KR102261186B1

KR102261186B1 - 자동신호증폭이 가능한 측방유동면역센서

Info

Publication number: KR102261186B1
Application number: KR1020190078123A
Authority: KR
Inventors: 오현경; 한겨레; 김민곤
Original assignee: 주식회사 지엠디바이오텍
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2021-06-07
Also published as: KR20210001680A

Abstract

본 발명의 일 실시예는, 신호 증폭이 가능한 멤브레인 스트립 센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 반응 멤브레인; 상기 반응 멤브레인 상에 제공되는 수투과성 고분자층; 및 상기 수투과성 고분자층 상에 위치하는 신호증폭 패드를 포함하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서를 제공한다.

Description

자동신호증폭이 가능한 측방유동면역센서{Lateral flow immunoassay sensor with automatic signal amplification}

본 발명은 멤브레인 센서 및 이를 이용한 시료 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 시간차 없이 시료를 공급하여도 반응 멤브레인 상에는 시간차 공급이 이루어져 신호가 증폭됨으로써 검출 강도를 개선할 수 있는 멤브레인 스트립 센서에 관한 것이다.

현장진단기기(point of care, POC)를 이용한 성분 측정 등을 수행하기 위하여 다양한 종류의 디바이스를 기반으로 제품화가 이루어지고 있다. 특히, 미세유체장치는 초미소 체적의 액체 시료를 이용하여 복잡한 생물화학적 반응을 달성할 수 있기 때문에 최근 각광을 받고 있다.

면역 크로마토그래피 분석법은 생물학적 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 결합하는 특성을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법으로, 이를 수행하기 위한 분석 기구로서 일반적으로 스트립 형태 또는 상기 스트립을 플라스틱 하우징 내부에 장착해 조립한 형태의 면역분석키트가 일반적으로 사용된다.

종래의 면역크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립은 접착성 플라스틱 지지체 상에 검체 패드, 컨쥬게이션 패드, 신호검출 패드 및 흡수 패드를 포함하여 이루어진다. 검체 패드에 주입된 액상 시료를 신호검출 패드를 경유해 흡수 패드까지 이동시키고, 신호검출 패드에서의 신호검출을 통해 면역분석을 수행한다. 변형된 다른 방법으로는 컨쥬게이션 패드 및 신호검출 물질을 하나의 다공성 패드에 통합하기도 한다. 이러한 종래의 면역크로마토그래피 분석 방법은 그 검출 감도가 1 ng/ml로서, 그 검출 감도의 향상에 대한 요구가 계속되어 왔다.

이러한 면역크로마토그래피 분석 방법에서의 검출 강도의 향상을 위하여, 샌드위치 면역분석법 등 다양한 시도가 있어왔다. 나노입자를 이용한 샌드위치 방법을 제외 하고 효소 발색반응, 형광, 화학발광 등의 고감도 반응을 한번의 시료 주입으로 가능한 단일 과정(one-step)으로 구현하는 것이 어렵다는 단점이 있어 왔고, 1차 및 2차 반응의 순차적인 진행을 위하여, 1차 반응용액 주입 후 일정 시간이 도과한 후에 2차 반응용액을 별도로 주입해야 하는 번거로움이 있었다.

따라서, 한 번의 시료 주입을 통하여 단일 과정으로 2 단계 이상의 반응 조건을 갖는 생체 반응을 측정할 수 있는 스트립 센서의 개발이 요구되는 실정이다.

한국 공개특허 제10-2018-0110384호

본 발명의 일 과제는, 일시의 용액 주입을 통하여 소량의 시료에 대한 높은 감도를 가지며 정량분석이 가능한 멤브레인 센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태는 반응 멤브레인; 상기 반응 멤브레인 상에 제공되는 수투과성 고분자층; 및 상기 수투과성 고분자층 상에 위치하는 신호증폭 패드를 포함하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 반응 멤브레인은 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플루오라이드(poly(vinylidene fluoride), PVDF) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 반응 멤브레인은 검출 영역, 대조 영역, 제거 영역 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 수투과성 고분자층은 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone, PVP), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리에틸렌옥시드(polyethylene oxide, PEO), 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA), 소듐 폴리아크릴산염(sodium polyacrylate), 카복시메틸 셀룰로오스, 소듐 알지네이트(sodium alginate, SA), 키토산, 풀루란, 전분, 젤라틴, 콜라겐 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신호증폭 패드는 신호증폭 물질을 함유할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신호증폭 물질은 흡광 물질, 형광 물질, 발광 물질, 전기화학적 신호 발생 물질, 흡광, 형광, 발광, 전기화학적 신호의 세기를 증폭하는 신호 증폭 물질 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 반응 멤브레인의 일 말단에는 시료가 주입되는 샘플 패드 및 상기 시료 중의 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 바인더를 함유하는 컨쥬게이션 패드가 제공되고, 타 말단에는 흡수 패드가 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 바인더는 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids), 압타머(aptamer), 나노입자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 상기 멤브레인 스트립 센서를 이용하여 시료 중의 분석 대상 물질을 검출하는 생체 시료의 분석방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서를 이용하는 경우, 일시에 시료 및 신호증폭 버퍼를 주입하더라도, 수투과성 고분자층에 의해 신호증폭 버퍼의 반응 멤브레인으로의 제공이 지연됨으로써 시료와 신호증폭 버퍼가 반응 멤브레인에 순차적으로 제공되어, 2가지 이상의 반응 조건을 갖는 효소반응, 항원항체 반응, 화학반응 등을 단순히 구현할 수 있다. 이를 통하여, 멤브레인 센서를 통한 분석 시, 소량의 시료에 대한 검출 감도를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서의 구성을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서에서의 시료 및 신호증폭 버퍼의 흐름을 나타낸다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 멤브레인 스트립 센서에서의 용액 주입 후 시간 경과에 따른 신호 검출 결과를 나타낸다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 의한 멤브레인 스트립 센서에 대하여 설명한다.

본 발명의 일 양태는 반응 멤브레인; 상기 반응 멤브레인 상에 제공되는 수투과성 고분자층; 및 상기 수투과성 고분자층 상에 위치하고, 신호증폭물질을 함유하는 신호증폭 패드를 포함하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서는 측면 흐름 분석(LFA) 기반의 바이오센서일 수 있다. LFA 방식은 용액 흐름의 외력에 의하여 검출하고자 하는 검체를 함유하는 액상 시료를 검체와 상호작용할 수 있는 화학 성분 또는 분자가 부착되어 있는 다양한 영역을 통하여 이동시킨다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서의 구성을 나타낸다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서(100)는 샘플 패드(110), 컨쥬게이션 패드(120), 반응 멤브레인(130), 신호증폭 패드(141) 및 상기 신호증폭 패드(141) 상에 제공되는 수투과성 고분자층(142)을 포함하는 신호증폭부(140), 및 흡수 패드(150)를 포함할 수 있다.

이때, 샘플 패드(110), 컨쥬게이션 패드(120), 반응 멤브레인(130) 및 흡수 패드(150)는 순차적으로 위치할 수 있다. 이러한 배열은 투입되는 시료의 진행방향과 일치할 수 있다. 또한, 신호증폭부(140)는 상기 반응 멤브레인(130)의 일 말단, 바람직하게는 상기 반응 멤브레인(130)의 양 말단 중 상기 컨쥬게이션 패드(120)와 근접한 말단 상에 위치할 수 있다.

샘플 패드(110)는 시료를 수용하여 컨쥬게이션 패드(120)를 거쳐 반응 멤브레인(130) 방향으로 전개하는 역할을 수행한다.

샘플 패드(110)는 분석 대상 물질에 대한 선택성을 보다 향상시키기거나 시료에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해, 여과 기능을 추가로 수행할 수 있다. 샘플 패드(110)는, 예를 들어, 전혈을 시료로 사용하는 경우 적혈구를 여과 제거할 수 있을 정도로 조밀한 소재로 이루어지거나, 여과를 돕는 보조물질을 추가로 함유할 수 있다. 샘플 패드(110)는, 필요에 따라, 샘플 패드(110)의 업스트림에 분석 대상 물질과 바인더 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭물질에 의해 영향을 배제할 수 있는 물질을 함유하는 보조 패드를 추가로 구비할 수 있다. 샘플 패드(110)는 셀룰로오스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 유리 섬유 등으로 이루어질 수 있으나, 시료를 흡수할 수 있는 소재라면 그 종류가 한정되는 것은 아니다.

컨쥬게이션 패드(120)는 시료 중의 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 바인더를 함유할 수 있다. 컨쥬게이션 패드(120)는 바인더가 도포된 후 건조되어 제공될 수 있다. 상기 바인더는 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acid), 압타머(aptamer), 나노입자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.

바인더가, 예를 들어, 금속 나노입자인 경우, 바인더 중의 리셉터와 분석 대상 물질의 특이적 또는 선택적인 반응에 의한 금속 나노입자의 색변화를 통해 분석 대상 물질을 검출할 수 있다. 나아가, 반응 멤브레인(130) 상에서 리셉터에 선택적으로 결합된 분석 대상 물질과 금속 나노입자의 결합체의 흡광도, 전기 전도도 등을 측정함으로써 분석 대상 물질을 정량적으로 분석할 수 있다. 금속 나노입자는, 예를 들어, 금 나노입자, 은 나노입자, 구리 나노입자 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바인더가, 예를 들어, 효소, 효소 기질 또는 효소반응 생성물질인 경우, 바인더 중의 리셉터와 분석 대상 물질의 특이적 또는 선택적인 반응에 의한 분석 대상 물질 또는 리셉터와 상기 효소, 효소 기질 또는 효소 반응 생성물질이 반응하여 산화·환원 반응 등과 같은 효소 반응을 일으키게 된다. 이 경우, 효소 반응에 의한 생성물의 흡광, 형광, 발광 등을 측정함으로써 분석 대상 물질을 검출할 수 있다. 효소는, 예를 들어, 글루코스 옥시다아제, 글루코스 탈수소효소, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 효소 기질은, 예를 들어, 글루코스, 과산화수소 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

컨쥬게이션 패드(120)는 셀룰로오스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 유리섬유, 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 등으로 이루어질 수 있으나, 바인더를 도포하여 건조한 후 컨쥬게이션 패드(120)가 액상 시료에 의해 젖을 경우 바인더가 컨쥬게이션 패드(120)로부터 쉽게 분리될 수 있는 소재라면 한정되지 않으며, 면역크로마토그래피 분석 스트립에서 일반적으로 사용되는 컨쥬게이션 패드라면 모두 적용될 수 있다.

반응 멤브레인(130)은 시료가 전개되는 통로 역할을 수행함과 동시에, 계획하는 화학, 생물학적 반응 결과를 확인하는 공간을 제공한다. 반응 멤브레인(130)은 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플루오라이드 및 이들의 조합으로부터 선택되는 소재로 이루어질 수 있으나, 시료의 수평 흐름이 가능한 멤브레인 형태의 소재라면 이에 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라 적절한 소재를 선택하여 사용할 수 있다.

반응 멤브레인(130)은 검출 영역, 대조 영역, 제거 영역 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다. 상기 검출 영역(detection zone)은 시료 중에 분석 대상 물질이 여부를 확인하기 위한 영역으로, 예를 들어, 분석 대상 물질-바인더 복합체를 고정하기 위한 포획 항체가 위치하고 있을 수 있다. 상기 대조 영역(control zone)은 시료가 검출 영역을 정상적으로 통과하였는지의 여부를 확인하기 위한 영역이다. 상기 제거 영역(deletion zone)은 불순물을 제거하기 위한 영역으로, 바람직하게는 검출 영역의 전단부에 위치할 수 있고, 시료 내의 비분석 대상 물질들을 미리 제거함으로써 검출 영역에서의 검출 감도를 보다 향상시키는 역할을 할 수 있다.

신호증폭부(140)는 상기 계획하는 화학, 생물학적 반응 결과로서 발생하는 신호를 증폭시켜 신호 검출의 민감도를 향상시키는 역할을 할 수 있다. 신호증폭부(140)는 수투과성 고분자층(142) 및 신호증폭 패드(141)를 포함하며, 반응 멤브레인 상에 순차적으로 적층되어 위치될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 신호증폭 패드(141)는 최초 주입된 시료와 바인더 사이에 1차 반응이 이루어진 후 유도된 2차 반응에 필요한 신호증폭 물질을 저장할 수 있다. 신호증폭 패드(141)는 셀룰로오스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 유리섬유 등의 소재로 이루어질 수 있으나, 수용액 상태의 신호증폭 물질을 처리 및 건조하여 사용할 수 있는 소재라면 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 신호증폭 물질을 기포함하는 신호증폭 버퍼를 사용하는 경우에는, 신호증폭 패드(141)는 신호증폭 물질을 포함하지 않을 수 있다.

수투과성 고분자층(142)은 수용성 고분자 화합물일 수 있으며, 예를 들어, 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone, PVP), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리에틸렌옥시드(polyethylene oxide, PEO), 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA), 소듐 폴리아크릴산염(sodium polyacrylate), 카복시메틸 셀룰로오스, 소듐 알지네이트(sodium alginate, SA), 키토산, 풀루란, 전분, 젤라틴, 콜라겐, 폴리아크릴아마이드(PAM), 메틸롤화 요소수지, 메틸롤화 멜라닌수지, 카복시메틸셀룰로스(CMC) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다. 수투과성 고분자층(142)은 접착성을 가지는 양면 테이프 형태로 이루어질 수 있다.

수투과성 고분자층(142)은 수투과성 고분자층(142)의 상부를 통하여 공급되는 신호증폭 버퍼에 의해 내부 기공에 침투되어 내부 기공을 따라 감소된 속도로 수직방향으로 전개되거나 및/또는 신호증폭 버퍼에 의해 수투과성 고분자층(142)이 용해됨에 따라 반응 멤브레인(130)까지 이동할 수 있다. 이러한 경로를 통하여, 수투과성 고분자층(142)은 신호증폭 버퍼 및 물질의 전달을 지연시켜, 신호증폭 버퍼와 일시에 또는 거의 일시에 제공된 시료와 시간차를 두고 반응 멤브레인(130)에 도달할 수 있게 한다.

신호증폭 물질은 흡광 물질, 형광 물질, 발광 물질, 전기화학적 신호 발생 물질, 또는 흡광, 형광, 발광, 전기화학적 신호의 세기를 증폭하는 신호 증폭 물질이 포함될 수 있다. 신호증폭 물질은, 예를 들어, 루미놀(luminol), 루미겐(lumigen), 루시페린(luciferin)과 같은 화학 발광 물질, 루테늄 트리스-바이피리딘(ruthenium tris-bipyridine, Ru(Bpy)₃) 등과 같은 전기화학 발광 물질, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DBA), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)(ABTA), 4-chloro-1-naphthol(CN), BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)/NBT (nitro blue tetrazolium) 등과 같은 효소 발색 기질, 유기형광 물질(예를 들어, FITC, 로다민 그린, 티아디카르보시아닌, Cy2, Cy3, Cy5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594, Alexa 647 등), 양자점(quantum dot) 등과 같은 형광 물질, 금속 나노입자, 마그네틱 나노입자, pH 조절 물질(예를 들어, NaOH, HCl, 버퍼) 등을 포함할 수 있다.

신호증폭 버퍼는 증류수, 식염수, 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS), 시트르산 완충액, 트리스　완충액(tris buffer), 탄산염　완충액(carbonate buffer), 붕산염　완충액(borate buffer), 인산염　완충액 및 이들의 조합으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있으나, 신호증폭 패드(141)로부터 신호증폭 물질을 분리하고 이를 포함하여 전개될 수 있는 것이라면 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 신호증폭 버퍼는 신호증폭 물질을 혼합하여 주입될 수도 있다.

흡수 패드(150)는 반응 멤브레인(130)으로 전개된 시료를 흡수하는 역할을 한다. 흡수 패드(150)는 셀룰로오스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 유리 섬유 등으로 이루어질 수 있으나, 시료를 흡수할 수 있는 소재라면 그 종류가 한정되는 것은 아니다.

시료는 분석의 대상이 되는 임의의 객체로서, 액상일 수 있으며, 예를 들어, 생물의 전혈, 혈장, 혈청, 누액, 타액, 소변, 기타 체액을 포함하는 바이오 시료, 또는 천연 또는 인공의 화합물을 포함하는 화학 시료 등을 포함할 수 있다. 시료는 분석 대상 물질로서, 소정의 DNA, 단백질, 화학 물질, 독성 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서는 시료 내의 소정의 분석 대상 물질에 따라 다양한 형태의 스트립 센서로 구현될 수 있다. 예를 들어, 혈청 내의 특정 단백질을 검출하고자 하는 경우, 바인더르 포함하는 컨쥬게이션 패드(120)과 흡수 패드(150) 사이에 특정 물질을 특이적으로 결합시킬 수 있는 항체를 고정하고, 검출 항체-효소 복합체를 이용하여, 혈청을 샘플 패드(110)에 주입할 경우, 샌드위치 면역반응이 이루어지고 검출 항체의 효소와 특이적인 신호를 보이는 반응 물질을 신호증폭 패드(141)에 포함시키면, 1차 항원-항체 반응이 이루어진 후, 특정 신호를 강화하여 나타낼 수 있는 센서를 구현할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서는 시료를 주입하여 면역 반응 또는 효소 반응 등을 통하여 분석 대상 물질을 측정할 수 있다. 측정 대상에 적절한 반응에 따라, 바인더 등 반응 물질의 종류 및 반응 멤브레인의 처리 등을 조절할 수 있다. 화학 발광 면역 스트립 센서의 경우, 컨쥬게이션 패드(120)에 검출 항체를 저장한 후, 반응 멤브레인에 포획 항체 및 2차 항체를 고정시키고, 신호증폭 패드(141)에 발광 반응을 일으키는 물질, 예를 들어, 금 나노입자를 포함시킨 상태에서 시료를 주입함으로써 반응 정도를 확인할 수 있다. 또한, 컨쥬게이션 패드를 포함하지 않는 경우에도, 반응 멤브레인에 검출 항체를 처리함으로써 원하는 결과를 이끌어낼 수 있다.

멤브레인 스트립 센서(100)는 지지체 상에 제공될 수 있다. 지지체는, 예를 들면, 접착성 플라스틱으로 이루어질 수 있으며, 멤브레인 스트립 센서(100)를 지지하는 역할을 할 수 있다.

멤브레인 스트립 센서는 상기 멤브레인 스트립 센서의 외부에 제공되는 하우징을 추가로 포함할 수 있다. 하우징은 멤브레인 스트립 센서의 상부를 둘러싸는 상부 하우징 및 멤브레인 스트립 센서의 하부를 둘러싸는 하부 하우징을 포함할 수 있다.

상부 하우징은 샘플 패드(110)의 상부에 위치하고, 시료를 샘플 패드(110)로 주입시키는 시료홀, 신호증폭 패드(141)의 상부에 위치하고, 신호증폭 버퍼를 신호증폭 패드(141)로 주입시키는 버퍼홀, 및 반응 멤브레인(130)의 검출영역, 대조영역 및/또는 제거영역 상부에 위치하고, 반응 멤브레인(130) 상에 수행된 반응 결과를 확인할 수 있는 분석홀을 포함할 수 있다.

다음으로, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서에서의 시료 및 신호증폭 버퍼의 흐름을 나타낸다.

도 2를 참조하여, 본 발명의 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서의 작동 관계를 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 시료는 샘플 패드(110)로 주입될 수 있다. 멤브레인 스트립 센서에 하우징이 있는 경우라면, 상부 하우징의 샘플홀을 통해 시료가 샘플 패드(110)에 주입될 수 있다. 샘플 패드(110)로 주입된 시료는 컨쥬게이션 패드(120)로 이동하며, 여기서 시료 중의 분석대상 물질은 컨쥬게이션 패드(120)에 도포되어 있는 바인더와 1차 반응을 수행할 수 있다. 컨쥬게이션 패드(120)를 통과하여 반응 멤브레인(130)으로 이동한 물질들은 반응의 결과를 반응 멤브레인(130)에 나타내고, 흡수 패드(150)로 흡수될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 신호증폭 버퍼는 신호증폭 패드(141)로 주입될 수 있다. 멤브레인 스트립 센서에 하우징이 있는 경우라면, 상부 하우징의 버퍼홀을 통해 신호증폭 버퍼가 신호증폭 패드(141)에 주입될 수 있다. 신호증폭 패드(141)로 주입되어 흡수된 신호증폭 버퍼는 신호증폭 패드(141)에 흡수되는 동시에 신호증폭 패드(141)에 존재하는 신호증폭 물질을 신호증폭 패드(141)로부터 분리시키며, 분리된 신호증폭 물질과 혼합되어 혼합 반응용액을 형성하며, 신호증폭 패드(141)에 존재하는 신호증폭 물질은 신호증폭 버퍼와 함께 수투과성 고분자층(142)으로 이동한다.

수투과성 고분자층(142)에 흡수 이동된 혼합 반응용액은 수투과성 고분자층(142)의 내부 기공에 침투되어 내부 기공을 따라 감소된 속도로 수직방향으로 전개되거나 및/또는 신호증폭 버퍼에 의해 수투과성 고분자층(142)이 용해됨에 따라 수투과성 고분자층(142) 하부에 접해 있는 반응 멤브레인(130)까지 이동할 수 있다. 이 과정에서, 혼합 반응용액의 흐름은 물리적 또는 공간적 장애에 의하여 지연 또는 지체될 수 있다.

혼합 반응용액 중 신호증폭 물질은 반응 멤브레인(130)에 잔존하는 분석대상 물질과 바인더의 1차 반응물과 2차 반응을 수행할 수 있다. 이러한 반응 결과물은 신호를 발생시키며, 이와 같은 방법으로 멤브레인 스트립 센서의 신호 감도를 향상시킬 수 있다. 또는, 혼합 반응용액 중 신호증폭 물질의 성질에 따라, 반응 멤브레인에서의 반응 용액의 pH 등 반응 조건을 변화시킬 수 있다. 이를 이용하여, 본 발명?? 일 실시예에 따른 멤브레인 스트립 센서는 1차 및 2차 반응의 반응 조건이 상이하거나 교차반응이 일어나거나 비특이적 반응이 일어나는 경우, 이를 단일 과정(one-step)으로 쉽게 구현할 수 있는 이점이 있다.

상기 '단일 과정'은 일시의 시료 주입만으로 반응 및 측정이 완료되는 것을 말한다. 일 예로 루미놀을 이용한 화학발광 면역 센서의 경우, 루미놀 발광 반응은 pH 9 이상에서 최대가 되므로 항원항체 결합이나 효소 반응이 최대가 되는 pH 조건과 차이가 있으며, 중성 이하의 pH 에서는 루미놀의 침전이 발생하는 문제가 있다. 일반적인 바이오 센서의 경우 주입시료가 혈액, 또는 혈청과 같이 중성 pH일 경우가 대부분이므로, 단일 과정을 통하여 이러한 루미놀 반응을 진행하기 매우 어려우나, 본 발명의 일 실시예에 따르면 이러한 2 가지 이상의 반응조건을 가지는 경우에도 쉽게 단일 과정을 통하여 구현할 수 있는 바, LFA 스트립 센서의 이용 범위를 넓힐 수 있게 된다.

샘플 패드(110)로 주입되는 시료와 신호증폭 패드(141)로 주입되는 신호증폭 버퍼는 동시에, 거의 동시에 또는 순차적으로 주입될 수 있다. 그러나, 수투과성 고분자층(142)에 의한 혼합 반응용액, 즉 신호증폭 물질의 이동의 지연은 신호증폭 버퍼와 일시에 또는 거의 일시에 제공된 시료와 시간차를 두고 반응 멤브레인(130)에 도달하도록 한다.

한편, 샘플 패드(110)와 신호증폭 패드(141)에 주입되는 시료/버퍼가 별도로 존재하므로, 1종의 시료를 통해 1 및 2차 반응을 모두 수행하게 하는 경우에 비해, 소량, 예를 들어, 100 μl의 시료만으로도 물질 검출이 가능할 수 있다.

실시예

실시예 1. 신호증폭부를 포함하는 스트립 센서의 제조 및 사용

유리섬유로 제조된 패드(3.8 mm × 4 mm)에 저장 완충액(5% trehalose, 0.5% protein saver, 1% TritonX100, 0.2% Tween20 in 1X phosphate buffered saline) 10 μl를 처리하고 건조시켜 컨쥬게이션 패드로 준비하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인(GE healthcare, FF080HP Nitrocellulose, 3.8 mm × 25 mm)에 포획 황체(1 mg/ml)를 분배(dispersal) 시스템을 이용하여 검출 영역에 고정시켜 반응 멤브레인으로 준비하였다. 유리섬유로 제조된 패드(3.8 mm × 4 mm)에 금 나노이온-항체 접합체(AuNP) 분산액을 처리하고 건조시켜, 접합체 패드로 준비하였다. 유리섬유로 제조된 패드(3.8 mm x 3 mm)에 1% 카제인 완충액 10 μl를 처리하고 건조시키는 전처리 과정을 거친 후, 0.1M 염화 금산 용액(pH 7.4) 6.5 μl를 처리 및 건조하여 신호증폭 패드로 준비하였다. 수투과성 고분자층으로는 폴리비닐알콜(PVA) 필름(3.8 mm × 4 mm)을 준비하였으며, 샘플 패드(3.8 mm × 20mm)와 흡수패드(3.8 mm × 20 mm)는 섬유 재질을 사용하여 도 1과 같이 스트립 센서를 제조하였다.

인산완충생리식염수(PBS)에 0.027 - 275 nM(0.01 - 100 ng/mL) 코티솔을 함유한 액상 시료를 준비하여 샘플 패드 상에 100 μl를 주입하고, 곧바로 이어 pH 3.8 시트르산 완충액에 10mM 하이드록실 아민이 포함된 용액 15 μl를 신호증폭 패드 상에 주입하였다.

비교예 1 내지 5. 수투과성 고분자층을 불포함하는 스트립 센서의 제조

상기 실시예 1에 있어서, 수투과성 고분자층으로서 PVA 필름을 사용하는 것 대신 아래 표 1의 소재를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 스트립 센서를 제조하였다.

	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5
소재	아크릴 소재의 시판 양면테이프	니트로셀룰로스 (NC)	Vivid^TM플라즈마 분리막	비대칭 슈퍼미크론 폴리설폰(MMM)	없음

실험예 1. 수투과성 고분자층의 지연 방출 특성 확인

수투과성 고분자층인 폴리비닐알콜(PVA) 필름의 지연 방출 특성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 수득한 스트립 센서를 이용하여 용액 주입 후 경과 시간 별 각 검출 영역에서의 신호의 세기를 비교하였다.

시료 및 용액 주입 후 시간에 따른 색 변화를 관찰한 결과, 비교예 1의 경우 시간에 따른 색 변화가 없는 반면, 실시예 1의 경우 신호증폭 버퍼(PBS) 주입 약 3 분 후부터 색상이 진해지는 것을 확인하였다(도 3). 이를 통해, 비교예 1의 경우 양면 테이프에 의해 신호증폭 버퍼가 완전히 차단되어 2차 반응이 진행되지 않았으며, 실시예 1의 스트립 센서의 경우, PVA로 이뤄진 수투과성 고분자층에 의하여 신호증폭 물질의 이동이 약 5 분 지연되었으며, 5 분 이후에 신호증폭 물질이 반응 멤브레인에 도달하여 2차 면역 반응이 진행되었음을 유추할 수 있었다.

실험예 2. 수투과성 고분자층의 지연 방출 특성 확인

수투과성 고분자층인 폴리비닐알콜(PVA) 필름의 수용성 특성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1 및 비교예 2 내지 5에서 수득한 스트립 센서를 이용하여 용액 주입 후 경과 시간 별 각 검출 영역에서의 신호의 세기를 비교하였다.

시료 및 용액 주입 후 시간에 따른 색 변화를 관찰한 결과, 비교예 2 내지 5의 경우 용액 주입 후 바로 점진적인 색 변화가 진행되는 반면, 실시예 1의 경우 신호증폭 버퍼(pH 3.8 시트르산 완충액에 10mM 하이드록실 아민이 포함된 용액) 주입 약 5 분 후부터 색상이 진해지며, 그 변화 정도 또한 비교예들에 비해 완만함을 확인하였다(도 4). 이를 통해, 비교예 2 내지 5의 경우 신호증폭 버퍼의 이동이 전혀 지연되지 않아 2차 반응이 1차 반응과 거의 동시에 진행되었으나, 실시예 1의 스트립 센서의 경우, PVA로 이뤄진 수투과성 고분자층에 의하여 신호증폭 물질의 이동이 약 5 분 지연되었으며, 5 분 이후에 신호증폭 물질이 반응 멤브레인에 도달하여 2차 면역 반응이 진행되었고, 최종 세기 또한 방출이 지연되지 않은 비교예들에 비해 현저히 개선되었음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

100: 멤브레인 스트립 센서 110: 샘플 패드
120: 컨쥬게이션 패드 130: 반응 멤브레인
140: 신호증폭부 141: 신호증폭 패드
142: 수투과성 고분자층 150: 흡수 패드

Claims

반응 멤브레인;
상기 반응 멤브레인 상에 제공되는 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA)의 수투과성 고분자층; 및
상기 수투과성 고분자층 상에 위치하는 신호증폭 패드를 포함하고,
신호증폭 버퍼는 시료와 동시에 또는 순차적으로 상기 반응 멤브레인으로 주입되고,
상기 수투과성 고분자층은 신호증폭 버퍼 및 신호증폭 물질의 방출을 지연시키는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서.
제1항에 있어서,
상기 반응 멤브레인은 니트로셀룰로오스, 나일론, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서.
제1항에 있어서,
상기 반응 멤브레인은 검출영역, 대조영역, 제거영역 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서.
삭제
제1항에 있어서,
상기 신호증폭 패드는 신호증폭물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서.
제5항에 있어서,
상기 신호증폭물질은 흡광물질, 형광물질, 발광물질, 전기화학적 신호 발생물질, 흡광, 형광, 발광, 전기화학적 신호의 세기를 증폭하는 신호 증폭 물질 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서.
제1항에 있어서,
상기 반응 멤브레인의 일 말단에는 시료가 주입되는 샘플 패드 및 상기 시료 중의 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 바인더를 함유하는 컨쥬게이션 패드가 제공되고, 타 말단에는 흡수 패드가 위치하는 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서.
제7항에 있어서,
상기 바인더는 항체, 항원, 효소, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids), 압타머(aptamer), 나노입자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 멤브레인 스트립 센서.
제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 멤브레인 스트립 센서를 이용하여 시료 중의 분석 대상 물질을 검출하는 생체 시료의 분석방법.