WO2013051889A2

WO2013051889A2 - 한 번의 시료 주입으로 순차적인 반응 조건의 변화가 가능한 멤브레인 센서

Info

Publication number: WO2013051889A2
Application number: PCT/KR2012/008085
Authority: WO
Inventors: 김민곤; 정효암; 안준형
Original assignee: 광주과학기술원; 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2012-10-05
Publication date: 2013-04-11
Also published as: WO2013051889A3; US9857363B2; EP2765422A4; KR101394221B1; US20140255958A1; CN103874924B; EP2765422B1; CN103874924A; KR20130037647A; EP2765422A2

Abstract

본 발명은 한번의 시료주입으로 반응 조건의 변화가 가능한 멤브레인 센서 및 이를 이용한 반응의 측정 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 반응물질 저장부와 반응 멤브레인 사이에 비대칭막을 형성시켜 두 가지 이상의 반응 조건을 갖는 생체 반응을 한 번의 시료 주입으로 순차적으로 일어나도록 설계한 멤브레인 센서에 관한 것이다.

Description

한 번의 시료 주입으로 순차적인 반응 조건의 변화가 가능한 멤브레인 센서

본 발명은 한 번의 시료주입으로 반응 조건의 변화가 가능한 멤브레인 센서 및 이를 이용한 반응의 측정 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 반응물질 저장부와 반응 멤브레인 사이에 비대칭막을 형성시켜 두 가지 이상의 반응 조건을 갖는 생체 반응을 한 번의 시료 주입으로 순차적으로 일어나도록 설계한 멤브레인 센서에 관한 것이다.

항체-항원 반응을 신속하게 측정하는 방법으로 LFA(lateral flow assay) 시스템이 많이 사용된다. LFA는 일반적으로 액체 시료가 모세관 현상으로 흐를 수 있는 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류층에는 접합체 패드와 시료 패드가 연결되어 있고, 멤브레인의 하류층에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 접합체 패드에는 시료물질과 선택적으로 결합할 수 있는 항체가 고정화된 금 나노입자 접합체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 시료물질과 선택적으로 반응하는 항체 및 금 나노입자에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화되어 있다. 상기 시료물질과 선택적으로 결합할 수 있는, 멤브레인에 고정화된 항체와 금 나노입자에 고정화된 항체는 시료물질에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 잘 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 LFA 장치에 액체 시료용액을 샘플 패드에 떨어뜨리면, 시료가 존재할 경우 시료에 선택성을 가지는 항체-금 나노입자와 멤브레인에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다.

멤브레인형 센서로서 현장진단용 멤브레인 스트립 바이오센서 시스템 (한국등록특허 599420); 복합센서 멤브레인(일본공개특허 2006-507511); 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서(한국등록특허 348351); Method for Determining Concentration of Multiple Analytes in a Single Fluid Sample (미국등록특허 7494818); 멤브레인을 갖는 센서 및 그 제조방법(한국등록특허 591390); Test Device for Simultaneous Measurement of Multiple Analytes in a Single Sample(미국공개특허 2005-214161) 등과 같이 다양한 형태가 공개된 바 있다.

그러나 종래의 나노입자를 이용한 LFA 방법은 그 검출 감도가 1 ng/ml 로서, 그 검출 감도의 향상이 필요하며, 나노입자를 이용한 샌드위치 방법을 제외 하고 효소 발색반응, 형광, 화학발광 등의 고감도 반응을 한번의 시료 주입으로 가능한 단일 과정(one-step)으로 구현하는 것이 어렵다는 단점이 있다. 또한 효소반응, 화학발광반응과 같은 2단계 이상의 반응 조건이 필요한 생체 반응의 경우 LFA 스트립에서는 한번의 시료 주입으로서 원하는 결과를 얻기 어려우며, 화학발광 스트립의 경우 우선적으로 항원항체 반응이 이루어진 후에 루미놀 반응을 위하여 2차적으로 루미놀 반응액을 주입하는 2 step 방법이나, 반응 멤브레인 위에 루미놀 반응 물질이 도포된 지지체를 위치하고 항원항체 반응이 완료된 시점에 반응부에 접촉하는 방식으로 구현되는 기술만이 알려져 있다(유럽특허 1,9652,212, 미국공개특허 2009-142781).

따라서 한번의 시료 주입을 통하여 단일 과정(one-step)으로 2단계 이상의 반응 조건을 갖는 생체 반응을 측정할 수 있는 스트립의 개발이 요구되는 실정이다.

본 발명은 이 같은 배경에서 도출된 것으로, 한번의 검출 시료 주입으로 2가지 이상의 반응조건을 갖는 생체 또는 화학반응을 손쉽게 LFA 스트립에서 구현할 수 있는 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

반응 멤브레인; 상기 반응 멤브레인 상에 위치하는 비대칭막 및 상기 비대칭막 상에 위치하고, 반응물질이 처리된 반응물질 저장부를 포함하는 수평 흐름(lateral flow)을 이용한 멤브레인 스트립 바이오센서를 제공한다.

일 실시예의 멤브레인 스트립 바이오센서에서, 반응 멤브레인의 양 끝단 중 어느 한 쪽에는 샘플패드가 위치하고, 다른 한 쪽에는 흡수패드가 위치하는 것을 특징으로 한다.

일 실시예의 멤브레인 스트립 바이오센서에서, 비대칭막의 평균 기공 크기는 0.01 ~ 50 ㎛ 이고, 상기 비대칭막은 폴리술폰(polysulfone), 폴리에테르술폰(polyethersulfone) 및 폴리카보네이트(polycarbonate) 중에서 선택된 1종 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

일 실시예의 멤브레인 스트립 바이오센서에서, 반응 멤브레인은 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리술폰, 폴리에테르술폰 및 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 중에서 선택된 1종 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

일 실시예의 멤브레인 스트립 바이오센서에서, 주입 시료 내 분석대상물질을 포획할 수 있는 생체물질이 반응 멤브레인 상에 처리된 것을 특징으로 한다.

일 실시예의 멤브레인 스트립 바이오센서에서, 분석대상물질과 반응하는 1차 반응물질이 반응 멤브레인 상에 처리되고, 신호를 발생하는 2차 반응물질이 상기 반응물질 저장부 내 처리되는 것을 특징으로 한다.

일 실시예의 멤브레인 스트립 바이오센서에서, 상기 샘플패드에 인접하여 컨쥬게이션 패드가 위치하며, 분석대상물질과 반응하는 1차 반응물질이 상기 컨쥬게이션 패드에 처리되고, 신호를 발생하는 2차 반응물질이 상기 반응물질 저장부 내 처리되는 것을 특징으로 한다.

일 실시예의 멤브레인 스트립 바이오센서에서, 상기 1차 반응물질은 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids), 압타머(aptamer) 및 나노입자 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 접합체이고, 상기 2차 반응물질은 흡광물질, 형광물질, 발광물질, 전기화학적 신호 발생물질 및 흡광, 형광, 발광, 전기화학적 신호의 세기를 증폭하는 신호 증폭 물질이 포함 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 멤브레인 스트립 바이오센서에 시료를 주입하여 분석대상물질을 하는 생체 시료의 분석방법을 제공한다.

본 발명의 바이오센서를 사용하면, 2가지 이상의 반응 조건을 갖는 효소반응, 항원항체 반응, 화학반응 등을 한 번의 검출 시료 주입으로 구현이 가능하므로, 기존의 검출 감도가 높은 LFA 스트립 센서의 적용 범위를 보다 확대할 수 있는 효과가 있다.

도 1 및 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 센서의 구성을 나타낸 것이다.

도 3은 실시예 1 및 비교예 1에서 시간 경과에 따른 반응 멤브레인의 pH 변화에 따른 색 변화를 확인한 사진이다. 이 때, 총 6개의 멤브레인 중 왼쪽 3개는 비교예, 오른쪽 3개는 실시예를 의미한다.

도 4은 실시예 1 및 비교예 1에서 시간 경과에 따른 색의 강도를 측정하여 비교한 그래프이다.

도 5는 실시예 2에서 화학 발광 멤브레인 센서의 구성을 나타낸 것이다.

도 6은 실시예 2에서 인간 혈청 내 CRP의 농도 별로 측정한 결과를 나타낸 사진이다.

도 7은 실시예 3에서 화학 발광 멤브레인 센서의 구성을 나타낸 것이다.

도 8은 실시예 3에서 인간 혈청 내 CRP의 농도 별로 측정한 결과를 나타낸 사진이다.

도 9는 실시예 2 및 3에서 인간 혈청 내 CRP의 농도 별로 발광 정도를 발광 측정기로 측정하여 비교한 그래프이다.

[부호의 설명]

11 : 샘플패드 12 : 흡수패드

13 : 컨쥬게이션 패드 14 : 반응물질 저장부

15 : 비대칭막 16 : 반응 멤브레인

17 : 하부기판 20 : anti-CRP 항체-퍼옥시다제 복합체

21 : anti-CRP 폴리클로날 항체

22 : anti-mouse IgG 23 : 콜린 옥시다제

본 발명은 반응물질 저장부와 반응 멤브레인 사이에 비대칭막이 존재하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 바이오센서에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트립 바이오센서의 기본 구성도이다.

상기 도 1에서 도시된 바와 같이 스트립 바이오센서는 반응물질 저장부(14), 비대칭막(15), 반응 멤브레인(16) 및 하부기판(17)을 포함하며, 기본적인 LFA 스트립의 구성 요소인 샘플패드(11), 흡수패드(12)를 포함한다.

상기 반응물질 저장부(14)는 최초 주입된 시료에 의하여 1차 반응이 이루어 진 후, 일정 시간 경과 후 유도된 2차 반응에 필요한 반응물질을 저장하기 위한 것으로, 생체시료, 화학시료, 반응조건 조절물질 등을 저장할 수 있다. 상기 반응물질 저장부(14)는 수용액상태의 반응 물질을 처리하여 건조될 수 있는 모든 재질이 사용될 수 있고, 일반적으로 스트립 센서에 사용되는 흡수패드, 멤브레인 등이 이에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 셀룰로오스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 유리 섬유와 같은 재질로 이루어지는 것이 좋다.

상기 비대칭막(15)은 기공이 큰 부분과 작은 부분이 비대칭 구조로 이루어진 막으로 윗면과 아랫면의 기공 크기가 서로 다르게 되며, 기공이 큰 부분은 반응물질 저장부(14) 쪽으로, 기공이 작은 쪽은 반응 멤브레인(16) 쪽으로 접촉된다. 따라서, 주입된 액체 시료가 반응 멤브레인(16)을 통하여 수평으로 이동할 때, 흐름 초기에 주입된 시료가 확산되도록 하며, 확산이 완료된 후 반응물질 저장부(14)에 건조되어 있는 반응물질을 반응 멤브레인(16) 쪽으로 이송함과 동시에, 반응 멤브레인(16)을 통하여 흐르는 주입된 시료가 반응물질 저장부(14)로 이송되는 것을 막는 역할을 수행한다. 상기 비대칭막(15)의 평균 기공 크기는 0.01 ~ 50 ㎛, 바람직하게는 1 ~ 30 ㎛로 형성되는 것이 좋다.

일반적으로 수용성 액체는 기공이 큰 부분으로부터 작은 부분 쪽으로 흐르고, 그 반대 방향으로는 흐르지 못하는 성질이 있는데, 이는 모세관 현상에 의하여 설명될 수 있다. 따라서 일반적인 유체는 친수성을 갖는 다공성 멤브레인을 통하여 흐르게 되고, 이러한 다공성 구조가 비대칭적으로 이루어진 비대칭막(15)에서는 기공이 큰 쪽에서 작은 쪽으로 먼저 수직흐름이 이루어진 후, 수평으로 흐르게 된다.

결국 수용성 주입 시료가 반응 멤브레인(16)을 통하여 수평으로 흐를 때, 건조된 상태의 비대칭막(15)은 수용성 시료가 반응물질 저장부(14) 쪽으로 확산 되도록 하는 중간 매개체 역할을 수행하게 되며, 모든 수용성 시료의 확산이 완료되어 반응물질 저장부(14)가 충분히 적셔진 후에는, 기공이 작은 쪽과 접촉되어 있는 반응 멤브레인(16)에서 더 이상 주입된 시료가 반응물질 저장부(14)로 확산되지 못하게 된다. 그와 동시에 지속적으로 반응 멤브레인(16)을 통하여 주입 시료는 수평 방향으로 흐르게 되고, 일정 시간의 경과 후 반응물질 저장부(14)에 존재하는 반응물질은 비대칭막(15)을 통하여 서서히 반응 멤브레인(16) 쪽으로 흘러 나오게 되므로, 반응물질 저장부(14)에 저장된 물질의 성질에 따라서 스트립 센서의 반응 조건을 변화시킬 수 있다. 즉, 상기 비대칭막(15)이 존재함에 따라 반응물질이 흘러나오는 시간을 지연하고, 반응물질 저장부(14)를 통하여 반응 멤브레인(16) 쪽으로 흘러나오는 반응물질이 일정시간 동안 균일하게 반응 멤브레인(16)에서 흡수패드(12) 쪽으로 흘러가도록 조절할 수 있으며, 반응물질 이외에 산, 염기 및 버퍼 조성물질을 포함시켜 반응 멤브레인(16)에서의 pH 조절 및 반응 조건의 변화가 가능하다.

상기 비대칭막(15)은 친수성 재질로서 기공이 균일하게 생성되어 있지 아니하고 기공이 큰 부분과 작은 부분이 분리될 수 있으면 그 종류에 제한되지 아니하나, 바람직하게는 폴리술폰(polysulfone), 폴리에테르술폰(polyethersulfone) 및 폴리카보네이트(polycarbonate) 중에서 선택된 재질로서 제조된 것을 사용하는 것이 좋다.

또한, 반응 멤브레인(16)은 생체시료가 이송되는 통로 역할을 수행함과 동시에 원하는 화학, 생물학적 반응 결과를 확인할 수 있는 수평 흐름이 가능한 멤브레인 형태의 모든 재질을 포함한다. 보다 바람직하게는 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리술폰, 폴리에테르술폰 및 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 중에서 선택된 재질의 멤브레인을 사용하는 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 액체 시료의 수평 흐름이 가능한 재질 중에서 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에서 샘플패드(11)는 액상시료가 투입되어 반응 멤브레인으로 전개되도록 하며, 흡수패드(12)는 반응 멤브레인으로 전개된 시료를 흡수하는 역할을 한다. 상기 샘플패드 또는 흡수패드는 액상 시료를 흡수할 수 있는 재료라면 그 종류가 제한되지 않으나, 바람직하게는 셀룰로오스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 유리 섬유와 같은 재질로 이루어지는 것이 좋다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트립 바이오센서의 기본 구성도로서 컨쥬게이션 패드(13)가 더 포함되는 것을 특징으로 한다. 상기 컨쥬게이션 패드(13)는 분석대상물질에 선택적으로 결합할 수 있는 1차 반응물질이 도포된 후 건조되어 있는 것을 사용할 수 있다. 상기 1차 반응물질로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids), 압타머(aptamer) 및 나노입자 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 접합체 등이 사용될 수 있다.

한편, 1차 반응물질이 금속 나노입자일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의한 금속 나노입자의 색변화를 통해 분석대상물질을 검출할 수 있으며, 멤브레인 상에서 리셉터에 선택적으로 결합된 분석대상물질과 금속 나노입자의 결합체의 흡광도, 전기 전도도 등을 측정함으로써 분석대상물질을 정량적으로 분석할 수 있다. 이러한 금속 나노입자는, 예를 들어, 금 나노입자, 은 나노입자, 구리 나노입자 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 1차 반응물질이 효소, 효소 기질 또는 효소반응 생성물질일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의해 분석대상물질 또는 리셉터와 상기 효소, 효소 기질 또는 효소반응 생성물질이 반응하여 산화환원반응 등과 같은 효소반응을 일으키게 되는데, 이 때 상기 효소 반응에 의한 생성물의 흡광, 형광, 발광 등을 측정함으로써 분석대상물질을 검출할 수 있다. 이러한 효소는, 예를 들어 글루코스 옥시다아제, 글루코스 탈수소효소, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 효소 기질은, 예를 들어 글루코스, 과산화수소 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 신호를 발생하는 2차 반응물질이 상기 반응물질 저장부 내 처리될 수 있고, 상기 2차 반응물질로는 흡광물질, 형광물질, 발광물질, 전기화학적 신호 발생물질 또는 흡광, 형광, 발광, 전기화학적 신호의 세기를 증폭하는 신호 증폭 물질이 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 루미놀(luminol), 루미겐(lumigen), 루시페린 (luciferin)과 같은 화학발광 물질, ruthenium tris-bipyridine(Ru(Bpy)₃)등과 같은 전기화학발광 물질, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB), 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DBA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)(ABTA), 4-chloro-1-naphthol(CN), BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)/NBT (nitro blue tetrazolium) 등과 같은 효소 발색기질, 유기형광물질(예, FITC, 로다민 그린, 티아디카르보시아닌, Cy2, Cy3, Cy5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 및 Alexa 647), 양자점(Quantum dot) 등과 같은 형광물질, 금속나노입자, 마그네틱나노입자, pH 조절 물질 (예, NaOH, HCl, 버퍼) 등이 사용될 수 있으며, 신호 증폭 물질 또는 저해 물질 등도 함께 사용될 수 있다.

그리고, 주입 시료 내 분석대상물질을 포획할 수 있는 생체물질(리셉터)이 반응 멤브레인(16) 상에 처리된다.

결국, 상기 컨쥬게이션 패드(13)에 1차 반응물질이 도포된 후 건조되어 있는 경우, 상기 1차 반응물질과 2차 반응물질에 의한 반응이 순차적으로 일어남에 따라 신호발생물질의 신호로 시료 내 분석대상물질을 측정할 수 있으며, 상기 비대칭막(15)은 2차 반응물질의 방출시간을 지연시키는 역할을 한다.

본 발명에 있어서, 상기 컨쥬게이션 패드(13)로는 1차 반응물질을 도포하여 건조한 후, 상기 컨쥬게이션 패드(13)가 액체에 젖을 경우 반응물질이 컨쥬게이션 패드로부터 쉽게 떨어지는 물질이면 모두 사용할 수 있으며, LFA 시스템에서 일반적으로 사용되는 컨쥬게이션 패드라면 모두 사용될 수 있으며, 셀룰로오스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 유리섬유와 같은 재질뿐 만 아니라, 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리술폰, 폴리에테르술폰 또는 PVDF(Polyvinylidene fluoride)와 같은 멤브레인 재질 모두 사용될 수 있다.

본 발명에서 샘플패드를 통하여 주입되는 시료는 분석대상물질이 포함되거나 포함되지 않은 임의의 시료일 수 있으며, 반응 멤브레인을 매개체로 하여 샘플패드에서 흡수패드로 흘러 갈수 있는 유체를 의미한다. 구체적으로 혈액, 혈청 또는 특정 분석물질(DNA, 단백질, 화학물질, 독성물질 등)을 포함하는 액체 형태의 시료를 의미한다.

본 발명의 바이오센서는 시료 내의 특정 분석물질에 따라서 다양한 형태의 스트립 센서로 구현될 수 있다. 예를 들어 혈청 내의 특정 단백질을 검출하고자 할 때, 반응물질 저장부와 흡수패드 사이에 특정 물질을 선택적으로 결합시킬 수 있는 항체를 고정하고, 검출 항체-효소 복합체를 이용하여, 혈청을 샘플 패드에 주입할 경우, 샌드위치 면역반응이 이루어지고 검출 항체의 효소와 특이적인 신호를 보이는 반응물질을 반응물질 저장부에 포함시키면 초기 항원 항체 반응이 이루어진 후, 특정 신호를 나타낼 수 있는 센서를 구현할 수 있다. 특히 반응물질 저장부에 위치한 물질의 반응조건과 항원항체 반응조건이 상이하거나, 교차반응이 일어나거나 비특이적 반응이 일어나는 경우, 일반적인 LFA 스트립 센서에서는 단일 과정(one-step)으로 구현되기 어려우나 본 발명의 바이오센서를 통하여 쉽게 구현될 수 있다.

상기 단일 과정(one-step)은 한 번의 시료 주입만으로 반응 및 측정이 완료되는 것을 말한다. 일 예로 루미놀을 이용한 화학발광 면역 센서의 경우, 루미놀 발광 반응은 pH 9 이상에서 최대가 되므로 항원항체 결합이나 효소반응이 최대가 되는 pH 조건과 차이가 있으며, 중성 이하의 pH 에서는 루미놀의 침전이 발생하는 문제가 있다. 일반적인 바이오 센서의 경우 주입시료가 혈액, 또는 혈청과 같이 중성 pH일 경우가 대부분이므로, 단일 과정을 통하여 이러한 루미놀 반응을 진행하기 매우 어렵다. 그러나 하기 실시예에서 보는 바와 같이 본 발명은 이러한 2가지 이상의 반응조건을 가지는 경우에도 쉽게 단일 과정을 통하여 구현할 수 있는 바, LFA 스트립 센서의 이용 범위를 넓힐 수 있게 된다.

한편, 본 발명은 상기 멤브레인 스트립 바이오센서에 시료를 주입하여 면역반응 또는 효소 반응 등을 통하여 분석대상물질을 측정하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.

측정 대상의 반응에 따라, 반응물질의 종류 및 반응 멤브레인의 처리 등을 조절할 수 있으나, 그 일 예로서 화학 발광 면역 스트립 센서의 경우, 컨쥬게이션 패드에 검출 항체를 저장한 후, 반응 멤브레인에 포획항체 및 2차 항체를 고정시키고, 반응물질 저장부에 발광 반응을 일으키는 물질을 포함시킨 상태에서, 시료를 주입함으로써 반응 정도를 확인할 수 있다. 또한, 컨쥬게이션 패드를 포함하지 않는 경우에도, 반응 멤브레인에 검출 항체를 처리함으로써 원하는 결과를 이끌어낼 수 있다.

상기 반응에 있어서, 일반적인 생체 물질 특히 단백질들은 반응 멤브레인에 처리하는 경우 흡착되어 고정화되나, 계면활성제 또는 수용성 고분자를 처리하는 경우, 주입 시료가 반응 멤브레인을 따라 이동할 때 주입 시료와 함께 흘러가는 성질을 갖는다. 이때 계면활성제로는 Surfactant 10G 등이 사용될 수 있고, 수용성 고분자로는 중량평균분자량 1,000 ~ 100,000 g/mole 범위의 PVP(Polyvinylpyrrolidone) 고분자가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

전술한, 그리고 추가적인 본 발명의 양상들은 첨부된 도면들을 참조하여 설명되는 바람직한 실시예 들을 통해 더욱 명확하게 설명될 것이다. 이하에서는 본 발명을 이러한 실시예들을 통해 당업자가 용이하게 이해하고 재현할 수 있도록 상세히 설명하기로 한다.

그러나 하기 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다

실시예 1 : 한번의 시료 주입을 통하여 순차적 pH 변화가 가능한 스트립 센서

유리섬유로 제조된 반응물질 저장부(4 mm × 4 mm) 에 pH 9.0 소디움 카보네이트(20 μL, 50 mM) 버퍼를 처리하여 건조시켰다. 다음 0.05 중량% α-나프톨벤제인(α-naphtolbenzein, 10μL in 1% surfactant 10G)과 50중량% 에탄올을 함께 처리하여 건조된 니트로셀룰로오스 멤브레인(Millipore, 180 sec Nitrocellulose, 4 mm × 25 mm)를 반응 멤브레인으로 사용하였다. 상기 α-나프톨벤제인은 pH 지시 시약으로서, 8 ~ 9 사이의 pH 변화에 따라 황색에서 파란색으로 변화하는 성질을 가진다.

또한 비대칭막으로는 폴리술폰 재질의 혈청 분리용 막(Vivid^TM, Pall, 4 mm × 4 mm, 기공이 큰 쪽 평균 기공 크기 약 10 ㎛, 기공이 작은 쪽 평균 기공 크기 약 0.1 ㎛)를 사용하였으며, 샘플패드(4 mm × 10mm)와 흡수패드(4 mm × 20 mm)는 유리섬유 재질을 사용하여 도 1과 같이 바이오센서를 구성하였다.

60 μL PBS 버퍼(pH 7.4)를 샘플패드에 주입하고 시간에 따른 반응물질 저장부와 흡수패드 사이의 색 변화를 통하여 반응물질 저장부의 pH 9.0 소디움 카보네이트 버퍼가 반응 멤브레인으로 흘러 나오는 정도를 측정하여 이를 도 3에 나타내었다. 반응 멤브레인의 색은 반응물질 저장부의 소디움 카보네이트 버퍼 성분이 흘러나온 양을 의미한다. 또한 색의 강도를 시간에 따라 측정하여 도 4에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이 PBS 주입 후 5분 이내에는 전혀 색의 변화가 나타나지 아니하였고, 5분 경과 이후에 서서히 균일하게 흘러 나오는 것을 확인할 수 있었다. 비대칭막의 경우 PBS 주입 후 약 5분간 반응물질 저장부의 반응용액이 흘러나오는 것을 지연할 수 있으며, 약 5 ~ 15분 동안 일정한 농도로 반응물질이 흘러 나오도록 하는 조절하는 기능을 수행한 것을 알 수 있다.

비교예 1 : 비대칭막이 존재하지 않는 스트립 센서

상기 실시예 1에서 비대칭막을 포함하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 PBS 버퍼를 샘플패드에 주입하고 시간에 따른 색 변화를 관찰하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

상기 도 3에서 보는 바와 같이, PBS 주입 후, 10초 경과 후부터 불규칙적으로 매우 진하게 변화하는 것을 확인할 수 있다. 이는 비대칭막이 존재하지 않는 경우 반응용액이 불규칙적으로 흘러나오는 것을 의미한다.

실시예 2 : 한번의 시료 주입을 통하여 인간 혈청 내의 CRP(C-Reactive Protein) 측정이 가능한 화학발광 스트립 센서(컨쥬게이션 패드 포함)

본 발명에서 이루고자 하는 바를 항원-항체 화학발광 반응에 응용하고자 고안된 도 5와 같이 스트립을 제조하였다.

상기 실시예 1에서와 달리 컨쥬게이션 패드(fusion 5, whatman, 4mm × 10mm)를 제조한 후, 이에 100 μg Surfactant 10G 및 200 μg PVP 55K로 전 처리된 anti-CRP 항체-퍼옥시다제 복합체(20) 0.2 μg(Abcam)을 첨가하였다. 그리고 반응물질 저장부에는 루미놀 140 μg 및 콜린클로라이드 58 μg를 처리하였다.

다음, 반응물질 저장부와 흡수패드 사이에서 반응물질 저장부에 가까운 쪽은 0.8 μg/mL anti-CRP 폴리클로날 항체(21)와 0.1 U/mL의 콜린 옥시다제(23) 혼합물을 고정하였으며, 흡수패드와 가까운 쪽은 0.8 μg/mL anti-mouse IgG(22)와 0.1 U/mL의 콜린 옥시다제(23) 혼합물을 고정하였다. 이때 각각의 고정화는 디스펜서로 처리하여 건조하였다.

90 μL 혈청을 샘플패드에 주입하면, 혈청 내 CRP 항원은 샘플패드를 거쳐 컨쥬게이션 패드의 검출항체-퍼옥시다제 복합체와 반응하여 반응 멤브레인을 통하여 이동하게 되고, 포획항체와 만나면 샌드위치 항원항체 반응에 의하여 포획항체와 반응하게 된다. 반응하지 못한 검출항체-퍼옥시다제 복합체의 경우 anti-mouse IgG와 결합하게 된다. 약 5분 후, 반응물질 저장부에 존재하는 루미놀과 콜린클로라이드가 반응 멤브레인을 통하여 흐르게 되고, 최초 각각의 항체가 고정된 영역의 콜린옥시다제와 콜린클로라이드가 반응하여 과산화수소를 생산한다. 생성된 과산화수소는 검출항체-퍼옥시다제 복합체가 존재할 경우 분해되어 루미놀 발광반응을 일으키게 된다. 주입된 혈청 내 CRP의 농도에 따라 측정된 사진을 도 6에 나타내었으며, 상기 도 6에서 보는 바와 같이 0.1 ng/ml 까지 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 3 : 한번의 시료 주입을 통하여 인간 혈청 내의 CRP(C-Reactive Protein) 측정이 가능한 화학발광 스트립 센서(컨쥬게이션 패드 불포함)

도 7과 같이 컨쥬게이션 패드를 포함하지 아니하고, 화학발광 면역 스트립의 이용성을 보다 증진시키기 위하여 0.04 μg anti-CRP 항체-퍼옥시다제 복합체를 100 μg Surfactant 10G 및 200 μg PVP 55K로 전 처리한 후, 반응물질 저장부 앞쪽의 반응 멤브레인에 처리하였다. 그리고 반응물질 저장부에는 루미놀 140 μg, 콜린클로라이드 58 μg 및 발광반응 증폭제로서 p-쿠마릭 에시드 1.15 μg를 처리하였다.

상기 실시예 3과 동일하게 90 μL 혈청을 샘플패드에 주입하여, 루미놀 발광반응을 확인하였으며, 주입된 혈청 내 CRP의 농도에 따라 측정된 사진을 도 8에 나타내었다. 상기 도 8에서 보는 바와 같이 약 50 pg/ml 까지 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.

한편 상기 실시예 2 및 3에서의 발광 정도를 발광 측정기(LAS-3000, FUJI PHOTO FILM CO., LTD)를 이용하여 측정하였으며, 이를 도 9에 나타내었다.

상기 도 9에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 2 및 3에서 통하여 혈청 내 CRP 의 농도에 따라 발광 정도가 증가한 바, 이를 통하여 정밀한 바이오센싱이 가능함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

반응 멤브레인;

상기 반응 멤브레인 상에 위치하는 비대칭막 및

상기 비대칭막 상에 위치하고, 반응물질이 처리된 반응물질 저장부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 수평 흐름(lateral flow)을 이용한 멤브레인 스트립 바이오센서.
제1항에 있어서,

반응 멤브레인의 양 끝단 중 어느 한 쪽에는 샘플패드가 위치하고, 다른 한 쪽에는 흡수패드가 위치하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제1항에 있어서,

상기 비대칭막의 평균 기공의 크기는 0.01 ~ 50 ㎛ 인 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제1항에 있어서,

상기 비대칭막은 폴리술폰(polysulfone), 폴리에테르술폰(polyethersulfone) 및 폴리카보네이트(polycarbonate) 중에서 선택된 1종 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제1항에 있어서,

상기 반응 멤브레인은 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리술폰, 폴리에테르술폰 및 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 중에서 선택된 1종 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제1항에 있어서,

주입 시료 내 분석대상물질을 포획할 수 있는 생체물질이 반응 멤브레인 상에 처리된 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제1항에 있어서,

분석대상물질과 반응하는 1차 반응물질이 반응 멤브레인 상에 처리되고,

신호를 발생하는 2차 반응물질이 상기 반응물질 저장부 내 처리되는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제2항에 있어서,

상기 샘플패드에 인접하여 컨쥬게이션 패드가 위치하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제8항에 있어서,

분석대상물질과 반응하는 1차 반응물질이 상기 컨쥬게이션 패드에 처리되고,

신호를 발생하는 2차 반응물질이 상기 반응물질 저장부 내 처리되는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제7항 또는 제9항에 있어서,

상기 1차 반응물질은 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids), 압타머(aptamer) 및 나노입자 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 접합체인 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제7항 또는 제9항에 있어서,

상기 2차 반응물질은 흡광물질, 형광물질, 발광물질, 전기화학적 신호 발생물질 및 흡광, 형광, 발광, 전기화학적 신호의 세기를 증폭하는 신호 증폭 물질이 포함 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 바이오센서.
제1항 내지 제9항 중에서 선택된 어느 한 항의 멤브레인 스트립 바이오센서에 시료를 주입하여 분석대상물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 생체 시료의 분석방법.