WO2019208961A1 - 면역 화학 진단법을 이용한 표적 항원 검출용 종이기반 3차원 구조의 미세칩과 이를 이용한 표적항원 검출 방법 - Google Patents

면역 화학 진단법을 이용한 표적 항원 검출용 종이기반 3차원 구조의 미세칩과 이를 이용한 표적항원 검출 방법 Download PDF

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오병근
신관우
이명준
김영기
염지나
베스나소움
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서강대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a paper-based three-dimensional microchip of the target antigen detection using immunochemical diagnostics and a method for detecting the target antigen using the same, and more specifically, through the speed and direction control of the fluid, through the three-dimensional structure of the chip
  • the present invention relates to a paper-based three-dimensional microchip capable of detecting a target antigen by a single sample injection without external power and a method for detecting the target antigen using the same.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay is one of the most widely used immunoassays. It is an assay for detecting a target protein present in a sample, and the detection of the target protein is made possible by an antigen-antibody reaction.
  • ELISA is based on the principle that an antibody or antigen is immobilized on a solid phase. The ELISA can be divided into a direct ELISA, an indirect ELISA, and a sandwich ELISA according to the method of utilizing the antibody.
  • ELISA is widely used because of its high precision and reliability, but it takes a lot of time to measure.
  • the sensor-based lab-on-a-chip has a short reaction time and automatic response, an external fluid flow device is required and difficult to handle.
  • paper-based devices are inexpensive, lightweight, and flexible, and thus are widely used as biosensors.
  • the paper-based device uses only the wet power of the paper, not only the moving speed is low but also the direction control such as speed control or jumping to another channel is difficult.
  • paper-based devices have limitations in the number of reactions, the rate of reaction, and the direction control, resulting in long measurement times, and in particular limitations in automatically implementing complex immunochemical reactions.
  • the present invention provides a microchip based on paper for immunochemical diagnosis capable of speed and direction control.
  • the present invention provides a microchip capable of automatically performing complex immunochemical reactions in the paper chip without external power.
  • the present invention is to provide a paper-based microchip significantly reduced the time required to diagnose the disease.
  • the present invention provides a paper-based microchip capable of detecting various diseases and viruses.
  • the present invention provides a paper-based microchip having high sensitivity and high selectivity for a specific antigen.
  • the conjugate pad 30 and the absorbent pad 40 which are respectively inserted into the holes formed in the pattern film to contact the paper are inserted into the holes formed to be spaced apart from each other. Are positioned at predetermined intervals from each other, and the conjugate pad 30 stores an antibody 32 or an aptamer to which the sensing material 31 is bound;
  • the sample and the washing solution are transferred to the conjugate pad, the reaction pad, and the absorption pad, and the substrate solution is moved into the space A under the reaction pad. It relates to a microchip of paper-based three-dimensional structure that is automatically supplied.
  • a third hole may be formed in the same pattern as the first pattern film 200, and may further fix the reaction pad by further removing the film area B between the first hole 210 and the second hole 220.
  • a second pattern film 300 further including 240;
  • a conjugate pad 30 inserted into the first hole and storing the sensing antibody 32 or the aptamer to which the sensing material 31 is coupled;
  • An absorption pad 40 inserted into the second hole and sucking the sample, the washing solution and the substrate solution;
  • Reaction pad 50 having the antibody 51 that binds to the conjugate pad and the absorbent pad and is connected to each other, and specifically binds to the antigen 1 included in the sample on the lower surface.
  • a third pattern film 400 including a fourth hole formed to expose the first hole and a third hole, and a fifth hole formed to expose the absorption pad;
  • a fourth pattern film 500 including a sixth hole 510 formed to expose the second hole and a ceiling hole 61 formed to expose the reaction pad inlet side directly below.
  • the holes and the microtubule pattern portion are vertically perforated, and the sample, the washing solution and the substrate solution move on the paper along the microtubule pattern portion.
  • the substrate solution microtubule pattern portion 233 is related to the microchip of the paper-based three-dimensional structure in communication with the second hole to move the substrate solution into the space A under the reaction pad.
  • a method for detecting a target antigen of a three-dimensional structure comprising the step of moving the substrate solution to the space (A) below the reaction pad by capillary force through the microtube without an external power source,
  • the antigen (1) contained in the sample and the detection antibody 32 or aptamer of the conjugate pad are reacted with the antigen and then moved to the reaction pad,
  • the antigen-sensing antibody and the unreacted detection antibody are reacted with the antibody 51 immobilized on the lower portion of the reaction pad.
  • the method relates to a method for detecting target antigen using a paper-based three-dimensional structure microchip which performs an enzymatic reaction between the substrate and the sensing material 31 bound to the sensing antibody when the substrate solution reaches the reaction pad.
  • the present invention can provide a microchip of paper-based three-dimensional structure that can detect the target antigen by a single sample injection without external power through the control of the velocity and direction of the fluid, the three-dimensional structure of the chip.
  • the present invention can increase the moving speed because the fluid moves along the microtubules (fine flow channels) made of a patterned film unlike the conventional method in which the fluid is absorbed into the paper and moves.
  • the present invention can control the fluid velocity and direction through the hydrophilic surface treatment on the paper under the microtubules and the width and length of the microtubules.
  • the paths through which the substrate solution flows and the paths through which the sample and the cleaning solution flow are located on different planes (3D structure, bridge structure). Soaking into the solution microtubules to prevent leakage. That is, the 3D microchip structure of the present invention can prevent signal reaction and waste of substrate solution by preventing an enzyme reaction from occurring in a region other than the reaction pad due to leakage of a sample or a washing solution.
  • FIG 1 is an overall perspective view of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an exploded view of FIG. 1.
  • FIG. 3 illustrates the assembly process of FIG. 1.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view taken along the line a-a 'in FIG.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram illustrating leakage prevention through a barrier region in a bridge structure.
  • Figure 7 measures the speed on paper with coating and channel width.
  • FIG. 9 illustrates the target antigen detection method of the present invention.
  • FIG 10 is an overall perspective view of another embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is an exploded view of FIG. 10.
  • FIG. 12 illustrates the assembly process of FIG. 10.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the 3D (bridge) structure of FIG. 10.
  • Example 14 is a photograph showing the discoloration of the reaction pad according to the 3D microchip and the antigen concentration of the present invention prepared in Example 1.
  • 15 is a graph measuring signal intensity by adjusting the antigen concentration of a sample.
  • 16 shows the signal strengths of 10 nM Trx, PSA, HSA and BSA.
  • Figure 17 is a photograph showing the discoloration of the reaction pad according to the 3D microchip and the antigen concentration of the present invention prepared in Example 2.
  • FIG. 18 is a graph measuring signal intensity by adjusting the antigen concentration of a sample in Example 2.
  • FIG. 1 is an overall perspective view of one embodiment of the present invention
  • Figure 2 is an exploded view of Figure 1
  • Figure 3 shows the assembly process of Figure 1
  • Figure 4 is a cross-sectional view of AA 'in FIG.
  • the microchip of the paper-based three-dimensional structure of the present invention is a paper 10, pattern film 20, conjugate pad 30, absorption pad 40, reaction pad and cover film (60).
  • the paper 10 provides a capillary force to the fluid as the base layer of the microchip.
  • the paper is used that is hydrophilic compared to the film.
  • the paper may be used without limitation, known paper used in paper-based microchips or sensors.
  • the paper may be paper or photographic paper used for Whatman Chromatography.
  • the thickness of the paper there is no particular limitation on the thickness of the paper.
  • the thickness of the paper may be 100 ⁇ 10000 ⁇ m.
  • the pattern film 20 is a film attached to the paper and formed with a microtubule pattern.
  • the pattern film may be a known plastic film, for example, PET or PE film.
  • the pattern film is not limited in thickness. As an example, the pattern film thickness may be 50 ⁇ 500 ⁇ m.
  • the pattern film 20 may include a first hole 21 into which the conjugate pad 30 is inserted, spaced apart from the first hole, an absorbent pad is inserted, and a reaction pad is positioned above.
  • the microtubule pattern portion 23 includes a sample microtubule pattern portion 231 to which a sample moves, a washing solution microtubule pattern portion 232, and a substrate solution microtubule pattern portion 233.
  • the pattern film 20 may include a sample injector 1, a washing solution injector 2, and a substrate solution injector 3.
  • the first hole, the second hole, and the microtubule pattern part are vertically perforated.
  • the paper and the microtubule pattern portion may form microtubules (microfluidic channels). That is, the paper forms the bottom of the microtubules and provides a power source of fluid flow, and the microtubule pattern portion forms the sidewalls of the microtubules so that the fluid can move through the microtubules on the paper.
  • the moving speed is also very slow and it is virtually difficult to move the fluid in the desired direction.
  • the present invention can move over the paper through the microtubule formed on the paper. Can move fluid quickly.
  • the conjugate pad 30 and the absorbent pad 40 are respectively inserted into the holes formed to be spaced apart from each other, and are positioned at predetermined intervals from each other, and the lower surface of the conjugate pad 30 contacts the paper.
  • the conjugate pad 30 is inserted into the first hole 21, and the complex for detecting an antibody 32, aptamer or target antigen having a detection material 31 bound therein or on top thereof. Any one or more of the detection antibodies may be stored or attached.
  • the detection antibody refers to the antibody 32 to which the detection material 31 is bound, hereinafter, for convenience, it may be used as a term encompassing an aptamer or a complex for detecting a target antigen.
  • the conjugate pad a fiber capable of supporting (storing) a sensing material and flowing out under specific conditions may be used.
  • the conjugate pad may be a glass fiber membrane.
  • the antibody refers to a protein that specifically binds to an antigen contained in a sample and exhibits an aggregation reaction.
  • the antibody for use in the invention is not particularly limited, and any antibody of IgG, IgM, IgE, IgA, or IgD may be used as long as it specifically binds to the antigen.
  • the animal species derived from the antibody is not particularly limited, but an antibody derived from rabbits, goats, and mice is relatively easy to obtain, and is preferable because of its many uses.
  • the aptamer may be a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure and having a characteristic of binding to a target molecule with high affinity and specificity.
  • DNA DNA, RNA or modified nucleic acid
  • the target antigen detection complex may be a complex including nanoparticles and an antibody, and more specifically, may be a complex in which nanoparticles, aptamers, and antibodies are combined.
  • the complex for detecting the target antigen may be referred to the applicant Patent No. 10-1613020.
  • the target antigen detection complex is a nanoparticle, an aptamer attached to the surface of the nanoparticle, specifically binding to the Fc (crystalizable fragment) region of the antibody and the aptamer and the Fc region is coupled to the target,
  • An antibody binding fragment (Fab) region capable of binding to an antigen comprises a plurality of antibodies directed opposite to the aptamer, wherein the aptamer is amplified by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) to bind to the antibody The amount of antigen can be detected.
  • RT-PCR real-time polymerase chain reaction
  • the nanoparticles may be gold, silver or silica.
  • the nanoparticles may have a size of 10 ⁇ 100nm.
  • S (sulfur) of the aptamer may be combined with the gold nanoparticles.
  • the sensing material may be a material capable of reacting with a specific material (for example, a substrate) to enable color reaction, fluorescence, luminescence, or infrared reaction.
  • the sensing material may be nanoparticles such as enzymes, enzyme balls, gold nanoparticles, and gold-enzyme complex particles.
  • the enzyme includes, but is not limited to, enzymes that catalyze color reaction, fluorescence, luminescence or infrared reaction, for example, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase. Azedes, horse radish peroxidases (HRP), luciferases and cytochrome P450.
  • enzymes that catalyze color reaction, fluorescence, luminescence or infrared reaction for example, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase.
  • Azedes horse radish peroxidases (HRP), luciferases and cytochrome P450.
  • the enzyme ball may include an enzyme and an antibody.
  • the enzyme balls may comprise enzymes, albumin aggregates and antibodies.
  • the enzyme ball may refer to the applicant Patent No. 10-1622477.
  • the enzyme ball may include a plurality of enzymes, albumin aggregates (particles) that form self-aggregates to support the plurality of enzymes therein, and antibodies attached to the albumin aggregates (particles) surface.
  • the plurality of enzymes are dispersed in albumin aggregates, and the plurality of enzymes are capable of a plurality of enzyme reactions with a plurality of substrates penetrating into the albumin aggregates.
  • the enzyme is supported 1-30% by weight in the albumin nano-aggregates, the albumin is bovine serum albumin, human serum albumin or a fragment thereof, the albumin aggregate may be 100 ⁇ 300nm in size.
  • the absorbent pad 40 is inserted into the second hole 22 and sucks the sample, the washing solution and the substrate solution.
  • the absorbent pad 40 may provide power for fluid to move by capillary force.
  • an excellent absorbing fiber may be used as the absorbent pad.
  • the absorbent pad may be a cellulose membrane, polyester, polypropylene, and glass fiber.
  • the reaction pad 50 is positioned over the conjugate pad and the absorption pad to connect them, and an antibody 51 and a control antibody that specifically bind to the antigen 1 included in the sample on the lower surface of the reaction pad. 52 are respectively fixed.
  • the reaction pad of the present invention may be a nitrocellulose membrane, polyvinylidene fluoride (PVDF), or the like having excellent absorption and protein adhesion.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • reaction pad 50 is located on a plane different from that of the conjugate pad and the absorption pad, a space A is formed between the reaction pad and the paper positioned below the reaction pad. Can be.
  • the structures of the conjugate pad, the absorption pad, and the reaction pad forming the lower space A in the reaction pad 50 are expressed as bridges to 3D structures.
  • Such a bridge structure to 3D structure is a concept that generically refers to a structure in which the paths through which the substrate solution flows and the paths through which the sample and the cleaning solution flow are located on different planes, and these paths do not physically contact each other. That is, the conjugate pad 30, the reaction pad 50, and the absorption pad 40 are in physical contact with each other to move the sample and the washing solution through the absorption force or capillary force of the membrane, but the path of the substrate solution is the three pads. Physically separated from each other, the sample or washing solution can be prevented from entering the substrate solution path by absorption or capillary force.
  • reaction pad of the present invention is excellent in absorbency, so that the sample and the cleaning solution flow into the pad and do not flow into the space (A).
  • the substrate solution may be injected into the space A through the substrate solution microtubule 233 to be in contact with the reaction pad located above the space A.
  • FIG. 5 shows that leakage is prevented with a 3D structure (bridge structure).
  • Figure 5a is a 3D (bridge) structure of the present invention
  • 5b is a planar structure in which the substrate solution is injected to the reaction pad side.
  • 5b shows that red ink flows into the substrate solution injection path, but no leakage occurs in the substrate solution path in the case of 5a.
  • the substrate solution reacts with the sample with the chromophore in the substrate solution microtubule to generate signal noise, resulting in substrate waste.
  • the microchip of the present invention may include a barrier region (B) that prevents the sample solution or the washing solution from leaking into the substrate solution microchannel after being introduced into the space (A).
  • the barrier region B is a film layer remaining in the pattern film 20 without being removed between the first hole and the second hole.
  • the upper portion of the barrier region (B) may be coated with a hydrophobic material (e).
  • a hydrophobic material e
  • the hydrophobic material may be Teflon.
  • 6 is a conceptual diagram illustrating leakage prevention through a barrier region in a bridge structure.
  • 6B shows that the sample solution passing through the conjugate pad 30 without barrier B can move to the space A through the paper 10 as well as the reaction pad on the top, but 6a is coated with the barrier B and the hydrophobic material. Shows that the sample cannot move into space A.
  • 1 to 4 is a microchip of the sample, the washing solution, the substrate solution is provided to each of the microtubule injection unit (1, 2, 3), and washed with the sample sequentially through the capillary force and the microtube without an external power source
  • the solution can be transferred to the conjugate pad, the reaction pad and the absorption pad.
  • the microchip may automatically supply the substrate solution to the space A under the reaction pad through the capillary force and the substrate solution microtube without an external power source when the cleaning solution is moved to the absorption pad.
  • sample microtubule pattern portion 231 and the washing solution microtubule pattern portion 232 may be laminated in one pattern channel and then communicate with the first hole, or each of the first hole.
  • the paper positioned below the sample microtubule pattern portion 231 may be coated with a hydrophilic material to provide a faster flow rate than the cleaning solution microtubule pattern portion or the substrate solution microtubule pattern portion.
  • the hydrophilic material may be a hydrophilic polymer or a hydrophilic metal.
  • silver may be coated with the hydrophilic material.
  • the microchip may include a hydrophilic material (D) coated on a paper forming the bottom of the space (A).
  • the hydrophilic material (D) allows the substrate solution to move quickly from the space (A) to the entire reaction pad.
  • the sample microtubule pattern portion 231 may provide a fast flow rate because the pattern width is wider than that of the cleaning solution microtubule pattern portion or the substrate solution microtubule pattern portion.
  • the substrate solution microtubule pattern portion 233 has a narrower pattern width, longer pattern length, and is not coated with a hydrophilic material than the sample microtubule pattern portion 231 and the cleaning solution microtubule pattern portion 232.
  • the substrate solution may reach the second hole at the latest compared to the sample or wash solution.
  • Figure 7 measures the speed on paper with coating and channel width. Referring to FIG. 7, when the channel size width is 0.5 mm, the speed is 0.41 mm / s without silver coating, and when the channel size width is 1.5 mm, the speed is 7.90 mm / s when silver coated, the channel Three times the width and silver coating can be nearly 20 times faster.
  • FIG. 8 shows controlling the direction of capillary flow through speed control.
  • a fluid flows into a wide channel-silver coated main channel and a narrow branch channel flowing into the main channel
  • capillary force causes the fast fluid to enter the slow channel branch channel.
  • the slow fluid forms an air wall, which not only prevents the fast fluid from entering the branch channel, but also prevents the slow fluid from entering the main channel.
  • the fluid of the branch channel may enter the main channel.
  • the microchip of the present invention may sequentially move the sample, the washing solution and the substrate solution to the reaction pad without an external power source through the speed control of the fluid flowing through the microtube.
  • the cover film 60 may suppress the sample flowing on the reaction pad upper surface.
  • the cover film prevents the sample from overflowing or entering the conjugate pad and into the substrate solution microtubules.
  • the cover film 60 includes a measurement hole 61 through which a part of the reaction pad located below is exposed.
  • the signal reader may calculate the antigen concentration by reading light or color changes of the reaction pad exposed through the measurement hole 61.
  • the cover film 60 may include a hole 62 to reduce the capillary force near the inlet of the sample and the reaction pad into which the sample is introduced.
  • a recessed groove 63 may be formed in a lower surface of the reaction pad, and a reaction pad may be inserted into the recessed groove.
  • the cover film includes holes 1, 2 and 3 which are formed at the same position as the sample injection unit 1, the cleaning solution injection unit 2, and the substrate solution injection unit 3 of the pattern film.
  • the present invention provides a method for detecting target antigen using a paper-based three-dimensional microchip. 9 shows a target antigen detection method.
  • the target antigen detection method of the present invention includes providing a sample, a washing solution and a substrate solution, moving the sample and the washing solution to a conjugate pad, a reaction pad, and moving the substrate solution to the bottom of the reaction pad.
  • the sample contains an antigen (4).
  • washing solution Any solution usable for the ELISA antigen-antibody reaction known as the washing solution can be used without limitation.
  • a substance that specifically reacts with the enzyme may be used as the substrate.
  • a substance that specifically reacts with the enzyme may be used.
  • horseradish peroxidase is used as an enzyme
  • chloronaphthol aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate), resorruphine benzyl Ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), TMB (3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di [3- ethylbenzthiazoline sulfonate]) or o-phenylenediamine (OPD) can be used,
  • alkaline phosphatase When alkaline phosphatase is used as the enzyme, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate as a substrate. Alternatively, enhanced chemifluorescence (ECF) can be used.
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • ECF enhanced chemifluorescence
  • the sample, the washing solution and the substrate solution are dropped onto the sample injection portions 1, 2, and 3 of the microchip having the above-described 3D structure.
  • the present invention can automatically perform the ELISA reaction by providing three solutions on the microchip at the same time.
  • the sample and the washing solution are sequentially moved to the conjugate pad 30, the reaction pad 50, and the absorption pad 40 by capillary force through the microtubes 231 and 232 without an external power source. .
  • the present invention is for detecting an antigen 4 included in the sample and an antibody 32 or aptamer of the conjugate pad, or a target antigen.
  • the complex (hereinafter, detection antibody 32) is transferred to the reaction pad after antigen antibody reaction (9b).
  • the substrate solution is injected into the space A under the reaction pad through the microtubule 233.
  • the method performs an enzymatic reaction between the sensing material 31 bound to the sensing antibody and the substrate (9d, 9e).
  • the method may include reading the signal according to the enzyme reaction with a reader to calculate the antigen concentration.
  • Apparatus and methods for measuring color change and luminescence intensity according to an enzyme reaction can be used without limitation.
  • the method is as described above, the conjugate pad and the absorbent pad spaced at a predetermined interval on the paper and the reaction pad is placed over the conjugate pad and the absorbent pad between the reaction pad and the paper It is possible to form a space (A) in which the substrate solution is introduced.
  • the method may control the speed and direction of the sample, the washing solution, the substrate solution by coating the upper portion of the paper located under the microtubules with a hydrophilic material or by adjusting the width of the microtubules.
  • Target antigen detection method using the microchip of the three-dimensional structure of the present invention can refer to the content of the microchip of the paper-based three-dimensional structure described above.
  • 10 to 13 show another embodiment of the present invention.
  • 10 is an overall perspective view of another embodiment of the present invention
  • FIG. 11 is an exploded view of FIG. 10
  • FIG. 12 shows an assembly process of FIG. 10
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the bridge structure of FIG. 10.
  • 10 to 13 illustrate a microchip structure in which the structure of FIGS. 1 to 4 is partially modified.
  • the microchip of the present invention is a paper 100, the first pattern film 200, the second pattern film 300, the conjugate pad 30, the absorption pad 40, the reaction
  • the pad 50 includes a third pattern film 400 and a fourth pattern film 500.
  • the paper 100, the conjugate pad 30, the absorption pad 40, and the reaction pad 50 may refer to the contents of FIGS. 1 to 4.
  • the first pattern film 200 is attached onto the paper, the first hole 210 into which the conjugate pad is inserted, the second hole 220 spaced apart from the first hole, into which the absorption pad is inserted, and the reaction pad is positioned above. ), And the microtubule pattern portion 230 in which the sample, the washing solution, and the substrate solution move by capillary force.
  • the microtubule pattern portion 230 includes a sample microtubule pattern portion 231 to which the sample moves, a washing solution microtubule pattern portion 232, and a substrate solution microtubule pattern portion 233.
  • the pattern film 200 may include a sample injector 1, a washing solution injector 2, and a substrate solution injector 3.
  • the pattern film 200 includes a film region B between the first hole 210 and the second hole 220.
  • the film region B may form a barrier region having a 3D structure as described above.
  • the hole 220 may include a film-shaped boundary region C in which an absorbent pad having a “a” shape is inserted and fixed.
  • the first pattern film 200 may be coated on the papers B and C with a hydrophobic material after being laminated on the paper 100.
  • the first pattern film 200 is laminated on the paper 100, and then hydrophilic on the lower paper of the sample microtubule pattern portion 231 and the paper on the substrate solution inlet side of the space A. It can be coated with material (D).
  • the second pattern film 300 has the same pattern as that of the first pattern film 200, but has a third hole 340 that can fix the reaction pad by additionally removing the barrier region B of the film. Is formed.
  • the conjugate pad, the absorption pad, and the reaction pad are respectively formed into the first holes 210 and 310, the second holes 220 and 320, and the first pad. Insert into 3 holes 340.
  • the third pattern film 400 may include a fourth hole 410 formed to expose the first hole and the third hole, and a fifth hole 420 formed to expose the absorbent pad.
  • the third pattern film 400 may be a transparent film.
  • the microchip of the present invention may attach the fourth pattern film 500 on the second pattern film without the third pattern film 400.
  • the fourth pattern film 500 may include a sixth hole 510 formed to expose the second hole and a ceiling hole 520 formed to expose the reaction pad inlet side directly below.
  • the fourth pattern film may refer to the cover film described above.
  • the sixth hole 510 may correspond to the measuring hole 61 of the cover film.
  • the substrate solution microtubule pattern portion 233 is in communication with the second hole to move the substrate solution into the space A under the reaction pad.
  • the paper positioned below the sample microtubule pattern portion 231 may be coated with a hydrophilic material to provide a faster flow rate than the cleaning solution microtubule pattern portion or the substrate solution microtubule pattern portion.
  • the sample microtubule pattern portion 231 may provide a fast flow rate because the pattern width is wider than that of the cleaning solution microtubule pattern portion or the substrate solution microtubule pattern portion.
  • the substrate solution microtubule pattern portion 233 has a wider pattern width or a longer pattern length than the sample microtubule pattern portion 231 and the cleaning solution microtubule pattern portion 232, so that the substrate solution is applied to the sample or the washing solution. In comparison, the second hole may be reached at the latest.
  • the paper and each film layer were produced with the structure of FIGS. 10-13.
  • Cricut explore Air 2 '(Provo craft & Novelty, Inc) was used for cutting.
  • a silver coating (D) was applied on the paper of the microtube 231 and the paper on the hole inlet side. Silver was put in a 0.5 mm size pen and a line was drawn with a pen on paper. It was dried for about 20 minutes at 60 °C.
  • the second film 300 was laminated on top of the first film.
  • the conjugate pad solution was prepared with 1 ⁇ l 0.5% BSA solution, 2.5 ⁇ l 40% trehalose, 20.6 ⁇ l 0.01% Tween, and 0.12 ⁇ l HRP bound Anti-trx antibody.
  • the mixture was dropped on a 7 mm ⁇ 4 mm glass fiber membrane and dried at room temperature for 4 hours.
  • Rabbit Anti-trx antibody was dropped on a nitro cellulose membrane (10 um pore size; 4 mm ⁇ 25 mm) to form a test dot (size 1 mm).
  • a control dot was made by dropping 1 ul (0.1 mg / ml) of Rabbit anti-Mouse IgG antibody onto the nitrocellulose membrane (reaction pad). Washed with 0.1% tween solution and dried. 0.5% BSA solution was dropped onto the nitrocellulose membrane to fill the pores and then washed. It was dried at room temperature for 1 hour.
  • the adsorption pad is shaped like a "bend" as a cellulose membrane.
  • the conjugate pad, absorbent pad and reaction pad were inserted into each hole of the second pattern film and the first pattern film. Then, the third pattern film and the fourth pattern film were sequentially laminated on the second pattern film and bonded to prepare a microneedle.
  • the size of the microchip is 55 mm ⁇ 45 mm and the weight is 1.5g.
  • One is a sample solution channel coated with silver (1 mm ⁇ 8 mm), a wash channel without silver coating (1 mm ⁇ 20 mm), and a substrate solution channel (0.5 mm ⁇ 210 mm).
  • Three solutions (see Table 1 below, 10 ⁇ l of sample solution, 20 ⁇ l of wash, 100 ⁇ l of TMB substrate solution) were added dropwise at the same time and waited for 12 minutes. All solutions flowed in sequence without external force and reacted automatically. After the substrate reaction, a signal is generated as shown in FIG. 3.
  • Table 1 measures the samples, washes, substrate solution components, volumes and the time these solutions reach the reaction pad through each microtubule.
  • the conjugate pad solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the solution was prepared as follows.
  • Example 14 is a photograph showing the discoloration of the reaction pad according to the 3D microchip and the antigen concentration of the present invention prepared in Example 1.
  • 15 is a graph measuring signal intensity by adjusting the antigen concentration of a sample. The signal was analyzed with a colorimetric image analysis program BIO-VALUE. The Trx density is inversely proportional to the RGB mean, and the Y axis in FIG. 15 is 1 / (RGB mean).
  • the linearity is shown in the Trx and the signal three periods at 0 to 60nM.
  • the linearity is very high at 0 to 20nM.
  • 16 shows the signal strengths of 10 nM Trx, PSA, HSA and BSA. Each solution was prepared with 260 ng / ml PSA solution, 660 ng / ml BSA solution, 665 ng / ml HSA solution.
  • Baseline (dotted line) in Figure 16 is the signal strength measured when there is no antigen.
  • Basis signal strength is 0.006511. Compared with this baseline, the signal strength hardly increased despite the addition of PSA, BSA and HSA solutions. On the other hand, Trx was 0.0075, which significantly increased the signal strength. On the other hand, when Trx is 2.5nM, the signal intensity is 0.006742, which is stronger than the other three antigens, 10nM. That is, it can be seen that the device of the present invention shows high selectivity for Trx.
  • Figure 17 is a photograph showing the discoloration of the reaction pad according to the 3D microchip and the antigen concentration of the present invention prepared in Example 2.
  • 18 is a graph measuring signal intensity by adjusting the antigen concentration of a sample. Referring to FIG. 18, when the gold-enzyme complex nanoparticles are used to generate a stronger signal than the detection antibody using only HRP, the sensitivity is also excellent.
  • the present invention can be used as an immunochemical diagnostic microchip capable of speed and direction control.

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Abstract

본 발명은 유체의 속도와 방향 제어, 칩의 3차원 구조를 통해 외부 동력없이 표적항원을 단 한 번의 시료 주입으로 검출할 수 있는 종이기반 3차원 구조의 미세칩과 이를 이용한 표적항원 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유체의 속도와 방향 제어, 칩의 3차원 구조를 통해 외부 동력없이 표적항원을 단 한 번의 시료 주입으로 검출할 수 있는 종이기반 3차원 구조의 미세칩을 제공할 수 있다. 본 발명은 유체가 종이 내부로 흡수되어 이동하는 종래 방식과 달리 패턴된 필름으로 된 미세관(미세 유동 채널)을 따라 유체가 이동하므로 이동속도를 높일 수 있다. 또한, 본 발명은 미세관 하부의 종이에 친수성 표면처리와 미세관의 폭과 길이 제어를 통해 유체 속도 및 방향을 제어할 수 있다. 본 발명은 기질 용액이 흐르는 경로와 시료와 세척용액이 흐르는 경로가 서로 다른 평면에 위치하여(3D 구조, 브릿지 구조) 이들 경로들이 물리적으로 서로 접촉하지 않으므로, 시료나 세척용액이 기질 용액 경로(기질 용액 미세관)로 스며들어 누설되는 것을 원천적으로 막을 수 있다. 즉, 본 발명의 3D 미세칩 구조는 시료나 세척 용액의 누설로 인해 반응 패드 이외의 영역에서 효소반응이 일어나는 것을 막아 신호 노이즈와 기질 용액 낭비를 줄일 수 있다.

Description

면역 화학 진단법을 이용한 표적 항원 검출용 종이기반 3차원 구조의 미세칩과 이를 이용한 표적항원 검출 방법
본 발명은 면역 화학 진단법을 이용한 표적 항원 검출용 종이기반 3차원 구조의 미세칩과 이를 이용한 표적항원 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 유체의 속도와 방향 제어, 칩의 3차원 구조를 통해 외부 동력없이 표적항원을 단 한 번의 시료 주입으로 검출할 수 있는 종이기반 3차원 구조의 미세칩과 이를 이용한 표적항원 검출 방법에 관한 것이다.
ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay; 효소면역정량법)은 가장 널리 이용되는 면역정량법 중 하나로, 시료 내 존재하는 대상 단백질을 검출하는 분석법으로, 대상 단백질의 검출은 항원-항체 반응에 의해 가능하게 된다. ELISA는 항체나 항원이 고체상에 흡착(immunosorbent)되어 있는 원리를 이용한 것으로, 항체의 활용 방법에 따라 직접(direct) ELISA, 간접(indirect) ELISA 및 샌드위치 ELISA로 나눌 수 있다.
ELISA가 높은 정밀도와 신뢰성을 가지고 있어 많이 활용되고 있으나 측정에 시간이 많이 걸린다. 한편, 센서 기반의 랩온어칩은 반응 시간이 짧고 자동 반응인 반면, 외부의 유체 유동 장치가 요구되고 다루기가 어렵다는 문제가 있었다.
최근, 사용이 편리하고 측정 단계가 단순화된 금 나노입자 베이스의 종이 스트라이프 키트가 제안되었다(Fu et al. 2017, Zhao et al, 2008). 하지만, 논문에서 제시한 금 나노입자 베이스의 종이 스트라이프 키트는 프로브에 따라 낮은 감도를 보여주는 한계가 있었다.
프로브 감도를 높이기 위해, HRP와 같은 발색효소(chromogenic enzyme)나 발광 물질을 사용한 프로브 사용이 제안되었다. 그러나, 변색의 정확성(감도)을 높이기 위해 미반응 효소나 시료용액을 제거하는 단계를 기판에 추가하여야 하는 문제가 여전히 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 면역 반응 후에 기판을 벗겨낸 후 새로운 기판에 효소를 떨어뜨리는 방법이 있으나, 사람이 기판을 벗겨내야 하므로 상업적으로 수행하기에는 한계가 있다.
이와 같이, 현재 종이 기반의 디바이스는 저렴하고 가벼우며, 또한 유연하여 바이오센서로서 활용이 많아지고 있다. 다만, 종이 기반의 디바이스는 종이의 젖는 힘만을 이용하므로 이동속도가 낮을 뿐만 아니라 속도 조절이나 다른 채널로의 점핑 등 방향 조절이 어렵다. 이와 같이, 종이 기반 디바이스는 반응수와 반응속도 및 방향 제어에 제한이 있어 측정 시간이 길어지고, 특히 복잡한 면역화학반응을 자동으로 구현하기에 한계가 있었다.
본 발명은 속도 및 방향 제어가 가능한 면역화학 진단용 종이 기반의 미세칩을 제공하는 것이다.
본 발명은 복잡한 면역화학 반응을 종이 칩 내에서 외부 동력없이 자동으로 수행할 수 있는 미세칩을 제공하는 것이다.
본 발명은 질병 진단까지 걸리는 시간을 획기적으로 줄인 종이 기반의 미세칩을 제공하는 것이다.
본 발명은 다양한 질병과 바이러스를 검출할 수 있는 종이 기반의 미세칩을 제공하는 것이다.
본 발명은 높은 민감도와 특정 항원에 대한 높은 선택성을 가진 종이 기반의 미세칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양상은
종이(10)
상기 종이 위에 부착되고 미세관 패턴이 형성된 패턴 필름(20) ;
상기 패턴 필름에 형성된 홀에 각각 삽입되어 상기 종이와 접촉하는 컨쥬게이트 패드(30)와 흡수패드(40), 상기 컨쥬게이트 패드(30)와 흡수패드(40)는 서로 이격되어 형성된 홀에 각각 삽입되어 상호간에 소정 간격을 두고 위치하고, 상기 컨쥬게이트 패드(30)에는 감지물질(31)이 결합된 항체(32)나 앱타머가 저장되고;
상기 컨쥬게이드 패드와 흡수패드 위에 걸쳐 위치하며, 시료에 포함된 항원(1)에 특이적으로 결합하는 항체(51)가 고정된 반응패드(50) ;
상기 패턴 필름(20) 위에 부착되는 덮개 필름(60)을 포함하고,
상기 반응 패드 하부의 필름(20)이 제거되어 형성된 공간(A)을 포함하고,
상기 시료, 세척용액, 기질 용액이 각각의 미세관 패턴부에 제공되면, 시료와 세척용액이 상기 컨쥬게이트 패드, 상기 반응패드 및 흡수패드로 이동되고, 기질용액은 반응패드 아래 공간(A)으로 자동 공급되는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩에 관련된다.
다른 양상에서, 본 발명은
종이(100)
상기 종이 위에 부착되며, 컨쥬게이트 패드가 삽입되는 제 1 홀(210), 상기 제 1 홀과 이격되며 흡수패드가 삽입되고 반응 패드가 위에 위치하는 제 2 홀(220), 및 시료, 세척용액 및 기질용액이 모세관힘으로 이동하는 미세관 패턴부(230)를 포함하는 제 1 패턴 필름(200) ;
제 1 패턴 필름(200)과 동일한 패턴이 형성되되, 제 1홀(210)과 제 2 홀(220) 사이의 필름 영역(B)을 추가로 제가하여 반응 패드를 고정시킬 수 있는 제 3홀(240)이 추가로 형성된 제 2 패턴 필름(300) ;
상기 제 1홀에 삽입되고, 감지물질(31)이 결합된 감지항체(32)나 앱타머가 저장된 컨쥬게이트 패드(30) ;
상기 제 2 홀에 삽입되고, 시료, 세척용액 및 기질용액을 빨아들이는 흡수패드(40) ;
상기 컨쥬게이드 패드와 흡수패드 위에 걸쳐 위치하여 이들을 연결하고, 하면에 상기 시료에 포함된 항원(1)에 특이적으로 결합하는 항체(51)가 고정된 반응 패드(50)
상기 제 1 홀과 제 3홀이 노출되도록 형성된 제 4홀, 상기 흡수 패드가 노출되도록 형성된 제 5홀을 포함하는 제 3 패턴 필름(400) ;
상기 제 2홀이 노출되도록 형성된 제 6홀(510)과 직하부에 상기 반응 패드 입구측이 노출되도록 형성된 천장 홀(61)을 포함하는 제 4 패턴 필름(500)을 포함하고,
상기 홀들과 미세관 패턴부는 상하 통공되며, 시료, 세척용액 및 기질 용액이 상기 종이 위를 상기 미세관 패턴부를 따라 이동하고,
상기 기질용액 미세관 패턴부(233)는 상기 반응 패드 아래의 공간(A)으로 기질용액을 이동시키도록 제 2홀과 연통된 종이 기반 3차원 구조의 미세칩에 관련된다.
또 다른 양상에서 본 발명은
시료, 세척용액 및 기질 용액을 종이 위에 형성된 각각의 미세관 패턴부에 제공하는 단계 ;
상기 미세관을 통해 외부 동력원 없이 모세관힘으로 시료와 세척용액을 순차로 컨쥬게이트 패드, 반응패드 및 흡수패드로 이동시키는 단계 ;
상기 미세관을 통해 외부 동력원 없이 모세관힘으로 기질용액을 상기 반응패드 아래 공간(A)로 이동시키는 단계를 포함하는 3차원 구조의 표적항원 검출 방법으로서,
상기 방법은 시료가 상기 컨쥬게이트 패드에 도달하면, 상기 시료에 포함된 항원(1)과 상기 컨쥬게이트 패드의 감지항체(32)나 앱타머를 항원 항체 반응시킨 후 상기 반응 패드로 이동시키고,
상기 방법은 항원-감지항체, 미반응 감지항체를 포함하는 시료가 상기 반응패드에 도달하면, 항원-감지항체 및 미반응 감지항체를 상기 반응 패드 하부에 고정된 항체(51)와 항원 항체 반응시키고,
상기 방법은 상기 기질 용액이 반응패드에 도달하면, 감지항체에 결합된 감지물질(31)와 기질 간에 효소반응을 수행하는 종이 기반의 3차원 구조 미세칩을 이용한 표적항원 검출 방법에 관련된다.
본 발명은 유체의 속도와 방향 제어, 칩의 3차원 구조를 통해 외부 동력없이 표적항원을 단 한 번의 시료 주입으로 검출할 수 있는 종이기반 3차원 구조의 미세칩을 제공할 수 있다.
본 발명은 유체가 종이 내부로 흡수되어 이동하는 종래 방식과 달리 패턴된 필름으로 된 미세관(미세 유동 채널)을 따라 유체가 이동하므로 이동속도를 높일 수 있다. 또한, 본 발명은 미세관 하부의 종이에 친수성 표면처리와 미세관의 폭과 길이 제어를 통해 유체 속도 및 방향을 제어할 수 있다.
본 발명은 기질 용액이 흐르는 경로와 시료와 세척용액이 흐르는 경로가 서로 다른 평면에 위치하여(3D 구조, 브릿지 구조) 이들 경로들이 물리적으로 서로 접촉하지 않으므로, 시료나 세척용액이 기질 용액 경로(기질 용액 미세관)로 스며들어 누설되는 것을 원천적으로 막을 수 있다. 즉, 본 발명의 3D 미세칩 구조는 시료나 세척 용액의 누설로 인해 반응 패드 이외의 영역에서 효소반응이 일어나는 것을 막아 신호 노이즈와 기질 용액 낭비를 줄일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일구현예의 전체 사시도이다.
도 2는 도 1의 분해도이다.
도 3은 도 1의 조립 과정을 도시한다.
도 4는 도 2에서 a-a'의 단면도이다.
도 5는 3D 구조(브릿지 구조)로 누설이 방지되는 것을 보여준다.
도 6은 브릿지 구조에서 장벽영역을 통한 누설 방지를 보여주는 개념도이다.
도 7은 코팅과 채널 폭에 따른 종이 위에서의 속도를 측정한 것이다.
도 8은 속도 제어를 통해, 모세관 흐름의 방향을 제어하는 것을 보여준다.
도 9은 본 발명의 표적 항원 검출 방법을 도시한 것이다.
도 10는 본 발명의 다른 구현예의 전체 사시도이다.
도 11은 도 10의 분해도이다.
도 12는 도 10의 조립과정을 도시한다.
도 13은 도 10의 3D(브릿지) 구조의 단면이다.
도 14는 실시예 1에서 제조한 본 발명의 3D 미세칩과 항원 농도에 따른 반응패드의 변색을 보여주는 사진이다.
도 15는 시료의 항원 농도를 조절하여 신호 세기를 측정한 그래프이다.
도 16은 10nM의 Trx, PSA, HSA, BSA의 신호세기를 측정한 것이다.
도 17은 실시예 2에서 제조한 본 발명의 3D 미세칩과 항원 농도에 따른 반응패드의 변색을 보여주는 사진이다.
도 18은 실시예 2에서 시료의 항원 농도를 조절하여 신호 세기를 측정한 그래프이다.
이하에서, 본 발명의 바람직한 실시 태양을 도면을 들어 설명한다. 그러나 본 발명의 범위는 하기 실시 태양에 대한 설명 또는 도면에 제한되지 아니한다. 즉, 본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 기술되는 "포함 한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일구현예의 전체 사시도이고, 도 2는 도 1의 분해도이고, 도 3은 도 1의 조립과정을 도시하고, 도 4는 도 3에서 A-A'의 단면도이다.
도 1 내지 도 4를 참고하면, 본 발명의 종이 기반 3차원 구조의 미세칩은 종이(10), 패턴필름(20), 컨쥬게이트 패드(30), 흡수패드(40), 반응패드 및 덮개필름(60)을 포함한다.
상기 종이(10)는 미세칩의 기반층으로서 유체에 모세관힘을 제공한다. 상기 종이는 상기 필름에 비해 친수성인 것이 사용된다. 상기 종이는 종이 기반의 미세칩이나 센서에 사용되는 공지된 종이가 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 종이는 와트만 크로마토그래피(Whatman Chromatography)에 이용되는 종이나 사진 인화지일 수 있다.
상기 종이의 두께에 대해 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 일예로서, 상기 종이의 두께는 100~10000㎛ 일 수 있다.
상기 패턴 필름(20)은 상기 종이 위에 부착되고 미세관 패턴이 형성된 필름이다. 상기 패턴 필름은 공지된 플라스틱 필름, 예를 들면, PET 또는 PE 필름 등일 수 있다. 상기 패턴 필름은 두께가 제한되는 아니다. 일예로서, 페턴필름 두께는50~500㎛일 수 있다.
도 2와 도 3을 참고하면, 상기 패턴 필름(20)은 컨쥬게이트 패드(30)가 삽입되는 제 1 홀(21), 상기 제 1 홀과 이격되며 흡수패드가 삽입되고 반응 패드가 위에 위치하는 제 2 홀(22), 및 시료, 세척용액 및 기질용액이 모세관힘으로 이동하는 미세관 패턴부(23)를 포함한다.
상기 미세관 패턴부(23)는 시료가 이동하는 시료 미세관 패턴부(231), 세척용액 미세관 패턴부(232) 및 기질용액 미세관 패턴부(233)를 포함한다.
상기 패턴필름(20)은 시료 주입부(1), 세척용액 주입부(2) 및 기질 용액 주입부(3)를 포함할 수 있다.
상기 제 1홀, 제 2 홀 및 미세관 패턴부는 상하가 통공된다.
본 발명은 상기 패턴필름(20)을 상기 종이(10) 위에 부착하면, 상기 종이와 미세관 패턴부는 미세관(미세유체 채널)을 형성할 수 있다. 즉, 상기 종이는 미세관의 바닥부를 형성함과 동시에 유체 흐름의 동력원을 제공하고, 상기 미세관 패턴부는 미세관의 측벽을 형성하여 유체가 종이 위 미세관을 통해 이동할 수 있도록 한다. 유체가 종이 내부 전체에 퍼져 종이에 스며들어 이동하는 경우, 이동속도도 매우 느리고 원하는 방향으로 유체를 이동시키기가 사실상 어려웠으나, 본 발명은 종이 위에 형성된 미세관을 통해 종이 위로 이동시킬 수 있으므로 원하는 방향으로 빠르게 유체를 이동시킬 수 있다.
상기 컨쥬게이트 패드(30)와 흡수패드(40)는 서로 이격되어 형성된 홀에 각각 삽입되어 상호간에 소정 간격을 두고 위치하고, 각각의 하면은 상기 종이와 접촉한다.
좀 더 구체적으로는, 상기 컨쥬게이트 패드(30)는 상기 제 1홀(21)에 삽입되고, 내부 또는 상부에 감지물질(31)이 결합된 항체(32), 앱타머 또는 표적 항원 검출용 복합체 중 어느 하나 이상의 감지항체가 저장 또는 부착될 수 있다.
이하에서, 감지항체가 감지물질(31)이 결합된 항체(32)를 의미하지만, 이하에서는, 편의상, 앱타머 또는 표적 항원 검출용 복합체를 포괄하는 용어로 사용될 수 있다.
상기 컨쥬게이트 패드로는 감지물질이 담지(저장)가능하고 특정 조건에서 유출될 수 있는 섬유가 사용될 수 있으며, 일예로서, 유리 섬유 멤브레인 일 수 있다.
상기 항체는 시료에 포함된 항원에 대해 특이적으로 결합하여 응집반응을 나타내는 단백질을 말한다. 발명에 사용되는 항체는 특별히 한정되지 않으며, 항원과 특이적으로 결합하는 것이면, IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 중 어떠한 클래스의 항체라도 가능하다. 또한, 항체의 유래 동물종에 관해서도 특별히 한정되지 않지만, 토끼, 염소 및 마우스 유래의 항체가 비교적 입수도 용이하고, 사용예도 많기 때문에 바람직하다.
상기 앱타머(aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)일 수 있다.
상기 표적 항원 검출용 복합체는 나노입자와 항체를 포함하는 복합체일 수 있고, 좀 더 구체적으로는 나노입자, 앱타머 및 항체가 결합된 복합체 일 수 있다. 상기 표적 항원 검출용 복합체는 본 출원인의 등록특허 10-1613020호를 참고할 수 있다. 참고로, 상기 표적 항원 검출용 복합체는 나노입자, 상기 나노입자 표면에 부착되고, 항체의 Fc(crystalizable fragment) 영역에 특이적으로 결합하는 앱타머 및 상기 앱타머와는 Fc 영역이 결합되고, 표적 항원과 결합가능한 Fab(antibody binding fragment) 영역이 상기 앱타머와 반대방향으로 배향되는 복수개의 항체를 포함하되, 상기 앱타머는 실시간 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 증폭되어 상기 항체에 결합된 표적 항원의 양을 검출할 수 있다.
상기 나노입자는 금, 은 또는 실리카일 수 있다. 상기 나노입자는 10~100nm의 크기일 수 있다. 상기 나노입자가 금인 경우, 상기 앱타머의 S(황)이 상기 금 나노입자와 결합할 수 있다.
상기 감지물질은 특정 물질(예를 들면 기질)과 반응하여 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응이 가능한 물질일 수 있다.
예를 들면, 상기 감지물질은 효소, 효소볼, 금나노입자, 금-효소 복합체 입자 등의 나노입자일 수 있다.
예를 들면, 상기 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제(HRP), 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함할 수 있다.
상기 효소볼은 효소와 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 효소볼은 효소, 알부민 응집체 및 항체를 포함할 수 있다. 상기 효소볼은 본 출원인의 등록특허 10-1622477호를 참고할 수 있다. 참고로, 상기 효소볼은 복수 개의 효소, 자기 집합체(self-aggregates)를 형성하여 상기 복수 개의 효소를 내부에 담지하는 알부민 응집체(파티클) 및 상기 알부민 응집체(파티클) 표면에 부착된 항체를 포함하되, 상기 복수 개의 효소는 알부민 응집체에 분산되어 존재하고, 상기 복수 개의 효소는 상기 알부민 응집체 내부로 침투되는 복수 개의 기질과 복수 개의 효소반응이 가능하다.
상기 효소는 상기 알부민 나노 응집체에 1~30중량% 담지되고, 상기 알부민은 소혈청 알부민, 인간혈청 알부민 또는 이의 단편이고, 상기 알부민 응집체는 크기가 100~300nm일 수 있다.
상기 흡수패드(40)는 상기 제 2 홀(22)에 삽입되고, 시료, 세척용액 및 기질용액을 빨아들인다. 상기 흡수패드(40)는 유체가 모세관힘으로 이동할 수 있는 동력을 제공할 수 있다. 상기 흡수패드로는 흡수력이 우수한 섬유가 사용될 수 있으며, 일예로서, 셀룰로오스 멤브레인, 폴리에스테르 , 폴리프로필렌 및 유리섬유 일 수 있다.
상기 반응패드(50)는 상기 컨쥬게이드 패드와 흡수패드 위에 걸쳐 위치하여 이들을 연결하고, 반응패드 하면에 상기 시료에 포함된 항원(1)에 특이적으로 결합하는 항체(51)와 콘트롤용 항체(52)가 각각 고정된다.
본 발명의 반응패드는 흡수력과 단백질 부착력이 우수한 니트로셀루로오스 멤브레인, 폴리플루오린화비닐리덴(PVDF) 등 일 수 있다.
도 2 내지 도 4를 참고하면, 상기 반응패드(50)가 상기 컨쥬게이드 패드와 흡수패드와는 다른 평면상에 위치하므로, 상기 반응 패드와 그 하부에 위치하는 종이 사이에는 공간(A)이 형성될 수 있다.
본 발명에서는 반응패드(50)에 하부 공간(A)을 형성시키는 컨쥬게이드 패드, 흡수패드 및 반응패드의 구조를 브릿지 내지 3D 구조라고 표현한다. 이러한 브릿지 구조 내지 3D 구조는 기질 용액이 흐르는 경로와 시료와 세척용액이 흐르는 경로가 서로 다른 평면에 위치시켜 이들 경로들이 물리적으로 서로 접촉되지 않는 구조를 총칭하는 개념이다. 즉, 컨쥬게이트 패드(30), 반응패드(50) 및 흡수패드(40)는 서로 물리적으로 접촉되어 멤브레인의 흡수력 내지 모세관힘을 통해 시료와 세척액이 이동되지만, 기질 용액의 경로는 이들 3개의 패드와 물리적으로 분리되어 있으므로 시료나 세척용액이 기질용액 경로로 흡수력이나 모세관힘으로 유입되는 것이 방지될 수 있다.
특히, 본 발명의 반응패드는 흡수력이 우수하여 시료와 세척용액이 패드 안으로 스며들어 흘러 공간(A)으로 유입되지 않는다.
기질용액은 상기 기질용액 미세관(233)을 통해 상기 공간(A)로 주입되어 상기 공간 (A)의 상부에 위치하는 반응패드와 접촉할 수 있다.
도 5는 3D 구조(브릿지 구조)로 누설이 방지되는 것을 보여준다. 도 5의 a는 본 발명의 3D(브릿지) 구조이고, 5b는 반응패드 측면으로 기질용액이 주입되는 평면 구조이다. 도 5b는 기질 용액 주입 경로 측으로 붉은색 잉크가 흘러들어가지만, 5a의 경우 기질 용액 경로로 누설이 전혀 발생하지 않음을 확인할 수 있다. 5b와 같은 경우, 기질 용액이 반응패드에 도달하기 전에 기질 용액 미세관에서 발색 효소를 가진 시료와 반응하여 신호 노이즈를 발생하고, 결과적으로 기질을 낭비하게 된다.
또한, 본 발명의 미세칩은 시료용액이나 세척용액이 공간(A)로 유입된 후 기질 용액 미세채널로 누설되는 것을 방지하는 장벽 영역(B)을 포함할 수 있다. 상기 장벽 영역(B)은 패턴필름(20)에서 상기 제 1홀과 제 2 홀 사이의 제거되지 않고 남아 있는 필름층이다.
또한, 상기 장벽영역(B) 상부는 소수성 물질(e)로 코팅될 수 있다. 상기 소수성 물질에 대해 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 소수성 물질은 테프론 일 수 있다.
도 6은 브릿지 구조에서 장벽영역을 통한 누설 방지를 보여주는 개념도이다. 도 6b는 장벽 B가 없어 컨쥬게이트 패드(30)를 통과한 시료 용액이 상부의 반응패드 뿐만 아니라 종이(10)을 통해 공간(A)로 이동할 수 있지만, 6a는 장벽 B와 소수성 물질의 코팅으로 인해 시료가 공간(A)로 이동할 수 없음을 보여준다.
도 1 내지 도 4의 미세칩은 시료, 세척용액, 기질 용액이 각각의 미세관 주입부(1, 2, 3)에 제공되면, 외부 동력원 없이 모세관힘과 상기 미세관을 통해 순차적으로 시료와 세척용액을 상기 컨쥬게이트 패드, 상기 반응패드 및 흡수패드로 이동시킬 수 있다. 상기 미세칩은 상기 세척용액이 상기 흡수패드로 이동되면, 외부 동력원 없이 모세관힘과 상기 기질용액 미세관을 통해 상기 기질 용액을 반응패드 아래 공간(A)으로 자동 공급할 수 있다.
상기 시료 미세관 패턴부(231)와 세척 용액 미세관 패턴부(232)는 하나의 패턴 채널로 합지된 후 제 1홀과 연통되거나, 각각 제 1 홀과 연통될 수 있다.
도 3a와 같이, 상기 시료 미세관 패턴부(231)의 하부에 위치하는 상기 종이는 친수성 물질로 코팅되어 상기 세척용액 미세관 패턴부나 기질 용액 미세관 패턴부에 비해 빠른 유속을 제공할 수 있다. 상기 친수성 물질은 친수성 고분자나 친수성 금속일 수 있다. 일예로서, 상기 친수성 물질로 은이 코팅될 수 있다.
또한, 상기 미세칩은 상기 공간(A)의 바닥을 형성하는 종이 위에 코팅된 친수성 물질(D)을 포함할 수 있다. 상기 친수성 물질(D)은 기질 용액이 상기 공간(A)에서 반응패드 전체로 빠르게 이동할 수 있도록 한다.
상기 시료 미세관 패턴부(231)는 상기 세척용액 미세관 패턴부나 기질 용액 미세관 패턴부에 비해 패턴 폭이 넓어 빠른 유속을 제공할 수 있다.
상기 기질 용액 미세관 패턴부(233)는 상기 시료 미세관 패턴부(231)와 상기 세척용액 미세관 패턴부(232)에 비해 패턴 폭이 좁고, 패턴 길이가 길며 또한 친수성 물질로 코팅처리 되지 않아 기질용액이 시료나 세척용액에 비해 가장 늦게 상기 제 2홀에 도달할 수 있다.
도 7은 코팅과 채널 폭에 따른 종이 위에서의 속도를 측정한 것이다. 도 7을 참고하면, 채널 사이즈 폭이 0.5mm일 때, 은 코팅없는 경우, 속도는 0.41mm/s이고, 채널 사이즈 폭이 1.5mm일 때, 은 코팅된 경우 속도는 7.90mm/s로서, 체널 폭을 3배로 넓히고 은 코팅을 하면 속도를 거의 20배나 높일 수 있다.
도 8은 속도 제어를 통해, 모세관 흐름의 방향을 제어하는 것을 보여준다. 도 8에서 채널 폭이 넓고 은 코팅된 주 채널과 이러한 주 채널로 유입되는 폭이 좁은 분기 채널에 유체를 흘려주는 경우, 모세관 힘에 의해, 빠른 유체는 느린 유체의 분기 채널로 진입하려고 한다. 하지만, 교차 지점에서 느린 유체는 에어 벽을 형성하고, 에어벽은 빠른 유체가 분기 채널로 진입하는 것을 막아줄 뿐만 아니라 느린 유체가 주 채널로의 진입도 방지한다. 도 8과 같이, 주 채널에 공급된 유체가 모두 흐른 후에 분기채널의 유체가 주채널로 진입할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 미세칩은 미세관을 흐르는 유체의 속도 제어를 통해 외부 동력원 없이도 순차적으로 시료, 세척용액 및 기질 용액을 상기 반응패드로 이동시킬 수 있다.
상기 덮개 필름(60)은 상기 시료가 반응 패드 상면위로 흐르는 것을 억제할 수 있다. 상기 덮개 필름은 시료가 넘치거나 컨쥬게이트 패드로 들어가서 기질 용액 미세관으로 들어가는 것을 방지한다.
상기 덮개 필름(60)은 하부에 위치하는 반응패드의 일부가 노출될 수 있도록 통공된 측정 홀(61)을 포함한다. 신호 리더기는 상기 측정홀(61)을 통해 노출된 반응패드의 광이나 색변화를 읽어 항원 농도를 산출할 수 있다.
상기 덮개 필름(60)은 시료와 샘플이 유입되는 반응 패드의 입구 인근에 모세관힘을 감소시키는 홀(62)을 포함할 수 있다.
상기 반응 패드의 하면에는 함몰 홈(63)이 형상되고, 상기 함몰홈에 반응패드가 삽입될 수 있다.
상기 덮개 필름은 상기 패턴 필름의 시료 주입부(1), 세척용액 주입부(2) 및 기질 용액 주입부(3)과 동일한 위치에서 통공된 홀들(1, 2, 3)을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 종이 기반의 3차원 구조의 미세칩을 이용한 표적항원 검출 방법을 제시한다. 도 9는 표적 항원 검출 방법을 나타낸다.
본 발명의 표적항원 검출 방법은 시료, 세척용액 및 기질 용액을 제공하는 단계, 시료와 세척액을 컨쥬게이트 패드, 반응패드로 이동시키는 단계, 기질 용액을 반응 패드 하부로 이동시키는 단계를 포함한다.
상기 시료는 항원(4)을 포함한다.
상기 세척용액으로 공지된 ELISA 항원-항체 반응에 사용 가능한 용액이 제한없이 사용될 수 있다.
상기 기질로는 상기 효소와 특이적으로 반응하는 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소로 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 또는 o-페닐렌디아민(OPD)이 사용될 수 있고,
상기 효소로 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 또는 ECF(enhanced chemifluorescence)가 사용될 수 있다.
본 발명은 시료, 세척용액 및 기질 용액을 앞에서 상술한 3D 구조의 미세칩 의 시료 주입부(1, 2, 3)에 떨어뜨린다. 본 발명은 3개의 용액을 동시에 미세칩 상에 제공하는 것으로 ELISA 반응을 자동으로 수행할 수 있다.
앞에서 상술한 바와 같이, 상기 미세관(231, 232)을 통해 외부 동력원 없이 모세관힘으로 시료와 세척용액을 순차로 컨쥬게이트 패드(30), 반응패드(50) 및 흡수패드(40)로 이동시킨다.
도 9를 참고하면, 시료가 상기 컨쥬게이트 패드(30)에 도달하면, 본 발명은 상기 시료에 포함된 항원(4)과 상기 컨쥬게이트 패드의 항체(32)나 앱타머, 또는 표적 항원 검출용 복합체(이하, 감지항체(32))를 항원 항체 반응시킨 후 상기 반응 패드로 이동시킨다(9b).
상기 방법은 항원(4)-감지항체(32), 미반응 감지항체를 포함하는 시료가 상기 반응패드(50)에 도달하면, 항원-감지항체 및 미반응 감지항체를 항체(51)와 항원 항체 반응시켜 고정한다(9c).
상기 방법은 상기 시료와 세척액이 반응 패드를 통과하여 흡수패드로 흡수되면, 상기 기질 용액을 상기 미세관(233)을 통해 상기 반응패드 아래 공간(A)으로 주입한다. 상기 방법은 상기 기질 용액이 반응패드에 도달하면, 감지항체에 결합된 감지물질(31)와 기질 간에 효소반응을 수행한다(9d, 9e).
상기 방법은 효소 반응에 따른 신호를 리더기로 읽어 항원 농도를 산출하는 단계를 포함할 수 있다. 효소 반응에 따른 색 변화나 발광 세기를 측정하는 장치나 방법은 공지된 것을 제한없이 사용할 수 있다.
상기 방법은 앞에서 상술한 바와 같이, 컨쥬게이트 패드와 상기 흡수패드를 소정 간격으로 이격시켜 상기 종이 위에 위치시키고, 상기 반응패드를 상기 컨쥬게이트 패드와 상기 흡수패드 위에 걸쳐 위치시켜 상기 반응패드와 종이 사이에 기질용액이 유입되는 공간(A)를 형성시킬 수 있다.
또한, 상기 방법은 미세관 하부에 위치하는 종이 상부를 친수성 물질로 코팅하거나 미세관의 폭을 조절하여 시료, 세척용액, 기질 용액의 속도 및 방향을 제어할 수 있다.
본 발명의 3차원 구조의 미세칩을 이용한 표적항원 검출 방법은 앞에서 상술한 종이 기반 3차원 구조의 미세칩의 내용을 참고할 수 있다.
도 10 내지 도 13은 본 발명의 다른 구현예를 나타낸다. 도 10은 본 발명의 다른 구현예의 전체 사시도이고, 도 11은 도 10의 분해도이고, 도 12는 도 10의 조립과정을 도시하고, 도 13은 도 10의 브릿지 구조의 단면이다. 도 10 내지 도 13은 도 1 내지 도 4의 구조를 일부 변형한 미세칩 구조이다.
도 10 내지 도 13을 참고하면, 본 발명의 미세칩은 종이(100), 제 1 패턴 필름(200), 제 2 패턴 필름(300), 컨쥬게이트 패드(30), 흡수패드(40), 반응패드(50), 제 3패턴 필름(400) 및 제 4 패턴 필름(500)을 포함한다.
종이(100), 컨쥬게이트 패드(30), 흡수패드(40), 반응패드(50)는 도 1 내지 도 4의 내용을 참고할 수 있다.
제 1 패턴 필름(200)은 상기 종이 위에 부착되며, 컨쥬게이트 패드가 삽입되는 제 1 홀(210), 상기 제 1 홀과 이격되며 흡수패드가 삽입되고 반응 패드가 위에 위치하는 제 2 홀(220), 및 시료, 세척용액 및 기질용액이 모세관힘으로 이동하는 미세관 패턴부(230)를 포함한다.
상기 미세관 패턴부(230)는 시료가 이동하는 시료 미세관 패턴부(231), 세척용액 미세관 패턴부(232) 및 기질용액 미세관 패턴부(233)를 포함한다.
상기 패턴필름(200)은 시료 주입부(1), 세척용액 주입부(2) 및 기질 용액 주입부(3)를 포함할 수 있다.
상기 패턴 필름(200)은 제 1홀(210)과 제 2 홀(220) 사이의 필름 영역 B를 포함한다. 상기 필름 영역 B는 앞에서 상술한 바와 같이 3D 구조의 장벽영역을 형성할 수 있다.
상기 홀 220은 "ㄱ" 자 형상인 흡수패드가 삽입되어 고정될 수 있는 필름상의 경계영역(C)를 포함할 수 있다.
도 12a를 참고하면, 상기 제 1 패턴 필름(200)은 상기 종이(100) 위에 합지된 후 필름 B, C 상에 소수성 물질로 코팅될 수 있다.
도 12a를 참고하면, 상기 제 1 패턴 필름(200)은 상기 종이(100) 위에 합지된 후, 시료 미세관 패턴부(231)의 하부 종이와 공간(A)의 기질 용액 입구 측의 종이 위에 친수성 물질(D)로 코팅될 수 있다.
제 2 패턴 필름(300)은 상기 제 1 패턴 필름(200)과 동일한 패턴이 형성되되, 필름의 장벽 영역(B)을 추가로 제가하여 반응 패드를 고정시킬 수 있는 제 3홀(340)이 추가로 형성된다.
도 12를 참고하면, 제 2 패턴 필름을 제 1 패턴 필름 위에 합지시킨 후, 컨쥬게이트 패드, 흡수패드 및 반응패드를 각각 제 1 홀(210, 310), 제 2 홀(220, 320), 제 3 홀(340)에 삽입한다.
상기 제 3 패턴 필름(400)은 상기 제 1 홀과 제 3홀이 노출되도록 형성된 제 4홀(410), 상기 흡수 패드가 노출되도록 형성된 제 5홀(420)을 포함할 수 있다.
상기 제 3 패턴 필름(400)은 투명 필름일 수 있다.
한편, 본 발명의 미세칩은 제 3 패턴 필름(400) 없이 제 4 패턴 필름(500)을 상기 제 2패턴 필름 상에 부착할 수 있다.
상기 제 4 패턴 필름(500)은 상기 제 2홀이 노출되도록 형성된 제 6홀(510)과 직하부에 상기 반응 패드 입구측이 노출되도록 형성된 천장 홀(520)을 포함할 수 있다. 상기 제 4 패턴 필름은 앞에서 상술한 덮개 필름을 참고할 수 있다.
상기 제 6홀(510)은 상기 덮개필름의 측정 홀(61)과 대응될 수 있다.
상기 기질용액 미세관 패턴부(233)는 상기 반응 패드 아래의 공간(A)으로 기질용액을 이동시키도록 제 2홀과 연통된다.
상기 시료 미세관 패턴부(231)의 하부에 위치하는 상기 종이는 친수성 물질로 코팅되어 상기 세척용액 미세관 패턴부나 기질 용액 미세관 패턴부에 비해 빠른 유속을 제공할 수 있다.
상기 시료 미세관 패턴부(231)는 상기 세척용액 미세관 패턴부나 기질 용액 미세관 패턴부에 비해 패턴 폭이 넓어 빠른 유속을 제공할 수 있다.
상기 기질 용액 미세관 패턴부(233)는 상기 시료 미세관 패턴부(231)와 상기 세척용액 미세관 패턴부(232)에 비해 패턴 폭이 넓거나 패턴 길이가 길어 기질용액이 시료나 세척용액에 비해 가장 늦게 상기 제 2홀에 도달할 수 있다.
이하, 본 발명을 첨부된 실시 예 및 도면을 참조하여 자세히 설명한다. 그러나 첨부된 실시예는 본 발명의 구체적인 실시태양을 예시할 뿐, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1
도 10 내지 도 13 구조로 종이와 각 필름층을 제작하였다. 커팅을 위해 Cricut explore Air 2’ (Provo craft & Novelty, Inc)를 사용하였다. 종이는 광페이퍼를 사용하고, 필름은 100㎛ PET 필름을 사용하였다.
제 1 필름(200)을 종이 위에 부착한 후 미세관 231의 종이 위와 홀 입구측 종이에 은 코팅(D)을 하였다. 은을 0.5mm 사이즈 펜에 넣고, 종이 위에 라인을 펜으로 그렸다. 60℃에서 20분정도 건조시켰다.
제 2 필름(300)을 제 1 필름 상부에 합지시켰다.
컨쥬게이트 패드 용액을 0.5% BSA 용액 1㎕, 40% 트레할로스(trehalose) 2.5㎕, 0.01% 트윈(Tween) 20.6㎕, HRP 결합된 Anti-trx antibody 0.12㎕로 제조하였다. 이 혼합물을 7 mm × 4 mm 유리 섬유 멤브레인에 떨어뜨리고 상온에서 4시간 정도 건조시켰다.
반응패드의 일측에 니트로 셀룰로오스 멤브레인(10 um pore size; 4 mm × 25 mm) 위에 1㎕(0.2mg/ml) Rabbit Anti-trx antibody를 떨어뜨려 test dot(사이즈 1mm)을 형성하였다. 니트로 셀룰로오스 멤브레인(반응패드)에 Rabbit anti-Mouse IgG antibody 1 ul (0.1 mg/ml)을 떨어뜨려 콘트롤 dot을 만들었다. 0.1% tween 용액으로 세척하고 건조하였다. 0.5% BSA 용액을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 떨어뜨려 기공을 채운 다음 세척하였다. 1시간 동안 상온에서 건조하였다.
흡착패드는 셀룰로오스 멤브레인으로서 굽어진 "ㄱ“ 형상이다.
컨쥬게이트 패드, 흡수 패드와 반응 패드를 제 2 패턴 필름과 제 1 패턴 필름의 각 홀로 삽입하였다. 다시, 제 3 패턴필름과 제 4 패턴 필름을 순차로 제 2 패턴 필름 위에 적층하여 접착하여 미세침을 제조하였다.
미세칩의 크기는 55 mm × 45 mm 이고 무게는 1.5g이다. 하나는 은으로 코팅된 시료용액 채널(1mm × 8 mm), 은 코팅 없는 세척 채널(1mm × 20mm), 기질 용액 채널(0.5 mm × 210 mm)이다. 3개의 용액(하기 표 1 참고, 샘플 용액 10㎕, 세척 20㎕, TMB 기질 용액 100㎕)을 동시에 적하하고 12분 정도 기다리면, 모든 용액은 외력없이 순서대로 흐르고 자동으로 반응한다. 기질 반응 후에 도 3과 같이 신호가 발생된다.
하기 표 1은 시료, 세척, 기질 용액 성분, 부피와 이들 용액이 각 미세관을 통해 반응 패드에 도달하는 시간을 측정한 것이다.
용액 성분 반응부 도달시간 부피
시료 0.05% BSA PBS 용액+Trx 3초±1초 10㎕
세척 0.1% Tween 20 PBS(V/V) 25초±5초 20㎕
기질 3,3,5,5-tetramethylbenzidine(TMB) 8분±30초 150㎕
실시예 2
컨쥬게이트 패드 용액을 하기와 같이 제조하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
우선, 0.5ml의 금입자에 HRP가 부착된 항체를 0.2mg/ml 로 10ul를 섞고 15분간 반응시킨 후 0.5mg/ml의 티올레이트 폴리에틸렌글라이콜을 10ul 넣어준 뒤 10분간 반응시켰다. 반응물을 13000RPM으로 20분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고, 이를 0.01% 트윈(Tween) PBS로 세척하고, 0.05% BSA 200ul 과 0.05% 트윈(Tween)용액 200ul를 넣어 보관하였다. 완성된 금-효소 나노입자 24㎕ 와 40% 트레할로스(trehalose) 2㎕ 로 컨쥬게이트 패드 용액을 제조하였다. 이 혼합물을 7 mm × 4 mm 유리 섬유 멤브레인에 떨어뜨리고 상온에서 4시간 정도 건조시켰다.
도 14는 실시예 1에서 제조한 본 발명의 3D 미세칩과 항원 농도에 따른 반응패드의 변색을 보여주는 사진이다. 도 15는 시료의 항원 농도를 조절하여 신호 세기를 측정한 그래프이다. 비색 이미지 분석 프로그램 BIO-VALUE로 신호를 분석하였다. Trx 농도는 RGB 평균에 반비례하고, 도 15에서 Y축은 1/(RGB 평균)이다.
도 15를 참고하면, 0~60nM에서 Trx와 신호세기간에 선형성을 보여주며, 특히, 0~20nM에서는 선형성이 매우 높다.
도 16은 10nM의 Trx, PSA, HSA, BSA의 신호세기를 측정한 것이다. 각 용액은 260 ng/ml의 PSA 용액, 660ng/ml의 BSA 용액, 665 ng/ml의 HSA 용액으로 준비하였다.
도 16의 베이스라인(점선)은 항원이 없을 때 측정한 신호세기이다. 배이스라인 신호세기는 0.006511이다. 이 베이스 라인과 비교하여 PSA, BSA, HSA 용액의 첨가에도 불구하고 신호세기가 거의 증가하지 읺았다. 반면, Trx는 0.0075로서 신호세기가 현저히 상승하였다. 한편, Trx가 2.5nM 일때 신호세기는 0.006742로서, 다른 3개의 항원들 10nM 보다 더 신호가 세다. 즉, 본 발명의 디바이스는 Trx에 대해 높은 선택성을 보여주고 있음을 확인할 수 있다.
도 17은 실시예 2에서 제조한 본 발명의 3D 미세칩과 항원 농도에 따른 반응패드의 변색을 보여주는 사진이다. 도 18은 시료의 항원 농도를 조절하여 신호 세기를 측정한 그래프이다. 도 18을 참고하면, 기존의 HRP만을 사용한 감지항체보다 금-효소 복합체 나노입자를 사용한 경우 더 강력한 신호를 발생시키며, 민감도 또한 우수함을 보여준다.
이상에서, 본 발명의 바람직한 구현 예에 대하여 상세하게 설명하였으나, 이들은 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위가 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 속도 및 방향 제어가 가능한 면역화학 진단용 미세칩으로 사용될 수 있다.

Claims (24)

  1. 종이(10)
    상기 종이 위에 부착되고 미세관 패턴이 형성된 패턴 필름(20) ;
    상기 패턴 필름에 형성된 홀에 각각 삽입되어 상기 종이와 접촉하는 컨쥬게이트 패드(30)와 흡수패드(40), 상기 컨쥬게이트 패드(30)와 흡수패드(40)는 서로 이격되어 형성된 홀에 각각 삽입되어 상호간에 소정 간격을 두고 위치하고, 상기 컨쥬게이트 패드(30)에는 감지물질(31)이 결합된 항체(32)나 앱타머가 저장되고;
    상기 컨쥬게이드 패드와 흡수패드 위에 걸쳐 위치하며, 시료에 포함된 항원(1)에 특이적으로 결합하는 항체(51)가 고정된 반응패드(50) ;
    상기 패턴 필름(20) 위에 부착되는 덮개 필름(60)을 포함하고,
    상기 반응 패드 하부의 필름(20)이 제거되어 형성된 공간(A)을 포함하고,
    상기 시료, 세척용액, 기질 용액이 각각의 미세관 패턴부에 제공되면, 시료와 세척용액이 상기 컨쥬게이트 패드, 상기 반응패드 및 흡수패드로 이동되고, 기질용액은 반응패드 아래 공간(A)으로 자동 공급되는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  2. 종이(10)
    상기 종이 위에 부착되며, 컨쥬게이트 패드가 삽입되는 제 1 홀(21), 상기 제 1 홀과 이격되며 흡수패드가 삽입되고 반응 패드가 위에 위치하는 제 2 홀(22), 및 시료, 세척용액 및 기질용액이 모세관힘으로 이동하는 미세관 패턴부(23)를 포함하는 패턴 필름(20) ;
    상기 제 1홀에 삽입되고, 감지물질(31)이 결합된 항체(32)나 앱타머가 저장되는 컨쥬게이트 패드(30) ;
    상기 제 2 홀에 삽입되고, 시료, 세척용액 및 기질용액을 빨아들이는 흡수패드(40) ;
    상기 컨쥬게이드 패드와 흡수패드 위에 걸쳐 위치하여 이들을 연결하고, 하면에 상기 시료에 포함된 항원(1)에 특이적으로 결합하는 항체(51)가 고정된 반응 패드(50) ; 및
    상기 패턴 필름(20) 위에 부착되는 덮개 필름(60)을 포함하고,
    상기 제 1홀, 제 2 홀 및 미세관 패턴부는 통공되어 시료, 세척용액 및 기질 용액이 상기 종이 위를 상기 미세관 패턴부를 따라 이동하고,
    상기 기질용액 미세관 패턴부(233)는 상기 반응 패드 아래의 공간(A)으로 기질용액을 이동시키도록 제 2홀과 연통된 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미세칩은 상기 시료, 세척용액, 기질 용액이 각각의 미세관 패턴부에 제공되면, 외부 동력원 없이 모세관힘과 상기 미세관을 통해 순차적으로 시료와 세척용액을 상기 컨쥬게이트 패드, 상기 반응패드 및 흡수패드로 이동시키고,
    상기 미세칩은 상기 세척용액이 상기 흡수패드로 이동되면, 외부 동력원 없이 모세관힘과 상기 기질용액 미세관을 통해 상기 기질 용액을 반응패드 아래 공간(A)으로 자동 공급하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미세칩은 시료가 상기 컨쥬게이트 패드에 도달하면, 상기 시료에 포함된 항원(4)과 상기 컨쥬게이트 패드의 감지물질이 결합된 항체(32), 앱타머 또는 표적 항원 검출용 복합체 중 어느 하나 이상의 감지항체를 항원 항체 반응시킨 후 상기 반응 패드로 이동시키고,
    상기 미세칩은 항원-감지항체, 미반응 감지항체를 포함하는 시료가 상기 반응패드에 도달하면, 항원-감지항체 및 미반응 감지항체를 항체(51)와 항원 항체 반응시켜 고정하고,
    상기 미세칩은 상기 기질 용액이 반응패드에 도달하면, 감지항체에 결합된 감지물질(31)과 기질 간에 효소반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 1홀과 제 2 홀 사이의 필름 영역(B)은 상기 시료와 세척용액이 상기 공간(A)으로 누설되는 것을 방지하는 장벽층을 형성하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 필름 영역(B) 상부는 소수성 물질로 코팅된 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 덮개 필름(60)은 시료와 샘플이 유입되는 반응 패드의 입구 인근에 모세관힘을 감소시키는 홀(61)을 포함하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 종이는 상기 필름에 비해 친수성인 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 시료 미세관 패턴부(213)와 세척 용액 미세관 패턴부는 하나의 패턴 채널로 합지된 후 제 1홀과 연통되는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 시료 미세관 패턴부(231)와 세척 용액 미세관 패턴부(232)는 각각 제 1홀과 연통되는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 시료 미세관 패턴부(231)의 하부에 위치하는 상기 종이는 친수성 물질로 코팅되어 상기 세척용액 미세관 패턴부나 기질 용액 미세관 패턴부에 비해 빠른 유속을 제공하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 시료 미세관 패턴부(231)는 상기 세척용액 미세관 패턴부나 기질 용액 미세관 패턴부에 비해 패턴 폭이 넓어 빠른 유속을 제공하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 기질 용액 미세관 패턴부(233)는 상기 시료 미세관 패턴부(231)와 상기 세척용액 미세관 패턴부(232)에 비해 패턴 폭이 넓거나 패턴 길이가 길어 기질용액이 시료나 세척용액에 비해 가장 늦게 상기 제 2홀에 도달하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 반응 패드(50)는 셀룰로오스계, 폴리바이닐계 멤브레인을 사용하여 내부나 하면을 따라 시료나 세척용액을 이동시키는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  15. 종이(100)
    상기 종이 위에 부착되며, 컨쥬게이트 패드가 삽입되는 제 1 홀(210), 상기 제 1 홀과 이격되며 흡수패드가 삽입되고 반응 패드가 위에 위치하는 제 2 홀(220), 및 시료, 세척용액 및 기질용액이 모세관 힘으로 이동하는 미세관 패턴부(230)를 포함하는 제 1 패턴 필름(200) ;
    제 1 패턴 필름(200)과 동일한 패턴이 형성되되, 제 1홀(210)과 제 2 홀(220) 사이의 필름 영역(B)을 추가로 제가하여 반응 패드를 고정시킬 수 있는 제 3홀(240)이 추가로 형성된 제 2 패턴 필름(300) ;
    상기 제 1홀에 삽입되고, 감지물질(31)이 결합된 감지항체(32)나 앱타머가 저장된 컨쥬게이트 패드(30) ;
    상기 제 2 홀에 삽입되고, 시료, 세척용액 및 기질용액을 빨아들이는 흡수패드(40) ;
    상기 컨쥬게이드 패드와 흡수패드 위에 걸쳐 위치하여 이들을 연결하고, 하면에 상기 시료에 포함된 항원(1)에 특이적으로 결합하는 항체(51)가 고정된 반응 패드(50)
    상기 제 1 홀과 제 3홀이 노출되도록 형성된 제 4홀, 상기 흡수 패드가 노출되도록 형성된 제 5홀을 포함하는 제 3 패턴 필름(400) ;
    상기 제 2홀이 노출되도록 형성된 제 6홀(510)과 직하부에 상기 반응 패드 입구측이 노출되도록 형성된 천장 홀(61)을 포함하는 제 4 패턴 필름(500)을 포함하고,
    상기 홀들과 미세관 패턴부는 상하 통공되며, 시료, 세척용액 및 기질 용액이 상기 종이 위를 상기 미세관 패턴부를 따라 이동하고,
    상기 기질용액 미세관 패턴부(233)는 상기 반응 패드 아래의 공간(A)으로 기질용액을 이동시키도록 제 2홀과 연통된 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 제 1홀과 제 2 홀 사이의 필름 영역(B)은 상기 시료와 세척용액이 상기 공간(A)으로 누설되는 것을 방지하는 장벽층을 형성하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 필름 영역(B) 상부는 소수성 물질로 코팅된 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  18. 제 15항에 있어서, 상기 시료 미세관 패턴부(231)의 하부에 위치하는 상기 종이는 친수성 물질로 코팅되어 상기 세척용액 미세관 패턴부나 기질 용액 미세관 패턴부에 비해 빠른 유속을 제공하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  19. 제 15항에 있어서, 상기 시료 미세관 패턴부(231)는 상기 세척용액 미세관 패턴부나 기질 용액 미세관 패턴부에 비해 패턴 폭이 넓어 빠른 유속을 제공하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  20. 제 15항에 있어서, 상기 기질 용액 미세관 패턴부(233)는 상기 시료 미세관 패턴부(231)와 상기 세척용액 미세관 패턴부(232)에 비해 패턴 폭이 넓거나 패턴 길이가 길어 기질용액이 시료나 세척용액에 비해 가장 늦게 상기 제 2홀에 도달하는 것을 특징으로 하는 종이 기반 3차원 구조의 미세칩.
  21. 시료, 세척용액 및 기질 용액을 종이 위에 형성된 각각의 미세관 패턴부에 제공하는 단계 ;
    상기 미세관을 통해 외부 동력원 없이 모세관힘으로 시료와 세척용액을 순차로 컨쥬게이트 패드, 반응패드 및 흡수패드로 이동시키는 단계 ;
    상기 미세관을 통해 외부 동력원 없이 모세관힘으로 기질용액을 상기 반응패드 아래 공간(A)로 이동시키는 단계를 포함하는 3차원 구조의 표적항원 검출 방법으로서,
    상기 방법은 시료가 상기 컨쥬게이트 패드에 도달하면, 상기 시료에 포함된 항원(4)과 상기 컨쥬게이트 패드의 감지항체(32)나 앱타머를 항원 항체 반응시킨 후 상기 반응 패드로 이동시키고,
    상기 방법은 항원-감지항체, 미반응 감지항체를 포함하는 시료가 상기 반응패드에 도달하면, 항원-감지항체 및 미반응 감지항체를 상기 반응 패드 하부에 고정된 항체(51)와 항원 항체 반응시키고,
    상기 방법은 상기 기질 용액이 반응패드에 도달하면, 감지항체나 앱타머에 결합된 감지물질(31)과 기질 간에 효소반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 종이 기반의 3차원 구조 미세칩을 이용한 표적항원 검출 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 방법은 컨쥬게이트 패드와 상기 흡수패드를 소정 간격으로 이격시켜 상기 종이 위에 위치시키고,
    상기 방법은 상기 반응패드를 상기 컨쥬게이트 패드와 상기 흡수패드 위에 걸쳐 위치시켜 상기 반응패드와 종이 사이에 기질용액이 유입되는 공간(A)를 형성시킨 것을 특징으로 하는 종이 기반의 3차원 구조 미세칩을 이용한 표적항원 검출 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 방법은 미세관 하부에 위치하는 종이 상부를 친수성 물질로 코팅하거나 미세관의 폭을 조절하여 시료, 세척용액, 기질 용액의 속도 및 방향을 제어하는 것을 특징으로 하는 종이 기반의 3차원 구조 미세칩을 이용한 표적항원 검출 방법.
  24. 제 21 항에 있어서, 상기 방법은 효소 반응에 따른 신호를 리더기로 읽어 항원 농도를 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종이 기반의 3차원 구조 미세칩을 이용한 표적항원 검출 방법.
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