CN112088308A - 利用免疫化学诊断方法的靶抗原检测用纸基三维结构的微芯片及利用其的靶抗原检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可通过控制流体的速度和方向并在没有外部动力的条件下通过芯片的三维结构只需注入试样一次来检测靶抗原的纸基三维结构的微芯片及利用其的靶抗原检测方法。本发明可提供可通过控制流体的速度和方向并在没有外部动力的条件下通过芯片的三维结构只需注入试样一次来检测靶抗原的纸基三维结构的微芯片。本发明与流体被吸收至纸的内部而移动的以往的方式不同，是流体沿着由图案化的膜形成的微管(微细流动通道)，因此，可提高移动速度。并且，本发明可通过对微管下部的纸进行亲水性表面处理并控制微管的宽度及长度来控制流体的速度及方向。本发明中，底物溶液流动的路径与试样和清洗溶液流动的路径位于互不相同的平面上(3D结构、桥结构)，以使这些路径不相互物理接触，因此，从而从根本上防止由于试样或清洗溶液渗入底物溶液路径(底物溶液微管)而被泄露。即，本发明的3D微芯片结构防止由于试样或清洗溶液的泄露而在除了反应垫之外的区域产生酶促反应，因此，可减少信号噪声和底物溶液的浪费。

Description

利用免疫化学诊断方法的靶抗原检测用纸基三维结构的微芯 片及利用其的靶抗原检测方法
技术领域
本发明涉及利用免疫化学诊断方法的靶抗原检测用纸基三维结构的微芯片及利用其的靶抗原检测方法，更详细地，涉及可通过控制流体的速度和方向并在没有外部动力的条件下通过芯片的三维结构只需注入试样一次来检测靶抗原的纸基三维结构的微芯片及利用其的靶抗原检测方法。
背景技术
ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay；酶联免疫吸附测定法)为最广泛利用的酶联免疫吸附测定法中的一种，是一种检测存在于试样中的对象蛋白质的分析法，可通过抗原-抗体检测对象蛋白质。ELISA为利用抗体或抗原吸附(immunosorbent)于固体上的原理的方法，可根据抗体的适用方法分为直接(direct)ELISA、间接(indirect)ELISA及夹心ELISA。
由于ELISA具有高精密度和可靠性而被广泛使用，但是，测定时间长。另一方面，基于传感器的芯片实验室的反应时间短且进行自动反应，但存在需要外部的流体流动装置且难以操作的问题。
最近，提出了使用方便且测定步骤简单的金纳米粒子基底的纸条试剂盒(Fu etal.2017，Zhao et al，2008)。然而，论文中揭示的金纳米粒子基底的纸条试剂盒存在由于探针而其灵敏度低的局限性。
为了提高探针灵敏度，提出了利用使用如HRP等显色酶(chromogenic enzyme)或发光物质的探针。但是，存在为了提高变色的准确性(灵敏度)而需要将去除未反应酶或试样溶液的步骤添加在基板中的问题。为了解决这种问题，使用在免疫反应之后剥离基板后在新的基板上滴加酶的方法，但由于需要人工剥离基板，因此，在商业操作方面具有局限性。
如上所述，当前的纸基装置的价格低廉、轻便、柔软，广泛用作生物传感器。但是，纸基装置仅利用纸的湿润力，因此，不仅移动速度低，而且还难以实现速度调节或向其他通道跳转等方向调节。如此，纸基装置在反应水和反应速度及方向控制上具有局限性，因此，测定时间变长，尤其，在自动进行复杂的免疫化学反应上具有局限性。
发明内容
技术问题
本发明提供可控制速度及方向的免疫化学诊断用纸基微芯。
本发明提供可在没有外部动力的条件下在纸芯片内自动进行复杂的免疫化学反应的微芯片。
本发明提供大幅度减少诊断疾病的时间的纸基微芯片。
本发明提供可检测多种疾病和病毒的纸基微芯片。
本发明提供具有高敏感度和针对特定抗原的高选择性的纸基微芯片。
解决问题的方案
本发明的一方面涉及纸基三维结构的微芯片，包括：
纸10；
图案膜20，附着于上述纸上，形成有微管图案；
结合垫30和吸收垫40，分别插入于形成在上述图案膜的孔中来与上述纸相接触，上述结合垫30与吸收垫40分别插入于以相隔开的方式形成的孔中来在相互之间以留有规定间隔的方式设置，在上述结合垫30储存有与检测物质31结合的抗体32或核酸适配体；
反应垫50，以横跨上述结合垫和吸收垫的方式设置，固定有与包含在试样中的抗原1特异性结合的抗体51；以及
覆膜60，附着于上述图案膜20上，
上述纸基三维结构的微芯片包括上述反应垫下部的膜20被去除而形成的空间A，
若上述试样、清洗溶液、底物溶液提供至各个微管图案部，则试样和清洗溶液移动至上述结合垫、上述反应垫及吸收垫，且底物溶液自动供应至反应垫的下部空间A。
根据再一方面，本发明涉及纸基三维结构的微芯片，包括：
纸100；
第一图案膜200，包括第一孔210、第二孔220及微管图案部230，上述第一孔210附着于上述纸上并插入有结合垫，上述第二孔220与上述第一孔相隔开并插入有吸收垫，反应垫位于上述吸收垫上，在上述微管图案部230中，试样、清洗溶液及底物溶液借助毛细管力移动；
第二图案膜300，形成有与第一图案膜200相同的图案，还形成有能够通过进一步去除第一孔210与第二孔220之间的膜区域B来固定反应垫的第三孔240；
结合垫30，插入于上述第一孔中，储存有与检测物质31结合的检测抗体32或核酸适配体；
吸收垫40，插入于上述第二孔中，用于吸入试样、清洗溶液及底物溶液；
反应垫50，以横跨上述结合垫和吸收垫的方式设置来连接上述结合垫和吸收垫，在下部面固定有与包含在上述试样中的抗原1特异性结合的抗体51；
第三图案膜400，包括用于暴露上述第一孔和第三孔的第四孔、用于暴露上述吸收垫的第五孔；以及
第四图案膜500，包括用于暴露上述第二孔的第六孔510及用于在直下部暴露上述反应垫入口侧的顶孔61，
多个上述孔与微管图案部上下贯通，试样、清洗溶液及底物溶液在上述纸上沿着上述微管图案部移动，
上述底物溶液微管图案部233与第二孔连通，以使底物溶液移动至上述反应垫的下部空间A。
根据另一方面，本发明涉及利用纸基三维结构的微芯片检测靶抗原的方法，包括：
向形成于纸上的各个微管图案部提供试样、清洗溶液及底物溶液的步骤；
在没有外部动力源的条件下将试样和清洗溶液通过上述微管并借助毛细管力依次移动至结合垫、反应垫及吸收垫的步骤；以及
在没有外部动力源的条件下将底物溶液通过上述微管并借助毛细管力移动至上述反应垫的下部空间A的步骤，
在上述方法中，若试样到达上述结合垫，则将包含在上述试样中的抗原1和上述结合垫的检测抗体32或核酸适配体进行抗原抗体反应后移动至上述反应垫，
在上述方法中，若包含抗原-检测抗体、未反应检测抗体的试样到达上述反应垫，则使抗原-检测抗体及未反应检测抗体与固定于上述反应垫下部的抗体51进行抗原抗体反应，
在上述方法中，若上述底物溶液到达反应垫，则使与检测抗体结合的检测物质31与底物之间进行酶促反应。
发明的效果
本发明可提供在没有外部动力的条件下通过芯片的三维结构只需注入试样一次来检测靶抗原的纸基三维结构的微芯片。
本发明与流体被吸收至纸的内部而移动的以往的方式不同，是流体沿着由图案化的膜形成的微管(微细流动通道)，因此，可提高移动速度。并且，本发明可通过对微管下部的纸进行亲水性表面处理并控制微管的宽度及长度来控制流体的速度及方向。
本发明中，底物溶液流动的路径与试样和清洗溶液流动的路径位于互不相同的平面上(3D结构、桥结构)，以使这些路径不相互物理接触，因此，从根本上防止由于试样或清洗溶液渗入底物溶液路径(底物溶液微管)而被泄露。即，本发明的3D微芯片结构防止由于试样或清洗溶液的泄露而在除了反应垫之外的区域产生酶促反应，因此，可减少信号噪声和底物溶液的浪费。
附图说明
图1为本发明一实例的整体立体图。
图2为图1的分解图。
图3示出图1的组装过程。
图4为图2中a-a’的剖视图。
图5示出防止泄漏至3D结构(桥结构)。
图6为示出在桥结构通过屏障区域防止泄露的概念图。
图7为根据涂敷和通道的宽度在纸上测定速度的图。
图8示出通过控制速度控制毛细管流动的方向。
图9示出本发明的靶抗原的检测方法。
图10为本发明另一实例的整体立体图。
图11为图10的分解图。
图12示出图10的组装过程。
图13为图10的3D(桥)结构的剖面。
图14为示出在实施例1中所制造的本发明的3D微芯片和反应垫随着抗原浓度而变色的照片。
图15为通过调节试样的抗原浓度来测定信号强度的曲线图。
图16为测定10nM的Trx、PSA、HAS、BSA的信号强度的图。
图17为示出在实施例2中所制造的本发明的3D微芯片和反应垫随着抗原浓度而变色的照片。
图18为通过调节实施例2中试样的抗原浓度来测定信号强度的曲线图。
具体实施方式
以下，通过附图说明本发明的优选实施方式。但是，本发明的范围并不限定于对下述实施方式的说明或附图。即，在本说明书中所使用的术语仅用于说明特定实施例，并非意图限定本发明。在文脉上除非另有其他含义，否则单数表述包括复数表述。并且，需要理解的是，在本说明书中所描述的“包括”或“具有”等术语是指在说明书中所记载的特征、数字、步骤、操作、结构要素、部件或它们的组合的存在，并不预先排除一个或多个其他特征或数字、步骤、操作、结构要素、部件或它们的组合的存在或附加可能性。
图1为本发明一实例的整体立体图，图2为图1的分解图，图3示出图1的组装过程，图4为图3中A-A’的剖视图。
参照图1至图4，本发明的纸基三维结构的微芯片包括纸10、图案膜20、结合垫30、吸收垫40、反应垫及盖膜60。
上述纸10作为微芯片的基底层向流体提供毛细管力。相比于上述膜，上述纸具有亲水性。上述纸只要是使用于纸基微芯片或传感器的公知的纸就可不受限制地使用。例如，上述纸可以为利用于Whatman色谱(Whatman Chromatography)的纸或相纸。
上述纸的厚度不受特别限制。作为一例，上述纸的厚度可以为100～10000μm。
上述图案膜20为附着于上述纸上并形成有微管图案的膜。上述图案膜可以为如，PET或PE膜等公知的塑料膜。上述图案膜的厚度并不受限制。作为一例，图案膜的厚度可以为50～500μm。
参照图2及图3，上述图案膜20包括第一孔21、第二孔22及微管图案部23，在上述第一孔21插入有结合垫，上述第二孔22与上述第一孔相隔开并插入有吸收垫，反应垫位于上述吸收垫上，在上述微管图案部23中，试样、清洗溶液及底物溶液借助毛细管力移动。
上述微管图案部23包括用于使试样移动的试样微管图案部231、清洗溶液微管图案部232及底物溶液微管图案部233。
上述图案膜20可包括试样注入部1、清洗溶液注入部2及底物溶液注入部3。
上述第一孔、第二孔及微管图案部上下贯通。
本发明中，若将上述图案膜20附着于上述纸10上，则上述纸和微管图案部可形成微管(微细流体通道)。即，上述纸在形成微管的底部的同时提供流体流动的动力源，上述微管图案部形成微管的侧壁以使流体可通过纸上微管移动。在流体扩散于纸的内部整体而渗入于纸中来移动的情况下，移动速度非常慢且事实上难以将流体移动至所需的方向，但是，本发明可通过形成于纸上的微管移动至纸上，因此，可将流体快速地移动至所需的方向。
上述结合垫30与吸收垫40分别插入于以相隔开的方式形成的孔中来在相互之间以留有规定间隔的方式设置，各自的下部面与上述纸相接触。
更具体地，上述结合垫30插入于上述第一孔21中，在内部或上部可储存或附着有与检测物质31结合的抗体32、核酸适配体或靶抗原检测用复合物中的一种以上检测抗体。
以下，检测抗体是指与检测物质31结合的抗体32，但是，以下为了方便，可作为包括核酸适配体或靶抗原检测用复合物的术语来使用。
作为上述结合垫，可使用能够装载(储存)检测物质并在特定条件下流出的纤维，作为一例，可以为玻璃纤维膜。
上述抗体是指与包含在试样中的抗原特异性结合来表现出凝聚反应的蛋白质。在发明中所使用的抗体不受特别限制，只要是与抗原特异性结合，可以为IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中任何级别的抗体。并且，抗体所来源动物种类也不受特别限制，但是，源自兔、山羊及小鼠的抗体比较容易得到，而且使用过的例也很多，因此优选。
上述核酸适配体(aptamer)可以为其自身具有稳定的三维结构且具有可与靶分子以高亲和性和特异性结合的特征的单链核酸(DNA、RNA或修饰核酸)。
上述靶抗原检测用复合物可以为包含纳米粒子和抗体的复合物，更具体地，可以为与纳米粒子、核酸适配体及抗体结合的复合物。上述靶抗原检测用复合物可参照本申请人的授权专利10-1613020号。作为参照，上述靶抗原检测用复合物包含纳米粒子、核酸适配体以及多个抗体，核酸适配体附着于上述纳米粒子的表面，并与抗体的可结晶的片段(crystalizable fragment，Fc)区域特异性结合，上述多个抗体中，Fc区域与上述核酸适配体结合，且可与靶抗原结合的抗原结合片段(antibody binding fragment，Fab)区域向上述核酸适配体的方向相反方向取向，上述核酸适配体可通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增来检测与上述抗体结合的靶抗原的量。
上述纳米粒子可以为金、银或硅石。上述纳米粒子的大小可以为10～100nm。在上述纳米粒子为金的情况下，上述核酸适配体的S(硫)可与上述金纳米粒子相结合。
上述检测物质可以为可与特定物质(例如，底物)进行发色反应、荧光反应、发光反应或红外线反应的物质。
例如，上述检测物质可以为酶、酶球、金纳米粒子、金-酶复合物粒子等纳米粒子。
例如，上述酶包括催化发色反应、荧光反应、发光反应或红外线反应的酶，但并不限定于此，例如，可包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶及细胞色素P450。
上述酶球可包含酶和抗体。例如，上述酶球可包含酶、白蛋白凝聚体及抗体。上述酶球可参照本申请人的授权专利10-1622477号。作为参照，上述酶球包含多个酶、通过形成自凝聚体(self-aggregates)来将上述多个酶装载于内部的白蛋白凝聚体(粒子)以及附着于上述白蛋白凝聚体(粒子)表面的抗体，上述多个酶以分散于白蛋白凝聚体的方式存在，上述多个酶可与向上述白蛋白凝聚体的内部渗透的多个底物产生多个酶促反应。
上述酶以1～30重量百分比装载于上述白蛋白纳米凝聚体中，上述白蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或其片段，上述白蛋白凝聚体的大小可以为100～300nm。
上述吸收垫40插入于上述第二孔22中来吸入试样、清洗溶液及底物溶液。上述吸收垫40可提供可使流体借助毛细管力移动的动力。可使用吸收力优秀的纤维作为上述吸收垫，作为一例，可以为纤维膜、聚酯、聚丙烯及玻璃纤维。
上述反应垫50以横跨上述结合垫和吸收垫的方式设置来连接上述结合垫和吸收垫，在反应垫的下部面分别固定有与包含在上述试样中的抗原1特异性结合的抗体51和控制用抗体52。
本发明的反应垫可以为吸收力和蛋白质附着力优秀的硝化纤维膜、聚偏氟乙烯(PVDF)等。
参照图2至图4，上述反应垫50位于与上述结合垫和吸收垫不同的平面上，因此，可在上述反应垫与位于其下部的纸之间形成空间A。
在本发明中，将在反应垫50形成下部空间A的结合垫、吸收垫及反应垫的结构称为桥结构或3D结构。这种桥结构或3D结构为统称使底物溶液流动的路径与试样和清洗溶液流动的路径位于互不相同的平面上以使这些路径不相互物理接触的结构的概念。即，结合垫30、反应垫50及吸收垫40相互物理接触并借助吸收力或毛细管力来移动试样和清洗溶液，底物溶液的路径与这三个垫物理分离，因此，可防止试样或清洗溶液借助吸收力或毛细管力流入至底物溶液路径。
尤其，本发明的反应垫的吸收力优秀，因此，试样和清洗溶液不会渗透至垫的内部而流入到空间A内。
底物溶液可通过上述底物溶液微管233注入至上述空间A来与位于上述空间A的上部的反应垫向接触。
图5示出防止泄漏至3D结构(桥结构)。图5的(a)部分为本发明的3D(桥)结构，图5的(b)部分为底物溶液注入至反应垫的侧面的平面结构。经确认，图5的(b)部分中，红色墨水流入底物溶液注入路径侧，但在图5的(a)部分中，完全不向底物溶液路径泄露。如图5的(b)部分所示，底物溶液在到达反应垫之前在底物溶液微管中与具有显色酶的试样进行反应来产生信号噪声，结果浪费底物。
并且，本发明的微芯片可包括用于防止试样溶液或清洗溶液流入至空间A后泄露至底物溶液微细通道的屏障区域B。上述屏障区域B为在图案膜20中上述第一孔与第二孔之间的没有被去除而留下的膜层。
并且，上述屏障区域B的上部可被疏水性物质e涂敷。上述疏水性物质不受特别限制。例如，上述疏水性物质可以为特氟龙。
图6为示出在桥结构通过屏障区域防止泄露的概念图。如图6的b部分所示，由于没有屏障B，经过结合垫30的试样溶液除了上部的反应垫之外还通过纸10移动至空间A，但如图6的a部分所示，由于屏障B和疏水性物质的涂敷，试样无法移动至空间A。
图1至图4中，若试样、清洗溶液、底物溶液提供至各自的微管注入部1、微管注入部2、微管注入部3，则微芯片可在没有外部动力源的条件下将试样和清洗溶液通过毛细管力和上述微管依次移动至上述结合垫、上述反应垫及吸收垫。若上述清洗溶液移动至上述吸收垫，则上述微芯片可在没有外部动力源的条件下将上述底物溶液通过毛细管力和上述底物溶液微管自动供应至反应垫的下部空间A。
上述试样微管图案部231和清洗溶液微管图案部232通过一个图案通道贴合后与第一孔连通，或者可分别与第一孔连通。
如图3的(a)部分所示，位于上述试样微管图案部231的下部的上述纸被亲水性物质涂敷，从而相比于上述清洗溶液微管图案部或底物溶液微管图案部可提供更快的流速。述亲水性物质可以为亲水性高分子或亲水性金属。作为一例，可涂敷作为上述亲水性物质的银。
并且，上述微芯片可包含涂敷于形成上述空间A的底部的纸上的亲水性物质D。上述亲水性物质D可使底物溶液从上述空间A快速地移动至整个反应垫。
上述试样微管图案部231的图案宽度比上述清洗溶液微管图案部或底物溶液微管图案部的图案宽度宽，从而可提供更快的流速。
上述底物溶液微管图案部233的图案宽度比上述试样微管图案部231和上述清洗溶液微管图案部232的图案宽度窄且其图案长度更长，并且，没有被亲水性物质涂敷，从而相比于试样或清洗溶液，底物溶液到达上述第二孔的速度可最慢。
图7为根据涂敷和通道的宽度在纸上测定速度的图。参照图7，当通道的宽度为0.5mm时，在没有被银涂敷的情况下，速度为0.41mm/s，当通道的宽度为1.5mm时，在没有被银涂敷的情况下，速度为7.90mm/s，因此，将通道的宽度增大3倍，若用银涂敷，则可将速度提高20倍。
图8示出通过控制速度控制毛细管流动的方向。在图8中，在向通道的宽度宽且被银涂敷的主通道和流入这种主通道的宽度窄的分支通道流入流体的情况下，速度快的流体想借助毛细管力进入速度慢的流体的分支通道。但是，在交叉位置，速度慢的流体形成气壁，而气壁不仅防止速度快的流体进入分支通道，而且还防止速度慢的流体进入主通道。如图8所示，在供应至主通道的流体全部流过之后，分支通道的流体才可以进入主通道。
如上所述，本发明的微芯片在没有外部动力源的条件下也可以通过控制在微管中流动的流体的速度来将试样、清洗溶液及底物溶液依次移动至上述反应垫。
上述覆膜60可控制上述试样流向反应垫的上表面。上述覆膜防止试样溢出或进入结合垫而进入底物溶液微管。
上述覆膜60包括以可使位于下部的反应垫的一部分暴露的方式贯通的测定孔61。信号阅读器可读取通过上述测定孔61暴露的反应垫的光或色变来计算抗原浓度。
上述覆膜60可在使试样和样品流入的反应垫的入口邻近处包括用于减少毛细管力的孔62。
在上述反应垫的下部面形成有凹槽63，反应垫可插入于上述凹槽中。
上述覆膜包括在于上述图案膜的试样注入部1、清洗溶液注入部2及底物溶液注入部3相同的位置贯通的孔1、孔2、孔3。
根据另一方面，本发明提供利用纸基三维结构的微芯片检测靶抗原的方法。图9示出靶抗原的检测方法。
本发明的靶抗原的检测方法包括：提供试样、清洗溶液及底物溶液的步骤；将试样和清洗溶液移动至结合垫、反应垫的步骤；将底物溶液移动至反应垫的下部的步骤。
上述试样包含抗原4。
上述清洗溶液只要是公知的ELISA抗原-抗体反应中可使用的溶液就可不受限制地使用。
可使用与上述酶特异性反应的物质作为上述底物。例如，在利用辣根过氧化物酶作为酶的情况下，可使用氯萘酚、氨基乙基咔唑、二氨基联苯胺、D-萤光素、光泽精(双(N-甲基吖啶)硝酸盐)、间苯二酚苄醚、鲁米诺、荧光红试剂(10-乙酰-3，7-二羟基苯恶嗪)、3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-tetramethylbenzidine，TMB)、2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2，2’-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sμlfonate]，ABTS)或邻苯二胺(OPD)。
在利用碱性磷酸酶作为上述酶的情况下，可使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、萘酚AS-BI-磷酸盐(naphthol-AS-B1-phosphate)或ECF(enhanced chemifluorescence)作为底物。
本发明将试样、清洗溶液及底物溶液滴落至如上所述的3D结构的微芯片的试样注入部1、试样注入部2、试样注入部3。本发明可通过将三种溶液同时提供至微芯片上来自动进行ELISA反应。
如上所述，在没有外部动力源的条件下将试样和清洗溶液通过上述微管231、微管232并借助毛细管力依次移动至结合垫30、反应垫50及吸收垫40。
参照图9，本发明中，若试样到达上述结合垫30，则将包含在上述试样中的抗原4和上述结合垫的抗体32或核酸适配体或靶抗原检测用复合物(以下，检测抗体32)进行抗原抗体反应后移动至上述反应垫(图9的(b)部分)。
在上述方法中，若包含抗原4-检测抗体32、未反应检测抗体的试样到达上述反应垫50，则将抗原-检测抗体及未反应检测抗体与51进行抗原抗体反应来固定(图9的(c)部分)。
在上述方法中，若上述试样和清洗溶液经过反应垫并吸收至吸收垫，则通过上述微管233将上述底物溶液注入至上述反应垫的下部空间A。在上述方法中，若上述底物溶液到达反应垫，则在与检测抗体结合的检测物质31与底物之间进行酶促反应(图9的(d)部分、图9的(e)部分)。
上述方法可包括使用阅读器读取由酶促反应产生的信号来计算抗原浓度的步骤。可无限制地使用所公知的测定由酶促反应产生的色变或发光强度的装置或方法。
在上述方法中，如上所述，将结合垫与上述吸收垫相隔开规定间隔来设置于上述纸上，能够以横跨上述结合垫和上述吸收垫的方式设置上述反应垫来在上述反应垫与纸之间形成用于使底物溶液流入的空间A。
并且，在上述方法中，可通过使用亲水性物质涂敷位于微管的下部的纸的上部或者调节微管的宽度来控制试样、清洗溶液、底物溶液的速度及方向。
本发明的利用本发明的三维结构的微芯片检测靶抗原的方法可参照上述的纸基三维结构的微芯片的内容。
图10至图13示出本发明另一实例。图10为本发明另一实例的整体立体图，图11为图10的分解图，图12示出图10的组装过程，图13为图10的3D桥结构的剖面。图10至图13为将图1至图4的结构的一部分变形的微芯片结构。
参照图10至图13，本发明的微芯片包括纸100、第一图案膜200、第二图案膜300、结合垫30、吸收垫40、反应垫50、第三图案膜400及第四图案膜500。
纸100、结合垫30、吸收垫40、反应垫50可参照图1至图4的内容。
第一图案膜200，包括第一孔210、第二孔220及微管图案部230，上述第一孔210附着于上述纸上并插入有结合垫，上述第二孔220与上述第一孔相隔开并插入有吸收垫，反应垫位于上述吸收垫上，在上述微管图案部230中，试样、清洗溶液及底物溶液借助毛细管力移动。
上述微管图案部230包括使试样移动的试样微管图案部231、清洗溶液微管图案部232及底物溶液微管图案部233。
上述图案膜200可包括试样注入部1、清洗溶液注入部2及底物溶液注入部3。
上述图案膜200包括第一孔210与第二孔220之间的膜区域B。如上所述，上述膜区域B可形成3D结构的屏障区域。
上述孔220可包括可使“┓”字形的吸收垫插入并固定的膜上的边界区域C。
参照图12的(a)部分，上述第一图案膜200贴合于上述纸100上后，可在膜B、膜C上涂敷疏水性物质。
参照图12的(a)部分，上述第一图案膜200贴合于上述纸100上后，可在试样微管图案部231的下部纸和空间A的底物溶液入口侧的纸上涂敷亲水性物质D。
第二图案膜300与上述第一图案膜200形成相同的图案，还形成有能够通过进一步去除膜的屏障区域B来固定反应垫的第三孔340。
参照图12，在将第二图案膜贴合于第一图案膜上之后，将结合垫、吸收垫及反应垫分别插入于第一孔210、第一孔310、第二孔220、第二孔320、第三孔340中。
上述第三图案膜400可包括用于暴露上述第一孔和第三孔的第四孔410、用于暴露上述吸收垫的第五孔420。
上述第三图案膜400可以为透明膜。
另一方面，本发明的微芯片可在没有第三图案膜400的情况下将第四图案膜500附着于上述第二图案膜上。
上述第四图案膜500可包括用于暴露上述第二孔的第六孔510及用于在直下部暴露上述反应垫入口侧的顶孔顶孔520。上述第四图案膜可参照如上所述的覆膜。
上述第六孔510可与上述盖膜的测定孔61对应。
上述底物溶液微管图案部233与第二孔连通，以使底物溶液移动至上述反应垫的下部空间A。
位于上述试样微管图案部231的下部的上述纸被亲水性物质涂敷，从而相比于上述清洗溶液微管图案部或底物溶液微管图案部可提供更快的流速。
上述试样微管图案部231的图案宽度比上述清洗溶液微管图案部或底物溶液微管图案部的图案宽度宽，从而可提供更快的流速。
上述底物溶液微管图案部233的图案宽度比上述试样微管图案部231和上述清洗溶液微管图案部232的图案宽度窄且其图案长度更长，从而相比于试样或清洗溶液，底物溶液到达上述第二孔的速度可最慢。
发明的实施方式
以下，参照所附的实施例及涂敷详细地说明本发明。但是，所附的实施例仅用于例示本发明的具体实施方式，并不意图限定本发明的保护范围。
实施例1
用图10至图13的结构制造纸和各膜层。使用Cricut explore Air 2’(Provocraft&Novelty，Inc)裁剪。使用光纸作为纸，使用100μm的PET膜作为膜。
将第一膜200附着于纸上后，在微管231的纸上和孔入口侧纸上涂敷银D。将银放入大小为0.5mm的笔中，用笔在纸上绘画。在60℃的温度下干燥20分钟左右。
将第二膜300贴合于第一膜的上部。
用1μl的0.5％的BSA溶液、2.5μl的40％的海藻糖(trehalose)、20.6μl的0.01％的吐温(Tween)、0.12μl的与HRP结合的抗-Trx抗体(Anti-trx antibody)制备结合垫溶液。将此混合物滴至7mm×4mm的玻璃纤维膜上，并在常温下干燥4小时。
将1μl(0.2mg/ml)的兔抗-Trx抗体(Rabbit Anti-trx antibody)滴至反应垫的一侧的硝化纤维膜(10μm的孔径(pore size)；4mm×25mm)来形成测试点(test dot)(大小为1mm)。将1μl(0.1mg/ml)的兔抗-小鼠IgG抗体(Rabbit anti-Mouse IgG antibody)滴至作为硝化纤维膜的(反应垫)来制备控制点(dot)。用0.1％的吐温溶液清洗并干燥。将0.5％的BSA滴至硝化纤维膜来填满气孔后进行清洗。在常温下干燥1小时。
吸收垫为纤维膜，具有弯曲的“┓”形状。
将结合垫、吸收垫及反应垫插入于第二图案膜和第一图案膜的各孔中。并且将第三图案膜和第四图案膜依次层叠粘结于第二图案膜上来制造微针。
微芯片的大小为55mm×45mm，重量为1.5g。其中，一个为用银涂敷的试样溶液通道(1mm×8mm)，一个为没用银涂敷的清洗通道(1mm×20mm)，一个为底物溶液通道(0.5mm×210mm)。若同时滴加三种溶液(参照下列表1，10μl的样品溶液、20μl的清洗溶液、100μl的TMB底物溶液)等待12分钟左右，则所有溶液在没有外力的条件下依次流动并自动进行反应。如图3所示，在底物反应之后，产生信号。
下列表1为对试样、清洗溶液、底物溶液的成分、体积以及这些溶液通过各个微管达到反应垫的时间进行测定的结果。
表1
Figure BDA0002750745880000161
实施例2
除了通过如下方法制备结合垫溶液之外，以与实施例1相同的方法进行。
首先，在0.5ml的金粒子中以0.2mg/ml混合10μl的附着有HRP的抗体并进行反应15分钟后，放入10μl的0.5mg/ml的硫醇聚乙二醇后进行反应10分钟。以13000RPM离心分离反应物20分钟后去除上清液，将其用0.01％的吐温(Tween)PBS清洗，放入200μl的0.05％的BSA和200μl的0.05％的吐温(Tween)溶液来保管。用24μl的完成的金-酶纳米粒子和2μl的40％的海藻糖(trehalose)制备结合垫溶液。将此混合物滴至7mm×4mm的玻璃纤维膜上，并在常温下干燥4小时。
图14为示出在实施例1中所制造的本发明的3D微芯片和反应垫随着抗原浓度而变色的照片。图15为通过调节试样的抗原浓度来测定信号强度的曲线图。通过比色图像分析程序BIO-VALUE分析信号。Trx浓度与RGB平均成反比，图15中的Y轴为1/(RGB平均)。
参照图15，在0～60nM中示出Trx与信号轻度之间的线性度，尤其，在0～20nM中的线性度非常高。
图16为测定10nM的Trx、PSA、HAS、BSA的信号强度的图。将各溶液准备为260ng/ml的PSA溶液、660ng/ml的BSA溶液、665ng/ml的HSA溶液。
图16的基线(虚线)为在没有抗原时测定的信号强度。基线信号强度为0.006511。相比于此基线，即使添加了PSA、BSA、HSA溶液，信号强度也几乎没有增加。与此相反，Trx的信号强度为0.0075，信号强度明显上升。另一方面，在2.5nM中的Trx的信号强度为0.006742，这比其他三个抗原在10nM中的信号强度更大。即，可确认本发明的装置对Trx具有高选择性。
图17为示出在实施例2中所制造的本发明的3D微芯片和反应垫随着抗原浓度而变色的照片。图18为通过调节实施例2中试样的抗原浓度来测定信号强度的曲线图。参照图18，相比于仅使用以往的HRP的检测抗体，在使用金-酶复合物纳米粒子时产生更强大的信号，敏感度也优秀。
以上，详细说明了本发明的优选实例，但这些仅为了说明的目的而使用，本发明的保护范围并不限定于此。
产业上的可利用性
本发明可用于可控制速度及方向的免疫化学诊断用微芯片。

Claims (24)

1.一种纸基三维结构的微芯片，其特征在于，
包括：
纸(10)；
图案膜(20)，附着于上述纸上，形成有微管图案；
结合垫(30)和吸收垫(40)，分别插入于形成在上述图案膜的孔中来与上述纸相接触，上述结合垫(30)与吸收垫(40)分别插入于以相隔开的方式形成的孔中来在相互之间以留有规定间隔的方式设置，在上述结合垫(30)储存有与检测物质(31)结合的抗体(32)或核酸适配体；
反应垫(50)，以横跨上述结合垫和吸收垫的方式设置，固定有与包含在试样中的抗原(1)特异性结合的抗体(51)；以及
覆膜(60)，附着于上述图案膜(20)上，
上述纸基三维结构的微芯片包括上述反应垫下部的膜(20)被去除而形成的空间(A)，
若上述试样、清洗溶液、底物溶液提供至各个微管图案部，则试样和清洗溶液移动至上述结合垫、上述反应垫及吸收垫，且底物溶液自动供应至反应垫的下部空间(A)。
2.一种纸基三维结构的微芯片，其特征在于，
包括：
纸(10)；
图案膜(20)，包括第一孔(21)、第二孔(22)及微管图案部(23)，上述第一孔(21)附着于上述纸上并插入有结合垫，上述第二孔(22)与上述第一孔相隔开并插入有吸收垫，反应垫位于上述吸收垫上，在上述微管图案部(23)中，试样、清洗溶液及底物溶液借助毛细管力移动；
结合垫(30)，插入于上述第一孔中，储存有与检测物质(31)结合的抗体(32)或核酸适配体；
吸收垫(40)，插入于上述第二孔中，用于吸入试样、清洗溶液及底物溶液；
反应垫(50)，以横跨上述结合垫和吸收垫的方式设置来连接上述结合垫和吸收垫，在下部面固定有与包含在上述试样中的抗原(1)特异性结合的抗体(51)；以及
覆膜(60)，附着于上述图案膜(20)上，
上述第一孔、第二孔及微管图案部贯通，从而使试样、清洗溶液及底物溶液在上述纸上沿着上述微管图案部移动，
上述底物溶液微管图案部(233)与第二孔连通，以使底物溶液向上述反应垫的下部空间(A)移动。
3.根据权利要求1或2所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，
若上述试样、清洗溶液、底物溶液提供至各个微管图案部，则上述微芯片在没有外部动力源的条件下将试样和清洗溶液通过毛细管力和上述微管依次移动至上述结合垫、上述反应垫及吸收垫，
若上述清洗溶液移动至上述吸收垫，则上述微芯片在没有外部动力源的条件下将上述底物溶液通过毛细管力和上述底物溶液微管自动供应至反应垫的下部空间(A)。
4.根据权利要求1或2所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，
若试样到达上述结合垫，则上述微芯片将包含在上述试样中的抗原(4)和与上述结合垫的检测物质结合的抗体(32)、核酸适配体或靶抗原检测用复合物中的一种以上检测抗体进行抗原抗体反应后移动至上述反应垫，
若包含抗原-检测抗体、未反应检测抗体的试样到达上述反应垫，则上述微芯片将抗原-检测抗体及未反应检测抗体与抗体(51)进行抗原抗体反应来固定，
若上述底物溶液到达反应垫，则上述微芯片使与检测抗体结合的检测物质(31)与底物之间进行酶促反应。
5.根据权利要求1或2所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述第一孔与第二孔之间的膜区域(B)形成用于防止上述试样和清洗溶液向上述空间(A)泄漏的屏障层。
6.根据权利要求5所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述膜区域(B)的上部被疏水性物质涂敷。
7.根据权利要求1或2所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述覆膜(60)在使试样和样品流入的反应垫的入口邻近处包括用于减少毛细管力的孔(61)。
8.根据权利要求1或2所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，相比于上述膜，上述纸具有亲水性。
9.根据权利要求1或2所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述试样微管图案部(213)和清洗溶液微管图案部通过一个图案通道贴合后与第一孔连通。
10.根据权利要求1或2所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述试样微管图案部(231)和清洗溶液微管图案部(232)分别与第一孔连通。
11.根据权利要求9所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，位于上述试样微管图案部(231)的下部的上述纸被亲水性物质涂敷，从而相比于上述清洗溶液微管图案部或底物溶液微管图案部提供更快的流速。
12.根据权利要求9所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述试样微管图案部(231)的图案宽度比上述清洗溶液微管图案部或底物溶液微管图案部的图案宽度宽，从而提供更快的流速。
13.根据权利要求1或2所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述底物溶液微管图案部(233)的图案宽度或图案长度比上述试样微管图案部(231)和上述清洗溶液微管图案部(232)的图案宽度宽或者图案长度更宽或更长，从而相比于试样或清洗溶液，底物溶液到达上述第二孔的速度最慢。
14.根据权利要求1所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述反应垫(50)使用纤维素类膜、聚乙烯类膜来使试样或清洗溶液沿着内部或下部面移动。
15.一种纸基三维结构的微芯片，其特征在于，
包括：
纸(100)；
第一图案膜(200)，包括第一孔(210)、第二孔(220)及微管图案部(230)，上述第一孔(210)附着于上述纸上并插入有结合垫，上述第二孔(220)与上述第一孔相隔开并插入有吸收垫，反应垫位于上述吸收垫上，在上述微管图案部(230)中，试样、清洗溶液及底物溶液借助毛细管力移动；
第二图案膜(300)，形成有与第一图案膜(200)相同的图案，还形成有能够通过进一步去除第一孔(210)与第二孔(220)之间的膜区域(B)来固定反应垫的第三孔(240)；
结合垫(30)，插入于上述第一孔中，储存有与检测物质(31)结合的检测抗体(32)或核酸适配体；
吸收垫(40)，插入于上述第二孔中，用于吸入试样、清洗溶液及底物溶液；
反应垫(50)，以横跨上述结合垫和吸收垫的方式设置来连接上述结合垫和吸收垫，在下部面固定有与包含在上述试样中的抗原(1)特异性结合的抗体(51)；
第三图案膜(400)，包括用于暴露上述第一孔和第三孔的第四孔、用于暴露上述吸收垫的第五孔；以及
第四图案膜(500)，包括用于暴露上述第二孔的第六孔(510)及用于在直下部暴露上述反应垫入口侧的顶孔(61)，
多个上述孔与微管图案部上下贯通，试样、清洗溶液及底物溶液在上述纸上沿着上述微管图案部移动，
上述底物溶液微管图案部(233)与第二孔连通，以使底物溶液移动至上述反应垫的下部空间(A)。
16.根据权利要求15所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述第一孔与第二孔之间的膜区域(B)形成用于防止上述试样和清洗溶液向上述空间(A)泄漏的屏障层。
17.根据权利要求16所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述膜区域(B)的上部被疏水性物质涂敷。
18.根据权利要求15所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，位于上述试样微管图案部(231)的下部的上述纸被亲水性物质涂敷，从而相比于上述清洗溶液微管图案部或底物溶液微管图案部提供更快的流速。
19.根据权利要求15所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述试样微管图案部(231)的图案宽度比上述清洗溶液微管图案部或底物溶液微管图案部的图案宽度宽，从而提供更快的流速。
20.根据权利要求15所述的纸基三维结构的微芯片，其特征在于，上述底物溶液微管图案部(233)的图案宽度或图案长度比上述试样微管图案部(231)和上述清洗溶液微管图案部(232)的图案宽度宽或者图案长度更宽或更长，从而相比于试样或清洗溶液，底物溶液到达上述第二孔的速度最慢。
21.一种利用纸基三维结构的微芯片检测靶抗原的方法，
包括：
向形成于纸上的各个微管图案部提供试样、清洗溶液及底物溶液的步骤；
在没有外部动力源的条件下将试样和清洗溶液通过上述微管并借助毛细管力依次移动至结合垫、反应垫及吸收垫的步骤；以及
在没有外部动力源的条件下将底物溶液通过上述微管并借助毛细管力移动至上述反应垫的下部空间(A)的步骤，上述利用纸基三维结构的微芯片检测靶抗原的方法的特征在于，
若试样到达上述结合垫，则将包含在上述试样中的抗原(4)和上述结合垫的检测抗体(32)或核酸适配体进行抗原抗体反应后移动至上述反应垫，
若包含抗原-检测抗体、未反应检测抗体的试样到达上述反应垫，则使抗原-检测抗体及未反应检测抗体与固定于上述反应垫下部的抗体(51)进行抗原抗体反应，
若上述底物溶液到达反应垫，则使与检测抗体或核酸适配体结合的检测物质(31)与底物之间进行酶促反应。
22.根据权利要求21所述的利用纸基三维结构的微芯片检测靶抗原的方法，其特征在于，
将结合垫与上述吸收垫相隔开规定间隔来设置于上述纸上，
以横跨上述结合垫和上述吸收垫的方式设置上述反应垫来在上述反应垫与纸之间形成用于使底物溶液流入的空间(A)。
23.根据权利要求21所述的利用纸基三维结构的微芯片检测靶抗原的方法，其特征在于，通过使用亲水性物质涂敷位于微管的下部的纸的上部或者调节微管的宽度来控制试样、清洗溶液、底物溶液的速度及方向。
24.根据权利要求21所述的利用纸基三维结构的微芯片检测靶抗原的方法，其特征在于，包括使用阅读器读取由酶促反应产生的信号来计算抗原浓度的步骤。
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