으며, 기존의 센서와 비교하여 더 넓은 측정 범위를 갖는 장점이 있다.
비교예 1: LFA 바이오센서 제조 및 이를 이용한 C-reactive protein(CRP) 농도 분석
1-1. 금 나노입자-항체 접합체 합성 및 접합체 패드 제조
앞선 실시예 2의 2-2와 동일한 방법으로 금 나노입자-항체 접합체 합성 및 접합체 패드를 제조하였다.
1-2. LFA 바이오센서 제조
니트로셀룰로오즈 멤브레인(Millipore, 180sec Nitrocellulose)을 25mm×300mm로 절단한 후 접착성이 있는 300mm×60mm의 플라스틱 카드(Millipore)에 부착하였다. 디스펜서(zeta co.)를 이용하여 니트로셀룰로오즈 멤브레인 내에 control 라인에 1mg/ml anti-mouse IgG(sigma), 베드 스피드 7.0cm/초, 펌프 스피드 0.8ul/cm, 부피 50ul를 도포하였고, test 라인에는 1mg/ml anti-CRP 폴리클로날 항체(abcam), 베드 스피드 7.0cm/초, 펌프 스피드 0.8ul/cm, 부피 50ul를 도포하였다. 니트로셀룰로오즈 멤브레인 위쪽 방향에는 0.2mm 정도 겹치도록 흡수패드(Millipore)를 플라스틱 카드에 부착시킨 후 3.5mm×60mm로 절단하였다. 절단된 구조체의 니트로셀룰로오즈 멤브레인 아래쪽 방향으로 3.8mm×60mm 크기의 인터 패드(MF1, whatman), 금 나노입자-항체 접합체가 건조된 접합체 패드(fusion 5, whatman), 샘플 패드(Millipore) 순으로 각각 0.2mm 정도 겹치도록 플라스틱 카드에 부착하였다. 이 완성된 구조체를 LFA 케이스(인포피아)에 삽입하여 LFA 바이오 센서를 제조하였다.
1-3. CRP 분석 및 신호 분석
앞선 실시예 2의 2-3과 동일한 방법으로 CRP 신호를 분석하였다.
도 6은 LFA 바이오센서를 이용한 CRP 분석 결과, CRP 농도가 0.1~10 ㎍/mL의 범위에서 CRP가 검출되었음을 보여준다. 이에 대하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 흡광도 분석을 한 결과는 하기 표 3에 나타난 바와 같다.
표 3
농도(μg/ml) 10분 경과
0 0
0.01 2.86
0.1 29.35
1 41.9
5 33.51
10 36.65
도 7에서 보는 바와 같이 LFA 센서는 CRP 농도가 0.1~10 ㎍/mL인 경우에 흡광도의 차이가 농도에 비례하여 나타나지 않은 반면, 본 발명에 따른 멤브레인 센서는 CRP 농도가 0~5 ㎍/mL인 경우에 농도의 증가에 따라 흡광도도 함께 증가하는 것으로 나타났는바, LFA 센서에 비하여 본 발명의 센서가 분석대상물질의 농도에 대해 더 넓은 측정 가능 범위를 가지며, 따라서 분석대상물질을 보다 정확하게 우수한 감도록 정량적으로 측정 가능하다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 센서는 빠른 시간에 안정된 측정 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 LFA 센서에 비교하여 검출 범위가 넓고 감도가 높아 정확한 정량 분석이 가능하다는 장점이 있다.
실시예 3: 멤브레인 바이오센서 제조 및 효소-화학발광(Enzymatic Chmemiluminescence)을 이용한 C-Reactive Pprotein(CRP) 농도 분석
3-1. 바이오센서제조
D-글루코스 (Duchefa Biochemie)와 루미놀(Sigma) 을 각각 50 mM 이 되도록 0.1 M 카보네이트 버퍼(pH 9.0)에 녹인 후, 7.5×3.5mm로 절단된 샘플패드(Milipore)에 20 ㎕씩 주입하여 건조하였다. anti-CRP 항체-퍼옥시다제 복합체(Abcam)를 PBS 버퍼에 20 ㎍/mL의 농도로 녹인 후, 약 7.5×3.5mm 의 크기로 절단된 Vivid 멤브레인(Pall, Vivid Plasma Separation-GR)에 약 7 ㎕ 를 주입하여 건조하였다.
니트로셀룰로오즈 멤브레인(Millipore, 240 sec Nitrocellulose)을 약 15×15mm 의 크기로 절단하였고, 레이저 가공기로 멤브레인에 工자 형태의 선을 그어 주었다. 0.1 mm 두께의 폴리아크릴 양면 접착제 테이프를 10×10mm크기로 절단하고, 0.5mm 크기의 구멍을 좌.우로 2개를 뚫어 구멍을 형성하도록 필름을 제조한 다음, 상기 멤브레인에 부착하였다. 이 경우 접착제의 두 구멍이 상기 멤브레인에 새겨진 工자 형태의 좌우 각각 배치되도록 하였다. 상기 멤브레인에 결합된 필름의 2개의 구멍을 통하여 한 쪽 구멍에는 리셉터로서 anti-CRP 폴리클로날 항체 (Abcam) 0.5 mg/mL와 250 U/mL의 글루코스 옥시다아제(Sigma) 혼합액을, 다른 구멍에는 0.5 mg/mL, anti-mouse IgG (Sigma, DE)와 250 U/mL의 글루코스 옥시다아제 혼합액을 1 ㎕씩 주입하고, PBS 버퍼에 10 mg/mL의 농도로 녹인 BSA를 5 ㎕, PBS버퍼를 10 ㎕ 순으로 주입하여 건조하였다. 건조된 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 6×3mm 크기로 절단된 스크린 메쉬 (Zonyl FSN 100, SEFAR), 상기 제조된 anti-CRP 항체-퍼옥시다제 복합체가 건조된 vivid 멤브레인, 상기 제조된 D-글루코스, 루미놀이 건조된 샘플 패드 순으로 멤브레인의 구멍을 덮도록 적층하여 바이오센서를 제조하였다.
3-2. 발광반응을 이용한 CRP 신호 분석
0, 0.01, 0.1, 1, 5 및 10 μg/mL의 농도로 CRP를 녹인 PBS 버퍼를 50 ㎕를 센서에 수직으로 주입하고, 발광측정기(LAS-3000, FUJI PHOTO FILM CO., LTD)를 이용하여 시간 경과에 따른 발광 신호를 측정하였다.
도 8의 Control 영역(왼쪽, anti-mouse IgG 와 글루코스 옥시다아제가 고정된 부분)의 경우 CRP 농도와 상관없이 모두 높은 반응을 나타내고 있는 반면, Test 영역(오른쪽, anti-CRP 폴리클로날 항체 와 글루코스 옥시다아제가 고정된 부분)의 경우 CRP 농도가 0~1 ㎍/mL의 범위에서는 농도 증가에 따라 발광 신호가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이에 대하여 발광도를 분석하고 그 결과를 도 9 및 하기 표 4에 나타내었다. 측정 시간이 경과됨에 따라 신호의 크기는 증가하나, 신호경향성 자체는 3분과 15분의 거의 동일한 것을 알 수 있으며, 따라서 시료 주입 후, 약 5분 이내에 측정결과를 확인할 수 있는 것으로 판단된다.
표 4 CRP 농도에 따른 발광 신호 결과
농도(μg/mL) 15분 경과 10분 경과 7분 경과 5분 경과 3 분 경과
0 78326 22490 28043 19214 10979
0.01 89538 52552 36381 24688 13710
0.1 106521 111455 54896 39408 23842
1 659558 350142 233597 154752 85941
5 540924 335252 224698 156162 91870
10 429909 249111 167023 114882 65047
실시예4: 멤브레인 바이오센서 제조 및 효소-화학발광(Enzymatic Chmemiluminescence)을 이용한 인간 혈청에서의 D-글루코스 농도 분석
4-1. 바이오센서제조
루미놀(Sigma) 을 각각 50 mM 이 되도록 0.1 M Carbonate 버퍼(pH 9.0)에 녹인 후, 7.5×3.5mm로 절단된 샘플패드(Milipore)에 20 μL씩 주입하여 건조하였다.
니트로셀룰로오즈 멤브레인(Millipore, 240 sec Nitrocellulose)을 약 15×15mm 의 크기로 절단하였고, 레이저 가공기로 멤브레인에 工자 형태의 선을 그어 주었다. 0.1 mm 두께의 양면 접착제 테이프를 10×10mm크기로 절단하고, 0.5mm 크기의 구멍을 좌.우로 2개를 뚫어 구멍을 형성하도록 필름을 제조한 다음, 상기 멤브레인에 부착하였다. 이 경우 접착제의 두 구멍이 상기 멤브레인에 새겨진 工자 형태의 좌우 각각 배치되도록 하였다. 상기 멤브레인에 결합된 필름의 2개의 구멍을 통하여 한 쪽 구멍에는 글루코스 분해 효소로서 250 U/mL의 글루코스 옥시다아제(Sigma)와 250 U/mL의 퍼옥시다제(Toyobo) 혼합액을, 다른 구멍에는 250 U/mL 의 퍼옥시다제 용액을 1 μL씩 주입하여 건조 하였다. 건조된 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 6×3mm 크기로 절단된 스크린 메쉬 (Zonyl FSN 100, SEFAR), 약 7.5×3.5mm 의 크기로 절단된 Vivid 멤브레인(Pall, Vivid Plasma Separation-GR), 상기 제조된 루미놀이 건조된 샘플 패드 순으로 멤브레인의 구멍을 덮도록 적층하여 바이오센서를 제조 하였다.
4-2. 발광반응을 이용한 D-글루코스 신호 분석
0, 0.04, 0.2, 1, 5 및 30 mM의 농도로 D-글루코스를 녹인 정상 인간 혈청(NHS)(Fitzgerald) 50 μL를 센서에 수직으로 주입하고, 발광측정기(LAS-3000, FUJI PHOTO FILM CO., LTD)를 이용하여 측정시료 주입 후, 1분 후에 D-글루코스의 발광 신호를 측정하였다.
도 10의 Control 영역(왼쪽, 퍼옥시다제만 고정된 부분)의 경우 D-글루코스 농도와 상관없이 모든 반응이 나타나지 않은 반면, Test 영역(오른쪽, 글루코스 옥시다아제와 퍼옥시다제가 고정된 부분)의 경우 D-글루코스 농도 측정 범위(0~30 mM) 에서 농도 증가에 따라 발광 신호가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 도 11은 D-글루코스 농도 증가에 따른 발광 신호의 증가를 보여 주는 그래프이다.
실시예5: 멤브레인 바이오센서 제조 및 효소-발색반응(Enzymatic Color reaction)을 이용한 Control Serum의 Level 1, Level 2 의 총 콜레스테롤(Total cholesterol) 반응 비교
5-1. 바이오센서제조
니트로셀룰로오즈 멤브레인(Millipore, 240 sec Nitrocellulose)을 약 15×15mm 의 크기로 절단하였고, 레이저 가공기로 멤브레인에 직경이 2 mm가 되도록 정 삼각형 배열로 3개의 원을 그어 주었다. 레이저 가공이 완료된 니트로셀룰로오즈 멤브레인에 총 콜레스테롤을 측정하기 위한 반응 용액을 제조하여 각각의 원에 2 μL씩 주입하여 건조하였다.
총 콜레스테롤 측정을 위하여 사용된 반응용액의 조성 및 함량은 하기 표 5와 같다.
표 5
성분 함량 (mg)
콜레스테롤 에스터라아제(Toyobo) 2.5 mg
콜레스테롤 옥시다아제 (Toyobo) 7.5 mg
퍼옥시다제 (Toyobo) 2.3 mg
MADB (Dojindo) 8.72 mg
4-아미노안티피린 4.06 mg
BSA 5 mg
Triton X-100 0.2 mg
MOPS (MP Biomedicals, LLC) 10.45 mg
D.I water 1 mL
pH 5.0
건조된 멤브레인 위에, 0.1 mm 두께의 양면 접착제 테이프를 10×10mm크기로 절단하고, 1 mm 크기의 구멍을 각각의 원의 중앙에 위치하도록 3개를 뚫어 구멍을 형성하도록 필름을 제조한 다음, 상기 멤브레인에 부착하였고, 5×5mm 크기로 절단된 샘플패드(Milipore)를 적층하여 제조 하였다.
5-2. Control serum Level 1, Level 2 를 이용한 효소 발색반응 확인
제조된 바이오센서에 50 μL의 Lipids control human serum Level 1과 Level 2 (LiquichekTM, BIO-RAD)를 각각 주입하여 Level 1 과 Level 2 의 발색 정도를 비교 하였다. 사용된 Level 1 과 Level 2 Control serum 은 정도 관리용 혈청으로써, Level 1은 정상범위, Level 2는 비정상범위의 고농도 콜레스테롤을 포함한다.
도 12에서 보는 바와 같이 발색반응을 통하여 Level 1, Level 2의 발색반응 정도의 차이를 확인하였다. 총 콜레스테롤 농도가 더 높은 Level 2 시료의 색이 더 진한 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 멤브레인상에 다수의 구멍을 가진 다공성 필름이 부착되어 있고, 각 구멍 위치에 해당하는 멤브레인상에 리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다공성 필름상에 접합체 패드가 추가로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리셉터는 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA 및 압타머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다공성 필름의 구멍의 크기는 10 내지 5000㎛인 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로오즈 멤브레인(nitrocellulose membrane)인 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 멤브레인 바이오센서에 사용되는 시료는 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  7. 제6항에 있어서, 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질, 효소반응 생성물질, 흡광물질, 형광물질 또는 발광물질인 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  8. 제2항에 있어서, 상기 접합체 패드에는 신호발생물질; 또는 분석대상물질에 선택적으로 결합하는 물질과 신호발생물질의 접합체가 도포되어 있는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 접합체 패드상에 샘플패드가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 접합체 패드와 다공성 필름 사이에 유체의 흐름을 좋게 하는 멤브레인을 끼워 넣는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 멤브레인을 다공성 필름의 각 구멍을 포함하는 영역으로 구획하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서.
  12. 제1항 또는 제2항의 멤브레인 바이오센서를 이용하되, 상기 멤브레인 바이오센서에 시료를 수직으로 주입하는 단계를 포함하는 면역반응 측정방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 멤브레인 바이오센서의 각 구멍마다 서로 다른 종류의 리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 측정방법.
  14. 제1항 또는 제2항의 멤브레인 바이오센서를 이용하되, 상기 멤브레인 바이오센서에 시료를 수직으로 주입하는 단계를 포함하는 효소반응 측정방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 멤브레인 바이오센서의 각 구멍마다 서로 다른 종류의 리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 측정방법.
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